ANDREWS KRUPINSKI EMERENCIANO
EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FAGOCÍTICA DO
EQUINOCROMO EM OURIÇOS-DO-MAR LYTECHINUS VARIEGATUS
(LAMARCK, 1816)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para a obtenção do Título de Mestre em Ciências (Biologia Celular e Tecidual)
São Paulo 2014
ANDREWS KRUPINSKI EMERENCIANO
Extração, purificação e avaliação da atividade fagocítica do equinocromo em
ouriços-do-mar Lytechinus variegatus (Lamarck, 1816)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para a obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Biologia Celular e Tecidual Orientadora: Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da Silva Versão original
São Paulo
2014
Aos meus pais, Ivone Cecilia
Krupinski Emerenciano e Airton
Emerenciano, por todo apoio e
motivação para seguir em frente. A
Deus.
Dedico!
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Ivone e Airton, por me terem dado educação, valores e por me terem
ensinado tudo, me apoiando em todas as decisões e vibrando a cada conquista. A
vocês que, muitas vezes, renunciaram aos seus sonhos para que eu pudesse realizar
o meu, partilho a alegria deste momento. Amo vocês.
Ao meu orientador, Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da Silva, pela amizade,
oportunidade, confiança e paciência. Obrigado pelos ensinamentos, por confiar no
meu trabalho, e dar liberdade para o meu crescimento pessoal e profissional.
Ao Prof. Dr. João Carlos Shimada Borges, pela amizade, confiança e por abrir as
portas da sua casa, me acolhendo tão bem. Obrigado pelos ensinamentos, toda ajuda,
pelos momentos de descontração e por me apresentar ao Laboratório de
Histofisiologia Evolutiva. Valeu gordinho...
Aos meus colegas do Laboratório de Histofisiologia Evolutiva, pelo suporte e todos os
momentos juntos: Alfonso, Camila, Débora, Douglas, Flávia Gabriel, Joana, João,
Karina, Leandro, Lígia, Luciana, Paola, Paula, Renan, Renata, Ricardo, Tânia, Yoel.
À amiga, Luciana Dzik, que além da amizade incondicional, me proporcionou bons
momentos de alegria e descontração, por sempre estar do meu lado, pelas conversas,
por sempre me incentivar a continuar, vibrar com as minhas conquistas, pelas loucuras
e abraços, e a seus pais, Renato e Sandra Dzik, que me acolheram como um filho.
Hoje sei que, além de amiga você é uma Irmã e passou a fazer parte da minha família.
Aos colaboradores, Débora Alvares Leite Figueiredo, Douglas Amaral dos Santos,
João C. Shimada Borges e Paola Cristina Branco, por toda a ajuda, pelas sugestões,
pela ajuda nos experimentos no CEBIMar, amizade e pelos bons momentos ao longo
desses anos de convivência.
À Emilia Ribeiro, que além de uma excelente técnica, se tornou uma grande e
inestimável amiga, abriu as portas de sua casa e me acolheu tão gentilmente.
Obrigado por toda ajuda, amizade e os valiosos ensinamentos.
Ao Leandro Pressinotti, pelas longas conversas, conselhos e ensinamentos valiosos
e por auxiliar na análise estatística.
Aos amigos Diogo Palermo e Joana Mona, por todos os ensinamentos, ajuda e
amizade, pelos momentos de descontração jogando cartas e tomando whisky.
Ao Ricardo Borges, por todas as conversas, conselhos e reforços positivos.
À Karina Rezende, por toda a ajuda, pela amizade ao longo desses anos e claro as
risadas e conversas no trem.
Aos secretários do Departamento Celiana, Paulo, Eloize e Ana Lúcia, por toda a ajuda.
Em especial à Regina Valbom, pelo apoio infinito, por estar sempre disposta a ajudar
e pelos prazos cumpridos.
Às Profs Marinilce Fagundes dos Santos e Chao Yun Irene Yan pela orientação
acadêmica. A elas, meus agradecimentos.
Aos técnicos do CEBIMar, Alex, Eduardo, Elso, Joseilto e Joseph (In memoriam), por
toda a ajuda nas coletas, durante os experimentos, pelas risadas e saídas de barco
nas horas vagas.
Aos secretários Emerson, Graça, Simone e todos os funcionários do CEBIMar, pelo
apoio e ajuda com a burocracia durante as estadias.
Aos amigos, Andrea Arevalo, Aline Olivé, Christiane Araujo, Eloíza Rezende, Fábio
Feitoza, Felipe Souza e Magna Magalhães, pela ajuda, risadas e momentos de
descontração.
Ao Prof. Dr. Daniel Carvalho Pimento do Laboratório de Biofísica e Bioquímica do
Instituto Butantan, por abrir as portas do seu laboratório para que eu realiza-se todos
os experimentos de purificação.
À Juliana Mozer Sciani, por me dar todo o suporte para a realização das etapas de
purificação e por toda a ajuda.
Aos amigos do Araçá, André, Bárbara, Camila, Carol, Cesar, Fernanda, Latinha, Lidia,
Marcella, Marina, Marinella, Milton, Nemias, Priscila, Profª Carmem, Profª Lucy,
Rafael, Riguel, Silvia, Thiago e Valéria, por todos os ensinamentos, amizade e
momentos de alegria.
Aos amigos da disciplina de Imuno do Butantan, Aline, Bruno, Giovanna, Ivana, Katie,
Luis, Thalita, Thiago e Marcela, pela ajuda, por ficarem me zoando depois da
apresentação, pelas risadas, as festas, os bares e pelos momentos de alegria.
Aos Profs. Vicente Gomes, Maria Inês Borella e José Roberto Kfoury pelas sugestões
durante o exame de qualificação.
Aos professores do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, pelos
ensinamentos em aulas, contribuições e ajudas.
A todos os alunos do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento.
Aos técnicos de laboratório, Braz, Junior, Marcos, Marley e Gabriella pelo apoio
técnico.
Aos funcionários da biblioteca e a todos os funcionários do ICB.
A todos os meus familiares, tios e primos. Não citarei nomes, para não me esquecer
de ninguém. Mas há aquelas pessoas especiais que diretamente me incentivaram.
Às minhas tias, Mari, Salete e Lúcia, por sempre estarem ao meu lado, pelo carinho e
afeto que sempre tiveram por mim, por vibrarem a cada vitória e pelos momentos de
alegria e descontração. Amo vocês.
Aos meus primos, que sempre estiveram ao meu lado, acompanhando cada
momento, Jociane, Francis, Sophia, Junior, Thaylla, Bianca, Erick e as minhas
pequenas Paula, Karoll e Kamilla.
Aos meus irmãos, Wanderson, Amanda e Fernanda (In memoriam), por
compartilharem todos os momentos bons e ruins, pelas risadas, amizade e toda
motivação.
Aos meus sobrinhos, Pedro e Laura, por deixarem minha vida mais alegre com seus
sorrisos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa
concedida (2011/14129-0).
Enfim, à todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram com o presente
trabalho, MUITO OBRIGADO!
“Que os vossos esforços desafiem
as impossibilidades, lembrai-vos
de que as grandes coisas do
homem foram conquistadas do
que parecia impossível.”
Charles Chaplin
RESUMO
Emerenciano AK. Extração, purificação e avaliação da atividade fagocítica do equinocromo em ouriços-do-mar Lytechinus variegatus (Lamarck, 1816). [dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Tecidual)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2014.
Em ouriços-do-mar, os esferulócitos vermelhos são responsáveis pela biossíntese do equinocromo, um pigmento naftaquinônico considerado antioxidante e bactericida, atuando nas infecções e defesa do organismo, no entanto seu papel na resposta imune permanece pouco elucidado. Estas células são consideradas biomarcadores, uma vez que em condições de estresse sua proporção encontra-se alterada. O presente trabalho avaliou a reposta imune inata de ouriços-do-mar Lytechinus variegatus, por meio da atividade fagocítica frente a diferentes concentrações de equinocromo (50 e 100 µg/ml). Para tanto, o equinocromo foi extraído do líquido celomático e purificado por RP-HPLC (reversed phase high-performance liquid chromatography). Nossos resultados demonstraram que o equinocromo em ambas as concentrações modula positivamente a fagocitose, aumentando a quantidade de células fagocitando. A concentração de 50 µg/ml foi capaz de ativar os amebócitos fagocíticos (AF), e aumentar a quantidade de AF com quatro ou mais leveduras fagocitadas. Já na concentração de 100 µg/ml, além da ativação dos AF, aumentou também, a quantidade de AF com uma, duas, quatro ou mais leveduras fagocitadas, sugerindo uma atuação dose-dependente. Desta forma, os dados apresentados demonstram que o equinocromo exerce um importante papel na resposta imune, trazendo novas perspectivas para acrescentar a literatura, contribuindo assim, para uma melhor compreensão do papel dos esferulócitos vermelhos em ouriços-do-mar. Palavras-chave: Equinocromo. Imunidade inata. Fagocitose. Ouriço-do-mar. Lytechinus variegatus.
ABSTRACT
Emerenciano AK. Extraction, purification and evaluation of the phagocytic activity of echinochrome in the sea urchins Lytechinus variegatus (Lamarck, 1816) [dissertation (Cell and Tissue Biology)]. Sao Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2014.
