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DNA FINGER PRINT

PROF. ALEXANDRE S. OSÓRIO

VNTR’s - Variable Number of Tandem Repeats

• Em alguns cromossomos humanos, existem certas regiões em que uma pequena seqüência de DNA érepetida várias vezes

• Seqüências hipervariáveis (também chamadas polimórficas) repetitivas de 1 a 4 pb com distribuição ao longo do genoma.

• O polimorfismo destas seqüências é resultado de diferentes rearranjos envolvendo segmentos de DNA de tamanhos diferentes.

• Herança Mendeliana (os filhos sempre recebem metade dos alelos de origem materna e metade de origem paterna).

Número variável de repetições em seqüência

Exemplos de seqüências de VNTR’s:• Repetição de 1 base:GTAAAAAAAAAAAAAAAGGAT• Repetição de 2 bases:GTCACACACACACACACAGGAT (dinucleotídeo)• •Repetição de 3 bases:GTCACCACCACCACCACCACGGAT (trinucleotídeo)• •Repetição de 4 bases:GTCAGACAGACAGACAGAGGAT (tetranucleotídeo)

IMPRESSÕES DIGITAIS DO DNA (DNA FINGERPRINTS)

O QUE SIGNIFICA?

Com base no estudo de uma bateria de 12-20 VNTR’s, é possível obter perfis genéticos praticamente indivíduo-específicos, muito úteis na investigação de paternidade, identificação de vítimas e criminosos.

TÉCNICAS

• RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism).• PCR (Polymerase Chain Reaction).

Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição

1) Coleta de amostras biológicas que podem ser saliva, sangue, esperma e cabelo com raiz, entre outros.

2) Extração e purificação do DNA.3) Corte com enzimas de restrição (tesouras moleculares que reconhecem e cortam seqüências específicas do DNA).4) Eletroforese: onde, através de uma corrente elétrica, são separados os fragmentos de DNA por tamanho.A partir daí, é formada uma espécie de código de barras que é a identificação individual e intransferível de cada indivíduo.

As enzimas de restrição Fazem parte de um sistema da célula bacteriana denominado sistema de modificação-restrição. Este sistema consiste numa endonuclease de restrição.

O nome dado a enzima refere-se ao organismo de onde foi isolado. A primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual foi isolado.

Sítios de reconhecimento, modificação e clivagem por alguns enzimas de restrição

Enzima Local de restrição Organismo de origem

EcoRIEscherichia coli

HindIIIHaemophilus influenza

SmalSerratia marcescens

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Enzimas de restriçãoUma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva uma cadeia dupla de DNA sempre que identificar uma sequência específica de 4 a 8 pares de bases que seja o local de restrição da enzima (Smith & Wilcox, 1970).

As seqüências reconhecidas apresentam nas duas cadeias complementares seqüências idênticas mas invertidas –palíndromo.

PCR – REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE

• Aquecimento do DNA a ser amplificado a temperatura de 94°C por 1 minuto, o que provoca separação da dupla hélice. Depois, com a temperatura mais baixa, são empregadas as polimerases, que atuam em cada uma das cadeias do DNA, complementando os pares de bases.

• A cada ciclo, a quantidade de DNA-alvo é duplicada, de modo que em 10 ciclos obtêm-se 1024 vezes mais DNA-alvo; em 20 ciclos, cerca de 1 milhão de vezes mais DNA-alvo.

• Propicia um aumento na eficiência da análise de material genético• Polimerases são enzimas que ocorrem nas células e catalisam

reações de polimerização (formação de moléculas de cadeias longas)

• Pela técnica PCR promove-se a duplicação de trechos do DNA in vitro.

PCR

VISUALIZAÇÃO DO DNAUso de sondas: pequenos segmentos de DNA radioativados, cuja seqüência de bases é conhecida. Acoplam-se às seqüências de DNA das quais são complementares, ligando-se às mesmas.

SLP: detecta um único segmento de DNA repetitivo em um único cromossomo. Seu uso resulta em um padrão que contém no máximo duas bandas: uma para cada segmento de DNA reconhecido em cada membro do par de cromossomos homólogos. Para a obtenção de padrões mais característicos de cada pessoa, são necessárias várias sondas. Devido à sua sensibilidade, são empregadas nas investigações criminais.

SLP (single-locus probe)

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VISUALIZAÇÃO DO DNA

MLP: detecta vários segmentos de DNA repetitivo localizados em muitos cromossomos. O padrão obtido consiste em aproximadamente 20 a 30 bandas. Por isso, a probabilidade de duas pessoas tomadas ao acaso apresentarem todas as bandas exatamente com a mesma posição é extremamente baixa (1:10 trilhões).

