Trabalho Elaborado por:

Andreia Silva Cristiana Rocha Diogo Pedro

3 ....................................................... Introdução

4 ........................................... Material Utilizado

5/6/7/8 .................... Componente Experimental

9/10 …................................ Análise de Gráficos

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No âmbito da disciplina de Biologia, foi-nos proposto elaborar um trabalho sobre Cianobactérias.

A Cianobactéria é um filo pertencente às Bactérias. Estas incluem organismos aquáticos, unicelulares, procariontes e fotossintéticos. Apresentam coloração azul em boas condições, mas são frequentemente encontradas com uma coloração verde. Em muitos casos, são responsáveis pela eutrofização do ambiente aquático no qual estão inseridas pela rápida reprodução (sempre por bipartição). A maioria das espécies encontram-se em água doce, mas algumas são marinhas ou ocorrem em solo húmido.

No nosso trabalho utilizámos água mineral, para averiguarmos se tinha o mesmo desempenho que nos outros meios a que estão familiarizadas. O objectivo deste trabalho foi observar o crescimento destas células ao longo do tempo.

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Câmara de Neubauer Meio de cultura Z8 Lugol (fixação) Inóculo de Microcystis aeruginosa e Chlorella

vulgaris

Concentrado e Extracto de Microcystis (para testes de toxicidade)

Quistos de Artemia salina

Pipetas Pasteur descartáveis Microscópio óptico Lupa Bomba aquário Sal cozinha ou sais marinhos Tubo plástico para arejamento

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Placa poços 3ml / tubos de ensaio Garrafão de 5L Frascos pequenos

Um dos meios usados na cultura de microalgas é o meio Z8, composto por uma solução rica em azoto (solução A), uma solução rica em fósforo (solução B), uma solução de ferro (solução de Fe-EDTA) e uma solução de micronutrientes.

Adicionámos a 3L de água mineral, no garrafão de 5L, o conteúdo dos 4 tubos com as soluções para meio Z8 e agitámos bem.

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Iniciámos a cultura de Microcystis da seguinte forma:

Nos 3 L de meio Z8 que ficaram no garrafão juntámos o conteúdo do tubo “inóculo células Microcystis”. Agitámos bem para que as células ficassem uniformemente distribuídas no meio.

Retirámos 2 ml da cultura para um tubo de ensaio e adicionámos 2 gotas de lugol de forma a fixar as células.

Colocámos a rolha com o tubo de arejamento no garrafão. Identificámos a cultura com a Cianobactéria usada, o meio de cultura e o seu volume e a data de inicio da mesma.

Ligámos a bomba de aquário e o tubo de arejamento de maneira a que ficasse a borbulhar e que as cianobactérias não se depositassem no fundo.

Colocámos num local iluminado com uma lâmpada, a uma temperatura de 20-25º.

1. Determinação da curva de crescimento de Microcystis aeruginosa:

Ao longo de um mês retirámos diariamente (excepto aos fins-de-semana) 2 mL da cultura e juntámos 2 gotas de lugol. Registámos os valores da densidade celular e construímos um gráfico com a densidade celular (células/mL) em função do tempo (dias).

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2. Teste de toxicidade com Chlorella

Preparámos o extracto de Microcystis aeruginosa da seguinte forma:

No tubo com o extracto congelado de Microcystis aeruginosa adicionámos meio Z8 até 40 mL e agitámos bem.

Congelámos e descongelámos várias vezes de forma a rebentar as células.

Verificámos ao microscópio que as células tinham rebentado.

Com papel de filtro filtrámos a solução obtida e recolhemos o filtrado.

Preparámos as soluções de tóxico:

Solução Tóxico Filtrado (mL) Meio Z8 (mL)

1:1 2 -1:2 1 11:4 0,5 1,5

Controlo - 2

Na placa de 24 poços adicionámos o filtrado sem ser diluído (1:1) e diluído 1:2 e 1:4 de acordo com a figura. Em cada poço adicionámos 2 mL da solução a testar. As

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diluições foram feitas com meio Z8. O controlo é também constituído por meio Z8.

Preparámos o inóculo de Chlorella vulgaris da seguinte forma:

Retirámos 2 ml do inoculo de Chlorella vulgaris fornecido, fixámos com 1 gota de lugol e quantificámos a densidade de células na câmara de Neubauer.

Conhecida a concentração de células no inoculo fizemos uma diluição com meio Z8 para que, adicionando a cada poço 0,5 ml de inoculo de Chlorella, e obtivessemos uma concentração inicial de 1x10^6 cél/ml.

Adicionámos a cada poço com o extracto de cianobactéria, 0,5 ml do inóculo de Chlorella vulgaris preparado.

Tapámos a placa com a tampa e envolvemos numa película aderente transparente, para evitar a evaporação.

Colocámos num local iluminado. Ao fim das 48 horas de exposição

terminámos o teste fixando as algas com 1 gota de lugol.

Determinámos a concentração de algas em cada poço, por contagem do número de células na câmara de Neubauer.

Após a contagem do número de células calculámos a percentagem de inibição (%I) para cada uma das concentrações da seguinte forma:% I = 100 – ((valor médio cél/ml das réplicas de cada diluição / valor médio cél/ml das réplicas do controlo)) x 100

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Construímos um gráfico onde se representa a percentagem de inibição em função da concentração celular.

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Após a contagem de todas as células obtivemos o seguinte gráfico:

Através do gráfico podemos concluir que inicialmente a concentração é praticamente idêntica

mas, após algum tempo, sobe significativamente. Acaba por atingir um valor máximo que depois diminui.

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13/01/

2010

15/01/

2010

17/01/

2010

19/01/

2010

21/01/

2010

23/01/

2010

25/01/

2010

27/01/

2010

29/01/

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31/01/

2010

02/02/

2010

04/02/

2010

06/02/

2010

08/02/

2010

10/02/

2010

0

5

10

15

20

25Curva de Crescimento da

Cianobactéria

Dias

Concentraçao (cél/ml x 106)

Após a contagem de todas as células obtivemos o seguinte gráfico:

Tal como era de esperar, a percentagem de inibição diminui à medida que a concentração de extracto diminui.

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1:1 1:2 1:40

1

2

3

4

5

6

Influência da Concentração do Ex-trato de Cianobactéria sobre o crescimento das algas verdes

Concentração do Extrato

Percentagem de Inibição