In sea urchins, the biosynthesis of echinochrome is mediated by red sphere cell. This naphthoquinone pigment presents antioxidant and bactericidal characteristics, acting in infections and host defense. However, the echinochrome role in immune response remains unclear. Stress conditions alter the number of red sphere cell, taking them to be considered biomarkers. In this study, we evaluated the innate immune response of the sea urchin Lytechinus variegatus. To this purpose, the echinochrome was extracted and purified from coelomic fluid by RP-HPLC (reversed phase high-performance liquid chromatography). Finally, phagocytic amoebocytes were exposed to different concentrations of echinochrome (50 and 100 mg/ml), when phagocytic activity was analysed. Here, we showed that echinochrome positively modulate phagocytosis, increasing the number of phagocytizing cells. The concentration of 50 mg/ml activated phagocytic amoebocytes (AF), and increased the number of AF containing four or more phagocytosed yeasts. For the other hand, at 100 mg/ml exposure, the activation of AF also increased the number of AF with one, two, four or more yeast phagocytosed, suggesting a dose-dependent activity. Thus, the data presented demonstrated that echinochrome plays an important role in the immune response. Additionally, this study contributed to a better understanding of the role of red sphere cell in sea urchins. Keywords: Echinochrome. Innate immunity. Phagocytosis. Sea urchin. Lytechinus variegatus.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AF – Amebócito fagocítico
CTR – Grupo controle
CV – Célula vibrátil
EI – Esferulócito incolor
EV – Esferulócito vermelho
MS – Espectrometria de massa
NF𝜅𝐵 – “Nuclear fator kappa B”
RP-HPLC – “Reversed Phase - High Performance Liquid Chromatography”
Q1/2/3/4 – quadrante 1, 2, 3 e 4
TFA – ácido trifluoroacético
TLR – Toll like receptor
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Filogenia do ouriço-do-mar............................................................. 19
Figura 2 – Anatomia do ouriço-do-mar............................................................ 21
Figura 3 – Esquema representativo das etapas da fagocitose........................ 29
Figura 4 – Espécime do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus........................ 32
Figura 5 – Georeferenciação do ponto de coleta............................................. 33
Figura 6 – Fluxograma da metodologia empregada para a obtenção do material, análise e ensaio................................................................................. 39
Figura 7 – Fotomicrografias de células a fresco do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus em contraste de fase....................................................................... 41
Figura 8 – Proporção dos tipos celulares do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus (n=10)............................................................................................. 42
Figura 9 – Perfil cromatográfico obtido através da injeção do extrato contendo o pigmento de Lytechinus variegatus, λ=214.................................... 43
Figura 10 – Perfil cromatográfico obtido através da injeção do extrato contendo o pigmento de Lytechinus variegatus, λ=475.................................... 44
Figura 11 – Perfil cromatográfico obtido para a repurificação do pico coletado, em coluna C-18, λ=214..................................................................... 45
Figura 12 – Perfil cromatográfico obtido para a repurificação do pico coletado, em coluna C-18, λ=475..................................................................... 47
Figura 13 – Espectro de massa do último pico coletado para repurificação em RP-HPLC................................................................................................... 48
Figura 14 – Fotomicrografias de ensaio de fagocitose in vitro com células do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus em contraste de fase............................. 49
Figura 15 – Atividade fagocítica de amebócitos fagocíticos expostos a diferentes concentrações de equinocromo em ouriços-do-mar Lytechinus variegatus......................................................................................................... 51
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 17
1.1 Ouriços-do-mar........................................................................................... 18
1.2 Imunidade inata.......................................................................................... 22
1.3 Células do sistema imune.......................................................................... 24
1.4 Fagocitose.................................................................................................. 27
2 OBJETIVO.................................................................................................... 31
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 32
3.1 Coleta dos animais..................................................................................... 32
3.2 Transporte e manutenção dos animais...................................................... 33
3.3 Procedimentos gerais para obtenção do líquido celomático...................... 34
3.4 Classificação dos celomócitos.................................................................... 34
3.5 Contagem relativa e absoluta dos celomócitos.......................................... 35
3.6 Ensaio de viabilidade celular...................................................................... 35
3.7 Extração do equinocromo........................................................................... 36
3.8 Purificação do equinocromo por HPLC...................................................... 36
3.9 Análise por espectrometria de massa........................................................ 37
3.10 Contagem de leveduras Saccharomyces cerevisiae................................ 37
3.11 Ensaio de fagocitose in vitro..................................................................... 38
3.12 Análise estatística..................................................................................... 38
4 RESULTADOS.............................................................................................. 40
4.1 Contagem diferencial dos celomócitos....................................................... 40
4.2 Viabilidade celular...................................................................................... 42
4.3 Extração e purificação do equinocromo..................................................... 42
4.4 Análise por espectrometria de massa (MS)............................................... 46
4.5 Avaliação da atividade fagocítica in vitro.................................................... 49
5 DISCUSSÃO................................................................................................. 52
6 CONCLUSÃO............................................................................................... 58
REFERÊNCIAS................................................................................................ 59
17 INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
Os ouriços-do-mar são equinodermos que encontram-se bem estabelecidos e
amplamente distribuídos, ao redor de todos os continentes. Estes animais pertencem
à classe Echinoidea, que apresenta características únicas e altamente especializadas,
como o sistema aquífero, desenvolvimento deuterostômico e pés ambulacrais
(Hyman, 1955; Smith et al., 1992). Os invertebrados marinhos pertencentes ao filo dos
equinodermos desempenhando importantes papéis nas comunidades ou
ecossistemas que habitam (Menge et al., 1994). Diferentes aspectos deste filo vêm
sendo avaliados, dentre os quais destacam-se os imunológicos, que envolvem o
estudo de mecanismos de defesa exercidos por seus celomócitos, presentes no
celoma perivisceral, e principais responsáveis pela resposta imune inata (Gross et al.,
1999).
A posição filogenética dos equinodermos apresenta uma base comum com os
vertebrados (Hibino et al., 2006), de forma que padrões similares de emergência de
moléculas relacionadas à imunologia, sugerem que alguns dos mecanismos celulares
empregados pelos vertebrados, para regulação da diversidade adaptativa e
receptores, podem ter emergido de sistemas antes estabelecidos em ancestrais
deuterostômicos, com a finalidade de controlar o sistema inato (Litman et al., 2005;
Litman et al., 2007)
Na última década, alguns autores observaram o aumento do número de
celomócitos e esferulócitos vermelhos em ouriços-do-mar submetidos a diferentes
tipos de estresse (Borges et al., 2010; Branco et al., 2012; Matranga et al., 2005; Smith
et al., 2010), passando a considerar estas células como biomarcadoras de estresse
ambiental (Coteur et al., 2002). Apesar do crescente número de estudos envolvendo
os celomócitos, a grande maioria baseia-se na análise destes como resposta a
mudanças ambientais, havendo um déficit de dados relacionados à função biológica
destas células.
Sabe-se que, ao degranularem, os esferulócitos vermelhos liberam equinocromo
(Johnson, Chapman, 1970), substância que possui atividade bactericida e
antioxidante (Service, Wardlaw, 1984), de forma que diversos estudos apresentem
como principal análise, as características farmacológicas desta substância. Com base
nisso, estudos que avaliem a função biológica dos diferentes tipos celulares de
ouriços-do-mar tornam-se necessários.
18 INTRODUÇÃO
Levando em conta a mudança de concentração do equinocromo mediante
alterações ambientais e diferentes condições de estresse, este pigmento é
considerado um biomarcador sensível e confiável (Bay et al., 1983). Desta forma,
avaliar o papel dele na resposta imune inata de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus,
apresenta grande valia.
1.1 Ouriços-do-mar
Os ouriços-do-mar são invertebrados marinhos, pertencentes a classe
echinoidea, que encontra-se no Filo Echinodermata. Este filo é composto por
organismos celomados, com simetria bilateral na fase larval, mas pentaradial na fase
adulta, apresentando duas regiões corporais: oral e aboral. O sistema nervoso
apresenta-se simples e as redes dos cordões nervosos seguem o padrão pentaradial.
Os animais deste filo são exclusivamente marinhos e bentônicos, sendo muitos
deles sésseis ou com reduzida capacidade de locomoção. Possuem um esqueleto
interno composto por ossículos calcários, podendo estes serem mais flexíveis, como
nas estrelas-do-mar e ofiuroides, ou mais rígidos - formando uma superfície
esquelética - como nos ouriços-do-mar e nas bolachas-do-mar, e apresentam ainda
espinhos ou tubérculos fixos ao esqueleto (Hyman., 1955).
Além de constituírem um dos grupos de grande importância das comunidades
bentônicas, ocupando diferentes níveis tróficos, podendo ser encontrados em zonas
polares e tropicais, com ampla distribuição geográfica (Pearse, 2006; Ventura et al.,
2006). Estes animais são essencialmente herbívoros, apresentando um trato
digestório completo – composto por boca e ânus – ausente em ofiuróides e asteróides.
As espécimes podem ser diferenciadas de acordo com o sexo, sendo dióicas, e a
fecundação ocorre no meio externo.
Características únicas, como a presença de sistema hidrovascular ou
ambulacrário, diferem estes animais de outros grupos. Este sistema é constituído por
um singular sistema de canais celomáticos e apêndices superficiais, que são
prolongamentos ocos denominados pés ambulacrais, podendo atuar na captura de
alimentos, locomoção ou percepção ambiental. (Hyman, 1955; Ruppert, Barnes,
1996).
No mundo, existem aproximadamente 7.000 espécies e 13.000 fósseis (Pawson,
2007), sendo que sua classificação apresentou alterações ao longo do tempo, e
19 INTRODUÇÃO
somente o avanço das tecnologias para o estudo da embriogênese em invertebrados
permitiu que Huxley (1875) propusesse o grupo Deuterostomata (região da boca é
formada depois da região anal). Posteriormente, esse grupo passou a englobar quatro
Filos: Chaetognatha, Echinodermata, Hemichordata e Chordata (Cuénot, 1948). O filo
echinodermata é atualmente subdividido em cinco classes: Crinoidea (lírios-do-mar),
Asteroidea (estrelas-do-mar), Ophiuroidea (serpentes-do-mar), Echinoidea (ouriços-
do-mar e bolachas-do-mar) e Holothuroidea (pepinos-do-mar). A partir das relações
filogenéticas aceitas atualmente, evidenciou-se a proximidade dos equinodermos com
os cordados (Halanych, 2004) (Figura 1).
Figura 1 – Filogenia do ouriço-do-mar
Árvore filogenética mostrando a relação entre ouriços-do-mar e outros grupos animais e sua proximidade aos cordados (Retirado de Consortium Sea Urchin Genome Sequencing Consortium 2006).
Devido a essa proximidade com os cordados, os equinodermos tornam-se
importantes ferramentas de estudo das características evolutivas apresentadas pelos
vertebrados.