MLP (multi-locus-probe)

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RESULTADOS DE TESTES

Mary Higgins foi violentada no Central Park em Nova York. Três suspeitos foram presos. O DNA revelou o verdadeiro agressor.

Mais de uma década após o assassinato da modelo infantil JonBenet Ramsey, o caso ainda parece inacabado e apoiado apenas em suposições - mesmo após o professor John Mark Karr, de 41 anos, ter confessado que estava com a menor no momento de sua morte, assegurando que foi um acidente e que estava apaixonado por ela. JonBenet Ramsey, de 6 anos, foi encontrada morta a pancadas e estrangulada no porão de sua casa, em Boulder, no dia 26 de dezembro de 1996, num crime que comoveu a sociedade americana. A menina era uma das modelos infantis mais famosas nos Estados Unidos. John Mark Karr foi preso, um dia depois de começar a ensinar em uma escola em Bangcoc, Tailândia, por solicitação dos Estados Unidos. Após o crime, em 1996, os pais de JonBenet, John e Patsy Ramsey, viveram sob as suspeitas levantadas por tablóides sensacionalistas, que sugeriam que os dois maltratavam e exploravam a menina com suas aparições em desfiles infantis. Além disso, John e Patsy eram acusados de terem ocultado informações cruciais para a investigação do caso.

RESULTADOS DE TESTESO assassinato de JonBenet Ramsey: um crime sem solução?

Tristeza ou remorso ?

RESULTADOS DE TESTESEm 1987: casal de noivos – Matthew Brock e Kelly Lynn Perry (também estuprada) – é achado baleado na cabeça (bala de rifle calibre 30) em Rodman Dam, área de recreação na Flórida.Principais suspeitos: os adolescentes Randall Scott Jones e Chris Reesh.

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RESULTADOS DE TESTES

Em agosto, Jones foi preso dirigindo a camionete roubada no Mississippi. Reesh foi preso no dia seguinte em Palatka, na Flórida.

Como os jovens insistiam em negar a participação no crime e ainda existiam algumas dúvidas sobre o caso, existia a necessidade de se conseguir mais provas. Sendo assim, foi realizado pela primeira vez o DNA fingerprinting para um caso criminal. A amostra de sêmen encontrada em Kelly foi comparada com as amostras de sangue dos supeitos.

Com os resultados do DNA fingerprinting o juri não hesitou em condenar Jones e Reesh.

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1) (UFMS – 2002) Durante o processo de investigação de um assassinato, o sangue da vítima, do acusado, e o encontrado na roupa do acusado, foram analisados. Verificou-se que o sangue encontrado na roupa era diferente do sangue do acusado, mas coincidia com o da vítima. Essa investigação é feita pelo DNA das pessoas e é tão segura quanto a da impressão digital, pelo menos em gêmeos não monozigóticos. No exame do DNA, é(são) feito(s)(001) o mapeamento de trechos do DNA, chamado recombinante.

E

(002) um código de seqüência de proteínas do RNA, que não seja do tipo barra, e sim do tipo curva.

E

BIOLOGIA – PROF. ALEXANDRE S. OSÓRIO

(004) o mapeamento de trechos do DNA, chamado complementar.

E

(016) o mapeamento de trechos do DNA, chamado “screening” genético

E

(008) o mapeamento de trechos do DNA, com seqüências de bases nitrogenadas, que não são genes (VNTRs — número variável de repetições em seqüência).

C

(032) um código de barra com o(s) tipo(s) de sangue que se deseja analisar, para verificar qual(is) código(s) coincide(m) ou é(são) diferente(s).

C

SOMA : 008+032 = 040

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2) (UFU-2006) O “DNA-fingerprint”, impressão digital do DNA, pode ser obtido de uma única célula que possua seu genoma intacto.A análise desse DNA pode ser utilizada para,EXCETOa) a identificação de suspeitos de crimes.b) a determinação de paternidade duvidosa.c) a pesquisa de material genético de animais extintos.d) a produção de alimentos transgênicos.

CORRETA : LETRA D

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3) (Unesp-2003) A ilustração apresenta o resultado de um teste de paternidade obtido pelo método do DNA-Fingerprint, ou “impressão digital de DNA”.

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4) (UFMS-2005) As enzimas de restrição, uma das principais ferramentas empregadas na tecnologia do DNA recombinante, são altamente especializadas, cortando o DNA apenas em locais específicos (sítios de restrição), identificados por certas seqüências de bases nitrogenadas. Atualmente, são conhecidas muitas dessas enzimas, a maior parte de bactérias, sendo mais comumente utilizadas aquelas que reconhecem seqüências de 4, 6 ou 8 pares de bases.

