Anlises epidemiolgicas e populacionais em Trypanosoma cruzi a
partir de estudos de microssatlites Juliana Ramos Pimenta
Orientadora: Prof. Andra Mara Macedo Co-orientador: Prof. Srgio
Danilo Pena
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Trypanosoma cruzi
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Apresentaes Clnicas Doena de Chagas
CardacaDigestivaIndeterminada ? Cardio-digestiva
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Fatores determinantes da variabilidade clnica Caractersticas
genticas do hospedeiro Caractersticas genticas do parasita
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Estudos Moleculares Correlacionar com formas clnicas da doena
de Chagas Caracterizar geneticamente os parasitas
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Microssatlites de DNA
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AA ABACBBBCCC Amplificao de microssatlites (PCR) alelo A alelo
B alelo C
Microssatlites so capazes de traduzir as semelhanas e diferenas
entre as cepas de T. cruzi ?
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Nomenclatura, 1999 Trypanosoma cruzi T. cruzi T. cruzi I T.
cruzi II Tipo III - Andrade, 1974 Linhagem 2 - Souto, 1996 Z1 -
Miles, 1977 Grupo 1 - Tibayrenc, 1995 Ribodemas II/III - Clark
& Pung, 1994 Tipo II - Andrade, 1974 Linhagem 1 - Souto, 1996
Z2 - Miles, 1977 Grupo 2 - Tibayrenc, 1995 Ribodemas I - Clark
& Pung, 1994 ZA - Romanha, 1979 Tipo I - Andrade Z3 - Miles ZB
- Romanha Grupo 1/2 - Souto ?
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Analisar os 8 locos de microssatlites em um grande nmero de
cepas de T. cruzi e investigar as relaes filogenticas entre elas.
Objetivo 1
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A B CD C - Policlonal D - Policlonal A - Monoclonal
(homozigoto) B - Monoclonal (heterozigoto)
MonoclonalPoliclonalTotal Humanos 62 (80%)16 (20%)78 No Humanos 28
(67%)14 (33%)42 6 (55%)5 (45%)11 TOTAL 96 (74%)35 (26%)131 Z3 4
(34%)8 (66%)12 ? Anlise 131 cepas
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rvore 97 cepas T. Cruzi II T. Cruzi I rDNA 1/2 rDNA 2 rDNA 1
rDNA 2 mini-exon 1
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Diferentes parasitas Diferentes formas clnicas
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Modelo Histotrpico Clonal da Doena de Chagas Infeco policlonal
Manuteno de parasitas in vitro Parasitas disponveis para anlise Nem
todos os clones so capazes de estabelecer infeco Isolamento Anlises
diretamente dos tecidos REDUO POPULACIONAL
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Col1.7G2 Cor Reto Diaf Esof SanJG LSSP-PCR em tecidos de
camundongos infectados Capaz de detectar DNA do parasita nos
tecidos. Dirigido ao kDNA. Perfil aleatrio complexo que no
corresponde a amplificao de 1 nico loco. Vantagens Desvantagens
Marcadores unilocais especficos
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Microssatlites de DNA
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Full-nested PCR ATAATAATAATAATAATA 53 TATTATTATTATTATTAT 53 DNA
molde inicial Primer externo F ATAATAATAATAATAATA 53
TATTATTATTATTATTAT 53 Primer externo R 5 3 ATAATAATAATAATAATA 3
TATTATTATTATTATTAT 5 Primer int. F Primer int. R ATAATAATAATAATAATA
53 TATTATTATTATTATTAT 53 1 a amplificao 2 a amplificao Produto
final
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Isolar e caracterizar novos locos de microssatlites no genoma
do T. cruzi. Objetivo 2
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Identificao dos locos de microssatlites
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8 locos de microssatlites selecionados
TcAAT-01TcTAC-01TcAAAT-01TcTAT-01 TcTAC-02 TcAAT-01 TcAAAT-01
TcATA-01TcTAC-02TcATT-01TcTGTC-01
Caracterizao dos novos locos Anlises de 36 cepas de T. cruzi.
