Prof. Augusto Dinis
BIOLOGIA CELULAR 1
Biologia Celular
Tráfego das proteínas de secreção
Alberts et al., 2008
A maior parte das proteínas destinadas ao Retículo
Endoplasmático (RE), complexo de Golgi, lisossomas,
membrana plasmática e exterior celular (exportação)
são sintetizadas em ribossomas que aderem ao RE
→ mecanismo de transporte co-traducional
Via da Secreção ou Via Secretora
O transporte de moléculas entre os compartimentos
desta via (compartimentos topologicamente
equivalentes mas sem continuidade espacial) é feito
por vesículas transportadoras
→ mecanismo de transporte vesicular
Biologia Celular
Tipos de Retículo Endoplasmático
Microfotografias TEM do Retículo Endoplasmático Rugoso (RER) e Retículo Endoplasmático Liso (REL)
Retículo Endoplasmático em microscopia de fluorescência
RE
RR
EL
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BIOLOGIA CELULAR 2
Biologia Celular
Síntese das proteínas de secreção
Representação esquemática da síntese de proteínas em ribossomas livres e em ribossomas ligados ao
retículo endoplasmático (proteínas de secreção) e microfotografias TEM de uma secção transversal
(à direita) e uma secção tangencial (encaixe superior) do Retículo Endoplasmático Rugoso
Biologia Celular
O que determina a síntese das proteínas de secreção em
ribossomas que aderem ao Retículo Endoplasmático?
Sequência-sinal de endereçamento para o Retículo Endoplasmático
� Sequência de 16 a 30 a.a. localizados no terminal N da cadeia peptídica eque inclui um ou mais a.a. carregados positivamente adjacentes a umsegmento contínuo de 6 ou mais a.a. hidrofóbicos (núcleo hidrofóbico).
� A sequência sinal é reconhecida e ligada por uma Partícula deReconhecimento do Sinal (PRS).
� A sequência sinal é clivada por uma peptidase durante a translocação parao lúmen do RER.
Extremo amina
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A Partícula de Reconhecimento do Sinal (PRS)
Biologia Celular
� Partícula ribonucleoproteica que liga simultaneamente a sequência sinal para o RER, a subunidade maior do ribossoma e o recetor proteico localizado na membrana do RER (recetor PRS).
� Consiste de seis polipeptídeos diferentes, dos quais cinco ligam uma pequena molécula de RNA (RNA da PRS) que medeia a interação com o RNA ribossómico:
P54 – liga a sequência sinal e o recetor PRS.
P68/P72 – necessárias para a translocação da
proteína.
P9/P14 – interagem com a subunidade maior do
ribossoma e provocam a interrupção temporária
da síntese da proteína.
O recetor da Partícula de Reconhecimento do Sinal
(recetor PRS)
Biologia Celular
� Proteína transmembranar integral
formada por duas subunidades
(subunidade α e subunidade β).
� A subunidade α interactua com o
complexo PRS + Sequência sinal +
Ribossoma e possui, juntamente com a
unidade P54 da PRS, actividade
GTPásica essencial para o ciclo de
ligação e dissociação da PRS com o seu
recetor.
� A subunidade β interactua com o
complexo translocador por onde
ocorre a passagem da proteína.
SRP
mRNA
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Biologia Celular
Características do transporte de proteínas para o Retículo
Endoplasmático (RE):
•A síntese da proteína precursora ocorre em ribossomas
ligados à membrana do retículo endoplasmático
• A síntese e a translocação ocorrem geralmente em simultâneo (translocação co-traducional)
• A proteína é translocada na sua conformação distendida
• A sequência sinal (localizada no extremo N) é clivadadurante a translocação da proteína para o lúmen do RE
• A translocação co-traducional requer GTP e a translocação
pós-traducional requer ATP
Translocação co-traducional de uma proteína para o lúmen do RE
Lodish et al., 2008
Biologia Celular
Etapa 2 – tradução da proteína é interrompida Etapa 4 – tradução da proteína é retomada
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Biologia Celular
Translocação pós-traducional de uma proteína para o lúmen do RE
Biologia Celular
• Nas leveduras, algumas poucas proteínas são transferidas para o RE após a sua completa tradução no citosol.
