UNIVERSIDADE DE SO PAULOFaculdade de Zootecnia e Engenharia de AlimentosDepartamento de Cincias Bsicas

BIOQUMICA FUNDAMENTALPROF. DR. MARCELO DE CERQUEIRA CESARENGENHARIA DE ALIMENTOS XIV - DIURNO

IDENTIFICAO DE MIOSINA NOS PESCADOS SARDINHA E ARUN PELO MTODO WESTERN BLOTTING

CAROLINE OLIVEIRA AGOSTINI 9006913

Pirassununga 2015

SUMRIO

RESUMO31.INTRODUO42.OBJETIVO103.MTODO114.RESULTADOS E DISCUSSO135.CONCLUSO146.BIBLIOGRAFIA15

RESUMO

Um mtodo muito utilizado para identificar protenas especficas em uma amostra o Western Blotting, a tcnica consiste em, primeiramente, separar protenas de uma amostra a partir de eletroforese, em seguida, as protenas do gel de poliacrilamida so transferidas para uma membrana, nesse experimento de nitrocelulose. A membrana passa por uma soluo de bloqueio para evitar ligaes indesejadas e ento imersa em um anticorpo primrio, especfico para a protena de interesse (nesse experimento: miosina de cadeia leve), depois de lavada a membrana imersa em outro anticorpo, o secundrio, que se liga ao primrio, por fim a membrana corada, de modo que o corante se liga somente ao anticorpo secundrio, mostrando somente a protena desejada. No experimento desse relatrio foi identificada a miosina de cadeia leve nos pescados Sardinha e AruanPalavras chave: protena, Western Blotting, eletroforese, eletroblotting, miosina, anticorpo

1. INTRODUODevido a grande importncia das protenas, interessante detectar, caracterizar e quantificar mltiplas protenas, para isso um mtodo muito utilizado o de Western Blotting, aplicado principalmente quelas que esto em baixas quantidades em determinada amostra (MIGUEL, MENEZES, ARAJO, 2012). A caracterstica principal desse procedimento a transferncia de um extrato proteico para uma membrana, geralmente de nitrocelulose. H tambm o immuno blot, que um tipo de o western blot aonde, aps a transferncia para a membrana, as protenas so identificadas com anticorpos especficos. Atualmente, utiliza-se o termo western blot como sinnimo de immuno blot (MORAES et al., 2013).A utilizao dessa tcnica consiste em basicamente 3 passos: (1) separao por dimenses, (2) transferncia para um suporte slido, e (3) marcao de protenas alvo, utilizando um anticorpo primrio e secundrio adequado para visualizao (MAHMOOD, YANG, 2012). Primeiramente so preparadas amostras contendo vrias protenas, ento uma corrida eletrofortica ser feita para que, atravs dos gis de poliacrilamida, as protenas sejam separadas. Aps a eletroforese, os resultados devem ser transferidos para uma membrana adsorvente, para isso feito o que se denomina "sanduche" blotting (Figura 1) da seguinte maneira: Mergulhe o cassete de plstico em tampo de transferncia com o lado preto (negativo) para baixo, dentro de um recipiente; Coloque uma esponja de fibra molhada no lado negro (negativo) do cassete; Coloque um papel de filtro molhado sobre a esponja e elimine as bolhas de ar; Coloque o gel diretamente sobre papel de filtro e elimine as bolhas de ar;

Coloque a membrana molhada no gel e elimine as bolhas de ar; Coloque outro papel de filtro molhado sobre a membrana e elimine as bolhas de ar; Coloque uma esponja de fibra molhada em cima do papel de filtro.

Figura 1 Sanduche blottingFonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Electroblotting

O sanduche ento fechado e colocado em um campo eltrico (eletroblotting), os eltrons vo do nodo para o ctodo, portanto, como o gel est do lado do nodo e a membrana do lado do ctodo, as protenas carregadas negativamente pelo SDS-PAGE iro do gel para a membrana, esse tipo de transferncia chamada de transferncia eletrofortica.A membrana pode ser base de nitrocelulose, polivinildina difluorada (PVDF), papel ativado ou nylon, a de nitrocelulose a mais utilizada devido ao seu baixo custo e por apresentar melhor eficincia na ligao com diferentes tipos de protenas, mas por outro lado menos eficiente para com protenas que fazem ligaes no covalentes e frgeis ao manuseio antes da hidratao.

