Vitelogenina Em Peixes
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MÉTODOS PARA ESTUDOS COM A MÉTODOS PARA ESTUDOS COM A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS: ENFOQUE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS: ENFOQUE
PARA A PARA A VITELOGENINAVITELOGENINA DE PEIXES DE PEIXES
AÇÃO DE METAIS EAÇÃO DE METAIS EXENOESTRÓGENOSXENOESTRÓGENOS
LAB. DE TOXICOLOGIA CELULARLAB. DE TOXICOLOGIA CELULARDEP. BIOLOGIA CELULAR, UFPRDEP. BIOLOGIA CELULAR, UFPR
DETECÇÃO E DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DA QUANTIFICAÇÃO DA
EXPRESSÃO PROTÉICAEXPRESSÃO PROTÉICA
SISTEMA REPRODUTORSISTEMA REPRODUTORNEUROENDÓCRINONEUROENDÓCRINO
CÉREBROCÉREBRO
HIPOTÁLAMOHIPOTÁLAMOGtRH (+) / DPM (–)
HIPÓFISEHIPÓFISE GtH I & GtH II (+)
e outros (+/–)
TESTÍCULO/OVÁRIOTESTÍCULO/OVÁRIO ESxH e outros fatores dimorfismo sexual gametogênese (Zn) incorpora VTG (GtH I)
POSSÍVEIS ETAPASPOSSÍVEIS ETAPASpara o estudo dapara o estudo da
EXPRESSÃO de PROTEÍNASEXPRESSÃO de PROTEÍNAS
seqüência da proteína seqüência de ácidos nucléico
MÉTODOS:
QUALITATIVOS: imuno-detecção (avaliação subjetiva);QUANTITATIVOS:
quantificação relativa:métodos semi-quantitativos (ELISA direto);métodos indiretos (p.ex.: análise de imagens);
quantificação absoluta:p.ex.: cromatografia ou ELISA sandwich
POSSÍVEIS ETAPAS para o estudo da EXPRESSÃOPOSSÍVEIS ETAPAS para o estudo da EXPRESSÃO
de de VITELOGENINAVITELOGENINA ( (VTGVTG) em fígado (HEPATÓCITOS) e) em fígado (HEPATÓCITOS) e
DETECÇÃO-QUANTIFICAÇÃODETECÇÃO-QUANTIFICAÇÃO em TECIDOS de TRAÍRAem TECIDOS de TRAÍRA
: uma OU outra ENTRADA
: uma E outra ENTRADA+
: relação INTRA-ESPECÍFICA (Hm)
: relação INTERESPECÍFICA (outras espécies - spp )
proteínas (PTs) ou
aminoácidos (aa’s) ou
seqüência de aa’s
DNA ou seqüência de DNA
RNA ou seqüência de RNA
DNA, RNA, PT, aa’s ou
SEQÜÊNCIAS spp Hm
ISOLAMENTO ou PURIFICAÇÃO deVTG de Hm (PLASMA ou CÉLULAS)
>> cromatografia de troca iônica (purificação)>> fracionamento por precipitação (isolamento)
ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay>> INCUBAÇÃO com anti-VTG
>> INCUBAÇÃO com ANTI-2ário-CONJUGADO
>> COLORIMETRIA (padrões : VTG purificada)
>> VALIDAÇÃO (bioensaios)
IMMUNOBLOTS : WESTERN ou DOT BLOTS
>> VTG em SDS-PAGE ou direto no NYLON
>> INCUBAÇÃO com anti-VTG ou anti-VTG
>> INCUBAÇÃO com ANTI-2ário-CONJUGADO
>> DENSITOMETRIA (padrões : VTG purificada)
RECORTAR, do SDS-PAGE, a BANDA com VTG
PRODUÇÃO DE anti-VTGIMUNIZAÇÃO em spp +
INDUÇÃO de VTG de Hmno FÍGADO por IIP de17-ESTRADIOL (E2)
anti-VTG de spp REAÇÃO CRUZADA
RT ( transcriptase reversa )TRANSCRIÇÃO REVERSA
mRNA’s >>> cDNA’s
EXTRAÇÃO de RNA-total do FÍGADO
NORTHERN BLOT
HIBRIDIZAÇÃO: cDNA-VTG ou SHt
>> RNA em GEL de AGAROSE
>> DENSITOMETRIA (padrões de RNA)
+
EXPRESSÃO in vitro do DNA-VTG de Hm>> VETORES de EXPRESSÃO (“gene” de VTG)>> produção de VTG (ou VTG-aa’s) em host cell
PCR ( DNA polimerase )
>> amplificação e isolamento
de cDNA ou OUTRO
>> com PRIMERS para VTG
construir SONDA MARCADA :
DNA-VTG
+
CONSTRUÇÃO/OBTENÇÃO de PRIMERS
oligonucleotídeos sintéticos degenerados
>> para sequências conservadas de aa’s
do domínio carboxi-terminal (3’) da VTG
(17 sequências conhecidas de 15 spp )
>> ALEATÓRIOS
SONDA HETERÓLOGA MARCADA (SHt )HIBRIDIZAÇÃO com ESTRINGÊNCIA
>> RNA ou DNA ou cDNA ou
>> oligonucleotídeos sintéticos degenerados
relacionados à seqüência(s) de DNA do GENE
