UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Centro de Ciências da Saúde
Faculdade de Odontologia
Rio de Janeiro 2016
Andréa Vaz Braga Pintor
AVALIAÇÃO MULTIPARAMÉTRICA COMPARATIVA DA
CITOTOXICIDADE DE DIFERENTES MATERIAIS OBTURADORES
UTILIZADOS EM PULPECTOMIAS EM DENTES DECÍDUOS
ATRAVÉS DE MODELO DE SIMULAÇÃO DE CANAL RADICULAR
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Centro de Ciências da Saúde
Faculdade de Odontologia
Rio de Janeiro 2016
AVALIAÇÃO MULTIPARAMÉTRICA COMPARATIVA DA CITOTOXICIDADE DE DIFERENTES MATERIAIS OBTURADORES
UTILIZADOS EM PULPECTOMIAS EM DENTES DECÍDUOS ATRAVÉS DE MODELO DE SIMULAÇÃO DE CANAL RADICULAR
Andréa Vaz Braga Pintor
Tese de Doutorado submetida ao Programa de
Pós-graduação em Odontologia (Área de Concentração:
Odontopediatria) da Faculdade de Odontologia da
Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos
requisitos para obtenção do título de Doutor em
Odontologia (Área de Concentração: Odontopediatria).
Orientadores:
Prof.a Dra. Laura Salignac de Souza Guimarães Primo
Prof.a Adjunta da Disciplina de Odontopediatria da FO/UFRJ
Prof.a Dra. Roberta Barcelos
Profa Adjunta da Disciplina de Odontopediatria da FO/UFF-NF
Prof. Gutemberg Gomes Alves
Prof. Adjunto da Disciplina de Biologia Celular e Molecular
Unidade de Pesquisa Clínica HUAP/UFF
FICHA CATALOGRÁFICA
Pintor, Andréa Vaz Braga
Avaliação multiparamétrica comparativa da citotoxicidade de diferentes materiais obturadores
utilizados em pulpectomias em dentes decíduos através de modelo de simulação de canal radicular /
Andréa Vaz Braga Pintor. – Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de Odontologia, 2016.
158 f. : il. ; 31 cm.
Orientadores: Laura Salignac de Souza Guimarães Primo, Roberta Barcelos, Gutemberg Gomes Alves.
Tese (doutorado) -- UFRJ, Faculdade de Odontologia, Programa de Pós-graduação em
Odontologia, Odontopediatria, 2016.
Referências bibliográficas: f. 136-149.
1. Materiais Restauradores do Canal Radicular – toxicidade. 2. Obturação do Canal Radicular. 3. Dente
Decíduo. 4. Sais de Tetrazólio - toxicidade. 5. Pulpectomia. 6. Sobrevivência Celular. 7. Odontopediatria -
Tese. I. Primo, Laura Salignac de Souza Guimarães. II. Barcelos, Roberta. III. Alves, Gutemberg Gomes. IV.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Odontologia, Programa de Pós-graduação em
Odontologia, Odontopediatria. V. Título.
FOLHA DE APROVAÇÃO
ANDRÉA VAZ BRAGA PINTOR
AVALIAÇÃO MULTIPARAMÉTRICA COMPARATIVA DA CITOTOXICIDADE DE DIFERENTES MATERIAIS OBTURADORES UTILIZADOS EM PULPECTOMIAS EM DENTES DECÍDUOS ATRAVÉS DE MODELO DE SIMULAÇÃO DE CANAL
RADICULAR
Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em
Odontologia (Área de Concentração: Odontopediatria) da Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutor em Odontologia (Área de Concentração:
Odontopediatria).
Rio de Janeiro, ___/___/___
DEDICATÓRIA
Aos meus amores Sergio, Bruna e Paula Pintor,
Aos meus pais Nilson e Sandra,
Á minha irmã Adriana
AGRADECIMENTOS
À Deus por me conceder a oportunidade e a dádiva da vida. Por guiar-me,
cega que sou, sigo confiante em seu projeto. Creio.
Ao meu esposo, filhas, pais, irmã, sobrinhos e sogros, meu amparo e
minha responsabilidade. Sergio Pintor, Bruna e Paula Pintor, Nilson e Sandra
Braga, Adriana Braga, Isadora Braga e Thiago Pintor, José (in memoriam) e Júlia
Pintor. Por todo o amor que recebo.
À Vânia, amiga de todos os dias, que cuida de mim e da minha família.
Aos meus generosos orientadores pelos seus conhecimentos, paciência e
tempo disponibilizados. Por terem me recebido como orientanda, agradeço pela
confiança em mim depositada. À Profa. Laura Salignac de Souza Guimarães
Primo pela orientação objetiva e pelo convívio tão rico, produtivo e agradável. À
Profa. Roberta Barcelos pela orientação eficiente e pelas inúmeras sugestões e
incentivos recebidos. Ao Prof. Gutemberg Gomes Alves pela orientação
competente na área da Biologia, desde o desenvolvimento do modelo de
simulação até a execução dos procedimentos experimentais.
Aos professores da Disciplina de Odontopediatria do Departamento de
Odontopediatria e Ortodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade
Federal do Rio de Janeiro por terem me recebido como aluna e como professora
substituta. Professores: Ivete Pomarico, Marcelo Costa, Rogério Gleiser, Lucianne
Cople Maia, Glória Castro, Andréa Antônio, Luciana Pomarico e Aline de Almeida
Neves. Agradeço pelos ensinamentos recebidos e por propiciarem um ambiente
de estudo e trabalho de cooperação produtiva e harmoniosa. Tenho orgulho de
fazer parte desse projeto.
Às professoras Andréa Antônio e Márcia Thomas que compuseram a
Banca de Qualificação, pela leitura cuidadosa e por todas as alterações sugeridas
para a versão final desta tese.
Aos colegas de Doutorado pela troca proveitosa de conhecimentos, boas
conversas e amizade. À minha turma querida: Michelle Ammari, Michele Lenzi,
Adílis Alexandria e Marcelo Roter. Aos que me receberam com carinho e
generosidade: Tatiana Fidalgo, Ticiana Saboia, Márcia Thomas e Marlus
Cajazeira. Aos que reuniram suas forças e se agruparam: Adrielle Mangabeira,
Thaís Soares, Cláudia Tavares, Clarissa Avelar, Christiane Cruz, Thiago Isidro e
João Farinhas. Cada qual com seus talentos e interesses, unidos através da
Odontopediatria.
Aos mestrandos advindos de diferentes regiões do Brasil, que enriquecem
o programa com sua diversidade e mostram que uma boa Odontologia é ensinada
e praticada de Norte a Sul. Com carinho especial para Queila Braga, Marina
Siqueira, Nashalie Alencar, Helena Romanos, Daniele Cassol, Paula Pires,
Roberta Jorge e Raquel Carvalho.
Aos colegas Cirurgiões-dentistas do Departamento de Odontopediatria e
Ortodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de
Janeiro: Nena Perez, Bárbara Guimarães, Andréa Quirino, Vanessa Silva e
Fernanda Barja. É muito bom contar com a experiência e amizade de vocês na
clínica.
Às queridas Mere de Assis, Andréa Seraphim e Kátia Seixas que com sua
eficiência tornam o atendimento dos pacientes pediátricos sempre mais fácil. Pela
alegria que irradiam.
Aos técnicos-administrativos: Maria Izabel do Amaral, Rosemere Roza,
Luiza Queiroz, Maria José Chagas, João Carlos Monteiro e Robson Azevedo.
Agradeço pela convivência agradável, amizade e pela eficiência com qual cuidam
do funcionamento do departamento.
À equipe do Laboratório de Cultura Celular da Unidade de Pesquisa Clínica
do Hospital Universitário Antônio Pedro/UFF. Em especial à Adriana Brandão
Linhares e Luciana Domênico Queiroz, pelo treinamento em cultivo celular e toda
a ajuda que me deram. À Ângela, Fátima e Sharlene pelo suporte e amizade.
Aos amigos de uma vida inteira pelo acolhimento, partilha e amizade:
Cláudia Souza, Vânia Nabuco, Mônica e José Calasans Maia, Lucienne Simões,
Roberto Prado, Tânia e João Bonnassis, Andréa e Renato Rocha, Patrícia
Vasconcellos e Paulo Prazeres, Ilka e Luís Henrique Pessanha, Luísa e Fernando
Carijó, Fernando Brumano, Cristina e Carlos Cunha.
Às alunas de Iniciação científica Clara Antunes e Juliana Kluft de Almeida
pela confiança na minha orientação.