Figura 2 Mtodo de Western Blotting para identificar protenas de interesseFonte: http://www.leinco.com/general_wbPor fim, a protena de interesse da amostra ter de ser marcada (Figura 2) para sua visualizao, para isso os seguintes passos devem ser feitos: Mergulhe a membrana em soluo de bloqueio durante 15 minutos temperatura ambiente em uma plataforma de agitao com velocidade alta; Eliminar a soluo de bloqueio; Incubar a membrana com anticorpo primrio por 15 minutos em plataforma de agitao para assegurar a constante cobertura da membrana; Rapidamente enxaguar a membrana em tampo de lavagem, em seguida, descartar o mesmo; Adicionar tampo de lavagem membrana durante 3 minutos em plataforma com velocidade mdia. Descartar a lavagem e incubar com anticorpo secundrio durante 15 minutos na plataforma oscilante definida para um ajuste rpido. Rapidamente enxaguar a membrana em tampo de lavagem e descartar o mesmo. Adicionar tampo de lavagem e lavar a membrana, durante 3 minutos em plataforma com velocidade mdia. importante prevenir interaes entre a membrana e o anticorpo escolhido para detectar a protena. Para bloquear a ligao no especfica, a membrana colocada numa soluo (bloqueio) diluda de protena tais como soro de albumina bovina e leite em p desnatado. tambm importante garantir que o tampo de bloqueio seja tambm adequado para o tipo de membrana. O bloqueio ajuda mascarar quaisquer ligaes no especficas sobre a membrana, reduzindo assim qualquer '' rudo '' no o produto final de western blot, eliminando falsos positivos e proporcionando um resultado claro (JENSEN, 2012).O anticorpo primrio escolhido de acordo com a protena de interesse, ele ento se liga a ela e em seguida realizada uma lavagem para que o anticorpo seja removido do resto da membrana. O anticorpo secundrio est complexado a uma enzima reveladora, a qual, na medida em que for incubada com seu substrato especfico, emitir um sinal escolhido, por isso o anticorpo secundrio deve ser escolhido de acordo com o primrio. A Figura 3 mostra um exemplo de como a protena marcada.

Figura 3 Exemplo de ligao do anticorpo primrio protena de interesse, seguido de ligao do anticorpo secundrio ao primrio.Fonte: http://www.fiocruz.br/ioc/media/apostila_volume_1.pdfAps a remoo do anticorpo secundrio, a membrana ser corada com corantes orgnicos ou marcadores fluorescentes, existem tambm vrios mtodos com colorao de prata e partculas coloidais como ouro, prata, cobre, ferro ou Indian ink. O tipo de colorao a ser utilizado deve ser compatvel com a membrana usada para a transferncia de protenas (KURIEN & SCOLFIED, 2003). Aps a colorao poder ser visualizada a protena de interesse (Figura 4), caso ela estivesse na amostra.

Figura 4 Exemplo de membrana marcada com a protena de interesse aps a realizao do mtodo Western BlottingFonte: http://www.scbt.com/pt/datasheet-3724-nitrocellulose-0-45-microm.htmlPode-se ver que essa tcnica bastante vantajosa, pois membranas midas so maleveis e de fcil manuseio; as protenas imobilizadas na membrana so rapidamente e uniformemente acessveis a diferentes ligantes; somente uma pequena quantidade de reagentes necessria para a anlise de transferncia; possvel fazer mltiplas rplicas do gel; o armazenamento da amostra transferida pode ser prolongado, antes de ser usada e a mesma protena transferida pode ser usada para mltiplas anlises sucessivas (KURIEN & SCOFIELD, 2006).