O sequenciamento do genoma do ouriço-do-mar Strongylocentrotus purpuratus,
demonstra que este consiste de 23.300 genes, incluindo muitos previamente
considerados inovações de vertebrados, ou apenas conhecidos fora dos
deuterostomados (sugerindo uma possível perda nos vertebrados) (Sea Urchin
Genome Sequencing Consortium, 2006). Dentre os quais há mais de 1.000 genes
com relevância direta à imunidade e outras funções celulares (Hibino et al., 2006) com
representantes homólogos de importantes reguladores imunes e hematopoiéticos de
cordados, assim como genes que são importantes na imunidade adaptativa de
20 INTRODUÇÃO
vertebrados mandibulados (Rast et al., 2006). Este quadro, portanto, demonstra a
posição filogenética desse filo animal e sua proximidade com os cordados, justificando
seu papel como modelo animal para estudos de imunidade inata. Desta forma, os
ouriços-do-mar podem ajudar a desvendar variações adicionais para proteção contra
patógenos, e fornecer um recurso, até então, pouco conhecidos para aplicações
antimicrobianas e identificação de novas funções imunes em deuterostomados, com
relevância direta à saúde humana.
Os equinóides, podem ser subdivididos em dois grupos: regulares (ouriços-do-
mar) e irregulares (bolachas-do-mar). Os ouriços-do-mar são tipicamente de forma
globosa, sendo mais ou menos achatados nos polos, apesar de alguns serem ovais.
Formados por uma carapaça de carbonato de cálcio, na qual estão fixos os espinhos,
e que delimita a cavidade celomática, que por sua vez é preenchida por líquido
celomático, onde circulam os elementos celulares, denominados celomócitos.
Possuem a boca diametralmente oposta ao ânus, sendo que a mesma fica em contato
com a superfície, rodeada por uma membrana ligeiramente calcificada, denominada
membrana peristomial, que delimita os cinco dentes da lanterna de Aristóteles, órgão
utilizado para alimentação. Na cavidade celomática, encontram-se as gônadas, o
aparelho digestivo e outros órgãos do animal. As brânquias ficam externas à
carapaça, rodeando a membrana peristomial em sentido perpendicular a mesma
(Ruppert, Barnes, 1996) (Figura 2).
21 INTRODUÇÃO
Figura 2 – Anatomia de um ouriço-do-mar.
Esquema ilustrando as características internas de um ouriço-do-mar (retirado de Ruppert, Barnes,1996).
A composição do líquido celomático assemelha-se à da água-do-mar, diferindo
um pouco na concentração de alguns compostos como potássio, lipídeos, proteínas e
açucares dissolvidos (Chia, Xing, 1996). Os celomócitos, presentes no líquido
celomático, são classificados basicamente em quatro tipos diferentes, sendo eles:
amebócitos fagocíticos, esferulócitos vermelhos, esferulócitos incolores e células
vibráteis. Estes possuem diferentes funções, e são responsáveis pela defesa do
organismo (Borges et al., 2010; Chia, Xing, 1996; Smith et al., 2006). A proporção dos
tipos celulares pode variar de acordo com a espécie, ou até mesmo entre indivíduos
da mesma espécie, levando em conta as condições fisiológicas. (Matranga et al.,
2005).
A espécie Lytechinus variegatus ocorre em uma grande variedade de habitats,
podendo variar entre lugares rasos, e fundos onde encontram-se cobertos com algas,
rochas, conchas ou areia, apresentam uma ampla distribuição geográfica, podendo
ser encontrada da Carolina do Norte até o Sul do Brasil e no Golfo do México. São
intolerantes a locais com material particulado em suspensão, abandonando as áreas
de turbidez. A temperatura é o fator que mais influência na distribuição e abundância
da espécie, sendo o limiar de temperatura aceitável entre 11 e 35 °C. Em 1978 no
22 INTRODUÇÃO
Panamá, foi relatado uma mortalidade em massa devido ao aumento da temperatura
para 39,5 °C, de forma que alguns autores argumentam que fatores abióticos foram
mais importantes na regulação da população do que fatores bióticos (Watts et al.,
2013).
1.2 Imunidade inata
A imunidade inata, também conhecida como inespecífica, é comum a todos os
organismos multicelulares, sendo considerada a primeira linha de defesa. Além disso,
é um mecanismo de defesa filogeneticamente conservado e mais antigo em relação
a imunidade adquirida, que pode ser definida como um conjunto de mecanismos
responsáveis por proteger o organismo contra infecções, independente de prévia
exposição a micro-organismos ou outros patógenos (Bols et al., 2001; Medzhitov,
Janeway, 1998). O sistema imune inato evoluiu, desenvolvendo uma série de
estratégias para identificação do próprio/não-próprio, que são baseadas no
reconhecimento de padrões moleculares, demarcando o que é próprio e não
infeccioso, assim como o normal e anormal dentro de seu próprio organismo. Estes
padrões são decifrados por receptores que induzem ou inibem uma resposta
imunológica, dependendo do significado destes sinais (Medzhitov, Janeway, 2002).
Assim, após o reconhecimento do patógeno, ocorre a ativação de mecanismos que
normalmente visam a sua destruição (Kurtz, 2004).
A base do reconhecimento do não-próprio está na capacidade do hospedeiro de
reconhecer padrões conservados do metabolismo microbiano, que são exclusivos
para o mesmo. Esta estratégia permite que o sistema imune inato consiga diferenciar
entre "não-próprio infeccioso" e "próprio não-infecciosa". Outro mecanismo, é a
detecção de marcadores de “estado normal”. Este reconhecimento está acoplado a
várias vias inibitórias, que bloqueiam o início da resposta imune contra o próprio
organismo. Os marcadores deste estado são produtos de genes específicos, e
produtos de vias metabólicas exclusivas para o hospedeiro e ausentes em
microorganismos. Além disso, temos o reconhecimento de auto-antígenos, que
baseia-se na detecção de marcadores específicos de “estado anormal” que são
induzidos após a infecção (principalmente infecções virais), e a transformação celular.
Estes marcadores identificam as células infectadas para a eliminação desta por meio
do sistema imunitário (Medzhitov, Janeway, 2002).
23 INTRODUÇÃO
Memória específica é uma característica do sistema imunológico adaptativo dos
vertebrados, que baseia-se em linfócitos e anticorpos, sendo a parte mais estudada
do nosso sistema imunológico. A maioria dos patógenos são eliminados por
mecanismos inatos, muitas vezes, já antes de o sistema imunológico adaptativo torna-
se ativo (Kurtz, 2004), sendo assim, tanto a iniciação das respostas imunes
adaptativas, quanto a indução de mecanismos efetores particulares parecem
depender dos sinais fornecidos pelo sistema imune inato (Medzhitov, Janeway, 1998).
Estudos indicam que a memória específica pode também existir em sistemas
imunológicos inato, uma vez que, diferentes táxons de invertebrados, como baratas,
camarões e besouros apresentaram uma resposta melhorada à exposição secundária
(Little et al., 2005), porém, os mecanismos são desconhecidos, sendo este fato uma
importante evidencia para compreensão dos princípios e evolução da resposta
imunológica. (Kurtz, 2004).
A resposta imune em invertebrados é um sistema “não adaptativo”, baseada em
componentes celulares e humorais. Através do emprego de uma variedade de células
que são capazes de realizar fagocitose, citotoxidade ou respostas inflamatórias, além
de peptídeos antimicrobianos e outros componentes, incluindo a síntese de óxido
nítrico, reações de coagulação e inibidores de serina protease, um conjunto amplo de
possíveis respostas imunitárias inatas são acionados quando um organismo é
imunologicamente desafiado (Ellis et al., 2011; Little et al., 2005)
A multiplicidade de mecanismos imunológicos pode ser grande dentro de um
indivíduo, ou até mesmo dentro das várias classes ou filos. Essa grande variedade de
mecanismos faz-se necessária devido a importância da atividade a ser realizada,
sendo raro que uma função importante seja desempenhada por um único mecanismo
dentro de um indivíduo (Pasquier, 2001).
As respostas imunológicas apresentadas por equinodermos, fazem parte do
sistema imune inato, e podem ser divididas em dois tipos de reposta, sendo uma
resposta celular e a outra humoral. A resposta celular é desempenhada pelas células
presentes no líquido celomático, uma população morfologicamente heterogênea de
células livres, capazes de reconhecer e neutralizar os agentes patogênicos, por meio
de fagocitose, encapsulação, coagulação, citotoxidade e cicatrização de feridas. Já a
resposta imune humoral, é mediada por uma grande variedade de compostos
secretados no líquido celomático, desempenhando um papel importante na defesa
contra infecção. Estes compostos podem variar entre lectinas, aglutininas, perforinas,
24 INTRODUÇÃO
complemento e algumas citocinas que compõem algumas das respostas humorais de
equinodermos (Gross et al., 1999; Smith et al., 2006).
1.3 Células do sistema imune
As células de ouriços-do-mar encontram-se distribuídas no líquido celomático,
na cavidade celomática e são também chamadas de celomócitos. Estas células são
diferentes quanto a morfologia, tamanho, abundância relativa e função, fato que torna
a classificação padrão para todos os equinodermos uma tarefa difícil (García-Arrarás,
Ramirez-Gomez, 2010). Atualmente, os celomócitos em equinoide são classificados
em quatro tipos distintos: amebócitos fagocíticos - que podem ser encontrados em
duas formas - petalóide ou filopodial, seguidos por células vibráteis, esferulócitos
incolores e esferulócitos vermelhos (Borges et al., 2010; García-Arrarás, Ramirez-
Gomez, 2010; Gross et al., 1999; Smith, 1981). As proporções de cada tipo de
celomócito pode variar consideravelmente, podendo variar entre indivíduos de
espécies diferentes ou até mesmo entre indivíduos da mesma espécie. Estas
mudanças poder ser em resposta a um desbalanço fisiológico - como o estado
nutricional, imunológico - ou até mesmo em decorrência de estresse causado por
mudanças ambientais (García-Arrarás, Ramirez-Gomez, 2010; Matranga et al., 2005;
Smith et al., 2006). Os embriões de ouriços-do-mar também possuem células que
agem na defesa imune (Silva, 2000), incluindo células blastocelulares, aptas para
fagocitose e degradação de bactérias (Tamboline, Burke, 1992), e células granulares
pigmentadas que produzem equinocromo (Calestani et al., 2003), e estão envolvidas
na defesa da ectoderme larval e na cicatrização de feridas (Hibino et al., 2006).
