VESÍCULA DE POLIDIACETILENO PARA DETECÇÃO DE ...
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i HIASMYNE SILVA DE MEDEIROS VESÍCULA DE POLIDIACETILENO PARA DETECÇÃO DE TRICLOROMETANO EM ÁGUA POTABILIZADA VIÇOSA MINAS GERAIS – BRASIL 2011 Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Ciência e tecnologia de Alimentos, para a obtenção do título de Magister Scientiae.
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HIASMYNE SILVA DE MEDEIROS
VESÍCULA DE POLIDIACET ILENO PARA DETECÇÃO DE TRICLOROMETANO EM ÁGUA POTABILIZADA
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL 2011
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Ciência e tecnologia de Alimentos, para a obtenção do título de Magister Scientiae.
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As pessoas que mais amo nesse mundo, especialmente ao meu pai Heron Medeiros, a minha mãe Maria Aparecida da Silva Medeiros e minha irmã Hedwirges Silva de Medeiros.
Dedico esse trabalho
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pois sem Ele minha vida não teria sentido. Agradeço por está
sempre comigo em todos os momentos de minha, por ter guiado os meus
passos, pelo teu amor eterno.
Á Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Tecnologia de
Alimentos, pela oportunidade de participar do Programa de Pós-graduação, em
nível de Mestrado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), pela concessão da bolsa de estudo.
Á minha família, especialmente, ao meu pai Heron Medeiros, a minha mãe
Maria Aparecida da Silva Medeiros e minha irmã Hedwirges Silva de Medeiros,
pelo apoio, amor e por estarem sempre comigo!
Aos meus parentes, aos meus tios e tias, primos e primas pelo amor e por
sempre torcerem por mim, especialmente a minha avó Maria Verônica e aos que
já se foram Raimundo, Rubens e Margarida Maria (Ângela).
Ao meu orientador, Nélio Jose de Andrade, pela orientação, por sua
presença constante em todas as etapas de realização da tese, pela amizade e
pela confiança em mim conferida.
Á professora Nilda de Fátima Ferreira Soares, por ter sido minha co-
orientadora durante meu mestrado, pela amizade e por tudo que fez por mim
durante minha graduação.
Á professora Maria Eliana Lopes R. de Queiroz, por ter sido minha co-
orientadora, pela ajuda e contribuição na tese.
Á professora Ana Clarissa dos Santos Pires, que também considero como
minha co-orientadora, pela contribuição e apoio na tese.
Ao professor Renato Souza Cruz, pela participação na banca e pelo apoio
e amizade no laboratório.
A toda equipe do laboratório de Microbiologia e Higiene Industrial, pela
amizade e apoio, especialmente a Laís pelos dias que passou comigo
trabalhando no laboratório.
A toda equipe de Embalagens, pela amizade e apoio, especialmente o
Allan, a Flávia e o Fabiano pela ajuda direta em meu experimento.
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Ao laboratório de Operações e Processos e a professora Jane pelo uso do
espctofotrômetro.
A todos os funcionários do departamento de Tecnologia de Alimentos,
pela ajuda e amizade.
Ao José Antônio, por todo amor, carinho e presença em minha vida.
Ao meu cunhado Pablo, pela amizade e apoio.
A cada um dos meus amigos e amigas pela amizade incondicional e por
torcerem sempre por mim.
A todos que de uma forma ou de outra contribuíram para que eu chegasse
aonde cheguei, o meu muito obrigado!!
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BIOGRAFIA
HIASMYNE SILVA DE MEDEIROS, filha de Heron Medeiros e Maria
Aparecida da Silva Medeiros, nasceu em Viçosa, Minas Gerais, em 04 de abril
de 1985.
Em fevereiro de 2005, iniciou o curso de Ciência e Tecnologia de
Laticínios, na Universidade federal de Viçosa, graduando-se em julho de 2009.
Em agosto de 2009, iniciou o mestrado no Programa de Pós- graduação
em Ciência e Tecnologia de Alimentos na Universidade federal de Viçosa.
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ÍNDICE
RESUMO..................................................................................................................vii ABSTRAT..................................................................................................................ix 1. Introdução.............................................................................................................1 2. Objetivos...............................................................................................................1 2.1. Objetivo geral..................................................................................................1 2.2. Objetivos específicos......................................................................................2 3. Revisão de Literatura............................................................................................2 3.1. Considerações gerais......................................................................................2 3.2. Trihalometanos................................................................................................3 3.3. Toxidade dos THM..........................................................................................7 3.4. Legislação.......................................................................................................9 3.5. Metodologia para quantificação de THM.......................................................10 3.6. Sensores de PDA..........................................................................................11 4. Delineamento experimental................................................................................16 5. Material e Métodos.............................................................................................17 5.1. Coleta das amostras de água.......................................................................17 5.2. Análises fisico-quimicas e microbiológicas de amostras de água.................17 5.3. Técnica da bioluminescência para análise de água......................................18 5.4. Identificação e quantificação de Triclorometano por GC-MS........................18 5.5. Preparo das vesículas...................................................................................19 5.6. Tratamento das vesículas com ultrasson de ponta.......................................20 5.7. Resposta Colorimétrica (RC).........................................................................20 5.8. Quantificação da mudança de cor.................................................................20 5.9. Medida do raio hidrodinânico das vesículas..................................................21 5.10. Avaliação da transição colorimétrica das vesículas na presença de TCM....21 6. Resultados e Discussão.....................................................................................22 6.1. Ocorrência de TCM e a qualidade de água das ETAs e dos pontos de coleta
de amostras nas redes de distribuição..........................................................22 6.2. Seleção da suspensão de vesículas.............................................................33 6.2.1. Resposta Colorimétrica (RC).........................................................................33 6.2.2. Diâmetro das vesículas em suspensão.........................................................36 6.2.3. Influência das ondas ultrassônicas no diâmetro das vesículas.....................37 6.2.4. Avaliação da transição colorimétrica das vesículas em razão do pH,
temperatura e concentração de TCM............................................................40 7. Conclusões.........................................................................................................45 8. Referências bibliográficas...................................................................................46
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RESUMO
MEDEIROS, Hiasmyne Silva de, M.Sc. Universidade Federal de Viçosa, julho de 2011. Vesícula de polidiacetileno para detecção de triclorometano em água potabilizada. Orientador: Nélio José de Andrade Coorientadores: Nilda de Fátima Ferreira Soares e Maria Eliana Lopes R. de Queiróz
Subprodutos do processo de desinfecção da água os trihalometanos são
considerados nocivos à saúde. Dentre os THM, encontra-se o triclorometano
(TCM) causado pela reação do cloro com ácidos originários da decomposição de
matéria orgânica, como os ácidos húmicos e fúlvicos. A detecção desses
compostos na água normalmente é realizada por métodos cromatográficos que
além do alto custo da análise exigindo pessoal bem treinado. Essa pesquisa
pretendeu desenvolver uma alternativa para avaliar a presença de TCM na água
por meio de um procedimento simples e rápido por meio de um sensor
colorimétrico, usando vesícula de polidiacetileno. Inicialmente, procurou-se
conhecer a qualidade físico-química, incluindo a concentração de TCM por
cromatografia gasosa com espectrofotômetro de massa (GC/MS), e a qualidade
microbiológica de amostras de águas coletadas em quatro estações de
tratamento, 15 pontos de rede de distribuição e cinco poços artesianos. De 28
amostras avaliadas, apenas duas, cerca de 2,5 % apresentaram valores acima
de 100 µg·L-1, valor máximo permitido pela Portaria 518 do Ministério da Saúde
de 25 dede março de 2004. Os resultados das análises físico-químicas e
microbiológica das amostras analisadas estiveram dentro dos limites exigidos
pela portaria 518/MS para água de consumo humano. As baixas concentrações
de turbidez e da cor, demonstrando um bom controle de qualidade nas ETAs,
provavelmente contribuíram para as baixas concentrações de TCM encontradas
nas amostras de águas. Verificou-se uma tendência de aumento da
concentração de valor de TCM a partir das ETAs, devido às quantidades de cloro
residual livre na rede, matéria orgânica oriunda do manancial de abastecimento
não retido nas ETAs mas presentes nas redes de distribuição e devido à reação
de formação TCM ser lenta. Para o desenvolvimento do sensor colorimétrico,
foram avaliadas diferentes vesículas contendo 10,12- ácido pentacosadiinócio
(PCDA) preparadas com e sem a adição de diferentes fosfolipídios como o
colesterol (CO), esfigomielina (ES) e o dimiristoifosfatidilcolina (DMPC), variando-
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se também a potência ultrassônica na produção da suspensão vesicular. A
vesícula que obteve a maior resposta colorimétrica (RC) com a adição de TCM e
o menor diâmetro, foi o tratamento 1 mM de PCDA+1mM de CO.ES submetida
a 400 w de potência. Ele foi escolhido e tratado com diferentes valores de pH,
temperatura e concentração vesicular e avaliado em relação à resposta
colorimétrica (RC) e ao tamanho, antes e após a adição de diferentes soluções
contendo, 100 µg·L-1, 1000 µg·L-1 e 10000 µg·L-1 de TCM em água deionizada.
Observando os valores da RC para os tratamentos testados, notou-se que o
tratamento: pH de 5,0, temperatura de 35 oC, com concentração de 100% da
vesícula, foi o que obteve a maior diferença entre os valores da RC em relação
aos tratamentos controle e com 100 µg·L-1. Os resultados mostram que a
suspensão de vesícula avaliada apresenta potencial para indicar a presença de
TCM em água com concentrações próximas àquelas exigidas pela legislação
brasileira.
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ABSTRACT
MEDEIROS, Hiasmyne Silva de, MSc. Universidade Federal de Viçosa, July, 2011. Vesicles polidiacetileno detection of trichloromethane in water. Adviser: Nélio José de Andrade Co-Advisers: Nilda de Fátima Ferreira Soares and Maria Eliane Lopes R. de Queiróz
By-products of the water disinfection with chorine compounds are
considered harmful to human health. Among them is trichloromethane (TCM)
caused by the reaction of chlorine with humic and fulvic acid present in the water.
The detection of TCM in water is made by the using chromatographic methods,
generally expensive and nedd weel-trained staff. This research aimed to develop
an alternative to evaluate the presence of TCM in the water using a simple and
rapid procedure using poli diacetileno vesicle. Initially, we tried to know the
physical and chemical quality, including the concentration of TCM, and
microbiological of the samples collected in four water treatment plants, 15
distribution network points and five wells. Of 28 samples tested, only two
samples, about 2.5% had values above 100 µg·L-1, maximun allowed value by
Brazilian standard legislation according to the Ordinance 518/MS 2004. The
results of physical-chemical, microbiological samples were analyzed within the
limits required by Brazilian legislation for drinking water. Low concentrations of
turbidity and color, showing a good quality control in water treatment plants,
probably contributed to the low concentrations found in TCM water samples.
There was a trend of increasing concentration value of TCM from the tratments
plants, due to the amount of free residual chlorine in the network, organic matter
from the supply source and because of the THM formation reaction is slow. For
the development of colorimetric sensor was evaluated different vesicles
containing acid pentacosadiinócio 10.12, with and without the addition of different
phospholipids and cholesterol (CO), esfigomielina (ES) and
dimiristoifosfatidilcolina (DMPC) and also was varied the ultrasonic power for
production of vesicular suspension. The vesicle suspension that had the biggest
colorimetric response (CR) and the smaller diameter, with the addition of TCM,
was the PCDA + 1mM 1mM CO.ES subjected to 400W of power. This vesicle
suspension was chosen to be conditioned with different values of pH,
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temperature and concentration and evaluated in relation to RC and size before
and after the addition of solutions containing 100 µg·L-1, 1000 µg·L-1 and 10000
µg.L-1 of TCM diluted in deionized water. Observing the values of RC for the
treatments, it was noted that the treatment - pH 5.00, temperature 35° C without
dilution of the vesicle- was what got the biggest difference between the values of
RC in relation to the control treatment and the 100 µg·L-1.