Aos meus queridos alunos, que trazem um propósito aos conhecimentos
que recebi e à experiência que acumulei.
Aos pacientes, pela confiança e pelos desafios que representam, fazendo
com que busquemos o conhecimento e as soluções.
“Nós dizemos que estes tempos são difíceis. Nós devemos pensar que os
tempos são como nós somos; e temos de concluir que se nos comprometermos a
ser melhores, seremos capazes, juntos, de fazer tempos e mundo melhores”
(Santo Agostinho – Confissões 80,8)
RESUMO
PINTOR, Andréa Vaz Braga. Avaliação multiparamétrica comparativa da citotoxicidade de diferentes materiais obturadores utilizados em pulpectomias em dentes decíduos através de modelo de simulação de canal radicular. Rio de Janeiro, 2016. Tese (Doutorado em Odontologia – Área de concentração: Odontopediatria) – Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016.
O objetivo do estudo foi avaliar a citotoxicidade de pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos através de um modelo de simulação de obturação de canal radicular de dente decíduo. A fim de orientar a escolha dos materiais, foi realizada uma revisão da literatura sobre as pastas utilizadas em estudos de Odontopediatria entre 2006 a 2016. Foram incluídos 21 artigos e concluiu-se que as pastas mais estudadas foram à base de óxido de zinco e eugenol (OZE) (n = 12), iodofórmio com hidróxido de cálcio (n = 8) e à base de hidróxido de cálcio (n = 3). Também foi executada uma revisão sistemática da literatura para a comparação dos resultados de efeito citotóxico (EC) de materiais obturadores de canais radiculares (MOCR) obtidos através de testes a base de sais de tetrazólio (TBST) e aqueles obtidos através de outro parâmetro de viabilidade celular nas mesmas células. O objetivo foi observar se os resultados de EC através das diferentes metodologias implicariam em tendências concordantes ou não de avaliação da citotoxicidade desses materiais. Foram incluídos 29 artigos e realizadas 279 comparações entre os resultados de avaliação do EC. Observou-se que 86,02% das comparações (n = 240) mostraram tendências similares de EC. Dentre os TBST, o MTT (n = 166) e o XTT (n = 81) apontaram tendências similares de EC em 87,95% e 92,59% das comparações. Os resultados sustentam a importância dos TBST para o rastreio da citotoxicidade de MOCR. Para a avaliação do EC das pastas selecionadas, foi desenvolvido um modelo de simulação de canal radicular que mimetizou as condições clínicas de obturação de canal radicular de dente decíduo limitando a exposição apical e a quantidade de material obturador usada. Através do modelo foi realizada a avaliação multiparamétrica da citotoxicidade das pastas: à base de OZE, Vitapex®, Guedes-Pinto, pasta de Guedes, Calcicur®, Calen® espessada com óxido de zinco (Calen/OZ), pasta UFRJ e Endoflas® (n = 3) frente a células primárias semelhantes a osteoblastos humanos. O estudo foi executado através dos ensaios de redução do XTT, da incorporação do Vermelho neutro (VN) e da densidade de células aderidas pela eluição do corante Cristal violeta (CVDE). Ademais, as pastas foram avaliadas na proporção material: veículo da ISO 10993-5 (2009) através do teste do XTT (n = 5). Quando avaliadas pelo modelo e o teste do XTT, mostraram EC leve: Calcicur®, UFRJ, Endoflas®, Calen/OZ, Guedes-Pinto e à base de OZE. Vitapex® e Guedes apresentaram EC moderado e forte. Através do VN o EC foi leve para Calcicur®, Endoflas®, Calen®/OZ, Guedes-Pinto e à base de OZE; moderado para Vitapex® e UFRJ e forte para Guedes. Os resultados do CVDE foram similares aos do VN, com exceção da pasta Calen®/OZ, não citotóxica. Segundo a proporção da ISO, a pasta Calcicur® mostrou EC moderado e as demais EC forte. Concluiu-se que as pastas apresentaram resultados de EC menores quando avaliadas através do modelo proposto comparados aos obtidos com a proporção ISO. A exceção foi a pasta de Guedes pronta para uso considerada fortemente citotóxica em todas as avaliações.
Palavras-chave: Dente decíduo, Obturação do canal radicular, Teste de materiais, Endodontia, Citotoxicidade. In vitro
ABSTRACT
PINTOR, Andréa Vaz Braga. Avaliação multiparamétrica comparativa da citotoxicidade de diferentes materiais obturadores utilizados em pulpectomias em dentes decíduos através de modelo de simulação de canal radicular. Rio de Janeiro, 2016. Tese (Doutorado em Odontologia – Área de concentração: Odontopediatria) – Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016.
The aim of this study was to evaluate, comparatively, the cytotoxicity of different root canal filling pastes for primary teeth through a root canal simulating model. Aiming the selection of the pastes, a narrative literature review was performed with regard to the mostly evaluated root canal filling materials in Pediatric dentistry studies (2006-2016). In the review 21 papers were included and the most evaluated pastes were: zinc oxide and eugenol based (n = 11), iodoform with calcium hydroxide (n = 8) and calcium hydroxide-based (n = 3). Also a systematic review was peformed aiming to compare the cytotoxic effect (CE) results of root canal flling materials (RCFM), obtained through the tetrazolium salt-based tests (TSBT), and those obtained through other cell viability parameters assays. The objective was to observe if the results of CE through the different methodologies would imply in concordant or not trends of the cytotoxicity for such materials. We included 29 studies and performed 279 comparisons between the CE results. It was noted that 86.02% (n = 240) of such comparisons showed similar CE trends. Among the TSBT, MTT (n = 166) and XTT tests (n = 81) pointed to similar trends of CE in 87.95% and 92.59% of the comparisons. These review results support the value of the TSBT for the cytotoxicity screening of RCFM. Aiming the evaluation of CE of the selected pastes, a root canal simulating model was developed, which mimetized the clinical conditions of root canal filling for primary teeth through the controll of the the apical exposure and the amount of filling paste used. Through the model a multiparametric evaluation of the cytotoxicity was performed of the pastes for: zinc oxide and eugenol (ZOE) based, Vitapex®, Guedes-Pinto, Guedes, Calcicur®, Calen® thickened with zinc oxide (Calen/ZO), UFRJ paste and Endoflas® (n = 3) to human osteoblast-like primary cells. The study was performed through the assays of: the XTT reduction, the Neutral red (NR) up-take dye and adhered cell density evaluation through the Crystal violet dye elution (CVDE). Furthermore, the pastes were evaluated according to the material: vehicle ratio recommended by the ISO 10993-5 (2009) through the XTT reduction assay (n = 5). When the pastes were evaluated through the model and the XTT assay, a slight CE was observed for Calcicur®, UFRJ, Endoflas®, Calen/ZO, Guedes-Pinto and ZOE. Vitapex® and Guede showed moderate cytotoxic and strong CE. Through the NR the CE was slight for Calcicur®, Endoflas®, Calen/ZO, Guedes-Pinto and ZOE; moderate for Vitapex® and UFRJ and strong for Guedes. The CVDE results were similar to those of NR, with exception for the Calen/ZO, not cytotoxic. According to the ISO proportion, the Calcicur® showed moderate CE and the others strong CE. It was concluded that the CE results through the model were lower than those obtained through the ISO proportion. The exception was the ready-to-use Guedes paste, considered strongly cytotoxic in all evaluations .
Key-words: Tooth, deciduous; Root canal obturation, Materials testing, Endodontics; Cytotoxicity, in vitro
RESUMEN
PINTOR, Andréa Vaz Braga. Avaliação multiparamétrica comparativa da citotoxicidade de diferentes materiais obturadores utilizados em pulpectomias em dentes decíduos através de modelo de simulação de canal radicular. Rio de Janeiro, 2016. Tese (Doutorado em Odontologia – Área de concentração: Odontopediatria) – Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016.