• A incorporação destas proteínas no RE não requer PRS. A sequência sinal é reconhecida por receptores proteicos distintos � complexo Sec62/63 associado ao translocador Sec61 da membrana do RE.
• Chaperonas Hsp70 citosólicas mantêm a cadeia polipeptídica numa conformação distendida para poder entrar no translocador.
• Chaperonas Hsp70 do RE, designadas BiP (binding proteins), auxiliam a cadeia peptídica a atravessar o canal funcionando como roquetes (com gasto de ATP).
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Biologia Celular
Inserção de proteínas na membrana do RE
� As proteínas destinadas à integração na
membrana dos organelos da via da secreção
são inseridas inicialmente na membrana do
RE em vez de serem libertadas no lúmen.
� Da membrana do RE, estas proteínas são
transportadas até ao seu destino final como
componentes membranares e não como
proteínas solúveis.
� Durante o transporte, a orientação da
proteína membranar é sempre preservada.
A orientação final das proteínas
membranares é estabelecida durante
a sua síntese na membrana do RER
Biologia Celular
Classes I, II e III � proteínas com uma só α-hélice na membrana (unitransmembranares ou “single-pass”):
• Tipo I – proteína ancorada com o segmento do terminal N na face luminal (exoplasmática) e o segmento do
terminal C na face citosólica ̶ sequência sinal presente no terminal N, a qual é clivada.
• Tipo II – proteína ancorada com o segmento do terminal N na face citosólica e o segmento do terminal C na
face lumenal ̶ proteínas sem sequência sinal no terminal N.
• Tipo III – proteínas com orientação similar às do Tipo I, mas sem a sequência sinal clivável.
Classe IV � proteínas com múltiplos segmentos hidrofóbicos inseridos na membrana � proteínas “multipass”.
Categorias das proteínas integrais de acordo com a sua topologia
Lodish et al., 2008
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BIOLOGIA CELULAR 7
Biologia Celular
Inserção de proteínas na membrana do RE
� As diferentes topologias das proteínas membranares refletem mecanismos distintos
usados pela célula para estabelecer a orientação dos segmentos peptídicos na bicamada
lipídica durante a síntese da proteína no RER
Síntese e integração de uma proteína transmembranar (Tipo I) na membrana do RE
(STA)
Lodish et al., 2008
Biologia Celular
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Processamento Proteolítico no RE
• Clivagens proteolíticas específicas (remoção de sequências
peptídicas)
Biologia Celular
• Algumas enzimas e hormonas formam-se a partir deprecursores de grandes dimensões (preproproteínas)
• Exemplo: insulina
- O precursor inicial (preproinsulina) contém umasequência sinal no terminal N que a endereça para o RE.
- A clivagem desta sequência durante a translocação namembrana do RE origina um segundo precursor(proinsulina).
- Este precursor é convertido em insulina após a união dasduas cadeias através de ligações dissulfureto e remoçãoproteolítica de um segmento peptídico interno.
Processamento Proteolítico no RE
• Formação de ligações dissulfureto (S-S)
Biologia Celular
A formação de pontes S-S entre as cadeias laterais de cisteínas é importante para o
enovelamento correcto das proteínas de secreção e manutenção da sua estrutura.
No citosol, os resíduos de cisteínas são mantidos no estado reduzido (–SH). No RE,
o ambiente oxidativo aí encontrado promove a formação de ligações S–S.
A formação de ligações S-S é catalisada pela enzima dissulfureto isomerase, uma das
proteínas residentes do lúmen do RE.
Insulina RNAse
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BIOLOGIA CELULAR 9
Processamento Proteolítico no RE
Biologia Celular
As proteínas translocadas para o RE atingem a sua conformação final por acção
sequencial de chaperonas presentes no lúmen do RE.
As chaperonas BiP ligam-se à cadeia logo que ela atravessa a membrana, mediando o
enovelamento da proteína e a montagem de proteínas com várias subunidades. Outras
proteínas importantes são as calnexinas e calreticulinas (chaperonas glicoproteicas).