Os amebócitos fagocíticos correspondem ao tipo celular mais abundante no
líquido celomático de ouriços-do-mar, compondo aproximadamente 40 a 80 % do
número total. Seu tamanho pode variar de 3 -20 µm, e sua função está relacionada
principalmente com a fagocitose, quimiotaxia, rejeição de tecidos enxertados,
produção de espécies reativas de oxigênio, aglutinação e as reações de coagulação.
Adicionalmente, os amebócitos parecem ser o principal tipo celular a expressar genes
imunológicos, incluindo os homólogos de complemento, um tipo C de lecitina e um
homólogo de NFkB. Desta forma os amebócitos são considerados como o principal
efetor da resposta imune inata (García-Arrarás, Ramirez-Gomez, 2010; Gross et al.,
1999; Hibino et al., 2006; Matranga et al., 2005).
25 INTRODUÇÃO
A morfologia dos amebócitos fagocíticos pode variar, subdividindo-os em
petalóide e filopodial. Diferenças entre estes dois tipos de células incluem a
localização subcelular de cinesina, microtúbulos, e miosina II, em adição ao
posicionamento das mitocôndrias. Possíveis relações entre estes subtipos de
fagócitos e suas funções específicas ainda não foram descritas (García-Arrarás,
Ramirez-Gomez, 2010; Hibino et al., 2006).
As células vibráteis, por outro lado, são esféricas e possuem um longo flagelo,
que auxilia na movimentação. Seu tamanho pode variar de 6 a 20 µm, e sua
distribuição no líquido celomático perivisceral pode variar de 9 a 20% do total de
células, sendo que sua função permanece pouco elucidada, estando relacionada
principalmente à reações de coagulação e na movimentação do líquido celomático
(García-Arrarás, Ramirez-Gomez, 2010; Gross et al., 1999; Hibino et al., 2006;
Matranga et al., 2005).
Os esferulócitos, por sua vez, são divididos em dois tipos, esferulócitos incolores
e esferulócitos vermelhos. Eles são caracterizados pela presença de grânulos no
interior de seu citoplasma, esses grânulos podem conter pigmento ou serem incolores.
Variam em tamanho, de 8 a 20 µm, e a sua distribuição varia substancialmente entre
espécies. Eles são semelhantes e ambos possuem movimentos amebóides. A função
dos esferulócitos incolores permanece desconhecida, ao passo que os esferulócitos
vermelhos apresentam atividade bactericida, em processos inflamatórios, além de
serem encontrados em torno de lesões e locais de infecções. Sua atividade
bactericida, tanto para bactérias gram-positivas, quanto gram-negativas, está
relacionada com a presença do equinocromo (3,5,7,8-pentahidroxi-6-etil-1,4-
naftoquinona), degranulado do interior de seus grânulos, uma naftoquinona que dá as
células a cor vermelha característica, além de possuir atividade antioxidante. Desta
forma, estas células e o equinocromo desempenham um importante papel na resposta
imune em ouriços (García-Arrarás, Ramirez-Gomez, 2010; Gross et al., 1999; Smith
et al., 2006; Matranga et al., 2005).
Na espécie Echinus esculentus, o equinocromo está presente nas células numa
concentração entre 3 e 60 μg/ml, e é ativo contra uma série de bactérias gram-
positivas e gram-negativas, na concentração de 50 μg/mL (Service, Wardlaw, 1984).
As bactérias gram-negativas estimulam, no ouriço S. purpuratus, a ação quimiotática
dos amebócitos fagocíticos para o foco da infecção, além de acumulação de
esferulócitos vermelhos e consequente liberação do equinocromo por degranulação.
26 INTRODUÇÃO
Por outro lado, a resposta à bactérias gram-positivas consiste na migração de
amebócitos fagocíticos e de células vibráteis (Johnson, 1969 lll). Provavelmente, os
efeitos bactericidas do equinocromo estão relacionados à quelação de ferro e auxílio
da prevenção de colonização microbial após a desova e fertilização, uma vez que
estão presentes também em ovos de ouriços-do-mar e larvas, (Smith et al., 2010).
Smith e Smith (1985), estudando a resposta ao estresse em bolachas-do-mar
Mellita quinquiesperforata, observaram que a liberação do equinocromo dos
esferulócitos vermelhos é similar à liberação de mediadores indutores de alergia de
basófilos e mastócitos de mamíferos, e concluíram que a sensibilização de células,
degranulação sem lise celular, liberação de histamina e similaridades das células
envolvidas, sugerem uma possível correlação com a resposta alérgica de mamíferos.
Alterações na proporção dos esferulócitos vermelhos tem sido observadas frente
a diferentes tipos de estresse, tais como: lesões no esqueleto calcário e na derme
(D’Andrea-Winslow, Novitski, 2008); contaminação do meio por metais, tais como
ferro, cobre, zinco e arsênio (Pinsino et al., 2008); contaminação do meio por fração
solúvel de petróleo (Borges et al., 2010); contaminação do meio por resíduos
industriais (Matranga et al., 2000), e aumento da temperatura (Branco et al., 2012;
Branco et al., 2013).
Segundo Matranga e colaboradores (2000), seria interessante conhecer as
origens da grande população de esferulócitos vermelhos observada em ocasiões de
estresse induzido, ambiental e experimentalmente em equinodermos, cujos
resultados apontam apenas um aumento da proporção dessas células, enquanto o
número total de células permanece estável. No trabalho, o grupo sugere que os outros
tipos celulares presentes no fluído celomático convertam-se em esferulócitos
vermelhos, o que confirmaria antigas teorias de que os esferulócitos incolores e
vermelhos são o mesmo tipo celular em diferentes momentos fisiológicos. Outra
possibilidade é de que as regiões hematopoiéticas liberariam os esferulócitos
vermelhos.
O equinocromo foi descrito inicialmente por MacMunn (1885), sendo
considerado um carregador de oxigênio. Em 1912, McClendon questionou a função
respiratória do pigmento, pois suas soluções não continham quantidade significativa
de ferro e, quando submetidas a vácuo, não absorveram nenhuma quantidade
apreciável de oxigênio atmosférico, além da afinidade ao oxigênio do pigmento
27 INTRODUÇÃO
reduzido ser tão alta, que era necessário muito cuidado para evitar que as soluções
fossem reoxidadas pelo ar.
Amostras puras de equinocromo, só foram isoladas a partir de 1934 (Ball, 1934),
e sua estrutura molecular foi identificada em 1940 por Kuhn e Wallenfels. Dentre todos
os pigmentos conhecidos dos equinodermos, é o que apresenta a maior atividade
antioxidante (Gerasimenko et al., 2006). Em 1939, Hartmann e colaboradores
reportaram que o equinocromo é responsável por estimular na ativação e aglutinação
do esperma de Arbacia pustulosa, porém Tyler (1939), estudando o efeito do
equinocromo purificado na espécie S. purpuratus, não encontrou o mesmo resultado,
sugerindo que o estimulador efetivo do esperma na experiência de Hartmann e
colaboradores, fosse o complexo formado pelo equinocromo e proteínas do extrato de
ovos daquela espécie.
O equinocromo, sendo uma naftoquinona (quinona com um anel naftalênico –
Silva et al., 2003), constitui uma classe estruturalmente diversificada de componentes
fenólicos, com uma ampla extensão de propriedades farmacológicas, sendo
amplamente utilizado na farmácia e medicina (Martínez, Benito, 2005). Assim, em
1988, as propriedades antioxidantes, antimicrobianas, de estabilizar membranas de
eritrócitos e de reduzir o nível de colesterol no sangue já eram conhecidas (Lebedev
et al., 2001). Em 1999, foi desenvolvida na Rússia uma preparação solúvel em água
nomeada Histocromo, com o equinocromo como princípio ativo, indicado para o
tratamento de doenças oculares e cardíacas como a doença arterial coronariana e o
ataque cardíaco (Mishchenko et al., 2003). Ao contrário dos antioxidantes endógenos,
(como as naftoquinonas vitamina E e ubiquinona), o equinocromo é capaz de
neutralizar os catalisadores da oxidação de membranas lipídicas, tais como cátions
de ferro acumulados na região de dano isquêmico dos tecidos (Lebedev et al., 2008).
Embora existam estudos envolvendo o equinocromo, seu papel ainda não está
bem elucidado, e há divergências sobre a função dos celomócitos, sendo que alguns
autores não descrevem a função de cada tipo de celomócito, referindo apenas o papel
destes na imunidade (Bertheussen, Seljelid, 1978; Chia, Xing, 1996; Smith, 1981).
1.4 Fagocitose
O significado biológico da fagocitose foi demonstrado pelo biólogo Russo Elie
Metchnikoff há mais de 100 anos em um equinodermo. Desde então, tem sido
28 INTRODUÇÃO
reconhecido como um componente crítico das respostas imunes inata e adaptativa
contra agentes patogênicos. Além disso, recentes estudos revelam que a fagocitose
é crucial para manter a homeostase (Flannagan et al., 2012). Durante esse processo,
células especializadas são responsáveis por englobar partículas estranhas ao
organismo, e transportá-las do meio extracelular para vacúolos intracelulares
(fagossomos), onde são degradadas (Henricks et al., 1986). A fagocitose é um
processo filogeneticamente conservado e de grande importância biológica (Flannagan
et al., 2012; Zong et al., 2008).
A análise detalhada de alguns modelos específicos tem permitido o
estabelecimento de princípios fundamentais da fagocitose, como o papel da
sinalização espaço-temporalmente coordenados, a necessidade de rearranjo do
citoesqueleto, e a ocorrência de remodelação da membrana (Flannagan et al., 2012).