El objetivo del estudio fue comparar la citotoxicidad de materiales de obturación de conductos radiculares de los dientes primarios a través de un modelo de simulación del conducto radicular de los dientes primários. Con el objetivo de la selección da las pastas, una revisión de la literatura se realizó con respecto a los materiales de obturación de conductos radiculares de los dientes primarios más estudiados en Odontología pediátrica (2006-2016). En la revisión 21 trabajos fueron incluidos y las pastas más evaluadas fueron: a base de óxido de zinc y eugenol (OZE) (n=12), yodoformo con hidróxido de calcio (n = 8) y a base de hidróxido de calcio (n=3). También se realizó una revisión sistemática con el objetivo de comparar los resultados de la evaluación del efecto citotóxico (EC) in vitro de materiales de obturación de conducto radicular (MOCR) obtenidos mediante ensayos con base de sales de tetrazolio (EBST) y los obtenidos por medio de otros parámetros de viabilidad celular. Se incluyeron 29 artículos y se hicieron 279 comparaciones entre los resultados de EC. Se observó que 86,02% (n=240) de esas comparaciones mostraron tendencias similares de EC teniendo en cuenta las diferentes pruebas. Entre los TBST, el MTT (n =166) y el XTT (n =81) mostraron tendencias similares de el EC en 87,95% y 92,59% de las comparaciones. Los resultados de esa revisión respaldan el valor de los EBST para el rastrero de la citotoxicidad de los MOCR. Con el objetivo de la evaluación de el EC de las pastas selecionadas, un modelo de simulación del conducto radicular se ha desarrollado, que simuló las condiciones clínicas de obturación del canal radicular de los dientes primários a través de la controll de la exposición apical y de la cantidade de pasta utilizada. A través del modelo se realizo una evaluación de múltiples parámetros de citotoxicidad de las pastas: a base de OZE, Vitapex®, Guedes-Pinto, Guedes, Calcicur®, Calen® con óxido de zinc (Calen/OZ), UFRJ y Endoflas® (n=3) a las células similares a osteoblastos humanos primarios. El estudio se realizó a través de pruebas de la reducción de XTT, de la inclusión de colorante Rojo neutro (RN) y mediante la evaluación de la densidad de células adheridas por elución de el colorante Cristal violeta (CVDE). Además, las pastas fueron evaluadas por el proporción material: vehículo recomendado por ISO 10993-5 (2009) por el ensayo de reducción XTT (n = 5). Cuando se evaluaron las pastas por el modelo y el ensayo de XTT se observó ligeiro EC para Calcicur®, UFRJ, Endoflas®, Calen/ZO, Guedes-Pinto y OZE. Vitapex® y la Guedes mostraran citotóxicidade moderada y fuerte. A través de la RN, el EC fue ligero para Calcicur®, Endoflas®, Calen/ZO, Guedes-Pinto y OZE; moderado para Vitapex® y UFRJ y flerte para Guedes. Los resultados CVDE fueron similares a los RN, con excepción de la Calen/ZO, no citotóxica. De acuerdo con la proporción de la ISO, Calcicur® mostro moderado EC y las otras fuerte. Se concluyó que los resultados de EC a través del modelo eran más bajos que los obtenidos a través de la proporción ISO. La excepción de la carpeta Guedes listo para usar, considerada fuertemente citotóxica en todas las evaluaciones.
Palabras-clave: Diente primario, Obturación del conducto radicular, Ensayo de Materiales, Endodoncia, Citotoxicidad, in vitro
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Exemplo de identificação dos resultados de efeito citotóxico em gráfico
de artigo, através do programa xScope 4.0® ........................................................ 45
Figura 2. A) Componentes do dispositivo modelo de simulação in vitro da
obturação de canal radicular de dente decíduo, B) Dispositivo montado. ........... 51
Figura 3. A) Pesagem de pasta obturadora (0,037g), B) Dispositivo modelo de
simulação de obturação com 185μl de meio de cultura Dulbecco’s Modified
Eagle’s media (DMEM) sem soro para obtenção do extrato do material (Vitapex®).
............................................................................................................................. 55
Artigo 2
Figure 1. Study selection flow diagram (Moher et al., 2015)................................. 90
Artigo 3
Figure 1. A) Components of the root canal simulating model; B) Filled root canal
simulating model ........................................................................................................ 125
Figure 2. Cytotoxicity assay results through the root canal simulating model (A, B,
C) and through the ISO 10993-5 (2009) material / vehicle standard (D). Cytotoxic
effects of the positive control (C+), negative control (C-), Calcicur®, Vitapex®,
Guedes paste (Fórmula & Ação) (GD), UFRJ paste, Endoflas®, Calen® thickened
with zinc oxide (CALEN/ZO), Guedes-Pinto paste (GP), and ZOE paste on primary
human osteoblast-like cells measured by Crystal violet dye elution (A), NRU (B)
and XTT tests (C, D) and expressed as a percentage of experimental control (cells
exposed to unconditioned medium) cell viability. *Statistically significant
differences between groups relative to the control (p < 0.05)................................ 126
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais características de diferentes ensaios de citotoxicidade
utilizados na avaliação de materiais obturadores de canais radiculares .............. 33
Tabela 2. Delineamento da pergunta segundo a estratégia (PECO) população,
exposição, comparação e resultados (outcomes) ................................................ 40
Tabela 3. Estratégia de busca .............................................................................. 41
Tabela 4. Classificação de efeito citotóxico com base nos resultados de
viabilidade celular relativa aos controles, adaptado de DAHL et al., 2006) .......... 46
Tabela 5. Classificação morfológica qualitativa da citotoxicidade dos extratos .... 47
Tabela 6 Resultados das comparações executadas entre as diferentes
metodologias de avaliação da citotoxicidade e os ensaios à bse de sais de
tetrazólio ............................................................................................................... 49
Tabela 7: Pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos .......... 52
Artigo 1
Table 1: Characteristics of included studies .............................................................. 70
Artigo 2
Table 1. Outlines the populations, exposition, comparisons, and outcomes (PECO format).
................................................................................................................................. 91
Table 2. Electronic database and search strategy ........................................................... 91
Table 3. Characteristics of the included studies .............................................................. 92
Table 4. Root canal filling materials brands / compositions ............................................. 97
Table 5. Results of the cytotoxic effect evaluation and comparisons ............................. 100
Table 6. Comparisons results considering the different assays parameters .................. 106
Artigo 3
Table 1. Components of the root canal pastes tested ............................................ 127
LISTA DE SIGLAS
ADA American Dental Association
CA50 Concentração de Atividade 50
CO2 Dióxido de carbono
CSEO Concentração Sem Efeito Observado
DCFH-DA Teste de diacetato de diclorofluoresceína
DeCS Descritores em Ciências da Saúde
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s media
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DO densidade ótica
ECVAM European Centre for the Validation of Alternative Methods
EUA Estados Unidos da América
FO-UFF/NF Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, Nova Friburgo
FO-UFRJ Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro
HO-1 Heme oxygenase-1
HUAP/UFF Hospital Universitário Antônio Pedro/Universidade Federal
ISO International Standard Organization
LDH Lactato desidrogenase
LILACS Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciências da Saúde
MCCEO Menor Concentração Com Efeito Observável
MEV Microscopia eletrônica de varredura
ml Mililitro
MOCR Material obturador de canal radicular
MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio
MTT brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio
NAC Conteúdo de ácido nucleico
OHAT Office of Health Assessment and Translation
OZE Óxido de zinco e eugenol
PARP Poli(ADP-ribose) polimerase
Pasta UFRJ Pasta Universidade Federal do Rio de Janeiro
PECO População, exposição, comparação e resultados (outcomes)
ROS Espécies reativas de oxigênio
TBARS Teste de ácido tiobarbitúrico substâncias reativas
TBST Testes à base de sal de tetrazólio
ToxRTool® Toxicological data Reliability Assessment Tool
UPC Unidade de Pesquisa Clínica
WST-1 Sal de tetrazólio solúvel em água
xScope 4.0® The Iconfactory and ARTIS software (Greensboro, EUA)
XTT 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazólio-5-carboxanilida
μl Microlitro
LISTA DE SÍMBOLOS
= Igual
± Mais ou menos
> Maior que
< Menor que
°C Graus Celsius
-- não citotóxico
- levemente citotóxico
+ moderadamente citotóxico
++ fortemente citotóxico
SUMÁRIO
1. Introdução .............................................................................................................. 21
1.1 Considerações sobre a avaliação da citotoxicidade ..................................... 28
2. Objetivo geral ......................................................................................................... 36
3. Objetivos específicos ............................................................................................ 36
4. Delineamento da pesquisa ................................................................................... 37
4.1 Tipo de estudo .............................................................................................. 37
4.2 Locais de execução do estudo ..................................................................... 37
4.3 Avaliação da citotoxicidade ........................................................................... 38
4.3.1 Revisão da literatura recente sobre as pastas obturadoras de canais
radiculares de dentes decíduos mais utilizadas e avaliadas em estudos de
Odontopediatria. ................................................................................................... 38
4.3.2 Revisão sistemática: comparação dos resultados de efeito citotóxico de
materiais obturadores de canais radiculares obtidos através dos testes a base de
sais de tetrazólio com os logrados através de outros ensaios de avaliação de
citotoxicidade ........................................................................................................ 39
4.3.3 Avaliação da citotoxicidade de pastas obturadoras de canais radiculares de
dentes decíduos através de modelo de simulação in vitro da obturação de canal
radicular de dente decíduo, limitando-se a quantidade de pasta obturadora
empregada e a exposição apical .......................................................................... 50
4.3.1 Avaliação da citotoxicidade de pastas obturadoras de canais radiculares de
dentes decíduos através do ensaio do XTT com a proporção veículo/material
recomendada pela ISO 10993-5 (2009) ............................................................... 58
5. Resultados ............................................................................................................. 60
5.1 Artigo 1: A critical review of the root canal filling materials mostly used in the
recent pediatric studies ........................................................................................ 60
5.2 Artigo 2: Are the results of the cytotoxicity of the root canal filling materials
evaluated through the tetrazolium salt-based tests and other cell viability
parameters conflitant? A systematic review ......................................................... 72
5.3 Artigo 3: Multiparametric evaluation of the cytotoxicity of selected root canal
filling materials for primary teeth through a root canal simulating model ............ 107
6. Considerações finais ........................................................................................... 128
7. Referências .......................................................................................................... 137
Anexos ........................................................................................................................ 151
Apêndice ..................................................................................................................... 159
21
1. Introdução
1.1 Considerações sobre pastas obturadoras de canais radiculares de
dentes decíduos
A manutenção da integridade da dentição decídua até sua completa
substituição pela dentição permanente constitui o principal objetivo da
Odontopediatria e também seu maior desafio (AAPD, 2014). Os dentes decíduos
apresentam dimensões menores que os correspondentes permanentes e,
consequentemente, as camadas de esmalte e dentina que protegem o tecido
pulpar são mais delgadas, o que facilita a instalação e a progressão dos
processos patológicos (IMPARATO, 2013). Os dentes decíduos expostos a
doenças como a cárie dentária ou a traumatismos, frequentemente necessitam de
intervenção, que além das restaurações coronárias, incluem a terapia pulpar.