↓

−G−C−G−G−C−C−G−C−

−C−G−C−C−G−G−C−G−

↑

Nocardia otitidisNotI8 pares de bases

↓

−G−A−A−T−T−C−

−C−T−T−A−A−G−

↑

Escherichia coliEcoRI6 pares de bases

↓

−G−C−G−C−

−C−G−C−G−

↑

Haemophilushemolyticus

HhaI4 pares de bases

Seqüência de bases eposição do corte

Organismo onde a enzima é

encontrada

Enzima

Com relação às enzimas de restrição, é correto afirmar que

(001) sua função natural nas bactérias seria proteger o organismo contra os

bacteriófagos, inativando o DNA viral antes de duplicar.

C

(002) enzimas que reconhecem sítios de restrição compostos por 4 pares de bases, clivam o DNA em média a cada 1.024 pares de bases.

E – A distância entre os sítios de restrição variam para cada

indivíduo e dependem da posição dos palíndromos na

molécula de DNA.

(004) todas as enzimas de restrição produzem fragmentos de DNA com o mesmo tamanho, ou seja, com o mesmo número de pares de bases.

E – Cada enzima de restrição identifica um tipo específico de

palíndromos na molécula de DNA.

(008) o sítio de reconhecimento dessas enzimas é chamado palíndromo deDNA, o que significa que ambos os filamentos têm a mesma seqüência debases, mas em orientação antiparalela.

C

(016) qualquer molécula de DNA, de vírus ou até de humanos contém sítios-alvo para as enzimas de restrição puramente ao acaso, e, portanto, pode ser cortada em fragmentos de tamanho definido.

C

(032) se duas moléculas diferentes de DNA são cortadas com a mesma enzima de restrição, os fragmentos obtidos não poderão ser utilizados para a formação de quimeras de DNA, pois apresentam tamanhos diferentes.

E

SOMA = 001+008+016 = 025

5) (PUCRS-2008) Os exames de identificação molecular (DNA) de pessoas têm sido muito úteis para solucionar casos forenses ou de investigação de paternidade, já que se baseiam na identificação de marcasgenéticas que, herdadas, devem aparecer simultaneamente no filho e em seu pai e/ou em sua mãe.No pior acidente aéreo da América Latina, ocorrido com o vôo TAM 3054,no qual 199 pessoas perderam a vida, equipes de peritos analisaram o DNA das vítimas fatais, comparando com o DNA de pessoas aparentadas, echegam a resultados semelhantes aos apresentados no quadro seguinte:

LETRA : A

6) (UFOP-2009) Sobre os modernos testes de paternidade, assinale o que for correto.a) A probabilidade de erro nos testes de paternidade pelo exame do DNA, segundo alguns cientistas afirmam, é de cerca de 1 caso em 5 bilhões. Na prática, portanto, o exame pode ser considerado 100% seguro.b) O mais moderno e preciso teste para determinar a paternidade é feito a partir do RNA do indivíduo.c) Os únicos materiais utilizados para um teste de paternidade são o sangue e o esperma.d) A comprovação da paternidade pelo exame do DNA é feita comparando-se as “impressões genéticas” dos pais e do filho. Caso as faixas de DNA do filho que equivalem às faixas da mãe forem idênticas às do suposto pai, comprova-se a paternidade.

LETRA : A

7) (Unicamp-2009) Testes de paternidade comparando o DNA presente em amostras biológicas são cada vez mais comuns e são considerados praticamente infalíveis, já que apresentam 99,99% de acerto. Nesses testes podem ser comparados fragmentos do DNA do pai e da mãe com o do filho. Um teste de DNA foi solicitado por uma mulher que queria confirmar a paternidade dos filhos. Ela levou ao laboratório amostras de cabelos dela, do marido, dos dois filhos e de um outro homem que poderia ser o pai. Os resultados obtidos estão mostrados na figura abaixo.

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a) Que resultado a análise mostrou em relação à paternidade do Filho 1? E do Filho 2? Justifique.

a) O filho 1 é do outro homem porque não há coincidência de bandas do

DNA com as do marido.

O filho 2 é do marido porque as barras são coincidentes.

b) Num teste de paternidade, poderia ser utilizado apenas o DNA mitocondrial? Por quê?

b) Não, porque o DNA mitocondrial tem apenas origem materna.