• Enovelamento correcto das cadeias polipeptídicas e
montagem das subunidades de proteínas multiméricas
Processamento Proteolítico no RE
Biologia Celular
Tipos de oligossacarídeos nas glicoproteínas:
• Oligossacarídeos N-linked – ligação ao grupo amídico
da cadeia lateral da Asparagina (Asn) duma
sequência-sinal de glicosilação (Asn-X-Ser/Thr)
→ formados no retículo endoplasmático e complexo
de Golgi.
• Oligossacarídeos O-linked – ligação ao grupo
hidróxilo (OH) da cadeia lateral dos aminoácidos
Serina (Ser) ou Treonina (Thr)
→ formados no complexo de Golgi.
• Adição e processamento de carbohidratos (glicosilação)
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BIOLOGIA CELULAR 10
Glicosilação de Proteínas no RE
Lodish et al., 2008 Alberts et al., 2008
Biologia Celular
A maior parte das proteínas de
secreção (solúveis ou ligadas a
membranas) são glicosiladas.
Neste processo, um precursor
oligossacarídico é transferido em bloco
para as proteínas do RE.
Este precursor consiste de14 resíduos
de açúcar (2 x N-acetilglucosamina,
9 x manose e 3 x glucose).
O precursor é transferido para a cadeia
lateral de um grupo NH2 de uma
asparagina (Asn) que integra um sinal
de glicosilação � oligossacarídeos
“N-linked” ou “asparagine-linked”.
Biossíntese do complexo precursor dos oligossacarídeos N-linked(Lodish et al., 2008)
Biologia Celular
Glicosilação de Proteínas no RE
Prof. Augusto Dinis
BIOLOGIA CELULAR 11
Cooper & Hausman, 2009
Biologia Celular
Glicosilação de Proteínas no RE
Funções das cadeias laterais oligossacarídicas nas glicoproteínas:
• Intervêm na conformação tridimensional das glicoproteínas
• Ajudam a proteger as proteínas da proteólise
• Participam no reconhecimento e na adesão celular
• Funcionam como antigénios (ex.: nos grupos sanguíneos ABO)
Biologia Celular
Glicosilação de Proteínas no RE
Prof. Augusto Dinis
BIOLOGIA CELULAR 12
• Síntese de fosfolípidos derivados do glicerol (glicerofosfolípidos)– Fosfatidil-colina
– Fosfatidil-serina
– Fosfatidil-etanolamina
– Fosfatidil-inositol
• Síntese de colesterol
• Síntese de ceramida (precursor dos esfingolípidos)
Biologia Celular
Síntese de Lípidos no REL
Por serem extremamente hidrofóbicos, os lípidos são
sintetizados na membrana do REL (folheto citosólico), embora
os seus precursores provenham do citosol
As reações químicas necessárias à síntese dos lípidos
membranares são catalisadas por enzimas presentes no REL
Biologia Celular
Síntese de fosfoglicerídeos no REL
Lodish et al., 2008
Etapa 1: dois ácidos gordos previamente ativados com coenzima A são, sequencialmente,
esterificados a uma molécula de glicerol-3-fosfato, originando-se ácido fosfatídico
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BIOLOGIA CELULAR 13
Biologia Celular
Síntese de fosfoglicerídeos no REL
Lodish et al., 2008
Etapa 2: formação dos fosfodiésteres nos quais um dos ésteres é o 1,2-diacilglicerol e o
outro uma molécula hidrossolúvel como a colina, etanolamina, serina, inositol, etc…
Biologia Celular
Síntese de fosfoglicerídeos no REL
Lodish et al., 2008
Grande parte dos fosfoglicerídeos
sintetizados de novo no folheto
citosólico são translocados para o
folheto lumenal por ação de flipases
específicas
ane
Cooper & Hausman, 2009
Prof. Augusto Dinis
BIOLOGIA CELULAR 14
Biologia Celular
Como são distribuídos os lípidos pelos
diversos compartimentos intracelulares?
1. Lípidos membranares que se destinem a outras zonas do RE e ao invólucro
nuclear difundem lateralmente ao longo da membrana.
Alberts et al., 2008
2. Lípidos membranares que se destinem a outros compartimentos da via
da secreção são transportados em vesículas transportadoras.
3. Lípidos membranares que se destinem às
mitocôndrias, plastídeos ou peroxissomas
são transportados por proteínas solúveis
no citosol → proteínas de intercâmbio ou
transferência de fosfolípidos.