Entre estas terapias o capeamento pulpar indireto e a pulpotomia visam preservar
a vitalidade pulpar, enquanto a pulpectomia é indicada para o tratamento de
condições inflamatórias irreversíveis e necrose da polpa dentária (FUKS, 2002;
RODD et al., 2006, AAPD, 2014, AHMED, 2014). Tais procedimentos apresentam
níveis satisfatórios de evidência científica (RODD et al., 2006).
Uma das principais metas clínicas da pulpectomia ou tratamento
endodôntico convencional é remover o tecido necrótico ou a polpa vital e
minimizar a quantidade de substâncias irritantes que possam estar presentes no
interior do sistema de canais radiculares, sendo a limpeza e a desinfecção desses
essenciais para o sucesso do tratamento endodôntico (HAAPASALO et al., 2005).
Devido a variabilidade morfológica e grande complexidade do sistema de canais
radiculares dos dentes decíduos posteriores, a pulpectomia em molares decíduos
ainda constitui um desafio na prática clínica Odontopediátrica (AHMED, 2013).
Dessa forma, o controle microbiano deve sustentar-se em um preparo químico-
mecânico eficiente associado à utilização de materiais obturadores que propiciem
selamento do sistema de canais radiculares (ROSA et al., 2010), e que
22
apresentem propriedades antimicrobianas e biocompatibilidade com os tecidos
periapicais (AMORIM et al., 2006).
Diferentes protocolos de tratamento envolvendo o procedimento da
pulpectomia em dentes decíduos têm sido apresentados e avaliados
(MORTAZAVI e MESBAHI, 2004; TRAIRATVORAKUL e CHUNLASIKAIWAN,
2008; AZEVEDO et al., 2009; BARCELOS et al., 2012). Entretanto, dentro do
conceito de decisão e prática clínica alicerçada pela Odontologia Baseada em
Evidências Científicas, o tópico ainda necessita da atenção e dedicação dos
pesquisadores. Em uma busca na base da ADA (American Dental Association),
em seu Centro de Odontologia Baseada em Evidências (EBD), três Revisões
Sistemáticas relacionadas ao tema foram identificadas (NADIN et al., 2003,
BARCELOS et al., 2011, BARJA-FIDALGO et al., 2011). Em todas, foi constatada
a falta de estudos clínicos randomizados controlados de longo prazo de
acompanhamento com forte evidência de comprovação para a determinação de
uma técnica e material obturador ideais.
Um material obturador ideal para o preenchimento do sistema de canais
radiculares de dentes decíduos deve apresentar propriedades e características
adequadas ao seu curto ciclo biológico e a proximidade com os dentes
permanentes em desenvolvimento. Assim, o material deve apresentar: (i)
reabsorção compatível com a aquela que ocorre nas raízes dos dentes decíduos,
(ii) rápida reabsorção, se extravasado através do forame apical durante a
obturação dos canais radiculares, (iii) biocompatibilidade com os tecidos
periapicais e os dentes permanentes em desenvolvimento, (iv) adesão às paredes
dos canais radiculares promovendo selamento do sistema de canais e (v) alto
poder antimicrobiano (HOLAN e FUKS, 1993, SARIGOL et al., 2010). Um
material obturador de canais radiculares biocompatível deve auxiliar ou estimular
o reparo tecidual (HUANG et al., 2002). Entretanto nenhum material obturador de
canais radiculares para dentes decíduos apresenta todas estas características.
Na literatura não há consenso sobre qual o melhor material (BARCELOS et al.,
2011, Al-OSTWANI et al., 2016), porém há evidência moderada para o uso das
pastas de óxido de zinco e eugenol (OZE), e de hidróxido de cálcio com
iodofórmio (BARJA-FIDALGO et al., 2011). Atualmente são recomendadas para a
23
obturação de canais radiculares de dentes decíduos as pastas, materiais que não
tomam presa, à base de hidróxido de cálcio (RODD et al., 2006), iodofórmio com
hidróxido de cálcio e à base de óxido de zinco e eugenol (RODD et al., 2006;
AAPD, 2014).
Estudo recente identificou na literatura os materiais obturadores de canais
radiculares de dentes decíduos mais usados, estudados e avaliados em
Odontopediatria e revelou que a pasta de óxido de zinco e eugenol ainda é a mais
utilizada nos estudos clínicos (ALMEIDA et al., 2013). Entretanto, as pastas
iodoformadas apresentaram uma tendência de aumento na sua utilização, sendo
empregadas inclusive, como material controle em estudos comparativos
(NAKORNCHAI et al., 2010; HOWLEY et al., 2012; ALMEIDA et al., 2013).
As pastas a base de iodofórmio apresentam frequência de sucesso clínico
entre 65 a 100% e foram introduzidas como materiais obturadores de canais
radiculares de dentes decíduos com base em suas propriedades desinfetantes
(BARCELOS et al., 2011) e pela maior facilidade de reabsorção, comparada à
pasta de óxido de zinco e eugenol (BARJA-FIDALGO et al., 2011). No Brasil, foi
proposta uma pasta composta por partes visualmente iguais de iodofórmio,
paramonoclorofenolcanforado e pomada Rifocort® (1,5mg rifamicina SV sódica,
5,0mg acetato de prednisolona e excipientes: metabissulfito de sódio,
propilenoglicol, ascorbato de sódio, macrogol) (Medley, Campinas, Brasil)
(GUEDES-PINTO et al., 1981), denominada Pasta Guedes-Pinto, a qual é
amplamente utilizada nas faculdades de Odontologia brasileiras (LEAL et al.,
2004; CERQUEIRA et al., 2008). Recentemente o efeito citotóxico da pasta
Guedes-Pinto sobre células mononucleares do sangue periférico foi avaliado
através do ensaio MTT, a base de sal de tetrazólio, o qual avaliou a atividade
mitocondrial dessas células após a exposição à pasta. No período de observação
de 24 horas, não houve diferença estatística significativa entre a pasta de
Guedes-Pinto e o controle experimental constituído de células não expostas a
material (PIRES et al. 2015). Estudos microbiológicos demonstraram o amplo
potencial antimicrobiano dessa pasta (AMORIM et al., 2006), sendo comprovada
sua ação contra quase todos os microrganismos encontrados em infecções
endodônticas de dentes decíduos (VARGAS-FERREIRA et al., 2010). Entretanto,
24
um de seus componentes, a pomada Rifocort® foi retirada do mercado, sendo
necessária sua manipulação em farmácia para a utilização na pasta. Dessa
forma, Antoniazzi et al. (2015) avaliaram a substituição da pomada Rifocort® por
outras associações com potencial antimicrobiano, como por exemplo o
digluconato de clorexidina, passíveis de serem empregadas no tratamento
endodôntico de dentes decíduos. Porém, ainda são necessários estudos que
avaliem a compatibilidade dos fármacos com os tecidos para possibilitar seu
emprego clínico. Em consideração aos seus aspectos citotóxicos, microbiológicos,
histopatológicos, e ao sucesso clínico, a Pasta Guedes-Pinto pode ser utilizada
como material de escolha para a terapia pulpar de dentes decíduos (CERQUEIRA
et al., 2008).