que codifica a VTG em spp de peixes
EXTRAÇÃO de DNA-total do FÍGADO>> clivagem aleatória (endonuclease de restrição)>> coleção heterogênea de fragmentos de DNA
“ISOLAMENTO” do DNA-VTG
HIBRIDIZAÇÃO: DNA-VTG ou SHt
>> SOUTHERN BLOT de GEL de AGAROSE
>> seleção de colônia com clones de DNA-VTG
+
+
CLONAGEM do DNA de Hm( DNA-total ou cDNA-VTG )
DNA de Hm (EXÓGENO à bactéria ou levedura)+
VETOR DE CLONAGEM (plasmídio ou fago)=
CLONES de DNA recombinante (COLÔNIAS)
VTG plasmática
de Sparus aurata
cDNA-VTG de Sparus aurata
mRNA-VTG
de Sparus aurata
Northern Blot:
autoradiografia (32P)
5 dias após IIP :
5 mg E2 . kg-1
SDS-PAGE (7%)Comassie Blue
3 10 30 M
VTG
3 3 10 10 30 30 M
VTG
ELISA
VTG de Sparus aurata
VTGWestern Blot: anti(2)-enzima
RESPOSTA
ESTROGÊNICA
INDUZIDA EM
Salvelinus alpinus
mRNA-VTGNorthern Blot: sonda fluorescente (cDNA-DIG)
Salvelinus alpinus
IIP : 10 mg E2 . kg-1
VTG: Western Blot(policlonal de truta em coelho / anti-IgG de coelho conjugado à peroxidase)
mRNA-RE2
Northern Blot: sonda fluorescente (cDNA-DIG)
Salvelinus alpinus
IIP : 10 mg E2 . kg-1
mRNA-VEPsNorthern Blot:
sonda fluorescente(cDNA-DIG)
Salvelinus alpinus
IIP : 10 mg E2 . kg-1
CULTIVO PRIMÁRIODE HEPATÓCITOS
DE TRUTA
IOD
TRUTA
mRNA-VTG
Northern Blot:
autoradiografia (32P)
[VTG]% (IOD)VTG SDS-PAGE (5-20 %)
TRUTA
[VTG]% (IOD)
EXPRESSÃODE VTG
vs.EXPOSIÇÃO AO Pb++
EMHoplias malabaricus
VITELOGENINA (VTG) em plasma de Hoplias malabaricusevidenciada por SDS-PAGE descontínuo (Coomassie Brilliant Blue)
empilhamento em ACRILAMIDA a 4 % \\ separação em ACRILAMIDA a 9 %INDUÇÃO in vivo com hexaidrobenzoato de estradiol (E2)
dose via intraperitoneal: 20 g E2 . g-1 biomassa — iip E2(+)
linha 1: 200 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E2 (-)linha 2: 200 nl do animal 4, FÊMEA jovem E2 (-)linha 3: 50 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+)linha 4: 200 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+)linhas 5 a 8: 50 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, após PRECIPITAÇÃO (2x),
com EDTA/MgCl2 e H2O
linha 5: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,5linha 6: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,0linha 7: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,5linha 8: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,0
animal 11, iip E2(+) :
1 2 3 4 5 6 7 8 MWM
205 kDa
116 kDa97,4 kDa
66 kDa45 kDa
29 kDa
VITELOGENINA (VTG) em plasma de Hoplias malabaricusevidenciada por SDS-PAGE descontínuo (Coomassie Brilliant Blue)
empilhamento em ACRILAMIDA a 4 % \\ separação em ACRILAMIDA a 9 %INDUÇÃO in vivo com hexaidrobenzoato de estradiol (E2)
dose via intraperitoneal: 20 g E2 . g-1 biomassa — iip E2(+)
linha 1: 400 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E2 (-)linha 2: 400 nl do animal 4, FÊMEA jovem E2 (-)linha 3: 100 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+)linha 4: 400 nl do animal 1, FÊMEA jovem E2 (-)linhas 5 a 8: 150 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, após PRECIPITAÇÃO (2x),
com EDTA/MgCl2 e H2O
linha 5: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,5linha 6: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,0linha 7: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,5linha 8: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,0
animal 11, iip E2(+) :
1 2 3 4 5 6 7 8MWM
116 kDa97,4 kDa
45 kDa
29 kDa