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1. Introdução
A cloração é o processo de desinfecção de água para consumo humano,
mais usado em todo o mundo, devido sua eficácia e seu preço relativamente
baixo. A reação do cloro com alguns compostos da matéria orgânica em
decomposição, particularmente os ácidos fúlvicos e húmicos, leva à formação
dos trihalometanos (THM). Dentre os THM formados, encontram-se o clorofórmio
(CHCl3), diclorobromometano (CHBrCl2), clorodibromometano (CHBr2Cl) e
bromofórmio (CHBr3) que, mesmo em baixas concentrações, podem ser tóxicos,
carcinogênicos, teratogênicos e possivelmente mutagênicos. O limite máximo
permitido no Brasil para soma das concentrações THM de 100 µg·L-1, de acordo
com a Portaria 518 do Ministério da Saúde, de 23 de abril de 2004 (BRASIL,
2004).
A análise dos THM é feita por cromatografia gasosa (CG) empregando o
detector, por captura de elétrons, que é seletivo para compostos que apresentam
halogênios em sua estrutura. Como técnica analítica, a CG depende da
qualidade do preparo da amostra, solventes e equipamentos de alto custo como
o cromatógrafo. Esses fatores têm levado ao desenvolvimento de novos
métodos, em que as principais vantagens são: rapidez nos resultados,
praticidade e baixo custo possibilitando a realização de um número maior de
análise.
Dessa forma, o uso de sensores colorimétricos, como as vesículas, torna-
se uma alternativa às técnicas cromatográficas. Pesquisas têm demonstrado a
diversidade de moléculas que podem ser incorporadas em nanoestruturas
auto-organizadas de polidiacetilenos (PDA) para atuarem como moléculas
receptoras de outras moléculas, detectando-as permitindo uma identificação
simples e rápida de compostos de interesse.
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Foi desenvolver vesículas de PDA para identificação de Triclorometano
em água potabilizada.
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2.2. Objetivos específicos
- Avaliou as propriedades físico–químicas e microbiológicas de amostras de
água potabilizada da região de Viçosa;
- Identificou e quantificou Triclorometano por GC-MS das amostras de água;
- Desenvolveu vesícula de PDA com adição fosfolipídeos;
- Avaliou a influência das ondas ultrassônicas e do tempo de exposição na
estrutura da vesícula;
- Caracterizou a suspensão de vesículas por espalhamento dinâmico de luz e
quantificou a mudança de cor;
- Avaliou a vesícula de PDA na detecção de Triclorometano em água
potabilizada;
- Avaliou o efeito da temperatura, pH da vesícula para detecção de
Triclorometano.
3. Revisão de Literatura
3.1. Considerações gerais
A água é ingerida pelo homem em maior quantidade que todos os outros
alimentos reunidos e é, também, a sua principal excreção. Um adulto ingere por
dia mais de 2 L de água, cerca de 3 % do seu peso corpóreo que, por sua vez, é
constituído por mais de 80 % de água (RIEDEL, 1992). Este contato/ingestão
com a água justifica e explica a facilidade com que parasitas macro ou
microscópicos atingem o homem e nele se desenvolvem, quando outros fatores
adicionais são favoráveis à sua sobrevida, desenvolvimento ou multiplicação.
Por outro lado, o homem está exposto à contaminante de origem
química que podem ocorrer na água natural, considerada o solvente universal.
Estima-se que cerca de 4 bilhões de metros cúbicos de contaminantes,
provenientes principalmente de efluentes industriais, compostos químicos de uso
agrícola, efluentes domésticos e outros, atinjam o solo a cada ano (VALENTE,
2000) e, conseqüentemente, a água. Esses, uma vez no ambiente, podem
receber transformações físicas e químicas, inclusive combinar com outros
3
compostos químicos podendo intensificar ou diminuir sua toxicidade aos seres
humanos e organismos vivos.
O controle da exposição a todos esses fatores de risco exige o uso de
água potável, ou seja, água tratada para remover contaminantes e evitar que
ocorram novas contaminações.
A determinação de contaminantes orgânicos em diferentes tipos de
águas como a água do mar, água potável tratada, água de nascente, dentre
outras, é fundamental para a solução e proteção de problemas ambientais
(BIZLU et al., 1996; BLOEMEN, 1993).
O crescimento populacional das últimas décadas e o relevante aumento
de conhecimentos científicos originou um rápido desenvolvimento dos setores
industrial e agrícola. A produção intensiva inerente a este desenvolvimento
originou um aumento do volume de águas residuais, quer de origem industrial,
quer doméstico e também agrícola. Foi assim introduzido um vasto número de
micropoluentes nas águas residuais com efeitos reconhecidamente indesejáveis
para a saúde pública.
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS, 1993), mais de 2000
substâncias químicas de diferentes categorias foram detectadas em águas, das
quais mais de 750 em águas destinadas ao consumo humano. Destas, mais de
600 são poluentes orgânicos e muitos deles farmacologicamente ativos, com
efeitos carcinogênicos, promotores de carcinogênese ou com ação mutagénica
(CHO et al., 2003).
3.2. Trihalometanos
A importância da matéria orgânica em sistemas aquáticos tem sido
claramente reconhecida durante os últimos anos. A matéria orgânica é,
freqüentemente, responsável pelo controle de processos geoquímicos por agir
como um receptor de prótons e controlador de pH, por influenciar o transporte e
degradação de poluentes e por participar em reações de dissolução/precipitação
mineral. O material orgânico dissolvido ou particulado também pode agir como
substrato para reações microbiológicas.
Compostos orgânicos voláteis (VOC) são os contaminantes mais
comumente encontrados em águas. Eles são usados extensivamente em áreas
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urbanas e estão presentes em inúmeros produtos, entre eles, os combustíveis,
solventes, adesivos, desodorantes e refrigerantes. A contaminação do ambiente
devido a esses produtos pode ocorrer por substâncias usadas em manufaturas
ou como resultado de processos de desinfecção, por frascos usados para
estocar solventes, práticas de agricultura, entre outras possibilidades
(KOSTOPOULOU et al., 2000).
Dentre os VOC, os compostos orgânicos voláteis halogenados (VHOC) é
uma importante classe de poluentes da água, frequentemente usados como
gases refrigerantes em refrigeradores, como propelente e como solventes de
limpeza em indústrias. Além disto, a água para consumo humano é
frequentemente desinfetada com cloro, que pode reagir com materiais orgânicos
presentes, principalmente ácidos húmicos e fúlvicos ou produto de um colapso
metabólico de plantas aquáticas, e produzir subprodutos voláteis. Além disto,
concentrações elevadas de bromo presentes em reservatórios usados como
fontes para a água tratada podem contribuir para a formação de compostos
bromados ou subprodutos de desinfecção com a mistura de cloro/bromo
(CAMPILLO et al., 2004).
A cloração da água é o método mais importante na desinfecção da água
para consumo humano, e é usada em todo o mundo (FANTUZZI et al., 2001)
devido sua eficácia e seu preço relativamente baixo. Esse procedimento é a
forma de proteger a água da contaminação microbiana externa e
desenvolvimento de bactérias durante a distribuição para a população. A
principal função do cloro é eliminar bactérias patogênicas, que podem causar
sérias doenças e morte (LEE et al., 2004; ZANG et al., 2002), reduzindo a
incidência de doenças promovidas pela água.
A reação do cloro com alguns compostos orgânicos leva à formação de
THM (Figura 1). A água bruta pode conter ácidos fúlvicos e húmicos, cujas
estruturas químicas ainda não são completamente conhecidas, resultantes da
decomposição de folhas da vegetação. A maioria desses ácidos contém radicais
cetonas, que podem causar a formação de halofórmios após a reação com o
cloro (VAN BREMEM, 1984).
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Figura 1 – Estruturas químicas dos THM formados pela reação do cloro com os compostos
orgânicos (VAN BREMEM, 1984).
Entre os compostos relacionados, os que possuem concentração mais
relevante em água potável são: triclorometano, bromodiclorometano,
dibromoclorometano e tribromometano. Portanto, quando se faz referência aos
THM, na realidade estão sendo mencionados os quatro compostos citados.
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A relação entre o uso de cloro nas estações de tratamento de água,
suas reações com os compostos orgânicos presentes e a formação de
compostos que poderiam ter efeitos negativos sobre a saúde humana foram
estudados pela primeira vez por Harris, na década de 70 (SANTOS, 1987). A
partir de suas indicações pioneiras sobre a possibilidade de existir uma
correlação entre águas de abastecimento e câncer, outros pesquisadores
passaram a estudar o assunto, como Rook, na Holanda, e Bellar, Litchtemberg e
Krones, nos Estados Unidos.
Os estudos efetuados com THM têm confirmado o potencial cancerígeno
destas substâncias, revelando efeitos mutagênicos em diferentes espécies
animais. Em relação ao homem, o efeito destas substâncias apresenta
diferenças de atuação mais quantitativas que qualitativas, devido aos fenômenos
biológicos de absorção, assimilação, excreção, desintoxicação e expressão
genéticas (GOUVEIA, 1989).
As variáveis que influenciam a reação de formação dos THM são
(KOSTOPOULOU et al., 2000; TOMINAGA, 1999; SANTOS, 1987).
a) Tempo: Em relação ao tempo, a formação de THM em condições
naturais não é instantânea e a princípio, quanto maior o tempo de contato entre o
cloro e os precursores, maior será a probabilidade de formação dos THM;
b)Temperatura: O aumento da temperatura reflete no aumento na
probabilidade de formação dos THM;
c) pH: A formação dos THM aumenta com a elevação do pH, pela sua
ação catalítica sobre o halofórmio;
d) Concentração de brometo e iodeto: Os brometos e iodetos, na
presença de cloro aquoso, são oxidados a espécies capazes de participar da
reação de substituição orgânica, resultando na formação de THM puro ou
misturado (um ou mais de um dos compostos). O bromo tem vantagens sobre o
cloro nas reações de substituição com os compostos orgânicos, mesmo que o
cloro esteja presente em excesso quando comparado com o bromo inicial.
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e) Características e concentrações dos precursores: Quanto maior a
concentração de ácidos húmicos e fúlvicos e outros precursores, maior será a
formação de THM. As características da água e dos precursores presentes
também irão influenciar a formação de THM.
f) Concentração de cloro: Quanto maior a dosagem de cloro, maior será
a probabilidade de formação de THM. A forma sob a qual o cloro se apresenta
também é importante; o cloro nas formas de HClO e ClO- tem maior poder de
formação de THM do que o cloro combinado, ou seja as cloraminas.
3.3. Toxicidade dos THM
Os THM mesmo em baixas concentrações podem ser tóxicos,
carcinogênicos, teratogênicos e possíveis mutagênicos (LEE et al., 2004;
BATTERMAN et al., 2002). Numerosos estudos epidemiológicos vêm sendo
conduzidos na investigação da correlação entre a cloração da água e a
mortalidade por câncer. Muitos estudos analíticos sugerem uma clara ligação
entre a exposição á água clorada e o desenvolvimento de câncer de bexiga e
sugerem também uma possível ligação com câncer retal. Outros estudos têm
demonstrado que a exposição aos subprodutos da cloração está relacionada a
abortos espontâneos e outras adversas conseqüências reprodutivas (LEE et al.,
2004).
Água tratada não é usada somente para beber, mas também para higiene
pessoal, cozinhar, lavar louças e roupas, e limpezas em geral. Como resultado,
para muitos contaminantes da água, os meios fundamentais de exposição e seu
aumento, não se dá só por ingestão, mas também por meio da absorção dérmica
ou por inalação.