TcAAT-01 TcTAC-01 TcAAAT-01 TcTAT-01 Nmero de Alelos Desequilbrio
de ligao Equilbrio de Hardy-Weinberg
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Otimizar a amplificao de locos de microssatlites de T. cruzi
diretamente em amostras de tecidos chagsicos. Objetivo 3
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6 meses Col1.7G2 + JG (50+50 tripomastigotas) RetoCorao Infeces
experimentais
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Microssatlites Resultados Amplificao em tecidos de camundongos
infectados experimentalmente com T. cruzi. LSSP-PCR
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Resultados Perfis dos microsatlites amplificados nos tecidos
dos camundongos e analisados no sequenciador automtico ALF.
Tamanhos dos alelos detectados nos tecidos X alelos apresentados
pelas cepas originais utilizadas na infeco mista inicial.
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DNA hum. Tecidos de pacientes (1:10) DNA T.cruzi Resultados
preliminares em tecidos humanos TcTAT-01
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Como estrutura das populaes de T. cruzi ? Como estrutura das
populaes de T. cruzi ?
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Ciclo silvestre Ciclo domstico Infeces policlonais de T.
cruzi
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Anlises populacionais das cepas de T. cruzi Existe
possibilidade de recombinao gentica entre os clones? Quantos clones
formam uma cepa multiclonal? Estes clones compartilham
caractersticas ou so heterogneos?
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Isolado de um paciente CEPA (JU24) JU24- Clone1 JU24- Clone2
JU24 Anlises populacionais das cepas de T. cruzi
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Otimizar a amplificao de locos de microssatlites em clulas
nicas de T. cruzi separadas atravs de FACS Vantage. Objetivo 4
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Epimastigotas de T. cruzi Separao das clulas nicas atravs do
FACS Fluorescence Activated Cell Sorter
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Separao das clulas nicas atravs do FACS Microplacas de 96 wells
Epimastigotas de T. cruzi PCR microssatlites Eletroforese
Sequenciador automtico de DNA Fluorescence Activated Cell
Sorter
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Controle da clonagem A - Well programado para conter 5 esferas
B - Well programado para conter 1 esfera C - Well programado para
conter 2 esferas
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Resultados 1 - Well programado para conter 1 clula 2 - Well
programado para conter 1 clula 3 - DNA de JG 4 - DNA de
Colombiana
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PCR Multiplex dos locos de microssatlites em clulas nicas 1 o
round TcAAT-01 TcAAAT-01 TcTAT-01 2 o round TcAAT-01 TcAAAT-01
TcTAT-01
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PCR Multiplex dos locos de microssatlites em clulas nicas
Perfis dos microsatlites amplificados nas clulas nicas de T. cruzi
analisados no sequenciador automtico ALF. Tamanhos dos alelos
detectados X alelos das cepas originais utilizadas na clonagem
mista inicial.
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Amplificao da cepa 4176 TcAAAT-01 e TcTAC-02
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Anlises de microssatlites foram capazes de discriminar entre as
cepas de T. cruzi mas tambm identificaram as semelhanas entre elas,
em concordncia com outros marcadores moleculares. Foram
padronizadas reaes de PCR nested para os novos locos de
microssatlites de T. cruzi que foram sensveis o bastante para
detectar DNA do parasita diretamente em tecidos infectados de
camundongos e humanos. Principais Concluses Foram identificados 8
novos locos de microssatlites polimrficos no genoma de T. cruzi.
Foi padronizada a tcnica capaz de amplificar microssatlites em
clulas nicas de T. cruzi separadas por FACS cell sorter.
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Colaboradores Dr. Egler Chiari, Afonso e Orlando (Dep.
Parasitologia, ICB/UFMG) Dr. Octvio Fernandes e Regina Mangia
(FIOCRUZ, RJ) Dra. Bianca Zingales (USP, SP) Dr. Michel Tybairenc
(Montpellier, Frana) Dra. Riva de Paula Oliveira e Helder (UFOP)
Dra. Santuza Teixeira, Dra. Maria de Ftima Horta, e o pessoal do
laboratrio Funcionrios: Neuza, Ktia, Mriam e Cssio Povo do LGB Dra.
Eliane Lages (Faculdade de Medicina do Tringulo Mineiro) Dr. Olindo
Martins Filho (CPqRR)
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Laboratrio de Gentica - Bioqumica, UFMG Grupo dos Cruzi Jorge
Simone Renato Prof. Andra Macedo Juliana E o Charles...