O sucesso de agentes patogênicos resulta na quebra da primeira linha de defesa
do hospedeiro, que envolve barreiras físicas - promovidas pelos revestimentos
externos do corpo – posteriormente, deparam-se com moléculas genéricas e
específicas que restringem a infecção, seguido da ativação da segunda linha de
defesa, composta por células capazes de fagocitar substâncias ou organismos
patogênicos (Matranga et al., 2005).
A fagocitose é um processo complexo, que envolve várias etapas, incluindo:
quimiotaxia, onde a célula fagocítica é atraída através de substâncias quimiotáticas
(como produtos microbianos, complemento ou células danificadas); em seguida
ocorre a adesão, etapa em que os fagócitos se ligam uns aos outros e aderem a
partícula a ser fagocitada. Posteriormente, ocorre a opsonização, fase em que ocorre
o aumento da adesão celular, através de proteínas específicas que recobrem a
superfície da partícula a ser fagocitada. Finalmente as células prolongam suas
projeções celulares, englobando o organismo estranho em um processo denominado
ingestão (Matranga et al., 2005) (figura 3).
29 INTRODUÇÃO
Figura 3 – Esquema das etapas da fagocitose
Esquema representativo do processo de fagocitose: Amebócito fagocítico e levedura, por meio de quimiotaxia a célula se aproxima da levedura, para engloba-la, ocorrendo em seguida a adesão, formação dos pseudópodes e internalização da levedura, gerando o fagossoma que posteriormente se funde ao lisossoma, que libera enzimas digestivas, formando o fagolisossoma, que degrada a levedura, e os restos celulares são exocitados.
A realização da fagocitose é finalizada com o englobamento da partícula, no
entanto, outro processo se inicia com objetivo de degradar a mesma. O processo de
internalização, em todos os casos, culmina na formação de um vacúolo ligado à
membrana, o fagossoma. O fagossoma recém formado é inócuo, isso se deve as
características da sua membrana limitante que assemelham-se a qual foi derivada, e
o seu conteúdo é apenas um reflexo do meio extracelular. Desta forma, a fagocitose
por si só é insuficiente para mediar a destruição de micro-organismos, no entanto, a
cisão com o lisossoma é seguida por uma série de modificações bioquímicas que
convertem o fagossoma numa organela potencialmente microbicida, o fagolisossoma.
A capacidade destrutiva impressionante do fagolisossoma é atribuída à atividade
combinada de vários efetores, incluindo enzimas hidrolíticas, oxidantes e peptídeos
catiônicos (Flannagan et al., 2012).
Em ouriços-do-mar, esse importante mecanismo de “limpeza” é eficientemente
desempenhado por uma subpopulação dos celomócitos, os amebócitos fagocíticos,
que são responsáveis por degradar e fagocitar partículas estranhas (Gross et al.,
1999). As primeiras observações de fagocitose por celomócitos de equinodermos
30 INTRODUÇÃO
foram realizadas em estrelas-do-mar Asteria rubens, após injeção de tinta da china,
as células fagocitando foram encontradas em diferentes partes do corpo (Smith,
1981). Desta forma, avaliar mecanismos de defesa que fazem parte do sistema imune
inato é uma ferramenta de extrema importância, por tratar-se do principal mecanismo
responsável pela defesa destes organismos contra patógenos.
Compreender exatamente como o sistema imunológico em invertebrados
responde a mudanças no ambiente é de extrema importância para compreender como
as interações patógeno/hospedeiro serão afetadas por essas mudanças, que por sua
vez irá ajudar-nos a compreender e prever como as mudanças na imunocompetência,
causadas ou não, pela variabilidade ambiental, pode ter impacto a nível de
comunidade ou da população (Ellis et al., 2011)
31 OBJETIVO
2 OBJETIVO
Correlacionar o equinocromo com processos do sistema imunológico inato do
ouriço-do-mar Lytechinus variegatus, por meio da ação de diferentes concentrações
de equinocromo (50 e 100 μg/ml) na atividade fagocítica de amebócitos fagócitos
desafiados por leveduras Saccharomyces cerevisiae.
32 MATERIAL E MÉTODOS
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta dos Animais
Indivíduos adultos de ouriços-do-mar Lytechinus variegatus (Lamarck, 1816)
(figura 4), (n=20) foram coletados manualmente por mergulho livre, a uma
profundidade de 2 à 10 m, no Parcel da Praia Grande (23° 51,200’ Sul e 045° 24,973’
Oeste), no canal de São Sebastião-Ilha Bela, litoral norte do Estado de São Paulo
(figura 5), sem distinção quanto ao sexo, com volume aproximado de 200 20 ml, sob
autorização para coleta, transporte e manutenção temporária de espécimes e
amostras biológicas emitida pelo Ministério do Meio Ambiente, por meio do SISBIO
(n° 30644-2).
Figura 4 – Espécime do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus (Barra de escala em
cm).
Durante o estudo, foram realizadas duas coletas: na primeira, os animais foram
empregados para extração e purificação do equinocromo, realizadas no laboratório de
Histofisiologia Evolutiva no Instituto de Ciências Biomédicas e no laboratório de
Bioquímica e Biofísica no Instituto Butantan, na segunda coleta, os animais foram
33 MATERIAL E MÉTODOS
empregados para a realização dos ensaios biológicos, realizados no Centro de
Biologia Marinha da Universidade de São Paulo.
Figura 5 – Georeferênciação do ponto de coleta.
Fonte: Google Maps
3.2 Transporte e Manutenção dos animais
Após coletados, os animais empregados para extração e purificação do
equinocromo, foram transportados para o biotério do Laboratório de Histofisiologia
Evolutiva do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, do Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, utilizando-se bolsas de tela de
nylon em galões de 30 litros com arejamento intermitente. No biotério, os animais
foram mantidos em caixas d'água plásticas (Marfinite) com capacidade para 200 litros,
troca de 20% da água semanalmente e arejamento constante.
Os animais empregados para os ensaios biológicos, foram coletados em bolsas
de tela de nylon e posteriormente transportados em galões até os tanques de
manutenção, situados no Centro de Biologia Marinha da Universidade de São Paulo.
Os animais foram mantidos nos tanques de fibra de vidro (500 litros), a água foi
renovada constantemente.
Todos os animais, pós coletados, foram aclimatados por pelo menos uma
semana antes do início dos experimentos, minimizando desta forma um possível
estresse causado pela captura. O fotoperíodo estabelecido foi o natural e os animais
34 MATERIAL E MÉTODOS
foram alimentados semanalmente ad libitum com algas marinhas (Ulva sp. e
Sargassum sp.) colhidas no mesmo local dos animais. Decorrido o período de
aclimatação, deu-se início aos experimentos propostos.
Os parâmetros físico-químicos analisados foram monitorados diariamente. A
salinidade foi monitorada com o auxílio de um refratômetro para salinidade com
compensação automática para temperatura (SR-3) e mantida em 35,0‰ 1‰ pela
adição, quando necessária, de água destilada.
A concentração de nitrito e oxigênio dissolvido foram monitorado com auxílio
de testes de nitrito (TetraTest® (Tetra Werke, Melle, Germany), mantido entre 0 e
0,1mg/l), e oxigênio dissolvido (LabconTest, mantido entre 8 e 11 ppm).
As leituras de temperatura foram realizadas, utilizando-se termostatos (Full
Gauge), e mantida a 20,0º 2,0 C através de termostatos ligados a aquecedores
(40w), assim como pelo resfriamento do ambiente através de ar condicionado
(Springer, 3000bti).
3.3 Procedimentos gerais para obtenção do líquido celomático
O líquido celomático do celoma perivisceral foi obtido com o auxílio de uma
seringa de 1 ml com agulha de 13x3,3 via membrana peristomial (Plytycs, Seljelid,
1993). A seringa foi inserida num ângulo transversalmente oposto ao da lanterna de
Aristóteles, evitando assim que o tubo digestivo e as gônadas fossem perfurados.
3.4 Classificação dos celomócitos
Após obtenção de amostras do líquido celomático perivisceral de cada ouriço,
uma fração de aproximadamente 0,1 ml foi destinada para classificação dos diferentes
tipos celulares. O líquido celomático foi então depositado sobre lâminas de vidro,
cobertas com lamínulas e observadas sob fotomicroscópio de contraste de fase (Zeiss
Standard 25, Carl Zeiss, German).
A classificação dos celomócitos foi realizada seguindo características próprias
de cada tipo celular com o auxílio da literatura existente para ouriços-do-mar (Borges
et al., 2005; Chia, Xing,1996; Smith, 1981; Smith et al., 2006). Desta forma, as células
foram subdivididas em quatro tipos:
35 MATERIAL E MÉTODOS
Amebócitos Fagocíticos: células com vasto citoplasma translúcido com capacidade de
adesão e espraiamento, apresentam ainda, filopódios e lamelipódios.
Esferulócitos Vermelhos: células esféricas com movimentos ameboides e presença
de grânulos intracitoplasmáticos vermelhos.
Esferulócitos Incolores: células esféricas com movimentos ameboides e presença de
grânulos intracitoplasmáticos incolor.
Células Vibráteis: pequenas células esféricas, dotadas de um único flagelo
responsável por contínuos movimentos circulares.
3.5 Contagem relativa e absoluta de celomócitos
A contagem relativa e absoluta dos celomócitos foram realizadas em câmara
de Neubauer, que consiste em uma lâmina de vidro com divisões que auxiliam na
contagem.
Após colocada a lamínula de vidro sobre a câmara, adicionou-se uma alíquota
do líquido celomático e foram realizada as contagens utilizando os quatro quadrantes
externos.
Na contagem absoluta dos celomócitos em câmara de Neubauer o número de
células por ml foi obtido pela seguinte equação:
Q1 + Q2 + Q3 + Q4
4 × 104 = n° de células/mL
Já na contagem relativa dos celomócitos a porcentagem de cada tipo celular foi
obtido pela seguinte equação:
n° de cada tipo celular × 100
n° total de células contadas
3.6 Ensaio de viabilidade celular
Para a análise de viabilidade celular utilizou-se o protocolo segundo Freshney
(1987), onde uma alíquota de 50µl do líquido celomático de cada animal foi adicionada
à 50µl da solução de azul de Tripan 0,4% (Sigma® St Louis, MO, EUA) e após 5
minutos foi colocado em Câmara de Neubauer e analisado sob microscópio óptico.