Isso ocorre, pois os THM apresentam alta volatilidade e são
predominantemente lipossolúveis. Estudos experimentais realizados pelo OMS
apontam que durante um banho de 8 min, a exposição aos THM é seis vezes
maior do que pela ingestão da mesma água durante um período de 24 horas,
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devido a inalação de clorofórmio que pode se apresentar na forma gasosa no
ambiente em virtude de sua volatilização. A detecção dos THM já foi comprovada
em alimentos e bebidas que utilizam água clorada, como sorvetes, sucos e
refrigerantes. Os THM são absorvidos rapidamente pelo trato gastrointestinal, o
clorofórmio depois de ingerido com a água é rapidamente e quase totalmente
absorvido na corrente sanguínea tanto em humanos quanto em animais, sendo
rapidamente transportado para os tecidos.
Para as crianças, o caminho de exposição pode se dá também através da
lactação, ou seja, a transferência de mãe para filho. Compostos orgânicos
halogenados, como os THM, tende a ser hidrofóbicos e solúveis em gorduras,
assim se acumulam em materiais gordurosos. Um exemplo é a fração lipídica do
sangue ou leite. O leite humano pode oferecer um excelente indicador biológico
da exposição da criança a substâncias lipofílicas (BATTERMAN, 2002). O
clorofórmio parece ser capaz de atravessar a barreira placentária, uma vez que
já foi detectado no cordão umbilical em concentrações maiores que no sangue
materno (TOMINAGA, 1999).
A presença de THM em águas de piscinas de natação e de recreação tem
sido reportada na literatura (GONZÁLES et al., 1989). Nesse caso, a matéria
orgânica necessária para a reação com cloro também pode ser proveniente de
fonte humana, tais como saliva, urina e transpiração. A contaminação por THM
pode se dá também por meio da inalação, devido sua alta volatilidade. Como
alvo de risco não está somente os nadadores, mas também todas as pessoas
envolvidas no ambiente, como os professores, atendentes e pessoas que
trabalham na limpeza ou na área de recepção.
A concentração de THM na atmosfera ambiente varia, dependendo de
vários fatores como ventilação, temperatura da água e a quantidade de
precursores orgânicos presentes nesta água (FANTUZZI et al., 2001).
A formação de THM também é a principal fonte de contaminação para a
vida aquática podendo ter propriedades ecotoxicológicas irreversíveis. Como a
água do mar contém um alto índice de brometo (aproximadamente 65 mg·L-1),
com a aplicação de doses de cloro, o bromo é formado pela oxidação do
brometo, levando a formação de compostos organobromados. Como
conseqüência, na cloração da água do mar, os THM são normalmente
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compostos por bromofórmio e bromoclorometanos (ALLONIER et al., 2003;
JENNER et al., 1997).
3.4. Legislação
Devido à alta toxicidade destes compostos, a Environmental Protection
Agency (EPA) estabelece um limite de concentração máxima de 80 μg·L-1 para
THM totais (TTHM), existindo a intenção de reduzir este valor para 40 μg·L-1
(CAMPILLO et al., 2004; MACÊDO, 1997). Muitos países europeus, como a
Alemanha, têm restringido o limite de TTHM para 10 μg·L-1 (CAMPILLO et al.,
2004).
No Brasil, a Portaria do Ministério da Saúde de número 518/GM de 25 de
março de 2004, estabelece normas para a qualidade da água para consumo
humano e seu padrão de potabilidade (BRASIL, 2004). De acordo com esta
portaria, a concentração máxima permitida de TTHM é de 100 μg·L-1 e para cada
THM tem um limite como mostra na Tabela 1.
Tabela 1: Valores de THM para águas de consumo humano
THM Valor guia (OMS)
(µ·L)
DECRETO-LEI
243/2001 (µ·L)
Triclorometano 200 -
Bromodiclorometano 60 -
Dibromoclorometano 100 -
Tribromometano 100 -
TTHM - 100
No Brasil, os limites de contaminantes no ambiente são determinados pelo
Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA). Na resolução 357/2005, não
há limite máximo para a concentração de THM no ambiente. Entretanto, no
Artigo 21 desta resolução, que trata das condições de emissão de efluentes, é
estabelecido um limite de 1,0 mg·L-1 para Triclorometano (TCM).
A Resolução do CONAMA n° 357/2005, considera que a saúde e o bem-
estar humano podem ser afetados pela condição de balneabilidade. Assim, no
Artigo 1° desta resolução é definida recreação de contato primário, quando existir
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o contato direto do usuário com os corpos de água como, por exemplo, as
atividades de natação, esqui aquático e mergulho.
Nesta resolução também não há qualquer citação sobre os limites
permitidos para THM, apenas no parágrafo 4° do Artigo 2° considera como
impróprias as águas onde for verificada a ocorrência, dentre outros, de resíduos
ou despejos, sólidos ou líquidos, capazes de oferecer riscos à saúde ou tornar
desagradável a recreação.
3.5. Metodologia para quantificação de THM
A metodologia para quantificação de THM em amostras de água proposta
pela Associação Brasileira de Normas Técnicas ABNT (1995), descrita na norma
13407, emprega extração líquido-líquido e cromatografia gasosa com detector de
captura de elétrons.
A Portaria n° 518 de março de 2004, que estabeleceu normas e padrão de
potabilidade da água destinada ao consumo humano, sugere a adoção das
técnicas de análise de água constantes na última edição do “Standard Methods
for the Examination of Water and Wastewater”, até que sejam publicadas normas
nacionais. Esta portaria dita ainda que metodologias alternativas deverão
receber aprovação do Ministério da Saúde para terem validade (BRASIL, 2004).
A metodologia proposta no Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater para análise de THM em amostras de água utiliza a
cromatografia gasosa como técnica de quantificação (com detector de captura de
elétrons - DCE) e a extração líquido-líquido como técnica de extração,
empregando o pentano como solvente extrator, sendo sugeridos também o
hexano, o metilciclohexano e o 2,2,4-trimetilpentano (EATON et al., 1998).
Várias técnicas de extração vêm sendo empregadas e estudadas para
análise de THM em águas. Macedo (1997) determinou a concentração de THM
em amostras de águas potáveis de Juiz de Fora - MG. Para extração dos THM
das amostras foi utilizado o procedimento de micro-extração em fase sólida
(MEFS) com fase estacionária polidimetilsiloxano (100 µm). Para a quantificação
foi utilizado um cromatógrafo a gás equipado com um detector de ionização de
chama (MS).
11
3.6. Sensores de PDA
O Polidiacetileno (PDA) é uma classe de polímeros conjugados
derivados da polimerização, sob radiação ultravioleta e via adição 1,4 de
monômeros de diacetileno (Figura 2). Após esta etapa, o polímero apresenta
coloração azul, absorvendo a luz no comprimento de onda de λ = 640 nm
(PIRES et al., 2010a).
O desenvolvimento de sensores utilizando polímeros conjugados
eficientes como matrizes de sensoriamento, tem recebido atenção considerável
nas últimas décadas. Especialmente, os sensores de PDA para a detecção de
espécies biologicamente importante, têm sido intensamente investigadas devido
à sua resposta quanto a mudança das propriedades colorimétricas.
O resultado dos agregados de PDA aparece após a polimerização, com
uma cor azul intensa perceptível visualmente. A vantagem de usar agregados
PDA como sensores e biossensores vem do fato de que uma visível mudança de
cor de azul para vermelho ocorre em resposta a uma variedade de perturbações
ambientais, como temperatura, alterações de pH, e ligante-receptor (PIRES et
al., 2010a).
Em estudo recente, Shuterman e colaboradores (2009) demonstraram
que monômeros de diacetileno também podem ser polimerizados a partir da luz
visível em um processo de absorção simultânea de dois fótons. De acordo com
os autores, o processo gera um polímero com coloração azul mais intensa e
macromoléculas mais estáveis comparadas ás obtidas pela polimerização via
radiação UV (Figura 2).
Figura 2 – Desenho esquemático da polimerização de monômeros de diacetileno a partir da
radiação ultravioleta (PIRES, et al., 2010a).
C
R2
C
R1
C C
C
R2
C
R1
C
R2
C
R1
C C 254 nm
C
R1
C
C
C
R2
C
R1
C
C
C
R2
C
R1
C
C
C
R2
12
Os polidiacetilenos exibem uma notável variedade de transições de cores
(Figura 3) decorrentes da temperatura (WU et al., 2009;
POTISATITYUENYONG et al., 2008; KIM et al., 2008; SHIBATA et al., 1989),
estresse mecânico (LEE et al., 2007) diferentes solventes
(POTISATITYUENYONG et al., 2008) interação com surfactantes (SU et al.,
2005; 2004), alterações no pH (POTISATITYUENYONG, et al., 2008) e
interações específicas com moléculas biológicas (KIM et al., 2008; SU et al.,
2005).
Os PDAs já são usados para fabricar sensores para a detecção de várias
substâncias, como vírus, enzimas, peptídeos, íons, anticorpos e proteínas. A
maioria dos estudos sobre a utilidade de vesículas de PDA concentraram-se na
variação da posição do grupo diacetilenico localizado na meio das moléculas.
Figura 3 – Transição colorimétrica do polidiacetileno da forma azul para a forma vermelha.
(PIRES et al., 2010a).
A grande maioria dos sensores de PDA são basicamente, preparados
em forma de vesículas em solução aquosa ou filmes finos em suportes sólidos
(Figura 4). Entretanto, outras estruturas podem ser encontradas, como cristais
e nanocompósitos integrados em matrizes inorgânicas (CARPICK et al., 2004).
Figura 4 - Formas de organização do polímero polidiacetileno: (a) Filme ultrafino em suporte sólido, (b) Vesícula em solução. (PIRES et al., 2010a).
13
Vesículas são estruturas em bicamadas, formadas por moléculas
anfifílicas (Figura 4b) (FEITOSA et al., 2009). Se estas estruturas são formadas
por moléculas de fosfolipídios são, então, chamadas de lipossomas.
Moléculas anfifílicas que não se organizam em estruturas compactas,
como as micelas, geralmente se associam para formar vesículas ou bicamadas
planas. Essas moléculas, em geral, possuem pequenos grupos hidrofílicos e, ou
grupos hidrofóbicos grandes e volumosos, que impedem a formação de micelas.
Já a formação das vesículas ao invés das bicamadas planas é dirigida por dois
fatores: (1) as bicamadas podem permitir a entrada de água na região
hidrofóbica, o que é energeticamente desfavorável e (2) a estrutura muito
extensa formada pela bicamada é entropicamente desfavorável (WACKLIN,
2007).
Uma quantidade considerável de pesquisas tem demonstrado a
diversidade de moléculas que podem ser incorporadas em nanoestruturas auto-
organizadas de polidiacetilenos para atuarem como moléculas receptoras de
outras biomoléculas, detectando-as (KIM et al., 2008; SCINDIA et al., 2007; SUN,
2005).
Figura 5 - Representação esquemática da transição colorimétrica de polidiacetileno em função da interação entre moléculas biológicas. (PIRES, et al., 2010a)
Vesículas de PDA, incorporadas com o fosfolipídio DMPC, em lâminas de
vidro, foram preparadas para detecção de Escherichia coli. Quando a E. coli, foi
vinculada aos seus anticorpos quimicamente ligado ao PDA, aumentou-se a
fluorescência das vesículas. A inserção de DMPC nas vesículas, reduziu muito
o tempo de resposta das alterações nas fluorescência, devido a flexibilidade da
estrutura (KIM et al., 2008).
Em outro trabalho, o vírus Influenza foi identificado utilizando vesícula de
PDA e quando o vírus se ligou ao receptor imerso no polímero, o pico de
14
absorção da cor azul reduziu com o concomitante aumento do pico referente à
cor vermelha e a solução tornou-se rosa-alaranjado (REICHERT et al., 1995).