2. OBJETIVOIdentificar a protena miosina de cadeia leve nos pescados Sardinha e Aruan pelo mtodo de Western Blotting.

3. MTODOPrimeiramente, cortou-se um pedao do msculo de Sardinha e de Aruan, ambos com dimenses aproximadas de 0,25 x 0,25 x 0,25 cm3. Os msculos foram colocados nos seus respectivos tubos, previamente rotulados e contendo 200 L do tampo Laemmli e agitou-se intensamente por 15 vezes, em seguida os micro tubos foram incubados por 5 minutos a temperatura ambiente.Feito isso, apenas o tampo homogeneizado do msculo foi transferido para outro microtubo com tampa e rotulado, ento os micro tubos foram incubados durante 5 minutos a 95C em banho maria.Foi ento realizada uma corrida eletrofortica. Logo aps a corrida, o gel retirado e cortou-se a parte superior. Durante 15 minutos, o gel ficou em tampo de transferncia em uma plataforma de agitao. Enquanto isso, esponjas de fibra e papis de filtro ficaram completamente mergulhados em tampo de transferncia dentro de uma bandeja, em outra bandeja, foi mergulhada uma membrana de nitrocelulose em tampo de transferncia.Foi feito ento o sanduche blotting da seguinte maneira: um cassete de plstico foi mergulhado em tampo de transferncia com o lado preto para baixo, dentro do recipiente; foi colocada uma esponja de fibra molhada no lado preto; em cima da esponja, colocou-se um papel de filtro molhado e foram eliminadas quaisquer bolhas de ar; o gel foi colocado diretamente sobre o papel absorvente e foram eliminadas quaisquer bolhas de ar; a membrana de nitrocelulose foi colocada acima do gel e foram eliminadas quaisquer bolhas de ar; por cima da membrana foi colocado outro papel filtro molhado e foram eliminadas quaisquer bolhas de ar e por fim, colocou-se uma esponja de fibra molhada por cima do papel filtro. O sanduche foi fechado e grampeado com o clipe branco.O mdulo Mini Trans-Blot foi configurado com o lado preto do cassete de frente do lado negro do mdulo Trans-Blot Mini. Transferiu-se o mdulo para a cuba previamente contendo o im agitador no fundo, preencheu-se com tampo de transferncia gelado at o cassete ficar totalmente mergulhado. Colocou-se a tampa da cuba, combinando os cabos vermelho x vermelho e preto x preto, ento foi feita a transferncia a 100 V durante 30 minutos.Passado o tempo, a membrana foi mergulhada em 25 mL de soluo de bloqueio por 15 minutos temperatura ambiente em uma plataforma de agitao com velocidade alta. Eliminou-se a soluo de bloqueio e a membrana foi incubada com 10 mL de anticorpo primrio por 15 minutos em plataforma de agitao para assegurar a constante cobertura da membrana. Logo aps, a membrana foi rapidamente enxaguada em 50 mL de tampo de lavagem, em seguida, descartou-se o mesmo. Adicionou-se 50 mL de tampo de lavagem membrana durante 3 minutos em plataforma de agitao com velocidade mdia, descartou-se a lavagem e a membrana foi incubada com 10 mL de anticorpo secundrio durante 15 minutos na plataforma oscilante definida para um ajuste rpido. Logo aps, a membrana foi rapidamente enxaguada em 50 mL de tampo de lavagem, em seguida, descartou-se o mesmo. Adicionou-se 50 mL de tampo de lavagem membrana durante 3 minutos em plataforma de agitao com velocidade mdia, descartou-se a lavagem e adicionou-se 10 mL de HRP, reagente de deteco de cor, incubou-se durante 10 minutos com agitao media e assistiu-se o desenvolvimento da cor. A membrana foi lavada duas vezes com gua destilada e seca com papel absorvente.

4. RESULTADOS E DISCUSSOAps a corar a membrana pode-se observar a protena miosina de cadeia leve que estava nas amostras de Sardinha e Aruan, como mostra a Figura 5.

Figura 5 Membrana de nitrocelulose mostrando a protena miosina nos peixes Sardinha e Aruan

5. CONCLUSOA partir do experimento pode-se concluir que a tcnica Western Blotting eficiente e pode-se observar a protena miosina de cadeia leve nos pescados Sardinha e Aruan.

6. BIBLIOGRAFIA

Jensen, E. C. (3 de fevereiro de 2012). The Basics of Western Blotting. The Anatomical Record, 369-371.KURIEN, B. T., & SCOFIELD, R. H. (2006). Western blotting methods (Vol. 38). San Diego.Mahmoode, T., & Yang, P.-C. (4 de setembro de 2012). Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences, 429-434.Miguel, M. P., Menezes, L. B., & Arajo, E. G. (30 de novembro de 2012). WESTERN BLOTTING: A TCNICA E APLICAES NA PESQUISA E ROTINA DIAGNSTICA EM MEDICINA VETERINRIA. Enciclopdia Biosfera, 1704-1719.Moraes, C. d., Junior, F. O., Masson, G., Rebello, K. M., Santos, L. d., Bastos, N. F., & Faria, R. C.-R. (2013). Srie em biologia celular e molecular - Mtodos experimentais no estudo de protenas (1 ed.). Rio de Janeiro.

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