Na literatura há uma pasta que apresenta como componentes os materiais:
óxido de zinco, eugenol, hidróxido de cálcio, tri-iodometano e iodo
dibutilortocresol; acrescida de sulfato de bário e paramonoclorofenol (Endoflas®),
a qual tem sido empregada como material obturador dos canais radiculares de
dentes decíduos com alta frequência de sucesso clínico e radiográfico (RAMAR e
MUNGARA, 2010; MOSKOWITZ et al., 2010; MOSKOWITZ et al., 2012; REWAL
et al., 2014). Esta pasta apresentou alta citotoxicidade para fibroblastos gengivais
humanos (BRISEÑO e WILLERSHAUSEN, 1992), reduziu a viabilidade celular de
macrófagos e células epiteliais de forma dose-dependente, tanto por contato
direto, quanto pela sua diluição em meio de cultura, quando em altas doses
(PETEL et al., 2013) e apresentou alta toxicidade tecidual (MITTAL et al., 1995).
Em estudo que avaliou o grau de reabsorção radicular após o tratamento
endodôntico de molares decíduos com esse material, comparado à reabsorção
dos molares decíduos homólogos sem tratamento dos canais radiculares,
concluiu-se que o material acelerou a reabsorção radicular (MOSKOWITZ et al.,
2012). Moskowitz et al. (2010) observaram que 3,3% dos 242 molares decíduos
tratados com esse material apresentaram aumento da área de lesão periapical
durante o acompanhamento radiográfico. Os autores relataram que tal aumento
pode estar relacionado a uma irritação dos tecidos periapicais e dos folículos de
desenvolvimento dos dentes permanentes sucessores, causada por algum
componente da fórmula. A análise histológica executada em um destes dentes
25
evidenciou um cisto radicular (PETEL et al., 2013). Outros relatos de formação de
cistos radiculares associados ao tratamento endodôntico de dentes decíduos são
encontrados na literatura para pastas contendo hidróxido de cálcio e iodofórmio
(TAKIGUCHI et al., 2001; NAGATA et al., 2008), contudo esta associação entre o
aparecimento de cistos radiculares em molares decíduos e o tratamento
endodôntico não está esclarecida. A literatura sugere que os materiais
obturadores de canais radiculares de dentes decíduos podem causar irritação aos
tecidos periapicais, a qual pode estar relacionada à formação dos cistos (PETEL
et al., 2013).
A pasta de óxido de zinco e eugenol (OZE), desde sua primeira descrição
como material obturador dos canais radiculares de dentes decíduos (SWEET,
1930) tem sido o material mais utilizado em estudos científicos (BARJA-FIDALGO
et al., 2011, BARCELOS et al., 2012, ALMEIDA et al., 2013) e nos programas de
Odontopediatria das faculdades de Odontologia norte-americanas (PRIMOSH,
1997; DUNSTON et al., 2008). Em estudo recente, observou-se que o OZE e o
hidróxido de cálcio foram os materiais obturadores para dentes decíduos
preferidos nas Universidades Colombianas (HINCAPIÉ et al., 2014). A pasta de
OZE apresenta desempenho clínico satisfatório (OZALP et al., 2005;
TRAIRATVORAKUL E CHUNLASIKAIWAN, 2008; BARCELOS et al., 2012),
embora apresente velocidade de reabsorção lenta, sendo associado à erupção
ectópica de dentes permanentes (TANNURE et al., 2011). Em estudo executado
no município do Rio de Janeiro (RJ) observou-se a preferência pelo OZE
acrescido de formocresol como material para obturação de canais radiculares de
dentes decíduos em situações clínicas propostas através de questionário
(BARJA-FIDALGO et al., 2010). Entretanto, o eugenol, bem como os derivados
fenólicos e o formaldeído, foram considerados inapropriados como componentes
de materiais obturadores de canais radiculares pelo potencial risco de injúria
tecidual como resultado de toxicidade celular (BARBOSA et al., 1993). Outros
estudos também observaram que o OZE reduziu a viabilidade celular (HUME et
al., 1993; HUANG et al., 2002). Este material reduziu a viabilidade de fibroblastos
gengivais humanos em ensaio com o teste do Vermelho Neutro e foi considerado
citotóxico (AZAR et al., 2000). Considerando a avaliação da atividade
26
antimicrobiana da pasta a base de óxido de zinco e eugenol, foi observado que
essa produziu inibição do crescimento bacteriano de cepas encontradas em
infecções endodônticas (QUEIROZ et al., 2009). Além disso a atividade
antibacteriana apresentada pela pasta a base de óxido de zinco e eugenol foi
superior a pasta de hidróxido de cálcio (Calen) espessada com óxido de zinco; a
pasta Sealapex, composta por material a base de óxido de cálcio, trióxido de
bismuto e óxido de zinco e a pasta EndoREZ - à base de óxido de zinco e matriz
resinosa (QUEIROZ et al., 2009).
Com o propósito de superar as limitações da pasta de OZE como material
obturador de canais radiculares de dentes decíduos, outros materiais têm sido
investigados, dentre eles as pastas de hidróxido de cálcio (CHAWLA et al., 1998;
NADKARNI e DAMLE, 2000; OZALP et al., 2005; COSER et al., 2008; SARI et al.,
2008). As pastas de hidróxido de cálcio têm sido empregadas com diferentes
formulações apresentando bons resultados clínicos (OZALP et al., 2005; COSER
et al., 2008; SARI et al., 2008; MASSARA et al., 2012), com índices de sucesso
que variam entre 86,7% a 100% (BARCELOS et al., 2011). O hidróxido de cálcio
apresenta propriedades antimicrobianas (PIVA et al., 2009) contra cepas
comumente encontradas em infecções endodônticas, quando avaliadas com e
sem espessamento com óxido de zinco (QUEIROZ et al., 2009). E em relação à
biocompatibilidade, foram encontrados resultados satisfatórios na literatura
(SILVA et al., 2010; QUEIROZ et al., 2011). Huang et al. (2002) observaram
menor citotoxicidade para um cimento à base de hidróxido de cálcio quando
comparada a materiais obturadores de canais radiculares que continham OZE.
Entretanto, Leonardo et al. (2000) observaram resultado contrário.
Todavia, foi observado que o hidróxido de cálcio apresenta uma tendência
a ser solubilizado no interior dos canais radiculares de dentes decíduos, antes da
reabsorção fisiológica destes dentes (CHAWLA et al., 1998). Assim, algumas
pastas foram espessadas com óxido de zinco (CHAWLA et al., 2001) ou com
óxido de zinco e fluoreto de sódio (CHAWLA et al., 2008) com a finalidade de
reduzir a velocidade de reabsorção intracanal e facilitar a visualização
radiográfica. A dificuldade no espessamento das pastas para uso clínico está na
dependência do operador e das condições de manipulação das pastas, levando a
27
uma falha de padronização do material. Dessa forma uma formulação espessada
com óxido de zinco de fabricação nacional e pronta para uso, tem sido objeto de
interesse dos pesquisadores da linha de pesquisa de terapia pulpar do
Departamento de Odontpediatria e Ortodontia da UFRJ. Assim, uma formulação
foi desenvolvida em parceria com a indústria de materiais odontológicos e
denominada pasta UFRJ, a qual apresenta como característica ser facilmente
inserida em canais radiculares por técnica de obturação com broca lentulo. No
presente estudo, a pasta UFRJ foi primeiramente avaliada quanto ao potencial de
redução da viabilidade celular.
Altos níveis de citotoxicidade foram observados nos representantes dos
principais grupos de materiais utilizados na prática odontológica em um estudo
que avaliou materiais obturadores para os sistemas de canais radiculares de
dentes permanentes através de testes de avaliação multiparamétrica da
viabilidade celular de células humanas primárias. Estes resultados indicaram que
devem ser realizados esforços para a formulação de materiais mais
biocompatíveis e uma reavaliação das metodologias in vitro para a determinação
da viabilidade celular (SCELZA et al., 2012).