Filme de Langmuir contendo α-D-manosídeo hexadecil (MC16) e PDA
para identificação de Escherichia jm109 (WORLD HEARTH ORGANIZATION,
1994). Os autores imergiram o filme em suspensão de 9 x 108 UFC·mL-1 da
bactéria e observaram que houve redução do pico referente a cor azul e
aumento do pico referente a cor vermelha, indicando mudança de cor do sensor.
O MC16 funcionou como agente recptor para o micro-organismo.
O PDA absorve a luz na região de maior energia e, portanto, pode
apresentar diferentes cores, como vermelho, laranja ou roxo, dependendo dos
diferentes estimulos externos. Muitos grupos de pesquisa têm demonstrado que
a modificação estrutural do grupo de cabeça e cadeia lateral é uma abordagem
muito eficaz para ajustar a resposta colorimétrica das vesículas de PDA (GOU et
al., 2010). Segundo Kim e colaboradores, mostraram que a força de interação
na superfície da vesícula PDA é fortemente determinada pela transição
colorimétrica causada pela temperatura (KIM et al., 2008). Nos casos extremos
em que as interações entre os grupos da cabeça são muito fortes, a transição da
cor do PDA, geralmente é um processo irreversível. O termocromismo
reversível, está relacionado com a modificação estrutural das produzida pelos
conjuntos de ligações das cabeças de PDA (AHN et al., 2009).
O termocromismo, isto é a transição colorimétrica induzida pelo aumento
da temperatura, é uma das áreas mais estudadas para filmes e vesículas de
PDA. Em estudo recente, a transição termocrômica de vesículas de PDA foi
avaliada no intervalo entre 20 ºC e 90 ºC. Observou-se que com o aumento da
temperatura houve deslocamento hipsocrômico, do pico de máxima absorção
referente à cor azul, que foi associado à movimentação das cadeias do polímero.
Além disso, em temperaturas intermediárias, a solução vesicular adquiriu
também coloração roxa que demonstrou ser reversível quando foram realizados
ciclos de aquecimento/resfriamento das vesículas (POTISATITYUENYONG et
al., 2008).
15
.
Figura 6: Representação esquemática do sensor de tempo e temperatura cromática com base na
vesícula PDA e polímeros anfifílicos (GOU et al., 2010).
Entretanto, a maioria dessas pesquisas, concentra-se principalmente na
resposta colorimétrica à temperatura. A investigação envolvendo o efeito das
modificações estruturais na resposta colorimétrica a outros estímulos, como pH,
íons, solventes e outros produtos químicos recebe pouca atenção.
O pH afeta a formação das ligações de H presentes na parte hidrofílica
do PDA e as estruturas auto-organizadas das moléculas anfifílicas de PDA são
estabilizadas por ligações de H. Desta forma, as condições de pH do sistema
são fundamentais (WU et al., 2009). A influência do pH no cromismo de filmes e
vesículas de PDA é importante para a aplicação dos mesmos como sensores
para diversos sistemas.
A estabilidade de vesículas de PDA funcionalizadas com aminoácidos foi
avaliada por Cheng (2008). Observou-se que à medida que o pH foi aumentado
em razão da adição de NaOH, ocorreu transição colorimétrica imediata de azul
para vermelho.
O estudo da influência de solventes sobre o cromismo de soluções de
PDA permite entender como diferentes moléculas interagem com este polímero.
O comportamento solvatocrômico de polímeros conjugados tem sido
16
intensamente estudado. Em determinados solventes, a planarização das cadeias
e as concomitantes interações entre cadeias ππ − geram um aumento do
comprimento de conjugação (Hoeben et al., 2005).
Vários estudos com diferentes solventes vêm sendo realizados como o de
Potisatityuenyong e colaboradores, que estudou o efeito de etanol na transição
de cor de vesículas de PDA. Em uma solução 45 - 50 % de etanol, as vesículas
aparentaram coloração roxa, sendo que com mais de 55 % do álcool houve
transição completa e irreversível para vermelho.
Em outro trabalho, feito por Dei e colegas (2008), estudou também o
solvatocromismo em suspensão de agregados de PDA. PDAs contendo
monômeros com diferentes comprimentos de cadeias foram utilizados. Em
clorofórmio, o PDA apresentou coloração amarela, entretanto, quando o
clorofórmio foi misturado com hexano houve transição colorimétrica. Pires e
colaboradores (2010a), também estudaram efeito de diferentes solventes
orgânicos como o CHCl3, CH2Cl e CCl4. Segundo a autora, não existe um
mecanismo único para a interação entre solventes orgânicos e moléculas de
PCDA. O processo de transição colorimétrica das vesículas de PCDA e de
PCDA incorporadas com colesterol e esfingomielina com a adição de CHCl3 foi
predominantemente entálpico, enquanto as transições espectrofotométricas
provocadas por CH2Cl, CCl4 foram processos entropicamente dirigidos.
È com base no solvatocronismo do polidiacetileno e na interferência do
pH e da temperatura no mesmo, o objetivo desse trabalho foi desenvolver
vesículas de PDA para identificação de THM em água potabilizada. È com base
no solvatocronismo do polidiacetileno e na interferência do pH e da temperatura
no mesmo, que foi realizado neste trabalho.
4. Delineamento experimental
As análises do experimento foram conduzidas em delineamento
inteiramente casualizado (DIC), com três repetições.
Os resultados de RC (resposta colorimétrica) foram submetidos à
análise de variância, em nível de 10 % de probabilidade (p<0,1).
17
5. Material e Métodos
A pesquisa foi desenvolvida nos Laboratórios de Higiene e Microbiologia
de Alimentos e de Embalagem do Departamento de Tecnologia de Alimentos da
Universidade Federal de Viçosa.
5.1. Coleta das amostras de água
Foram coletadas no período da manhã e por três dias diferentes do mês
de junho, amostras de água de quatro estações de tratamento (ETA/UFV, ETA1
SAAE/Viçosa, ETA 2/SAAE/Viçosa e ETA/COPASA), de 15 pontos de controle
nas redes de distribuição, e, ainda de amostras de cinco poços artesianos. No
momento da coleta, era medida a temperatura e cloro residual das amostras de
água. Depois as amostras eram mantidas sobre refrigeração até o momento das
análises.
5.2. Análises físico-químicas e microbiológicas de amostras de água
As seguintes análises físico-químicas e microbiológicas foram efetuadas,
conforme metodologias propostas pela APHA (American Public Health
Association) (GREENBERG et al.,1992):
a) alcalinidade total, expressa em mg·L-1 de CaCO3.
b) acidez, expressa em mg·L-1 de CO2.
c) cloretos, expressos em mg·L-1 de NaCl.
d) cloro residual livre, expresso em mg·L-1 de Cl2.
e) turbidez, expressa em UNT.
f) pH.
g) cor, expressa em uH.
h) mesófilos aeróbios, expressa em UFC·mL-1.
i) coliformes totais, expressos em NMP/100 mL.
j) Escherichia coli, em NMP/100 mL.
5.3. Técnica da bioluminescência para análise de água
18
Medida de ATP- bioluminescência está diretamente associada com a
presença de adenosina trifosfato (ATP), oriunda de micro-organismos ou de
matérias orgânicas.
As amostras de água coletadas nas ETAs e nos pontos de rede foram
analisadas também pela técnica de ATP- bioluminescência, usando-se kit Aquest
Total (BIOTRACE, 2000), para determinação do ATP total. Esta técnica consiste
em coletar aproximadamente 50 mL de uma amostra de água em béquer
esterilizado de onde será retirada uma alíquota com cerca de 0,1 mL com o
auxílio dos kits. O kit é introduzido na cubeta que contém o complexo enzimático
luciferina/luciferase, e por meio de agitação manual por aproximadamente 5 s,
promove-se a reação de formação de luz. Após agitação, a cubeta é inserida em
local apropriado no luminômetro, obtendo-se a leitura em 10 s, devidamente
impressa. O resultado é expresso em unidades relativas de luz (URL).
5.4. Identificação e quantificação de Triclorometano por GC-MS
O método de quantificação dos TCM se realizou por meio da
cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa (GC/MS), marca
Shimadzu com detector quadrupolo em coluna DB-5 ms (30 m x 0,25 mm x 0,25
µm), utilizando a técnica de microextração em fase sólida (SPME). Uma fibra
100 μm DVB/PDMS foi exposta ao espaço livre do vial contendo 10 mL de
amostra em forno a 80 ºC por 20 min e em seguida dessorvida a 250 ºC por 10
min no injetor. As condições empregadas no GC foram: injetor a 250 ºC; splitless
com splitter abrindo após 3 min; temperatura do forno de 40 ºC a 290 ºC a 4
ºC/min; fluxo de gás Hélio a 1 mL/min (16 psi); fonte de íons a 170 ºC, 29 a 400
m/z, modo SIM (CARLOS, 2011).
Para a determinação da curva de calibração do TCM, foi seguido o
procedimento: Padrões de TCM em diferentes concentrações, em 5 pontos na
faixa de 20 a 100 μg·L-1 foram preparados com água deionizada e o hedspace
injetado no GC-MS para identificação do tempo de retenção;
5.5. Preparo das vesículas
19
As vesículas de 10,12-ácido pentacoisadiinócio (PCDA) foram
preparadas puras e também com adição de diferentes fosfolipídios:
esfingomielina (ES), colesterol (CO) e 1,2- Dimiristoifosfatidilcolina (DMPC).
Vesículas de PCDA foram preparadas nas concentrações de 1 mM, 2
mM e 3 mM de PCDA em 10 mL de TCM. O solvente foi removido por meio de
fluxo de nitrogênio e 10 mL de água deionizada foram adicionados O volume foi
completado para 10 mL com água deionizada. As suspensões foram então,
levadas ao banho ultrassônico por 60 min, e, em seguida, filtradas em filtro
PVDF (Millipore®). Depois foram estocadas a 4 ºC por, no mínimo, 10 h, antes da
irradiação em luz ultravioleta (Prodicil 110 v, 254 nm) por 5 min (PIRES et al.,
2010b).
Para o preparo das vesículas de PCDA/CO.ES, a solução de 1 mM de
ES e de CO foi solubilizada em 10 mL de TCM, sendo o solvente removido por
fluxo de nitrogênio. Soluções de PCDA (1 mM, 2 mM e 3 mM) foram preparadas
em 2 mL de DMSO. As soluções foram aquecidas a 80 ºC durante 15 min e
então adicionadas ao filme lipídico formado por ES e CO. O volume foi
completado para 10 mL com água deionizada. As suspensões foram então,
levadas ao banho ultrassônico por 60 min, e, em seguida, filtradas em filtro de
0,45 µm PVDF (Millipore®). Depois foram estocadas a 4 ºC por, no mínimo, 10 h,
antes da irradiação em luz ultravioleta (Prodicil 110 v, 254 nm) por 5 min (PIRES
et al., 2010b).
Já para o preparo das vesículas de PCDA/DMPC, soluções de 1 mM,
2 mM e 3 mM de PCDA e 1mM de DMPC foram separadamente solubilizadas
em 10 mL de TCM, sendo o solvente removido por fluxo de nitrogênio. O volume
foi completado para 10 mL com água deionizada. As suspensões foram, em
seguida, filtradas em filtro PVDF (Millipore®). Depois foram estocadas a 4 ºC por,
no mínimo, 10 h, antes da irradiação em luz ultravioleta (Prodicil 110 v, 254 nm)
por 5 min (SU et al., 2005).
5.6. Tratamento das vesículas com ultrasson de ponta
A suspensão da vesícula preparada conforme item anterior, que obteve a
resposta colorimétrica e o tamanho menor, foi submetida ao desruptor de células
R2D091109, ao em vez do banho ultrassônico durante seu preparo. Para avaliar
20
também a influencia da potencia, foram usadas 5 diferentes potências: 100 w,
200 w, 300 w, 400 w e 500 w, por 18 min. Para avaliar esses efeitos na estrutura
da vesícula, foram feitas as medidas do diâmetro hidrodinâmico e a resposta
colorimétrica antes e após a adição de TCM até que ocorra a transição
colorimétrica.
