Monica Gomes LimaDoutoranda em Neurociências

monicasafira@gmail.com

Fevereiro - 2011

NO é a molécula sinalizadora mais difundida encontrada na

retina :

› Influência fisiológica - mais claramente pelo mecanismo de

sinalização onde NO ativa a guanilato ciclase solúvel (GCs) para

promover a síntese de GMPc.

Estimulação da retina pela luz estimula liberação de NO (Neal

et al., 1998);

› Fotorreceptores: (Savchenko et al., 1997)

canais iônicos controlados por voltagem no bastonete;

canais ligados a nucleotídeos cíclicos em cones e bastonetes.

› Bipolares: (Mills & Massey, 995)

modula níveis de GMPc;

reduz o acoplamento entre amácrinas AII e bipolares dos cones.

INTRODUÇÃO

Ganglionares: › Doador de NO: modula a condutância dos canais de GMPc

(Ahmad et al., 1994; Kawa & Sterling 2002);

› NO: pode modula a atividade retiniana (Goldstein et al., 1996;

Maynard et al., 1995);

› Como NO afeta a resposta de células ganglionares

individualmente?

E se houver adaptação ao escuro?

Existe preferência por alguma classe de ganglionar?

A resposta à luz é mediada por alguma das vias ligadas ao

bastonete?

INTRODUÇÃO

Ganglionares:

› on, off e on-off.

INTRODUÇÃO

Eletrofisiologia:

› Preparação da retina de furão:

Patch-clamp:

P35-P55;

Enucleação dos olhos : oxigenados a 37ºC – 12min;

Dissecação da retina: mantida em EMEM (95% de O2 – 5% CO2);

Separação de parte da retina

Registros eram feitos por 30-120min;

Eletrodo era preenchido (mM): 140 KCl, 10 HEPES, 0,5 EGTA, 0,5% lucifer

yellow.

› Estimulo luminoso:

LEDs controlados por computador: 463, 569 e 651 nm

Ativação dos fotorreceptores.

MATERIAIS E MÉTODOS

Eletrofisiologia:

› Aplicação da droga:

L-Arginina: 1 - 5 mM;

D-Arginina: 1 - 5 mM;

SNAP: 1 mM;

Estricnina: 50 µM. Dissolvidos em EMEM – administrados por gravidade.

Análise Morfológica:

› Células eram identificadas após registro (73 células).

Nikon Eclipse E600 ou Confocal Bio-Rad MRC-1024ES; Diferenciar classes de células ganglionares.

MATERIAIS E MÉTODOS

Efeitos do NO na

resposta provocada

pela luz:

› Registro de 55 células:

antes, durante e

depois;

› 47 de 55 foram

afetadas por l-

arginina;

› Resposta on: 29 de 37

RESULTADOS Trasiente Sustentada

Magnitude do efeito:RESULTADOS

RESULTADOS

OFF ON-OFF

RESULTADOS Efeito das concentrações de L-arginina:

Res

post

a on

› Diferenças nas inibições das respostas on e off.

RESULTADOS

› 4 on: ↓ resposta (19,2-53,4%);

› e 3 off: 2 bloqueadas e 1

reduzida (38,5%).

› SNAP tem efeito semelhante

ao da L-arginina.

Efeito do SNAP:

› 4

ON OFF

NO em Diferentes Classes

Morfológicas:

› Alfa: 75% (6 em 8);

› Beta: 88,5% (23 em 26);

› Gama: 75% (9 em 12).

RESULTADOS

Influência de L-arginina ou SNAP no Potencial de

Repouso:

› Pot. Repouso: -57,4±4,6 mV;

› Após aplicação da droga: 61 de 73 céls.

12 de 73: hiperpolarizaram (2-5 mV);

Efeitos do NO:

› Podem influenciar respostas visuais – excitabilidade da

membrana – efeitos do NO nas respostas provocadas pelas

correntes;

RESULTADOS

Efeitos do NO nas respostas provocadas pelas

correntes:

› 30 céls. ganglionares: 10 passos de 10-180 pA

19 on: 14 de 19 - ↓ respostas L-arginina (18,4-58,5%)

5 off: todas afetadas – 4 bloqueadas e 1↓ 36,7%.