Nos dentes decíduos, a proximidade das áreas receptoras de pasta
obturadora com os dentes sucessores permanentes em desenvolvimento gera um
ambiente biofísico e bioquímico onde a ação ou liberação de possíveis produtos,
a partir desses materiais, podem ter efeitos indesejáveis. Além disso, como as
pastas obturadoras não tomam presa, as mesmas poderiam apresentar maior
solubilidade comparadas a cimentos de obturação de canais radiculares utilizados
em dentes permanentes. Dessa forma, testes de avaliação da citotoxicidade de
materiais obturadores têm sido executados (HUANG et al., 2007; SARIGOL et al.,
2010, PIRES et al., 2015). Contudo, a utilização de diferentes metodologias e
linhagens celulares dificulta a interpretação e a comparação dos dados (HUANG
et al., 2007; SARIGOL et al., 2010; SCELZA et al., 2012; PIRES et al., 2015).
Na literatura, a avaliação da citotoxicidade de pastas obturadoras de canais
radiculares de dentes decíduos a base de óxido de zinco e eugenol, de hidróxido
de cálcio e de iodofórmio frente a diferentes linhagens celulares, mostra
28
resultados de efeito citotóxico diversos que variam de moderado a grave
(BRISEÑO e WILLERSHAUSEN, 1990; BRISEÑO e WILLERSHAUSEN, 1992;
AZAR et al., 2000; HUANG et al., 2002; SARIGOL et al., 2010; PETEL et al.,
2013; POGGIO et al., 2014). Sendo observado que a utilização de células
primárias semelhantes a osteoblastos humanos para a avaliação da
biocompatibilidade in vitro de materiais com finalidade endodôntica já foi testada
com sucesso (ZHU et al., 2000; HUANG e CHANG 2002; WANG et al., 2007;
DEUS et al., 2012; SCELZA et al., 2012). Contudo, são encontradas frequências
de sucesso clínico e radiográfico moderadas e altas para as pastas obturadoras
de canais radiculares de dentes decíduos a base de óxido de zinco e eugenol, de
hidróxido de cálcio e de iodofórmio (OZALP et al., 2005; MOSKOWITZ et al.,
2005; TRAIRATVORAKUL e CHUNLASIKAIWAN, 2008; BARCELOS et al., 2012;
REWAL et al., 2014). Assim, com a finalidade de mimetizar as condições clínicas
de obturação de canal radicular de dente decíduo, este estudo propôs o
desenvolvimento de um modelo de simulação in vitro da obturação de canal
radicular desses dentes, limitando-se a quantidade de pasta obturadora
empregada e a exposição apical. Tal modelo destinou-se a avaliação da
biocompatibilidade in vitro de pastas obturadoras de canais radiculares de dentes
decíduos à base de óxido de zinco e eugenol, de hidróxido de cálcio e de
iodofórmio frente a uma linhagem celular de interesse relacionada com o
processo de reparo ósseo, células semelhantes a osteoblastos.
1.2 Considerações sobre a avaliação da citotoxicidade
A avaliação da citotoxicidade de determinada substância ou material requer
a utilização de células em cultivo como modelo de função fisiológica. As células
obtidas diretamente de um explante, por desagregação enzimática ou mecânica,
são denominadas células primárias, apresentam características genotípicas e
fenotípicas do tecido de origem e crescem em cultura por um período de tempo
limitado. Algumas células podem dar origem a uma linhagem celular contínua,
que embora não tenham perdido as características do tecido de origem,
apresentam alta taxa de proliferação. A alteração em uma cultura que acarreta o
aparecimento de linhagem de células contínua é chamada transformação in vitro.
29
As células que apresentam uma capacidade infinita de crescimento são
denominadas imortalizadas (FRESHNEY, 2005)
A viabilidade celular é caracterizada pela mensuração da capacidade das
células para executar determinadas funções como metabolismo, crescimento,
reprodução, alguma forma de responsividade e adaptabilidade (DESCRITORES
EM CIÊNCIAS DA SAÚDE, 2016).
Em relação à biocompatibilidade, pode-se afirmar que um material é
considerado biocompatível quando, aplicado com finalidade específica e correta,
comporta-se adequadamente em um tecido receptor (DOROZHKIN, 2010), de tal
forma que a interação entre ambos não resulte em irritação, lesão, inflamação,
pirogenicidade, mutagenicidade, carcinogenicidade, imunogenicidade ou
toxicidade (CALASANS-MAIA, 2009). Ou seja, sem gerar efeitos locais ou
sistêmicos ao hospedeiro, proporcionando uma resposta benéfica (GRANJEIRO e
SOARES, 2011). Contrariamente, o termo toxicidade refere-se a capacidade de
uma substância produzir efeito danoso ou nocivo através de sua interação com
organismo vivo. Quando o efeito nocivo é avaliado em nível celular através de
testes in vitro, observa-se a citotoxicidade ou efeito citotóxico de determinada
substância (GRANJEIRO e SOARES, 2011). Segundo Eisenbrand et al. (2002) o
termo citotoxicidade refere-se ao potencial apresentado por um composto de
induzir morte celular.
Assim, os testes para avaliação in vitro da citotoxicidade são importantes
para definição da citotoxicidade basal, ou seja, do potencial de um composto ou
substância em causar morte celular como consequência de um dano celular ou
desequilíbrio de funções celulares básicas em determinado número de células.
Ademais, os ensaios de citotoxicidade auxiliam na avaliação do comportamento
de uma cultura de células expostas a diferentes concentrações da substância ou
composto investigado (EISENBRAND et al., 2002).
O desenvolvimento de ensaios para a avaliação de efeito citotóxico ou
citotoxicidade in vitro com base na detecção de células viáveis, objetivou
idealmente a possibilidade de utilização desses testes em amostras de tamanho
grande, com a avaliação específica de células viáveis em uma mistura contendo
30
também células mortas (GREEN et al., 1984). Em 1983, Mosman (1983) propôs
um teste colorimétrico rápido a base de sal de tetrazólio (brometo de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) MTT com aplicabilidade para a avaliação da
viabilidade/proliferação celular. Desde então, o ensaio de redução do MTT e de
outros à base de sais de tetrazólio como o 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-
2H-tetrazólio-5-carboxanilida), XTT (SCUDIERO et al., 1988); o (3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio) MTS
(BARLTROP e OWEN, 1991); e o sal de tetrazólio solúvel em água, WST-1 (TAN
e BERRIDGE, 2000), têm sido utilizados na avaliação da citotoxicidade in vitro de
diferentes substâncias (VRBOVÁ et al., 2016; TAO et al., 2016) e materiais
(SCELZA et al., 2012). Esses testes baseiam-se na capacidade de células
viáveis, metabolicamente ativas, em reduzirem um sal de tetrazólio, através de
oxidorredutases, em um sal de formazan (BERRIDGE e TAN, 1993; BERNAS e
DOBRUCKI, 2002). Formazanos são sais geralmente sólidos de colorações
intensas que variam do vermelho ao azul escuro/púrpura e apresentam uma
cadeia atômica característica (-N=N-C=N-NH-) (JAWAD e SHMEINE, 2015). A
redução do MTT, de cor amarelo pálido, resulta em um sal insolúvel de formazan,
de coloração azul escuro/púrpura, que requer uma etapa de solubilização, com
isopropanol (MOSMAN, 1983; WANG et al., 2007) a fim de viabilizar a sua
quantificação através de leitura da discrepância ótica em leitor de microplaca
espectrofotométrico. Na literatura também se encontra descrita a utilização de
outros solventes para a solubilização do sal de formazan como o etanol (SILVA et
al., 2015) e o dimetilsulfóxido (DMSO) (VALOIS et al., 2008; ZAMBUZZI et al.,
2009; CHANG SW et al., 2014). Entretanto, para o solvente DMSO foi relatado
risco potencial ao pessoal quando expostos à grandes quantidades, além de
efeitos deletérios sobre os equipamentos de laboratório (SCUDIERO et al., 1988).
Assim foram desenvolvidos sais de tetrazólio XTT, MTS e WST-1, geradores de
produtos de formazan solúveis em água, após a bioredução por células viáveis,
dispensando o procedimento de solubilização.