5.7. Resposta Colorimétrica (RC)
Nos casos de mudança de cor, de azul para vermelho, calcula-se a RC,
como parâmetro semi-quantitativo da alteração das propriedades crônicas
segundo a equação 1:
RC = ((B0 – Bi) / B0) * 100 (1)
B= (Aazul / (A azul + Avermelho))
Em que: Aazul = absorvância a 640 nm e Avermelho = absorvância 540 nm; B0 e Bi
valores calculados antes e depois da mudança de cor, respectivamente (PIRES
et al., 2010b).
5.8. Quantificação da mudança de cor
Para avaliar a variação de cor da suspensão de vesículas, antes e após a
imersão em solução de TCM, foi utilizado o parâmetro (RC) conforme Okada et al.
(1998). A adição de TCM, foi realizada em 500 µL da suspensão vesicular, de 1
em 1 µL , até que ocorra a mudança de cor do azul para o vermelho. O cromismo
da suspensão foi avaliado pela resposta colorimétrica, por meio de espectro de
absorção UV-visível (Shimadzu UV-2550).
5.9. Medida do raio hidrodinânico das vesículas
O diâmetro das vesículas em suspensão foi medido por espalhamento
de luz dinâmico (Nanophox, Sympatec). O tamanho da vesícula foi determinado
21
em uma intensidade de laser de 50%. Foram pipetados 400 µL da vesícula e
diluídas água deionizada, completando o volume para 1000 µL. Cada tamanho
médio de partícula da suspensão foi determinado por experimentos que
consistiram de três medidas simples com um tempo de medição de 300 s.
5.10. Avaliação da transição colorimétrica das vesículas na presença de
TCM
A partir de solução estoque, foram preparadas soluções com 100 µg·L-1,
1000 µg·L-1 e 10000 µg·L-1 de TCM em água deionizada.
Para a avaliação da transição colorimétrica das vesículas na presença
de TCM, foram feitos algumas modificações nas condições da vesícula para
verificar a influência de alguns fatores na RC. Os fatores escolhidos foram pH,
temperatura e concentração da suspensão vesicular. Foi feito então um
delineamento estatístico fatorial, para determinar quais tratamentos seriam
avaliados, conforme a Tabela 2 abaixo.
Para cada tratamento, 500 µL das soluções contendo TCM foram
adicionados a 2 mL de suspensão de vesículas. Depois foram submetidos as
temperatura de 20 oC, 30 oC e 40 oC durante 10 min.
Tabela 2 – Tratamentos aplicados às vesículas de PCDA mais colesterol e
esfingomielina.
Tratamento pH T (°C) Concentração (%)
1 5,00 20 20
2 7,00 20 20
3 5,00 40 20
4 7,00 40 20
22
Após, foi realizado pelo parâmetro de resposta colorimétrica (RC)
conforme Okada et al. (1998).
Para todos os tratamentos testados acima, foram feitas soluções de
vesículas de controle com adição de 500 µL de água deionizada, para avaliar se
houve influência desses parâmetros na vesícula na identificação do TCM.
6. Resultados e Discussão
6.1. Ocorrência de TCM e a qualidade de água das ETAs e dos pontos de
coleta de amostras nas redes de distribuição
Nessa pesquisa, optou-se pela determinação apenas do TCM
considerando que de acordo com a literatura é o THM que se apresenta em
maiores concentrações, constituindo-se cerca de 80 % dos trihalometanos totais
(TTHM).
Para determinação das concentrações de TCM, foi aplicada a equação
2, obtida por meio da realização da curva analítica.
y= 843,5x + 1435 (2)
Em que y é a área do pico de TCM no cromatograma e x a concentração
de TCM.
5 5,00 20 100
6 7,00 20 100
7 5,00 40 100
8 7,00 40 100
9 6,00 30 40
10 6,00 30 40
11 6,00 30 40
12 6,00 30 40
23
Figura 7 - Equação área versus concentração (µg·L-1) para a determinação de TCM na água.
Figura 8 – Cromatograma da resposta do detector versus tempo de retenção (min) para
obtenção da curva analítica do TCM. - Concentração de 20 µg·L-1 - Concentração de 40 µg·L-1 -
Concentração de 60 µg·L-1 - Concentração de 80 µg·L-1 - Concentração de 100 µg·L-1.
As concentrações de TCM variaram de 0 (zero) µg·L-1 a 133,6 µg·L-1
dependendo do ponto de coleta na rede de distribuição (Tabela 3). A Portaria
518, do Ministério da Saúde, de 25 de março de 2004, que legisla sobre os
padrões de potabilidade de água no Brasil, indica um valor máximo permitido
(VMP) de 100 µg·L-1 de TTHM. A OMS propõe um máximo de 200 µg·L-1 TCM
nas águas potáveis. No entanto, deve-se ressaltar que diversos países adotam
limites diferentes para máximos de TTHM. No Canadá, a legislação propõe 350
µg·L-1, na Holanda adota-se o valor de 75 µg·L-1, na Alemanha 25 µg·L-1 e na
França, 10 µg·L-1 (BRAGA, et al., 2004).
Tempo (min)
Res
pos
ta d
o d
ete
ctor
Concentração µg·L-1
Áre
a
24
Tabela 3 - Concentrações de TCM em amostras de água potabilizada coletadas
em ETAs, poços e pontos de controle de rede de distribuição.
AMOSTRA MÉDIA (µg·L-1) DP (±) AMOSTRA MÉDIA (µg·L-1) DP (±)
ETA1/ SAAE 0,5 0,4 P 11 11,7 15,7
ETA2/SAAE 1,0 0,4 P12 29,4 23,0
ETA/UFV 5,1 4,1 P 13 16,6 13,4
ETA/COPASA 3,9 2,1 P14 27,4 43,5
P1 3,3 1,1 P15 52,9 70,6
P2 3,3 1,2 P16 -- --
P3 2,1 2,5 P17 10,1 9,7
P4 07 1,3 P18 25,3 22,0
P5 0,3 0,5 P19 31,3 14,5
P6 1,3 1,1 PA1 5,2 5,1
P7 1,2 1,1 PA2 8,2 4,9
P8 2,4 1,5 PA3 4,7 1,6
P9 22,2 32,1 PA4 1,8 0,2
P10 45,8 49,1 PA5 2,2 0,1
P1 a P8 - Amostras coletadas em pontos de rede de distribuição da ETA/SAAE/Viçosa.
P9 a P15 - Amostras coletadas em pontos de rede de distribuição da ETA/UFV.
P16 a P19 - Amostras coletadas em pontos de rede de distribuição de ETA/ COPASA.
PA1 a PA5 - Poços artesianos profundos.
-- não identificado.
Verifica-se, portanto, pela Tabela 3, que das 28 amostras avaliadas em
três repetições, duas delas, correspondendo a pouco mais de 2 %, encontram-se
acima do VMP indicado pela Portaria 518/MS e nenhuma atingiu à
recomendação do valor máximo aceito pela OMS.
Pela Tabela 3, constata-se que as amostras coletadas nas ETAs
continham baixas concentrações de TCM, com valores entre 0,1 µg·L-1 e 6,0
µg·L-1. A formação de THM é dependente da presença dos ácidos húmicos e
fúlvicos, como precursores, e de compostos clorados, particularmente dos
inorgânicos. Nas quatro estações avaliadas, o procedimento de desinfecção é
25
realizado com o cloro na forma gasosa, portanto um processo que favorece a
formação de THM. Por isso, uma maneira eficiente de se evitar a formação
desses compostos indesejáveis é aplicar um controle rígido nos padrões de
turbidez. A turbidez é causada pela presença de material em suspensão, dentre
eles plânctons e bactérias, que ao se decomporem formam os precursores
mencionados. Esse parâmetro deve ser inferior 5 UNT, determinada no
neferômetro, de acordo com a Portaria 518/MS. No entanto, sabe-se que quanto
menor for os valores de turbidez menores serão as concentrações de
precursores.
Os valores de turbidez para todas as amostras avaliadas encontravam-
se abaixo de 0,5 UNT, ou seja, 10 vezes menores do VMP (Tabela 4). Também,
os valores para o parâmetro cor da água nas amostras estiveram sempre abaixo
do VMP que é de 15 uH (Unidade Hazen - PtCo/L) (Tabela 4).
A cor é resultante da decomposição de matéria orgânica e, também,
pela presença de íons metálicos, como ferro e manganês, e também plânctons e
resíduos industriais. Portanto, podem originar a presença dos precursores
mencionados.
Tabela 4 – Qualidade de água de ETAs e de pontos de rede de distribuição.
Amostra Turbidez
(UT)
Cor (uH)
pH
Cloro Residual Livre (mg·L-1 Cl2)
ETA/SAAE1 0,46 ± 0,20 3 ± 2 6,98 ± 0,03 0,48 ± 0,03 ETA/SAAE2 0,85 ± 0,20 7 ± 1 7,76 ± 0,01 0,45 ± 0,01 ETA/ UFV 0,25 ± 0,08 nd 6,37 ± 0,05 0,47 ± 0,05
P1 0,37 ± 0,38 7 ± 2 7,64 ± 0,04 0,43 ± 0,04 P2 0,31 ± 0,04 7 ± 2 7,61 ± 0,07 0,36 ± 0,07 P3 0,38 ± 0,07 6 ± 1 7,49 ± 0,06 0,43 ± 0,06 P4 0,52 ± 0,06 6 ± 1 7,48 ± 0,09 0,42 ± 0,09 P5 0,24 ± 0,11 5 ± 1 7,43 ± 0,01 0,46 ± 0,01
26
P6 0,35 ± 0,01 7 ± 2 7,32 ± 0,07 0,40 ± 0,07 P7 0,31 ± 0,08 7 ± 1 7,40 ± 0,09 0,41 ± 0,09 P8 0,46 ± 0,05 8 ± 2 7,22 ± 0,01 0,43 ± 0,03 P9 0,40 ± 0,09 nd 6,14 ± 0,13 0,48 ± 0,01
P10 0,17 ± 0,01 nd 6,17 ± 0,03 0,38 ± 0,03 P 11 0,57 ± 0,01 nd 6,17 ± 0,01 0,37 ± 0,02 P12 0,24 ± 0,02 nd 6,10 ± 0,06 0,52 ± 0,01 P 13 0,32 ± 0,05 nd 6,10 ± 0,07 0,51 ± 0,02 P14 0,27 ± 0,01 nd 6,08 ± 0,10 0,48 ± 0,02 P15 0,37 ± 0,01 nd 6,06 ± 0,06 0,35 ± 0,01
nd- Não Determinado. P1 a P8: Amostras coletadas em pontos de rede de distribuição da ETA/SAAE/Viçosa. P9 a P16: Amostras coletadas em pontos de rede de distribuição da ETA/UFV.
Assim, o controle desses dois parâmetros na água das ETAs parece ter
sido fundamental para que as concentrações de TCM fossem baixas, como as
determinadas nessa pesquisa. Para isso, é necessário que as etapas do
tratamento convencional da água, que incluem a sedimentação simples, a
floculação com agentes coagulantes, a decantação, a filtração estejam atuando
no sentido de produzir uma água com baixos valores de turbidez e de cor
(ANDRADE, 2008). Essas etapas mencionadas se completam com o processo de
desinfecção da água filtrada, normalmente usando-se compostos clorados.
Nessas estações, o tratamento convencional da água iniciou-se com a
etapa de sedimentação simples nas fontes de captação, ou seja, na lagoa usada
para obtenção da água para a ETA1/SAAE e a ETA/UFV, e no córrego onde foi
captada a água para ETA2/SAAE, e no poço artesiano para ETA/COPASA. Nessa
etapa, ocorreu uma diminuição da turbidez e da cor pela deposição das partículas
maiores e ação da radiação UV sobre os micro-organismos.