8) (PUC-RS 2004) A origem africana do humano moderno vem sendo proposta com base em evidências genéticas. Uma genealogia baseada em 182 tipos de DNA mitocondrial aponta para a existência de um ancestral comum, uma fêmea africana. Os estudos sobre DNA mitocondrial podem revelar o ancestral maternode uma pessoa, uma vez quea) apenas as células femininas possuem mitocôndrias.b) todas as mitocôndrias, e o DNA que elas têm, procedem do citoplasma do óvulo.c) o cromossomo X está no DNA mitocondrial.d) as mitocôndrias de células masculinas não possuem DNA.e) as mitocôndrias dos espermatozóides contêm o cromossomo Y.

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DNA mitocondrial• O DNA mitocondrial é

transmitido através do ovócito materno para filhos e filhas. O ovócito é bem suprido de mitocôndrias, mas o espermatozóide contém poucas e mesmo essas poucas não persistem nos descendentes. Segundo, não trocam genes com outros segmentos genômicos (não se recombinam), sendo transmitidos às gerações seguintes em blocos de genes (denominados haplótipos). Há, assim, uma história genealógica imutável.

DOENÇAS CAUSADAS POR MUTAÇÕES NO DNA MITOCONDRIAL

Cegueira permanente ou temporária decorrente de lesões no nervo óptico.

Neuropatia óptica hereditária de Leber

Perda progressiva das habilidades motoras e verbais; e degeneração do gânglio basal do encéfalo . É potencialmente letal na infância

Síndrome de Leigh

CPEO combinada com deterioração da retina, doenças cardíacas, perda da audição, diabetes e falhas renais.

Síndrome de Kearns-Sayre

Movimentos anormais devido a rigidez muscular, freqüentemente acompanhada de degeneração do gânglio basal do encéfalo.

Distonia

Níveis altos de glicose no sangue, o que causa diversas complicações.

Diabetes melito

Paralisia dos músculos que movimentam o globo ocular e miopatia mitocondrial

Oftalmoplegia progressiva externa (CPEO)

Perda progressiva da capacidade cognitivaMal de Alzheimer

SINTOMASDOENÇA

8) (PUC-RS 2004) A origem africana do humano moderno vem sendo proposta com base em evidências genéticas. Uma genealogia baseada em 182 tipos de DNA mitocondrial aponta para a existência de um ancestral comum, uma fêmea africana. Os estudos sobre DNA mitocondrial podem revelar o ancestral maternode uma pessoa, uma vez quea) apenas as células femininas possuem mitocôndrias.b) todas as mitocôndrias, e o DNA que elas têm, procedem do citoplasma do óvulo.c) o cromossomo X está no DNA mitocondrial.d) as mitocôndrias de células masculinas não possuem DNA.e) as mitocôndrias dos espermatozóides contêm o cromossomo Y.

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CORRETA : LETRA B

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9) (UFSC-2002) A revista Época, em 30/07/2001, anunciou em sua capa: O DNA não falha. O título referiu-se a uma reportagem da qual foi extraído o trecho abaixo:Depois da pílula anticoncepcional, que transferiu para as mulheres o

controle da fertilidade, da fertilização “in vitro” e da barriga de aluguel,

métodos que permitem a gravidez sem sexo, o teste de DNA surge como

uma das grandes descobertas do mundo ocidental. Para muitos

especialistas [...] a técnica só traz benefícios. Outros acreditam que

reflexos da descoberta vão alterar o universo das relações familiares.

Sobre a utilização dos testes de DNA, e as implicações dessa prática para os indivíduos e a sociedade em geral, é CORRETO afirmar que:(001) os testes de DNA podem ser empregados para finalidades de investigação de paternidade e também para identificação de supostos criminosos, como em casos de estupros e assassinatos.

C

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(002) o melhor material biológico para um teste de DNA é aquele extraído de núcleos de glóbulos brancos do sangue, mas outros tecidos, como pele e ossos, também podem ser utilizados.

E

(004) para uma investigação de paternidade, a partir de testes de DNA, coletam-se amostras biológicas do suposto pai, não sendo necessário obter informações do(a) filho(a) e de sua mãe.

C

(008) os exames de investigação de paternidade, a partir de testes de DNA, oferecem, atualmente, resultados com exatidão total, não restando qualquer questionamento ou dúvida sobre os diagnósticos apresentados.

C

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(016) o custo do exame de DNA, ainda muito elevado no Brasil, é um dos fatores que dificulta sua utilização em larga escala pelos segmentos populacionais menos favorecidos economicamente.

C

(032) a criação de bancos de dados, com a identificação genética de criminosos e suspeitos, em países como a Inglaterra, vem gerando grande polêmica, uma vez que podem ser entendidos como uma violação da privacidade biológica dos indivíduos.

C

SOMA : 001+002+008+016+032 = 059