Os ensaios de avaliação da viabilidade/proliferação celular à base de sais
de tetrazólio constituem uma abordagem amplamente utilizada como rastreio do
efeito citotóxico em toxicologia. Entretanto, a literatura descreve fatores
31
experimentais como capazes de alterar a redução do MTT e assim os resultados
de efeito citotóxico (STEPANENKO e DMITRENKO, 2015), como condições do
meio de cultura (JABBAR et al., 1989), o estado de crescimento das células (LIU
e DALGLEISH, 2009) e o uso de concentrações diferentes de soro fetal de vitelo
(ZHANG e COX, 1996). Ademais, os resultados originados pela redução do MTT
frente a algumas drogas anticancerígenas (MAIOLI et al., 2009; YANG et al.,
2014; STEPANENKO e DMITRENKO, 2015) e material nanoparticulado
(FISICHELLA et al., 2009) também foram reportados como sobrestimados e/ou
subestimados quando comparados aos resultados obtidos por outras
metodologias como a contagem celular direta ou ensaio de lactato desidrogenase
(LDH) (STEPANENKO e DMITRENKO, 2015). Tais observações levaram esses
autores a recomendar a suplementação dos testes a base de sais de tetrazólio
com outros ensaios não-metabólicos, a fim de evitar conclusões a partir de
resultados de efeito citotóxico enviesados (STEPANENKO e DMITRENKO, 2015).
Considerando a avaliação do efeito citotóxico de materiais obturadores de
canais radiculares, alguns pesquisadores recomendam a execução de testes com
diferentes parâmetros de ensaio, para a obtenção de observações (“endpoints”)
variadas, a fim de aumentar a chance de detecção dos possíveis efeitos danosos,
bem como apresentar indícios para a investigação das vias de citotoxicidade (DE
DEUS et al., 2009; SCELZA et al., 2012; SILVA et al., 2015).
Diferentes testes de avaliação da citotoxicidade de materiais obturadores
de canais radiculares correlacionando o parâmetro de ensaio, a lógica envolvida e
a principal referência estão descritas na Tabela 1.
Com base nas considerações iniciais aqui apresentadas, no presente
estudo foram executados: 1) uma revisão narrativa da literatura sobre as pastas
obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos mais estudadas e
avaliadas nos estudos clínicos de Odontopediatria dos últimos dez anos; 2) uma
revisão sistemática que investigou a comparação entre os resultados de efeito
citotóxico de materiais obturadores de canais radiculares obtidos por testes à
base de sais de tetrazólio com aqueles logrados através de outros parâmetros de
citotoxicidade e 3) a avaliação da citotoxicidade de pastas obturadoras de canais
32
radiculares de dentes decíduos selecionadas por meio de um modelo de
simulação de canal radicular e através da proporção material / veículo
recomendada pela ISO 10993-5.
33
Tabela 1. Principais características de diferentes ensaios de citotoxicidade utilizados na avaliação de materiais obturadores de canais radiculares
Ensaio Parâmetro Fundamento Referência
MTT Viabilidade celular – marcador
metabólico
Avaliação da atividade metabólica de células viáveis através da redução do sal de tetrazólio (amarelo) em sal insolúvel
de formazan (azul escuro/púrpura).
Mosmann, 1983 (J of lmmunol Methods 1983;65: 55-63)
WST-1 Viabilidade celular – marcador
metabólico
Avaliação da atividade metabólica de células viáveis através da redução do sal de tetrazólio em sal de formazan (púrpura
ou laranja) solúvel em água.
Tan and Berridge, 2000 (J of lmmunol Methods
2000;238: 59-68)
MTS Viabilidade celular – marcador
metabólico
Em células metabolicamente ativas, o sal de tetrazólio é reduzido em um sal de
formazan solúvel na presença de fenazina metasulfato, aceptor de elétron
intermediário, o qual acelera a bioredução.
Barltrop et al., 1991 (Biorganic & Medical
Chemistry Letters 1991;11(1):611-614
XTT Viabilidade celular – marcador
metabólico
Avaliação da atividade metabólica de células viáveis através da redução do sal de tetrazólio em sal de formazan (laranja)
solúvel.
Scudiero et al., 1988 (Cancer Res
1988;48(17):4827-33.)
Vermelho neutro Redução da viabilidade celular
– marcador membranar
Células viáveis incorporam o corante vermelho neutro através de transporte ativo pela membrana e o acumulam preferencialmente nos lisossomos.
Borenfreund and Puerner, 1985 (Toxicol Lett 1985;24:119-124).
Eluição do corante cristal violeta
Redução da viabilidade celular – marcador de DNA
O corante cristal violeta cora o DNA nuclear. Útil para células aderentes.
Gentry and Dalrymple, 1980 (J Clin Microbiol 1980;Sept:361-366)
Exclusão do corante azul tripan
Redução da viabilidade celular – marcador membranar
Células viáveis com membranas intactas, não permitem a penetração do corante,
corando somente células mortas.
Krause et al., 1984 (The Journal of Histochemistry
and Cytochemistry
34
1984;2(10):1084-1090).
Azul de alamar Viabilidade celular – marcador
metabólico
A forma oxidada do corante resazurina (azul escuro) entra no citoplasma celular
e é convertido a nível mitocondrial, através de enzimas, em sua forma
reduzida resofurin de coloração vermelha.
Nakayama et al. 1997 (J Immunol Methods 1997 May 26;204(2):205-8)
Citometria de fluxo Marcador de apotose/necrose
Permite a discriminação entre células vivas e mortas com base nas
propriedades de dispersão, ou através do uso de corantes de DNA fluorescentes
que passam pela membrana celular danificada e se ligam ao DNA.
Hoppner et al., 2002. (Journal of Immunol
Methods 2002;267(2):157–163)
Microscopia de Fluorescência:
Apoptose/necrose com dupla coloração
acridina laranja/brometo de
etídio
Marcador de apotose/necrose
Permite a discriminação entre células vivas, em fases inicial ou final de
apoptose e necrose através de corantes fluorescentes. E ainda observar a morfologia celular e nuclear, e a
desintegração da cromatina.
Baskic et al., 2006 (Cell Biol Int 2006;30(11):924-
932)
Indução de apoptose detectada através do
corante Hoechst 33258 e
ativação da poli (ADP-ribose) polymerase
(PARP)
Marcador de apotose
A PARP é responsável pela modificação pós translacional de proteínas em resposta a agentes genotóxicos, é
importante no mecanismo de reparo do DNA, morte celular e estabilidade
genômica. A ativação da PARP é um marcador de resposta ao dano ao DNA.
Yu MK et al., 2010 (J Endod 2010;36:1967–
1971) Hoechst 33258 (Begg and
Mooken, 1989)
Lactato desidrogenase (LDH)/
Marcador de componente intracelular liberado
LDH é uma oxiredutase que catalisa a conversão do piruvato. É liberada para o citosol após dano a membrana celular,
sua detecção indica morte celular.
Decker and Lohmann-Matthes, 1988. (Journal of
Immunol Methods 1988;115:61-69)
35
Análise de heme oxygenase-1 (HO-1)
Marcador de componente intracelular
A HO-1 é uma isoforma da heme oxigenase que cataboliza a hematina celular em biliverdina, monóxido de
carbono e ferro. A expressão aumentada é indicadora de estresse oxidativo
Yoshida and Migita, 2000 (Journal of Inorganic
Biochemistry 2000;82:33–41)
Conteúdo de ácido nucleico (NAC)
Marcador de componente intracelular
Usa a quantidade total de macromoléculas celulares extraídas para
estimar a densidade celular.
Cingi et al., 1991 (Toxic. in Vitro 1991;5(2):119-
125)
Teste de diacetato de diclorofluoresceína
(DCFH-DA)
Marcador de componente intracelular liberado
Uma célula submetida a estresse oxidativo apresenta níveis elevados de
espécies reativas de oxigênio (ROS) que causam dano aos lipídios, proteínas e
DNA.
Schieber and Chandel, 2014 (Current Biology 2014;24(10):453–462)
Microscopia electrônica de
varredura (MEV)
Alterações morfológicas gerais
Imagens em alta resolução da superfície da amostra, resultando aparência
tridimensional
Bell et al., 1979. (Scan Electron Microsc 1979;(3):11-121)
36
2. Objetivo geral
Avaliar a citotoxicidade de diferentes pastas obturadoras de canais
radiculares de dentes decíduos através de um modelo de simulação de canal
radicular.
3. Objetivos específicos
Avaliar a frequência de sucesso clínico/radiográfico das pastas obturadoras de
canais radiculares de dentes decíduos mais estudadas e avaliadas em
estudos de Odontopediatria nos últimos dez anos.