O azul de Tripan é um corante vital que não atravessa membranas íntegras,
sendo assim, as células vivas não permitem a passagem do corante, não adquirindo
36 MATERIAL E MÉTODOS
coloração, já as células mortas, apresentam suas membranas danificadas, permitindo
o fluxo de corante para o interior da célula e apresentando uma coloração azul. A
proporção foi obtida através do número total de células contadas e o número de
células mortas.
3.7 Extração do equinocromo
Para a obtenção de um extrato bruto contendo os pigmentos presentes no
líquido celomático do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus foi utilizado o método
descrito por Amarowicz e colaboradores (1994), com algumas modificações. Após
retirar o líquido celomático o mesmo foi centrifugado a 1200 rpm por 10 minutos para
diminuir o volume do líquido em relação as células, 5ml do líquido celomático
juntamente com o pellet de células, foi ressuspendido e adicionado uma solução de
ácido clorídrico HCl 6M (10 ml). Após a adição de HCl as células foram então lisadas
e o pigmento liberado. O pigmento foi extraído da solução com a adição de três vezes
o volume em éter etílico. A camada de éter etílico contendo o pigmento foi então
lavada por três vezes com uma solução salina (5% NaCl) para total remoção do HCl.
A solução de éter contendo o pigmento foi seca, por meio da evaporação do éter.
O extrato contendo o pigmento foi ressuspendido em etanol e armazenado no
freezer a -20 °C, posteriormente o pigmento foi submetido a purificação por HPLC, no
Laboratório de Bioquímica e Biofísica do Instituto Butantan.
3.8 Purificação por HPLC do equinocromo
Para a purificação do pigmento resultante da extração foi usado um sistema de
cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC), (20A Prominence,
Shimadzu Co., Kyoto, Japão), em uma coluna C18 (ACE® C18, 5 μm, 100 Å, 250 mm
x 4,6 mm), com uma eluição isocrática, sendo os solventes A = ácido trifluoroacético
(TFA) / água (1:1000) e solvente B = metanol / acetonitrila (5:9), em fluxo constante
de 0,5 ml/min, a 38 °C. O conteúdo eluído foi monitorado por um detector Shimadzu
SPD-M20A PDA, na faixa de 200 a 500 nm e coletado manualmente.
A fração proveniente da primeira purificação foi submetida a uma repurificação
utilizando a mesma coluna, porém uma eluição em um gradiente linear, de 0 a 100%
do solvente B em 20 minutos, sendo o solvente A ácido trifluoroacético (TFA) / água
37 MATERIAL E MÉTODOS
(1:1000) e solvente B TFA / acetonitrila / água (1:900:100), em fluxo constante de 1
mL/min, a 38 °C. A eluição do equinocromo foi monitorado pelo comprimento de onda
de 475 nm.
3.9 Análise por espectrometria de massas
Todas as etapas de purificação, bem como as análises por espectrometria de
massas foram realizadas no Laboratório de Bioquímica e Biofísica, do Instituto
Butantan.
A análise de massa foi realizada em um espectrômetro ESI-IT-ToF (Shimadzu
Co., Japão) para determinação da massa molecular e pureza do composto obtido da
purificação em cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC). A
amostra foi diluída em metanol 50% e inserida diretamente no espectrômetro por
injeção manual, em um injetor Rheodyne, em modo negativo, a um fluxo de 50 µL/min.
A voltagem utilizada da interface foi 4,5 kV e a voltagem do detector, 1,8 kV, com
temperatura de 200 °C. Os espectros foram obtidos na faixa de 50 a 2000 m/z.
3.10 Contagem de leveduras Saccharomyces cerevisiae
Para avaliar a atividade fagocítica dos amebócitos fagocíticos foram utilizadas
nos ensaios leveduras Saccharomyces cerevisiae (Meyen ex E. C. Hansen, 1883),
elas foram escolhidas por serem micro-organismos capazes de induzir uma resposta
imune, serem de fácil obtenção e manipulação, além de ser um organismo não
patogênico, evitando a contaminação em caso de acidentes.
As leveduras utilizadas foram obtidas comercialmente como fermento biológico
fresco Fleischmann®. Uma solução de levedura foi preparada contendo 200µg de
levedura em 10 ml de água do mar filtrada. A solução foi passada por uma seringa de
insulina para dissociação das leveduras e posterior contagem nos quatro quadrantes
externos da câmara de Neubauer.
A proporção de leveduras para cada amebócito fagocítico foi obtida na razão
de 10:1, conforme estabelecido por Silva e Peck (2000).
38 MATERIAL E MÉTODOS
3.11 Ensaio de fagocitose in vitro
Para o ensaio de fagocitose in vitro, foram utilizados dez animais, sendo que
para cada animal foram feitas nove lâminas, divididas em um grupo controle, e dois
grupos tratados com diferentes concentrações de pigmento.
Alíquotas de 100 µL do líquido celomático foram adicionadas à lâminas de
vidro, e incubadas por um período de uma hora em câmara úmida, para a adesão e
espraiamento das células. Transcorrido o período de uma hora, adicionou-se a
suspensão de leveduras Saccharomyces cerevisiae. Após adicionar a suspensão de
leveduras, as lâminas foram reincubadas por mais uma hora em câmara úmida, e em
seguida observadas em microscopia de contraste de fase (Carl Zeiss® -
Fotomicroscópio II) para a avaliação da fagocitose, além de permitir a visualização
das leveduras internalizadas pelos amebócitos fagocíticos.
Para a análise da fagocitose, em cada lâmina foram contadas cem células,
analisadas de acordo com a quantidade de leveduras Saccharomyces cerevisiae
fagocitadas. Dessa forma, a contagem foi subdividida em:
Amebócitos fagocíticos sem leveduras
Amebócitos fagocíticos com 1 levedura
Amebócitos fagocíticos com 2 leveduras
Amebócitos fagocíticos com 3 leveduras
Amebócitos fagocíticos com 4 ou + leveduras
Para verificar a ação do equinocromo na atividade fagocítica dos amebócitos
fagocíticos, foram adicionadas 50 e 100 µg/ml de equinocromo previamente purificado
aos ensaios de fagocitose in vitro.
3.12 Análise estatística
Os dados foram submetidos a análises pelo teste de Kruskal Wallis para dados
não paramétricos. Para as análises foi usado o software STATISTICA 7.0 StatSoft.
Inc. Diferenças foram consideradas significantes quando o P<0,05.
39 MATERIAL E MÉTODOS
Figura 6 – Fluxograma da metodologia empregada para obtenção do material, análise
e ensaio.
40 RESULTADOS
4 RESULTADOS
4.1 Contagem diferencial dos celomócitos
Os quatro diferentes tipos celulares (Figura 7), foram observados em todos os
animais utilizados, sendo que os amebócitos fagocíticos (AF), tanto na forma filopodial
– caracterizada pela emissão de estreitos prolongamentos citoplasmáticos,
distribuídos radialmente em torno da região central da célula – quanto na petalóide –
caracterizada pela presença de largos prolongamentos citoplasmáticos que lembram
pétalas – estas foram as células mais abundantes encontradas no líquido celomático
do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus, sem distinção das diferentes formas,
seguidas pelas células vibráteis (CV), esferulócitos incolores (EI) e esferulócitos
vermelhos (EV), respectivamente. Não foram observadas alterações entre as
proporções dos tipos celulares para cada animal (Figura 8).
41 RESULTADOS
Figura 7 – Fotomicrografias de células a fresco do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus em contraste de fase.
A: Líquido celomático contendo os diferentes tipos celulares (barra de escala = 50 µm). B: Célula vibrátil em maior aumento, presença de um longo flagelo (barra de escala = 20 µm). C: Amebócito fagocítico na forma filopodial em maior aumento (barra de escala = 20 µm). D: Amebócito fagocítico na forma petalóide em maior aumento (barra de escala = 20 µm). E: Esferulócito incolor em maior aumento, presença de grânulos incolores (barra de escala = 20 µm). F: Esferulócito vermelho em maior aumento, presença de grânulos vermelhos contendo equinocromo (barra de escala = 20 µm).
42 RESULTADOS
Figura 8 – Proporção dos tipos celulares de ouriços-do-mar Lytechinus variegatus
(n=10).
Valores expressos em porcentagem. Barras equivalem as médias ± DVP.
4.2 Viabilidade celular
A viabilidade celular dos celomócitos foram avaliadas em todos os animais
utilizados nos experimentos, e se manteve superior a 98%.
4.3 Extração e Purificação
O líquido celomático do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus se mostrou como
uma excelente fonte para a obtenção do pigmento. A fração com o pigmento, obtida
após a extração foi submetida a purificação – por RP-HPLC – em coluna C18, como
descrito anteriormente. As figuras 9 e 10 apresentam os cromatogramas obtidos da
extração, com absorbância nos comprimentos de ondas de 214 e 475 nm,
respectivamente.
A eluição de todo o pigmento na amostra injetada ocorreu entre 0 a 15 min, o
pico de maior intensidade foi observado no tempo de retenção de 11,108 min no
comprimento de onda de 475 nm (figura 10). No entanto, outros picos puderam ser
observados com maior intensidade no comprimento de onda 214nm (figura 9). O pico
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1
Po
rcen
tage
m (
%)
Celomograma Amebócito Fagocítico Esferulócito Incolor Esferulócito Vermelho Célula Vibrátil
43 RESULTADOS
marcado com asterisco foi selecionado como o pico de interesse e coletado
manualmente.
Figura 9 – Perfil cromatográfico obtido através da injeção do extrato contendo o pigmento de L. variegatus, λ=214.
Presença de diferentes picos com diferentes intensidades. O asterisco corresponde ao pico de interesse coletado manualmente.