Na sequência, a água recebeu tratamento com sulfato de alumínio [Al2
(SO4)3.18H2O] ou policloreto de alumínio [Aln(OH)m Cl 3(n-m)] que associado à
alcalinidade (OH-) presente na água formou o hidróxido de alumínio [(Al(OH)3] que
apresenta carga elétrica positiva e durante a etapa de floculação reagiu com a
partículas menores responsáveis pela turbidez e cor que apresentam carga
elétrica negativa. Assim, há uma atração eletrostática entre o hidróxido de
alumínio e as partículas mencionadas, havendo um aumento do peso específico e
do diâmetro das partículas. Portanto, de acordo com a Lei de Stokes (Equação 3)
que trata da velocidade de sedimentação das partículas que demorariam dias ou
meses para se decantaram em razão de vários fatores.
27
(3)
Sendo V a velocidade final de sedimentação, o peso específico de
partícula, o peso específico da água, µ a viscosidade do líquido, g a
aceleração da gravidade, r o raio da partícula.
Deve-se ressaltar que as ETAs conseguiram manter a concentração de
0,2 mg·L-1 cloro residual livre, sendo esse valor mínimo exigido pela legislação, o
que é fundamental para garantir a qualidade microbiológica da água. Por outro
lado esse cloro residual pode reagir com a matéria orgânica e formar o TCM. Para
melhoria da eficiência da cloração, é recomendável que a turbidez da água após a
filtração seja, no máximo, de 0,5 UNT e o pH, no máximo, 8,00 (BRASIL, 2004).
Este fato deve-se ao conhecimento de que a forma não dissociada do cloro
(HClO) é a que tem ação antimicrobiana e sua concentração, por ser um ácido
fraco (Ka= 3,18x10-8, a 25 oC), é regida pela equação de Henderson-Hasselbalch
(Equação 4), usada para quantificar a concentração de ácido hipocloroso (Tabela
5).
(4)
Tabela 5 - Concentrações de ácido hipocloroso (HClO) nas água das ETAs e nos
pontos de coletas nas redes de distribuição.
Amostra µg·L-1
(Média) Amostra
µg·L-1
(Média) ETA/ SAAE1 0,36 P7 0,23
ETA/SAAE 2 0,16 P8 0,28
ETA/UFV 0,44 P9 0,46
P1 0,18 P10 0,36
P2 0,16 P 11 0,36
P3 0,22 P12 0,50
P4 0,22 P 13 0,50
28
P5 0,22 P14 0,50
P6 0,28 P15 0,34
P1 a P8: Amostras coletadas em pontos de rede de distribuição da ETA/SAAE/Viçosa. P9 a P15 - Amostras coletadas em pontos de rede de distribuição da ETA/UFV.
Os valores encontrados nessa pesquisa são compatíveis com outros
trabalhos em que se determinaram as concentrações TCM ou TTHM em
amostras de água de outras regiões (SOUZA, 2009; VIANA et al., 2009;
MARMO, 2005, BRAGA et al., 2004; TROLI et al., 2002 ). Braga e colaboradores
(2004) avaliando a concentração de TTHM em vários pontos de rede distribuição
na cidade de Fortaleza/Ceará determinaram valores numa faixa de 39 µg·L-1 e 79
µg·L-1 de TCM, com médias de 66, 79 ± 29,22 µg·L-1, 59,31 ± 10,99 µg·L-1 e
63,46 ± 8,69 µg·L-1, para cada ponto de rede. Souza (2009) avaliou amostras de
água de uma indústria em que a água bruta recebeu tratamento de pré-cloração
com 5 mg·L-1 de CRL, encontrando concentrações de 10 µg·L-1 de TTHM.
Também encontrou, nas amostras de água após o tratamento convencional na
ETA contendo 2 mg·L-1 de CRL apresentou 120 µg·L-1. Já as amostras de águas
coletadas no banheiro do setor administrativo e no refeitório da indústria, ambas
contendo 1,0 mg·L-1 de CRL apresentaram as concentrações de 80 µg·L-1 e 70
µg·L-1 de TTHM, respectivamente. A diminuição da concentração de cloro nos
pontos avaliados reduziu muito as concentrações de TTHM. Quando a água
bruta foi clorada com 2 mg·L-1 de CRL, a água tratada, a água do banheiro do
setor administrativo e água refeitório continham 0,2 mg·L-1, de CRL, as
concentrações de TTHM foram reduzidas para 1,0 µg·L-1, 10 µg·L-1, 0,7 µg·L-1,
0,6 µg·L-1, respectivamente.
Troli e colaboradores (2004) avaliaram o efeito do tipo de composto
clorado adicionado á água de uma ETA em Corumbá/Mato Grosso, que utilizava
o Rio Paraguai como manancial. As amostras de água foram coletadas na
Estação de Tratamento de Água cuja turbidez inicial era de 11,0 UNT. Foram
aplicados à água 2 mg·L-1 de CRL, obtidos a partir de produtos comerciais com
Cl2, hipoclorito de sódio, hipoclorito de cálcio e dicloroisocianurato de sódio. Os
valores das concentrações de TCM independente do tipo de agente desinfetante
variaram de 13,93 a 43,46 µg·L-1, atendendo, portanto à legislação. No entanto,
as maiores concentrações de TCM foram encontradas quando a desinfecção da
água foi realizada com os hipocloritos. Os autores concluem que apesar do
29
conteúdo de matéria orgânica nas amostras após tratamento convencional, os
valores obtidos de THM estão dentro dos limites propostos pela Portaria 518/MS.
Andreola e colaboradores (2005) avaliaram a influência da época do ano
- seca ou chuvosa - na formação de TTHM. Amostras coletadas em um
reservatório do sistema de tratamento após 8h e 30 min do contato com o cloro
continha 5,0 µg·L-1 de TTHM na época de seca e 57,7 µg·L-1, no período de
chuva. No período seco, a amostra de água do manancial apresentou uma
turbidez de 19,0 UNT e no período chuvoso atingiu 850 UNT.
A concentração de TCM na rede de distribuição de água da ETA/UFV foi
avaliada em duas pesquisas. Numa delas, a média de TCM determinada foi de
4,4 µg·L-1 (CARLOS et al., 2011) e na outra houve uma variação de 10,2 ± 2,0
µg·L-1 e 21,22 ± 2,81 µg·L-1 de TCM (LELES, 2005) .
Os valores da concentração TCM na rede de distribuição das ETAs (P1
a P8) encontravam-se entre 0 (zero) a 4,8 µg·L-1, com uma média de 1,6 ± 1,5
µg·L-1 mostrando um ligeiro aumento com relação às ETAs (Tabela 6). Por
outro lado, a concentração de CRL nesses pontos de coleta (P1 a P8)
mantiveram-se numa faixa de 0,32 a 0,52 mg·L-1 de CRL. É provável que a
presença de matéria orgânica nas tubulações, ou nos reservatórios dos pontos
de coleta tenha contribuído para pequeno aumento na concentração de TCM.
Tabela 6 - Médias e desvios-padrão da concentração de TCM nas ETAs, redes
de distribuição e dos poços artesianos.
Amostra TCM (µg·L-1)
ETA1/SAAE
Pontos de Rede de Distribuição
0,5 ± 0,4
1,6 ± 1,5
ETA2/SAAE 0,7 ± 0,7
ETA/UFV
Pontos de Rede de Distribuição
5,1 ± 4,1
29,4 ± 36,5
ETA/COPASA
Pontos de Rede de Distribuição
3,9 ± 2,1
16,7 ± 17,6
Poços artesianos 3,9 ± 4,1
30
Nos pontos de coleta de amostras das redes de distribuição da ETA/UFV
e da ETA/COPASA, as concentrações de TCM foram consideravelmente mais
elevadas, com medias de 29,4 ± 36,5 µg·L-1 e 16,7 ± 17,6 µg·L-1,
respectivamente. Observando-se os resultados das análises físico-químicas
verifica-se que não há alterações que possam justificar o aumento nas
concentrações de TCM. A provável explicação pode estar nas condições da rede
de distribuição e nos reservatórios de água. À distância percorrida pela água a
partir da ETA/UFV e da ETA/COPASA é menor do que da ETA/SAAE. No
entanto, não parece ser à distância o principal fator na formação de TCM, sendo
o mais provável é que as tubulações e os reservatórios nesses sistemas de
distribuição tenham mais matéria orgânica para reagir com o cloro. Por outro
lado, a concentração de CRL variou entre 0,31 e 0,51 mg·L-1. Como em todos os
pontos de coletas das amostras ainda havia a presença de cloro, em
concentrações acima do mínimo exigido pela legislação, que é de 0,2 mg·L-1, e a
possível presença de precursores, a reação de formação de TCM poderia
ocorrer aumentando sua concentração.
Resultados de análises complementares nas amostras de água usadas
na avaliação de TCM encontram-se na Tabela 7. Os resultados das análises
físico-químicas de acidez, alcalinidade e cloretos encontraram-se dentro dos
padrões exigidos pela Portaria 518/MS. Para todas as amostras, as contagens
de bactérias heterotróficas foram <1,0x100 UFC·mL-1 e as de coliformes a 35 oC
e Escherichia coli apresentaram ausência em 100 mL, portanto dentro dos
padrões exigidos pela legislação. Esses resultados não apresentaram alterações
e, ou valores que pudessem justificar os resultados encontrados para as
concentrações de TCM, no entanto, auxiliaram na avaliação da qualidade da
água e interpretação dos resultados.
Tabela 7 – Análises complementares da qualidade de água de ETAs e de pontos
de rede de distribuição.
Amostra
Acidez (mg·L-1 CO2)
Alcalinidade (mg·L-1 CaCO3)
Cloretos (mg·L-1 de NaCl)
ETA/SAAE 4,0 ± 0,3 32,0 ± 1,0 27,2 ± 1,0
31
ETA/SAAE2 3,7 ± 0,1 29,9 ± 1,3 27,8 ± 2,3
ETA/UFV 0,0 ± 0 26,2 ± 2,3 33,8 ± 1,5
P1 4,2 ± 0,6 41,6 ± 1,8 38,0 ± 1,3
P2 4,8 ± 1,0 22,3 ± 2,3 35,0 ± 2,0
P3 4,0 ± 1,1 30,3 ± 5,2 36,5 ± 2,0
P4 3,8 ± 0,7 22,4 ± 2,3 27,0 ± 1,3
P5 3,7 ± 0,1 20,4 ± 1,7 28,6 ± 2,5
P6 3,5 ± 1,5 20,0 ± 1,2 27,0 ± 2,7
P7 4,0 ± 0,3 20,8 ± 0,9 29,4 ± 2,3
P8 11,7 ± 1,6 18,8 ± 4,1 29,0 ± 5,1
P9 6,9 ± 1,0 26,2 ± 1,5 38,4 ± 4,5
P10 4,2 ±2,1 24,2 ± 2,2 37,3 ± 1,5
P 11 3,9 ± 0,1 25,9 ± 0,1 25,2 ± 1,7
P12 6,6 ± 1,0 22,4 ± 3,0 25,6 ± 1,6
P 13 10,30±1,2 21,2 ± 4,1 31,3 ± 0,2
P14 7,69 ± 0,1 24,1 ± 3,0 23,7 ± 1,4
P15 8,80±1,0 26,6 ± 0,7 22,5 ± 1,4
P1 a P8: Amostras coletadas em pontos de rede de distribuição da ETA/SAAE/Viçosa.
P9 a P16: Amostras coletadas em pontos de rede de distribuição da ETA/UFV.