6 on-off: on reduzida em 5, off bloqueadas em 4.

Mas não há uma relação clara entre os efeitos do NO nas repostas

provocadas pela luz e nas repostas provocadas pela corrente:

Sub-grupo com excitabilidade de membrana sensível ao NO.

RESULTADOS

Avaliação da adaptação ao escuro (resposta off):

› Mediada por duas vias

Bastonete > bipolar de bastonete > A II > bipolar do cone off >

ganglionares off (APB-sensível)

Sinapses glicinérgicas;

APB: bloqueia - Hiperpolarização da bipolar ligada ao bastonete – não ocorre

liberação de glutamato;

Bastonete > bipolar de cone off > ganglionares off (APB-resistente)

Bastonete – cone (gap junctions) – bipolar do cone.

Podem influenciar na modulação pré-sináptica da resposta off de

céls. Ganglionares.

RESULTADOS

Qual das vias está envolvida no bloqueio das respostas

off?

› Avaliação da resposta pré-sináptica:

SNAP: doador de NO;

Estricnina: bloqueia receptor glicinérgico;

APB: bloqueia receptor glutamatérgico.

RESULTADOS

RESULTADOS

7 em 11 4 em 11

NO:

› Modula as três classes de ganglionares (alfa, beta e gama);

› “Amortece” resposta visuais à estímulos em flashes;

› Via off é mais sensível;

Evidência direta: influencia na resposta das céls.

ganglionares, individualmente;

Afeta a transferência da informação retina-níveis

superiores do sistema visual;

Não atribuído à toxicidade: respostas on e off são

diferentes;

DISCUSSÃO

Possíveis sítios de ação para a modulação do NO nas

respostas visuais:

› Doadores de NO ↑GMPc em céls da retina:

Múltiplos sítios de ação podem contribuir para efeitos do NO;

› Pequena proporção de neurônios: NO afeta propriedades

intrínsecas da membrana - Descargas provocadas por corrente;

› Pouco provável que respostas on e off diferentes sejam

refletidas pela ação dos fotorreceptores

Primeira influência do NO – céls. ganglionares (pré-sináptico);

DISCUSSÃO

APB-sensível x APB-resistente: A redução da resposta off

› APB-sensível (Müller et al., 1988): hiperpolarização de bipolar de

bastonete

Estricnina: inibe sinapses glicinérgicas (sinapses com ganglionares

off).

› APB-resistente (Hack et al. 1999; Soucy et al. 1998):

4 em 11: atividade da via APB-resistente – funcional na adaptação

ao escuro (mesópicas e escotópicas);

› NO inibe liberação de glicina:

Sinapses glicinérgicas: mecanismos pelo qual bloqueia as respostas

das células ganglionares off.

+ outros sítios de ação

DISCUSSÃO

Redução da resposta on:

› Não tentaram estabelecer os sítios de ação do NO nas respostas

das ganglionares on;

› Literatura:

NO reduz o acoplamento:

de gap junctions na retina (DeVries & Schwartz 1989; Miyachi et al., 1990);

de AII com bipolar de cone on (Mills & Massey, 1995);

NO: Canais ligados a GMPc em bipolares on (Nawy & Jahr,1990,

1991; Shiells & Falk, 1990)

Aumento da resposta a luz em bipolares on!!!

Não há uma regra – diminuição das respostas à luz nas céls.

ganglionares on.

DISCUSSÃO

O NO possui um poderoso efeito na retina, principalmente às

relacionadas com a respostas off à estímulos luminosos

› 86% das respostas off sofreram alteração – maior parte foi bloqueada;

Complementar:

› NGL: bloqueio da NOS reduz as respostas visuais de todas céls X e Y

(Cudeiro et al., 1994) – L-arginina não possui efeito na resposta visual;

› Córtex: manipulações no sistema NO produz reduções/aumentos na

reposta visual (Cudeiro et al., 1997).

CONCLUSÃO

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