44 RESULTADOS
Figura 10 – Perfil cromatográfico obtido através da injeção do extrato contendo o pigmento de L. variegatus, λ=475.
Diminuição da intensidade de alguns picos observados em 214 nm. O asterisco corresponde ao pico de interesse coletado manualmente.
De acordo com as análises dos perfis cromatográficos obtidos, foi possível
verificar que o pico de interesse coletado não estava puro. A partir disso o pico
coletado foi submetido a uma repurificação, onde a eluição do pigmento proveniente
da repurificação ocorreu entre 0 a 45 min, e foi monitorado nos comprimentos de onda
de 214 e 475 nm. No comprimento de onda de 214 nm (figura 11), podemos observar
a presença de mais de um pico, sendo escolhido o pico de interesse com maior
intensidade, o tempo de retenção foi de 22,160 min.
45 RESULTADOS
Figura 11 – Perfil cromatográfico obtido para a repurificação do pico coletado, em coluna C-18, λ=214.
O pico de maior intensidade (*) foi coletado manualmente para analises. Observa-se a presença de diferentes picos em menor intensidade.
46 RESULTADOS
46
Já o comprimento de onda de 475 nm, apresentou um pico de grande
intensidade no tempo de retenção de 22,116 min (figura 12), que foi coletado
manualmente. Com a repurificação do primeiro pico coletado, obtivemos uma alíquota
pura do pigmento, que foi submetida a análise por espectrometria de massas (MS)
para confirmar a presença e pureza do equinocromo. Posteriormente a atividade do
pigmento obtido por RP-HPLC foi avaliada nos ensaios de fagocitose in vitro.
4.4 Análise por espectrometria de massa (MS)
Para verificar a presença do equinocromo, bem como a pureza da molécula,
foram feitas análises por espectrometria de massa.
A análise dos dados obtidos por espectrometria de massa (MS), permitiu
confirmar que as etapas de extração do equinocromo do líquido celomático de L.
variegatus, assim como a purificação do mesmo por RP-HPLC, foram realizadas com
êxito. Na figura 13 observamos um íon de grande intensidade 265,03 Da, que
corresponde ao peso molecular do Equinocromo A. Após confirmação, demos início
aos estudos in vitro da atividade do equinocromo no sistema imune inato de L.
variegatus.
47 RESULTADOS
Figura 12 – Perfil cromatográfico obtido para a repurificação do pico coletado, em coluna C-18, λ=475.
Pico de maior intensidade (*) foi coletado manualmente, representando o equinocromo purificado.
48 RESULTADOS
Figura 13 – Espectro de massas do último pico coletado para repurificação em RP-HPLC.
O íon de maior intensidade correspondente ao equinocromo 265, 0311 Da.
49 RESULTADOS
49
4.5 Avaliação da atividade fagocítica in vitro
Os ensaios de fagocitose in vitro demonstraram que as únicas células do líquido
celomático de L. variegatus, com capacidade para realizar fagocitose são os
amebócitos fagocíticos (figura 14).
Figura 14 – Fotomicrografias de ensaio de fagocitose in vitro com células do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus em contraste de fase.
A – F Amebócitos fagocíticos, fagocitando uma ou mais leveduras Saccharomyces cerevisiae (setas branca), bem como a presença de amebócitos fagocíticos que não fagocitaram leveduras (setas vermelha). Barra de escala = 20 µm.
50 RESULTADOS
50
Os amebócitos fagocíticos foram expostos à duas concentrações diferentes –
previamente estipuladas – de equinocromo (50 e 100 µg/ml), onde analisou-se os
amebócitos que estavam fagocitando, bem como a quantidade de leveduras
Saccharomyces cerevisiae presente em cada um deles.
O número de amebócitos fagocíticos que estavam fagocitando encontram-se
significativamente aumentados, nos dois grupos tratados com equinocromo (figura
15). O número de amebócitos sem leveduras internalizadas diminuiu
significativamente em ambos os grupos, sendo mais significativo no grupo tradado
com 100 µg (0,0001), do que no grupo tratado com 50 µg (0,0010), ambos em relação
ao controle, no entanto não foram encontradas diferenças significativas quando
comparamos os grupos tratados entre si.
O número de leveduras Saccharomyces cerevisiae fagocitadas pelos
amebócitos fagocíticos, nas duas concentrações de equinocromo, foram analisados,
sendo que na concentração de 50 µg, o número de leveduras fagocitadas foi
significativamente maior (p= 0.0177), apenas nos amebócitos com quatro ou mais
leveduras. O número de amebócitos com uma levedura foi significantemente maior
(p= 0,0197) no grupo tratado com 100 µg de pigmento, em relação ao controle. Os
amebócitos com duas e quatro ou mais leveduras tiveram um aumento significativo
(p= 0,0167 e 0,0177, respectivamente), no grupo tratado com 100 µg, em relação aos
seus respectivos controles. Nenhum dos grupos testados apresentou diferenças
significativas quando comparamos os grupos tratados entre si. O único grupo que não
apresentou diferenças significativas em nenhum dos tratamentos foi o de amebócitos
com três leveduras.
De modo geral, o tratamento de 50 µg de equinocromo demonstrou um
aumento na quantidade de amebócitos que estavam fagocitando, e uma tendência a
aumentar a quantidade de leveduras fagocitadas por amebócitos fagocíticos, apesar
deste resultado não ser significativo em todos os grupos. Já o tratamento com 100 µg
de equinocromo, apresentou uma resposta significativa em quase todos os grupos,
exceto no de amebócitos com três leveduras.
51 RESULTADOS
51
Figura 15 – Atividade fagocítica de amebócitos fagocíticos expostos a diferentes concentrações de equinocromo em ouriços-do-mar Lytechinus variegatus.
Diferenças significativas (*) entre os grupos tratados com 50 µg e 100 µg de equinocromo e seu respectivo controle.
52 DISCUSSÃO
52
5 DISCUSSÃO
Os métodos utilizados para obtenção e purificação do equinocromo do líquido
celomático do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus foram eficientes. A eficiência do
método foi testada por meio da análise da composição da última fração coletada do
RP-HPLC, através de espectrometria de massas, e foi possível confirmar a presença,
bem como a pureza da molécula do equinocromo. Este método vem sendo utilizado
para separação de pigmentos oriundos de carapaças de outras espécies de ouriço-
do-mar, além de peptídeos presentes no líquido celomático (Kuwahara et al., 2009;
Sciani et al., 2013), apresentando uma alta eficiência.
No líquido celomático perivisceral de ouriços-do-mar, bem como na carapaça,
espinho e outros órgãos, são encontrados compostos polihidroxilados de coloração
variada, como o equinocromo (Anderson et al., 1969; Kuwahara et al., 2010). As
células responsáveis por sua biossíntese são os esferulócitos vermelhos, porém, o
seu papel ainda permanece pouco elucidado. Sua função, até então descrita, está
relacionada com a atividade bactericida e antioxidante (Ramírez-Gómez, García-
Arrarás, 2010). Sendo assim, os resultados do presente estudo trazem dados inéditos
e ainda pouco explorados na literatura.
Os ensaios de fagocitose in vitro, demostraram que o único tipo celular apto a
realizar a fagocitose em L. variegatus, é o amebócito fagocítico, os demais tipos
celulares não participaram efetivamente deste processo. Esses dados, estão de
acordo com a literatura existente para equinodermos (Borges et al., 2005; Borges et
al., 2010; Branco et al., 2012; Johnson, 1969).
A adição do equinocromo nos ensaios de fagocitose in vitro, acarretou em um
aumento significativo da atividade dos amebócitos fagocíticos, observada através da
diminuição significativa do número de amebócitos fagocíticos sem leveduras
fagocitadas. Desta forma, tanto o grupo tratado com 50 µg/ml, quanto o tratado com
100 µg/ml de equinocromo, foram capazes de recrutar e/ou induzir um maior número
de amebócitos fagocíticos a realizarem a fagocitose. Esses dados indicam que a
atuação do equinocromo seria capaz de modular positivamente o processo fagocítico
em L. variegatus, através do aumento do número de amebócitos fagocíticos que
efetivamente estavam fagocitando.
53 DISCUSSÃO
53
Em paralelo, dados do nosso grupo de pesquisa demonstraram que ouriços-do-
mar antárticos Sterechinus neumayeri, submetidos ao estresse por aumento da
temperatura, apresentaram o aumento do número de esferulócitos vermelhos,
positivamente correlacionado ao aumento da capacidade fagocítica (Branco et al.,
2012). Este aumento dos esferulócitos vermelhos em resposta a um agente estressor
leva, consequentemente, a um aumento da concentração de equinocromo, uma vez
que a célula degranula, liberando o pigmento na tentativa de reestabelecer a
homeostase por meio de sua atividade bactericida, antioxidante e potencializadora da
fagocitose. Juntos, os dados sugerem que o aumento da concentração de
equinocromo influencia positivamente a fagocitose, inclusive em ambientes antárticos.
O englobamento e a destruição de partículas e micro-organismos invasores por
fagocitose, são componentes críticos e essenciais da resposta imune inata
(Flannagan et al., 2012). Desta forma, a resposta fagocítica está diretamente
relacionada com a capacidade que o organismo tem de manter a homeostase do
sistema como um todo. Levando em consideração a fagocitose como um componente
essencial, estudos que avaliem este tipo de resposta são de extrema importância. As
leveduras são comumente utilizadas em ensaios de fagocitose, devido à presença de
β-glucan em sua membrana, o que atua como estimulador da resposta imune de
maneira bastante eficaz, além de ser um organismo não patogênico (Secombes,
Fletcher, 1992; Silva et al., 2007).