Também nas amostras de água, foram realizadas medidas de ATP-
bioluminescência, que estão diretamente associados com a presença de
adenosina trifosfato (ATP), oriundos de micro-organismos ou de matérias
orgânicas específicas, como extrato celular de vegetais, células somáticas e
sangue. Como a presença dessas substâncias é muito pouco provável nas águas
das ETAs e também nas águas das redes de distribuição, a técnica foi usada para
avaliar a presença de micro-organismos como as bactérias heterotróficas ou
coliformes a 35 °C ou Escherichia coli.
Essa técnica tem sido usada para avaliar com sucesso a qualidade
microbiológica de água (KRIEGEL AND RIGATA, 2010; CAPRITA et al., 2009;
COSTA et al., 2004; DELAHAYE et al., 2004; LEE et al., 2004), leite e derivados
(HUANG et al., 2008), produtos minimamente processados, como o melão
(UKUKU, SAPERS and FETT, 2005) , superfícies de processamento de
alimentos (COSTA et al., 2006 ) ar de ambientes ( LEE et al., 2008).
32
Pelas medidas de ATP-bioluminescência (Tabela 8), pode-se concluir que
havia ausência ou a baixa concentração de ATP nas amostras de água. Foi
determinado o valor médio de 20,5 ± 13,4 URL considerando-se todas as
amostras.
Esses valores estão abaixo dos valores de 150 URL recomendados pelo
fabricante do equipamento, que indica condições higiênicas satisfatórias para
superfícies de processamento de alimentos, em uma área de 100 cm2, usando-se
o swab para remoção do ATP das superfícies (BIOTRACE, 2000). No entanto,
esses valores de recomendação devem ser definidos para cada situação
específica. Por exemplo, para água não há um valor de referência. No entanto
esses valores são compatíveis com os resultados obtidos para as avaliações
microbiológicas: <1,0x100 UFC·mL-1 de bactérias heterotróficas e ausência de
coliformes a 35 oC /100 mL e consequentemente ausência de E. coli por 100 mL.
Tabela 8 – Medidas de ATP-bioluminescência para amostras de água das
ETAs (UFV, SAAE1 e 2) e de pontos de coletas de amostras na rede de
distribuição.
Amostras Média (URL) ± DP
ETA/UFV 8,3 ± 1,5
ETA1/SAAE 27,3 ± 29,1
ETA2/SAAE 30,3 ± 29,1
P1 51,6 ± 50,6
P2 39,3 ± 30,0
P3 24,6 ± 4,6
P4 21,0 ± 5,1
P5 16,6 ± 1,5
33
P1 a P8: Amostras coletadas em pontos de rede de distribuição da ETA/SAAE/Viçosa.
P9 a P15 - Amostras coletadas em pontos de rede de distribuição da ETA/UFV.
6.2. Seleção da suspensão de vesículas
6.2.1. Resposta Colorimétrica (RC)
Observa-se pela Tabela 9, que a adição de TCM promoveu a transição
colorimétrica para diferentes composições na produção das suspensões de
vesículas, tanto das de PCDA quanto daquelas contendo CO.ES e DMPC. No
entanto, a maior RC foi obtida pela suspensão preparada com 1 mM de PCDA +
1 mM de CO.ES com adição de 25 µL de TCM, que corresponde a menor
quantidade adicionada do solvente, em relação a quantidade de TCM adicionada
nas outras vesículas até a mudança de cor do azul para o vermelho (Figura 16).
Fica claro na tabela 9, que apesar de todas as vesículas possuírem
PCDA e serem adicionadas de TCM, a presença de DMPC ou CO e ES na
estrutura modifica a sensibilidade ao composto clorado e possivelmente o
mecanismo de transição de cor.
TABELA 9 – Resposta Colorimétrica (RC) dos diferentes tipos de vesículas após
a adição de TCM.
P6 13,6 ± 3,2
P7 16,3 ± 2,0
P8 15,3 ± 4,61
P9 21,3 ± 8,5
P10 11,3 ± 3,2
P 11 11,6 ± 0,5
P12 21,6 ± 5,0
P 13 8,3 ± 3,2
P14 16,3 ± 8,7
P15 14,6 ± 4,2
Total 20,5 ± 13,4
34
Amostra
(concentração em mm)
TCM
(µl)
Média ± DP
1 PCDA 30 15 ± 1,5
2 PCDA 28 11 ± 1,5
3 PCDA 30 14 ± 2,0
1 PCDA +1 DMPC 25 11 ± 12
2 PCDA + 1 DMPC 28 11 ± 2,1
3 PCDA + 1 DMPC 28 9 ± 7,5
1 PCDA + 1 CO.ES 25 21 ± 6,0
2 PCDA + 1 CO.ES 25 15 ± 6,6
3 PCDA + 1 CO.ES 28 18 ± 9,4
RC: resposta colorimétrica; PCDA - 10,12-ácido pentacoisadiinócio polidiacetileno;
DMPC - Dimiristoifosfatidilcolina; CO.ES - colesterol e esfingomielina.
Figura 16 - Absorbância da suspensão de vesículas de 1 mM de PCDA + 1 mM de CO.ES com
aumento da adição de 5 µL variando de 0 µL a 25 µL. A linha verde corresponde à adição de 25
µL.
A RC expressa à quantidade de moléculas de PCDA, em porcentagem,
em que ocorreu a transição da cor de azul para vermelha, neste caso, usando-se
35
o TCM como solvente indutor. À medida que o solvente foi adicionado, ocorreu à
redução do pico referente à cor azul e o aumento do pico referente à cor
vermelha (Figura 17).
Figura 17- Absorbância da suspensão de vesículas de 1 mM de PCDA + 1 mM de CO.ES antes
(linha azul) e após adição de triclorometano (linha verde).
Em média as suspensões de vesículas de PCDA, PCDA/DMPC e
PCDA/CO.ES possuem coloração azul com bandas de absorção máxima de 640
± 2,0 nm e na coloração vermelha apresentam bandas eletrônicas de 540 ± 2,0
nm, em sua varredura. Isso mostra que a adição das moléculas de lipídios
incorporadas no PCDA não impediu a etapa de polimerização. O PCDA é
responsável pela coloração azul da suspensão de vesícula. Segundo Rozner e
colaboradores (2008), os fosfolipídios formam microdomínios dentro da estrutura
do PCDA e, por isso não afetam a polimerização e a formação da cor azul.
A RC depende muito do tipo de solvente e da interação que ocorre entre
eles e as moléculas da vesícula. Pires e colaboradores (2010b) testaram a
transição colorimétrica em vesículas de PCDA causada por diferentes solventes
orgânicos, dentre eles o TCM, que foi o que provocou a maior conversão de
moléculas PCDA na forma azul para forma vermelha.
Dessa forma, pode-se dizer que a presença do colesterol e da
esfingomielina promove interações com as moléculas do TCM, que alteram a
transição colorimétrica do azul para o vermelho, com uma menor quantidade de
moléculas de TCM.
6.2.2. Diâmetro das vesículas em suspensão
A adição dos fosfolipídios aumentou o diâmetro das vesículas (Tabela
10), o que indica, portanto, que a incorporação das moléculas na estrutura do
PCDA influenciou no tamanho do raio hidrodinâmico. A suspensão de vesículas
compostas de 1 mM de PCDA + 1 mM CO.ES foi a que apresentou menor
diâmetro, em média 312,82 ± 1,88 nm.
Observou-se também que as vesículas contendo DMPC obtiveram
médias de diâmetro maiores que as contendo CO.ES. Provavelmente, as
36
interações ocorridas entre CO.ES e PCDA foram maiores que as ocorridas entre
DMPC e PCDA, promovendo um tamanho menor das vesículas. E também as
cadeias de PCDA contendo ES são mais saturadas do que as cadeias contendo
DMPC, elas são capazes de formar mais facilmente ligações de Hidrogênio,
promovendo uma interação maior entre suas cadeias, diminuindo o seu
diâmetro.
Tabela 10 – Diâmetro, em nm, das vesículas de PCDA adicionadas de CO, ES e
DMPC.
Amostra
(mM)
Média ± DP
(nm)
1 PCDA 123,32 ± 2,39
2 PCDA 162,08 ± 1,62
3 PCDA 144,19 ± 1,77
1 PCDA +1 DMPC 757,10 ± 8,46
2 PCDA + 1 DMPC 729,34 ± 10,74
2 PCDA + 1 DMPC 839,72 ± 12,62
1 PCDA + 1 CO.ES 312,82 ± 1,88
2 PCDA + 1 CO.ES 729,34 ± 5,44
3 PCDA + 1 CO.ES 663,40 ± 2,94
PCDA - 10,12-ácido pentacoisadiinócio polidiacetileno;
DMPC Dimiristoifosfatidilcolina;
CO.ES - colesterol e esfingomielina.
As vesículas de PCDA apresentaram variação em seu tamanho de
acordo com a quantidade de PCDA (1 mM, 2 mM e 3 mM), numa faixa de 123,32
nn a 162,08 nm. Okada e colaboradores (1998) encontraram pelo espalhamento
de luz dinâmico, valores de diâmetros de 50 a 350 nm para vesículas de PCDA.
37
Em razão dos resultados da RC e do tamanho das suspensões de
vesículas, aquelas preparadas com 1 mM de PCDA + 1 mM CO.ES foram as
selecionadas para as análises posteriores, com o objetivo de definir condições
para que essas vesículas sejam indicativas da presença de TCM em água
tratada.
6.2.3. Influência das ondas ultrassônicas no diâmetro das vesículas
Nessa etapa da pesquisa, foi efetuada uma modificação na produção das
suspensões das vesículas. Na fase anterior, elas eram preparadas em banho
ultrassônico, onde a onda produzida na água vai atuar nas vesículas que se
encontram dentro de um frasco. Agora, as ondas ultrassônicas foram aplicadas
diretamente nas vesículas, buscando-se melhores RC.
Constata-se pela Tabela 11, que a suspensão de vesículas com 1 mM de
PCDA/CO.ES aumentou seus valores de RC, para todas as potências aplicadas
de 100 w a 500 w quando comparadas com a técnica do banho ultrassônico. As
médias das porcentagens das RC variaram entre 31,5 ± 0,7 % e 39,5 ± 10,8 %,
quando o ultra-som foi aplicado diretamente na vesícula, enquanto essa variação
foi de 21,0 ± 6,0 %, para o uso do banho ultrassônico.
Tabela 11 – Resposta Colorimétrica (RC) das vesículas preparadas com 1 mM de PCDA/CO.ES submetidas a diferentes potências no ultrasson de ponta.
Amostra TCM (µL) RC (%) Média ± DP
100 w 35 33,0 ± 1,4
200 w 35 39,5 ± 10,8
300 w 30 31,5 ± 2,1
400 w 25 34,0 ± 4,2
500 w 30 31,5 ± 0,7
RC: resposta colorimétrica.
No entanto, a vesícula selecionada submetida a 400 w de potência mudou
a transição colorimétrica de azul para vermelho, com a menor quantidade de
TCM (25 µL) sendo sua RC média de 34 ± 4,2 % (Figura 18).
38
As suspensões de vesículas preparadas com a aplicação de diferentes
potências foram armazenadas por um período de 30 dias à temperatura de
refrigeração (± 7 °C) e avaliadas quanto a alterações nos seus diâmetros (Tabela
12). Constatou-se um aumento do diâmetro das vesículas submetidas a todas as
potências, com variações entre 398,99 nm (100 w, 1 dia) a 2209,95 nm (200 w,
30 dias). Novamente, a menor variação no tamanho da vesícula ocorreu para o
tratamento com 200 w, só que ela já começou com um diâmetro muito grande.
Então optamos pela a de 400 W, que teve o também uma pequena variação,
sendo que ela foram de 350,08 nm, para 1 dia de armazenamento, para 465,02
nm com 15 dias e 525,88 nm para 30 dias. Essa baixa variação pode está
relacionada com a estabilidade da vesícula durante o tempo de armazenamento.