Além do aumento no número de amebócitos fagocíticos ativados, também
observamos um aumento significativo do número de amebócitos com uma, duas, três
e quatro ou mais leveduras Saccharomyces cerevisiae fagocitadas. Sendo que na
concentração de 50 µg/ml de equinocromo, esse aumento foi observado apenas para
os amebócitos com quatro ou mais leveduras. Já na concentração de 100 µg/ml de
equinocromo, os amebócitos contendo uma, duas, três, e quatro ou mais leveduras
internalizadas apresentaram diferenças significativas. Desta forma, a atuação do
equinocromo não estaria apenas relacionada à ativação dos amebócitos fagocíticos,
mas também apresentaria um papel na ativação destes amebócitos, quando se leva
em consideração a alteração do número de leveduras fagocitadas por célula. Este
aumento apresentou-se de maneira dose-dependente, uma vez que a maior
concentração de equinocromo levou a um maior aumento no número de leveduras
fagocitadas por célula. Esses dados reforçam a nossa hipótese, de que o equinocromo
estaria atuando modulando positivamente o processo fagocítico.
54 DISCUSSÃO
54
Levando em conta os resultados obtidos, podemos verificar que ambas as
concentrações apresentaram efeitos. Além disso, o equinocromo aumentou o número
de amebócitos com 4 ou mais leveduras à partir da dose de 50 µg/ml, desta forma,
indicando que o equinocromo ativa os amebócitos para realizarem a fagocitose. No
entanto, essa ativação não necessariamente aumentaria a quantidade de leveduras
fagocitadas, podendo haver mais amebócitos com uma levedura apenas. Para
aumentar o número de leveduras fagocitadas, poderia ser necessário uma segunda
molécula que auxiliaria este segundo processo de ativação. Porém, o equinocromo,
por si só, foi capaz de ativar tanto os amebócitos a fagocitarem, quanto a aumentar a
quantidade de levedura fagocitada por amebócito. Nesse sentido, ele teria efeito na
comunicação celular ou tornaria o metabolismo da célula mais ativo. Sendo assim,
com adição do equinocromo nos ensaios fagocíticos, acelerou, mas não exatamente
ordenou o “evento” fagocitose.
Um fator que poderia influenciar nos ensaios de fagocitose, seria a utilização de
diferentes proporções de leveduras Saccharomyces cerevisiae por célula. Xing e
colaboradores (1998), demonstraram o aumento do número total de partículas
fagocitadas por amebócitos do pepino-do-mar Holothuria leucospilota, e esse
aumento foi positivamente correlacionado com a quantidade adicionada de partículas
por células. No presente estudo, as proporções estabelecidas foram de dez leveduras
por célula, para todos os ensaios, evitando assim falsas interpretações.
A atividade bactericida do equinocromo foi previamente demonstrada em
diferentes concentrações, 37,5 e 50 µg/ml, sendo que estas encontram-se no limite
superior do intervalo fisiológico (3 – 60 µg/ml (Service, Wardlaw, 1984)). No presente
estudo, utilizamos duas contrações diferentes, uma dentro do intervalo fisiológico e
outra superior. A concentração de 50 µg/ml fui suficiente para ativar a fagocitose dos
amebócitos, no entanto o número de amebócitos com uma, duas e três leveduras
fagocitadas não aumentou, ao passo que os amebócitos com quatro ou mais
leveduras apresentaram-se como os únicos a aumentar significativamente. Quando
comparamos com a concentração de 100 µg/ml, apenas os amebócitos com três
leveduras não apresentaram um aumento significativo, o número de amebócitos com
uma, duas, quatro ou mais leveduras aumentou significativamente. Adicionalmente,
Hatate e colaboradores (2002), demonstraram a atividade antioxidante de pigmentos
provenientes de carapaças de ouriços-do-mar, roxo, vermelho e verde, e que a
atividade antioxidante observada está diretamente relacionada com a concentração
55 DISCUSSÃO
55
utilizada, e não a espécie de ouriço. Sendo assim, nossos dados corroboram com o
resultado descrito anteriormente, uma vez que observamos respostas diferentes de
acordo com a concentração.
O equinocromo sendo uma naftoquinona, pertence a uma classe estruturalmente
diversa de compostos fenólicos: as quinonas, que por sua vez, apresentam uma vasta
gama de propriedades farmacológicas, como atividade antineoplásica,
antiinflamatória, antioxidante, antiviral, antifúngica, mutagênica, bactericida, laxante,
antipsoriático entre outras, e sua distribuição varia entre bactérias, fungos, líquens,
gimnospermas, angiospermas e equinodermos (Martínez, Benito, 2005). O papel do
equinocromo como antioxidante e bactericida, já está bem estabelecido na literatura
para equinodermos (Johnson, 1969; Kuwahara et al., 2009, 2010; Shankarlal et al.,
2011), no entanto, sua atuação no sistema imune de equinodermos ainda permanece
pouco elucidada.
A contagem diferencial dos celomócitos é um método utilizado para a análise da
proporção dos diferentes tipos celulares, sendo que as proporções aqui descritas para
cada tipo celular do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus foi semelhante aos dados da
literatura para ouriços (Borges et al., 2005; Branco et al., 2012; Johnson, 1969; Smith
et al., 1992).
Alterações nas proporções dos diferentes tipos celulares podem servir como um
indicativo de algum tipo de estresse. O aumento no número de esferulócitos
vermelhos, foi relatado em ouriços-do-mar submetidos a diferentes tipos de estresse
como: lesão no esqueleto e derme, contaminação ambiental por metais pesados,
petróleo e resíduos industriais (Borges et al., 2010; D’Andrea-Winslow, Novitski, 2008;
Matranga et al., 2000; Pinsino et al., 2008). Pesquisas envolvendo estrela-do-mar
submetidas ao estresse por variação de pH, demonstraram uma redução no número
total de celomócitos, em paralelo a uma reduzida capacidade fagocítica (Hernroth et
al., 2011). Adicionalmente, a inoculação de bactérias gram-positivas no líquido
celomático de Asteria rubens acarretou em aumento da concentração de dois tipos
celulares (Coteur et al., 2002). Desta forma, mudanças no número de esferulócitos
vermelhos podem servir como biomarcadores de estresse ambiental, como descrito
anteriormente por Bay e Oshida (1983). Os animais utilizados não apresentaram
alterações nas proporções celulares, indicando assim, que os mesmos encontravam-
se em condições ideais.
56 DISCUSSÃO
56
Uma vez que o ambiente marinho é um local prolífico quanto ao surgimento de
espécies microbianas, os organismos que nele habitam necessitam de um mecanismo
de defesa bastante eficaz. Desta forma, o equinocromo estaria atuando tanto no
combate ativo contra diversos microrganismos, quanto na modulação de suas células
fagocíticas em resposta ao desafio.
Juntos, nossos dados indicam que os esferulócitos vermelhos possuem um
papel fundamental na resposta imune inata de ouriços-do-mar, tendo sua quantidade
e degranulação elevada em diferentes condições de estresse, liberando assim o
equinocromo como resposta bactericida e ativadora da resposta fagocítica, na
tentativa de manter sua homeostase. Entretanto, o mecanismo pelo qual o
equinocromo estaria atuando para gerar essa resposta, ainda permanece
desconhecido. O sequenciamento do genoma do ouriço-do-mar Strongylocentrotus
purpuratus, demonstrou que 4 à 5% dos genes identificados no genoma estão
diretamente relacionados com funções imunológicas (Rast et al., 2006), esses genes
codificam, dentre outros, receptores que são essências para resposta imunológica.
Desta forma, o equinocromo poderia estar atuando através de algum desses
receptores transmembrana expressos.
Adicionalmente, um estudo recente de Sun e colaboradores (2013) envolvendo
a análise da expressão de dois genes codificantes de receptores TLRs – responsáveis
pelo reconhecimento de patógenos durante a resposta imune inata – em pepinos-do-
mar, mostrou um aumento na expressão destes em resposta à bactérias gram-
positivas e gram-negativas, em diferentes órgãos, mostrando uma correlação entre o
aumento da expressão de genes que codificam esses receptores com a exposição à
fatores patogênicos. Desta forma, o aumento da fagocitose poderia estar envolvido
com uma maior expressão desses receptores TLRs, que seriam induzidos pela
mudança na concentração do equinocromo em decorrência ao estresse sofrido. No
entanto, essas são apenas suposições de um mecanismo pelo qual o equinocromo
atuaria, podendo também atuar por outros receptores, ou até mesmo possuir a
capacidade de atravessar a membrana da células devido a suas característica
hidrofóbicas. Apesar de tudo, este mecanismo de atuação, permanece pouco
elucidado na literatura, fazendo-se necessário estudos aprofundados.
Nossos resultados mostram-se essenciais para o entendimento da biofisiologia
deste animal fascinante, trazendo novas perspectivas de atuação do equinocromo
durante a resposta imune inata, porém, estudos adicionais são necessários para o
57 DISCUSSÃO
57
completo entendimento do mecanismo pelo qual este pigmento atua nas células
fagocíticas de ouriços-do-mar.
58 CONCLUSÃO
58
6 CONCLUSÃO
Os resultados demonstram dados até então pouco explorados na literatura,
relacionando a função de celomócitos com o sistema imune inato de ouriço-do-mar,
onde pudemos identificar um novo papel para o equinocromo presente nos
esferulócitos vermelhos de L. variegatus.
A resposta imune inata, aqui avaliada por ensaios de fagocitose, foi modulada
positivamente com a utilização de 50 e 100 µg/ml de equinocromo, desempenhando
assim, um papel na ativação e/ou recrutamento dos amebócitos fagocíticos, onde
observou-se um aumento no número das células fagocitando.
As diferentes concentrações utilizadas de equinocromo aumentaram a
quantidade de leveduras S. cerevisiae fagocitadas por amebócito fagocítico, também
modulando positivamente essa resposta. Além disso, essa modulação aparentemente
ocorre de forma dose-dependente, uma vez que a quantidade de leveduras
internalizadas aumentam significativamente na maior concentração de equinocromo
utilizada.
Desta forma, nossos resultados demonstram que o equinocromo apresenta outra
função, além das descritas até o momento, reforçando sua atuação no sistema imune
inato de ouriços-do-mar através, também, da modulação da fagocitose.
* De acordo com: International Committee of Medical Journal Editors. [Internet]. Uniform requirements for manuscripts submitted to Biomedical Journal: sample references. [updated 2011 Jul 15]. Available from: http://www.icmje.org
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