Pires e colaboradores (2010a) e Potisatityuenyong e colaboradores
(2008) afirmam que o controle do tamanho das vesículas é importante para
assegurar a repetibilidade dos resultados, garantindo sua estabilidade por um
determinado tempo. Neste caso o tempo estudado foi de 30 dias, armazenado a
4 °C, e outro fator importante é o tamanho, quanto menor o tamanho menor é a
RC, o que significa uma maior uma maior superfície de contado e um numero
maior de moléculas disponível para interagir com TCM e mudar de cor.
Tabela 12 – Diâmetro (nm) das vesículas preparadas com 1 mM de
PCDA/CO.ES e submetidas a diferentes potências no desruptor de células por
18 min.
Figura 18 - Absorbância da suspensão de vesículas de 1 mM de PCDA + 1 mM de CO.ES
antes (linha vermelha) e após (linha azul) adição de triclorometano submetida a 400 w de
potência.
39
Amostra 1 dia
(nm)
15 dias
(nm)
30 dias
(nm)
100 w 398,99 ± 12,32 574,93 ± 24,09 1056,85 ± 156,43
200 w 1708,45 ± 121,2 2036,49 ± 143,15 2209,95 ± 62,22
300 w 792,7 ± 34,08 1514,60 ± 235,78 2072,04 ± 337,11
400 w 350,08 ± 26,65 465,02 ± 57,01 525,88 ± 71,23
500 w 425,15 ± 43,22 530,98 ± 32,53 741,13 ± 21,50
Assim, fundamentado nos resultados anteriores, decidiu-se por usar as
seguintes condições no preparo das vesículas a serem usadas para avaliarem a
transição colorimétrica das vesículas em razão do pH, temperatura e
concentração de TCM:
a) Composição: 1 mM de PCDA + 1mM de CO.ES.
b) Potência aplicada diretamente na vesícula: 400 w por 18 min.
6.2.4. Avaliação da transição colorimétrica das vesículas em razão do pH,
temperatura e concentração de TCM
A análise de variância (Tabela 13) mostrou que a temperatura foi o fator,
que apresentou diferença significativa (p<0,1) nos valores de RC para os
diferentes tratamentos. No entanto, parece que a dificuldade em manter o pH
dentro dos valores (5,00, 6,00 e 7,00) indicados pelo delineamento experimental
pode ter afetado a análise dos dados. A perturbação de vesículas PDA por
aumento da temperatura promove a dinâmica de todos os segmentos, incluindo
a cauda alquila, cabeça polar e na cauda apolar. A transição de cores ocorre
quando o movimento térmico de todos os segmentos supera as interações (inter
e intra) em cadeia dentro do PDA das vesículas, resultando num rearranjo da
estrutura (CHAROENTHAI et al., 2011).
As lipossomas multi-funcionais têm sido estudados porque demonstram
alterações reversíveis na cor e na intensidade de fluorescência em resposta às
mudanças no pH. O espectro de absorção do PCDA, com adição de NaOH,
aumentou o pH na faixa de 4,00 a 8,80 provocando um aumento sistemático do
pico em 540 nm, ou seja, ocorre a mudança de cor de azul para vermelho. Nesta
40
fase, a abstração de prótons pelos íons hidroxilas OH- acrescentandos, provoca
um aumento sistemático das cargas negativas, resultando em um rearranjo
parcial da vesícula (CHAROENTHAI et al., 2011).
Tabela 13 – Resposta Colorimétrica (RC) das vesículas em razão do pH,
temperatura e diluição após a adição de amostras de água, contendo diferentes
concentrações de triclorometano.
% - porcentagem de vesícula em água deionizada.
Dentre os tratamentos testados, os que obtiveram a RC das amostras
com TCM maiores do que a amostra controle e que apresentou maior
porcentagem de RC foi o tratamento 7 (Figura19) .
Quanto maior a resposta colorimétrica, mais perceptível ao olho
humano é a mudança da cor azul para vermelha. Observa-se que ocorre no
espectro gradualmente uma mudança da região azul para a região vermelha
Tratamento pH T(°C) % 0 µg·L-1
RC (%)
100 µg·L-1
RC (%)
1000 µg·L-1
RC (%)
10000 µg·L-1
RC (%)
1 5,28 20 20 2,4 1,0 0,3 2,2
2 7,00 20 20 1,0 1,1 2,4 2,4
3 5,48 40 20 8,1 6,8 7,4 6,1
4 7,02 40 20 33,5 33,3 33,3 33,0
5 5,31 20 100 6,8 8,2 7,1 7,1
6 7,14 20 100 5,5 4,6 6,4 7,0
7 5,03 40 100 9,5 10,8 11,0 10,7
8 7,02 40 100 12,7 12,2 12,5 12,2
9 6,24 30 40 2,0 2,0 2,1 1,3
10 6,41 30 40 5,9 7,7 6,6 5,9
11 6,41 30 40 6,2 6,4 5,9 5,9
12 6,11 30 40 7,7 5,4 6,0 5,9
41
com o aumento da temperatura, acompanhado da ligeira diminuição da
absorbância. Isso sugere, que o aumento da temperatura nesta fase deve causar
um rearranjo dos segmentos da vesicula.
Também foi avaliado o tamanho das vesículas (Tabela 14), e verificou-
se que para o tratamento 7, houve uma diminuição no diâmetro com a adição de
TCM. Uma possibilidade que poderia ter ocorrido uma interação da vesícula com
o TCM adicionado, com isso diminuiu o diâmetro vesicular.
Figura 19 - Absorbância da suspensão da vesícula do tratamento 7. Tratamento 7 na
temperatura ambiente pH 3,54; - Tratamento 7 na temperatura ambiente pH 5,03; - Tratamento 7
com adição de 0 µg·L-1 de TCM; - Tratamento 7 com adição de 100 µg·L-1; - Tratamento 7 com
adição de 1000 µg·L-1 de TCM (branca); - Tratamento 7 com adição de 10000 µg·L-1 de TCM
(amarela).
Tabela 14 – Diâmetro (nm) das vesículas em razão do pH, temperatura e diluição
após a adição de amostras de água, contendo diferentes concentrações de
triclorometano.
Tratamento pH T(°C) % 0 µg·L-1 (nm)
100 µg·L-1 (nm)
1000 µg·L-1 (nm)
10000 µg·L-1 (nm)
1 5,28 20 20 761,02 516,79 1582,72 653,61
2 7,00 20 20 716,46 719,73 718,02 580,94
3 5,48 40 20 570,95 497,56 602,96 546,70
4 7,02 40 20 399,05 414,25 417,78 435,47
5 5,31 20 100 1368,65 695,25 625,10
709,50
6 7,14 20 100 874,37 653,98 642,02 642,52
7 5,03 40 100 2435,20 1995,00 2350,38 2136,13
8 7,02 40 100 2435,20 1995,00 2350,38 2136,13
9 6,24 30 40 762,07 896,19 992,04 1934,14
42
% - porcentagem de vesícula em água deionizada.
Foram avaliadas então novas condições de temperatura (35, 37, 40),
constituindo-se nos tratamentos 13, 14, 15, sendo o pH mantido em 5,00 e a
concentração de vesículas na suspensão de 100%, para avaliação da RC
(Tabela 16).
Observando os valores da RC, nota-se que o tratamento 13 (Figura 20),
foi o que obteve a maior diferença entre os valores da RC do controle e a
100µg·L-1 de 5,6 %. Isso mostra que a vesícula nas condições de pH 5,25, na
temperatura de 35 °C é capaz de mudar de cor na presença de 100 µg·L-1 de
TCM em 500 µg·L-1 de suspensão de vesícula. Isso é importante, pois 100 µg·L-1
TCM é a quantidade máxima de TTHM permitida pela Portaria nº 518/MS e baixo
do indicado pela OMS que é de 200 µg·L-1 de TCM em água para consumo
humano.
Figura 20: Absorbância da suspensão de vesículas do tratamento 13. - Tratamento 13 na
temperatura ambiente pH 3,63; - Tratamento 13 na temperatura ambiente pH 5,25; - Tratamento
13 com adição de 0 µg·L-1 de TCM; -Tratamento 13 com adição de 100 µg·L-1 (branca); -
Tratamento 13 com adição de 1000 µg·L-1 de TCM (amarela); - Tratamento 13 com adição de
10000 µg·L-1 de TCM.
Houve um aumento do diâmetro das vesículas que passou de 645,32 nm
para 798,35 nm, sendo um resultado conflitante com o obtido anteriormente para
10 6,41 30 40 722,21
756,98 786,23 801,34
11 6,41 30 40 737,21
771,46 751,46 748,67
12 6,11 30 40 843,87 856,22 844,80 798,33
43
o tratamento 7. No entanto, deve-se observar que mesmo com o aumento
tamanho, as vesículas do tratamento 13 (687,98 nm) foram muito menores do
que do tratamento 7 (1995,00 nm). Há um consenso de que vesículas menores
são mais eficientes na transição colorimétrica, respondendo mais rápido a
estímulos externos.
Tabela 15 – Resposta Colorimétrica (RC) das vesículas em razão do pH 5,
temperatura variando de 35 °C, 37 °C e 40 °C após a adição de amostras de
água, contendo diferentes concentrações de triclorometano.
% - porcentagem de vesícula em água deionizada.
Tabela 16 – Diâmetro (nm) das vesículas em razão do pH 5, temperatura
variando de 35, 37 e 40°C após a adição de amostras de água, contendo
diferentes concentrações de triclorometano.
Tratamento pH T
(°C)
(%) 0 µg·L-1
(%)
100
µg·L-1
(%)
1000
µg·L-1
(%)
10000
µg·L-1
(%)
Diferença da
RC (%) entre 0
e 100 µg·L-1
13
5,2
5
35 100 4,3 9,9 8,7 9,7 5,6
14 5,4
8
37 100 9,4 10,3 6,7 6,7 0,9
15 5,2
4
40 100 15,2 17,3 16,7 17,2 2,1
Tratamento pH T
(°C)
% 0 µg·L-1
(nm)
100 µg·L-1
(nm)
1000 µg·L-1
(nm)
10000 µg·L-1
(nm)
13 5,25 35 20 645,32 687,98 749,96 798,35
14 5,48 37 20 1783,95 993,47 923,56 908,36
15 5,24 40 100 789,36 743,34 743,85 733,96
44
7. Conclusões
De 28 amostras de água das ETAs, de redes de distribuição e ainda de
poços artesianos, apenas duas repetições, pouco mais de 2 % não se
enquadraram dentro da legislação brasileira, a Portaria 518 de 2004 do
Ministério da Saúde. Verificou-se ainda uma tendência de aumento na
concentração de TCM nos pontos de coleta na rede de distribuição, embora em
valores abaixo do VMP (100 µg·L-1).
Esse resultado se deve provavelmente ao bom controle nos sistemas de
tratamento e distribuição de águas avaliadas, o que pôde ser constatado pelos
bons resultados das análises físico-química, microbiológica das amostras
analisadas, em particular da turbidez, cor e cloro residual livre.
Ocorreu transição colorimétrica em vesículas de PCDA contendo CO.ES
estimulada pelo TCM, que obteve uma maior alteração da mudança de cor do
azul para o vermelho. O diâmetro das vesículas aumentou na presença de
fosfolipídios, entretanto, o colesterol e esfingomielina foram os fosfolipídios que
menos aumentaram o diâmetro da suspensão.
A Resposta Colorimétrica melhorou ao se modificar o processo de
produção da suspensão de vesículas, quando se utilizou o ultrassom de ponta
em substituição ao banho ultrassônico.
Os melhores resultados na indicação da presença de triclorometano
foram obtidos quando se usou a vesícula composta de 1 mM de PCDA + 1mM
de CO.ES, preparadas com uma potência de 400 w por 18 min, em pH 5,0 e
temperatura de 35 oC. No entanto, mais estudos devem ser realizados afim de
aumentar a especificidade e a sensibilidade da suspensão de vesículas.
45
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