Comparar através de uma revisão sistemática da literatura, os resultados da
citotoxicidade de materiais obturadores de canais radiculares obtidos através
de ensaios a base de sais de tetrazólio e os obtidos através de outros
parâmetros de viabilidade celular nas mesmas células/linhagens celulares.
Desenvolver modelo de simulação de canal radicular de dente decíduo.
Avaliar quanto a citotoxicidade as pastas obturadoras de canais radiculares de
dentes decíduos selecionadas através de metodologia multiparamétrica.
Avaliar quanto a citotoxicidade as pastas obturadoras de canais radiculares de
dentes decíduos selecionadas através da proporção material veículo
recomendada pela ISO 10993-5 (2009).
37
4. Delineamento da pesquisa
4.1 Tipo de estudo
Estudo observacional, com documentação indireta, documentação direta
laboratorial e abordagem indutiva. O presente estudo consistiu de: i) uma revisão
da literatura recente que pesquisou as frequências de sucesso clínico/radiográfico
das pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduo mais utilizadas e
avaliadas em estudos de Odontopediatria, ii) uma revisão sistemática que
comparou os resultados de efeito citotóxico de materiais obturadores de canais
radiculares obtidos através dos testes a base de sais de tetrazólio com os obtidos
através de outros testes de avaliação de citotoxicidade nas mesma
células/linhagens celulares e iii) um estudo para avaliação da citotoxicidade de
pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos através de modelo
de simulação in vitro da obturação de canal radicular de dente decíduo, limitando-
se a quantidade de pasta obturadora empregada e a exposição apical.
4.2 Locais de execução do estudo
A revisão da literatura foi executada no Departamento de Odontopediatria e
Ortodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de
Janeiro (FO/UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil).
A revisão sistemática foi executada no Departamento de Odontopediatria e
Ortodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de
Janeiro (FO/UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil) e na Unidade de Pesquisa Clínica
(UPC, Niterói, RJ) do Hospital Universitário Antônio Pedro – Universidade Federal
Fluminense (UFF, Niterói, RJ).
Os testes de avaliação da citotoxicidade foram executados no Laboratório
de Cultura Celular da Unidade de Pesquisa Clínica (UPC, Niterói, RJ) do Hospital
Universitário Antônio Pedro – Universidade Federal Fluminense (UFF, Niterói,
RJ).
38
4.3 Avaliação da citotoxicidade
4.3.1 Revisão da literatura recente sobre as pastas obturadoras de canais
radiculares de dentes decíduos mais utilizadas e avaliadas em
estudos de Odontopediatria.
4.3.1.1 Método
Esse estudo foi executado segundo as orientações de Green et al. (2006)
para revisão narrativa da literatura.
4.3.1.1.1 Fontes de informação e estratégia de busca
As bases de dados Pubmed (Title/Abstract field), Cochrane Library e
LILACS foram pesquisados em janeiro de 2013, os termos em inglês para
pulpectomia e dentes decíduos, pulpectomy e primary teeth, com limite de
publicação de dez anos. A busca foi executada independentemente por dois
revisores (AVBP, QOB) e na lista de referências nos artigos dos dois últimos anos
(2011 - 2013).
4.3.1.1.2 Critérios de elegibilidade
Foram incluídos, nessa revisão, os estudos clínicos controlados não
aleatorizados e controlados aleatorizados conduzidos em pacientes pediátricos
tratados com o procedimento de pulpectomia e obturação dos canais radiculares
de dentes decíduos, com acompanhamento clínico e radiográfico mínimo de 6
meses, publicados entre 2002 e janeiro de 2013. Não houve restrição quanto a
idade, gênero e etnia dos pacientes, dentes tratados ou diagnóstico pulpar inicial.
4.3.1.1.3 Seleção dos estudos e extração de dados
Os títulos e resumos dos artigos recuperados na busca foram lidos e
avaliados segundo os critérios de elegibilidade, independentemente por dois
revisores (AVBP e QOB). Os casos de discordância entre esses foram resolvidos
por consenso através da avaliação de um terceiro revisor (RB).
39
A extração de dados executada pelos revisores incluiu: referências (título,
autores, ano de publicação, localização geográfica), material obturador de canais
radiculares utilizado, tamanho da amostra, tempo de acompanhamento clínico e
radiográfico e, frequências de sucesso.
4.3.1.1.4 Análise descritiva dos dados
Os artigos identificados nas três bases de dados e na busca manual foram
compilados em um único acervo e as referências duplicadas removidas. Os
artigos que atenderam aos critérios de elegibilidade foram incluídos nessa
revisão. As principais características dos estudos selecionados foram tabuladas e
avaliadas segundo uma análise descritiva.
4.3.2 Revisão sistemática: comparação dos resultados de efeito citotóxico
de materiais obturadores de canais radiculares obtidos através dos
testes a base de sais de tetrazólio com os logrados através de
outros ensaios de avaliação de citotoxicidade
4.3.2.1 Método
Essa revisão sistemática foi executada com base na abordagem para
revisão sistemática e integração de evidências descrita no Handbook for
conducting a literature-based health assessment using OHAT (Office of Health
Assessment and Translation) approach for systematic review and evidence
integration, Division of the National Toxicology Program, National Institute of
Environmental Health Sciences, U. S. Department of Health and Human Services,
Estados Unidos da América (OHAT, 2015).
4.3.2.1.1 Critério de elegibilidade
Segundo os critérios estabelecidos na estratégia PECO (Tabela 2) foram
incluídos nessa revisão estudos in vitro que avaliaram o efeito citotóxico de
materiais obturadores de canais radiculares não sólidos (MOCR) em células
animais e/ou humanas, através de testes a base de sais de tetrazólio e outros
testes de avaliação da citotoxicidade.
40
Os critérios de exclusão aplicados foram relacionados aos diferentes tipos
de publicação: estudos clínicos, relatos de caso, revisões, editoriais, opiniões,
artigos técnicos, levantamentos, diretrizes, conferências, comentários e estudos
em animais. Os estudos executados em organismos não-animais foram excluídos.
Também o foram, os estudos que avaliaram outros materiais, outros materiais
dentários ou MOCR com outros objetivos.
Tabela 2. Delineamento da pergunta segundo a estratégia (PECO) população, exposição, comparação e resultados (outcomes)
PECO
População Células animais e/ou humanas
Exposição
Expostas a materiais obturadores de canais radiculares (MOCR) com avaliação da
citotoxicidade por meio de diferentes testes de avaliação da citotoxicidade
Comparação
Expostas a materiais obturadores de canais radiculares (MOCR) com avaliação da
citotoxicidade por meio de testes à base de sais de tetrazólio
Outcome Efeito citotóxico
4.3.2.1.2 Fontes de informação
Foram executadas buscas eletrônicas nas bases de dados Pubmed,
Scopus e Web of Science até setembro de 2015.
4.3.2.1.3 Estratégia de busca
O processo de busca eletrônica nas bases de dados foi executado
independentemente por dois revisores (AVBP e RB). Foram identificados termos
MeSH e palavras-chave na base de vocabulário estruturado do Descritores em
Ciências da Saúde (DeCS) e em artigos publicados, serviram como base para a
preparação da estratégia de busca, que incluiu alterações nos termos e seguiu as
regras de sintaxe próprias de cada base de dados (Tabela 3). Não foram
aplicados filtros ou limites nas buscas. Os artigos presentes em mais de uma
base de dados foram considerados uma única vez. Os títulos e, quando
41
necessário, resumos e metodologias dos artigos, foram lidos e avaliados visando
a identificação daqueles potencialmente elegíveis. Os casos de discordância entre
os revisores foram resolvidos em consenso com um revisor sênior (GGA).
Tabela 3. Estratégia de busca
Base de dados Estratégia de busca
Pubmed cytotox*[Title/Abstract] OR biocompat*[Title/Abstract] AND endod*[Title/Abstract] OR root canal filling[Title/Abstract]
Scopus “cytotox*” OR “biocompat*” AND “endod*“ OR “root canal
filling”
Web of Science cytotox* OR biocompat* AND endod* OR root canal filling
Os artigos potencialmente elegíveis foram lidos integralmente para
determinação da elegibilidade de acordo com o PECO, avaliação da qualidade
metodológica e extração de dados. Em caso de dúvida, as justificativas foram
resumidas e discutidas em reuniões de consenso com o revisor sênior (GGA).
4.3.2.1.4 Avaliação da qualidade metodológica
O Handbook for conducting a literature-based health assessment using
OHAT (Office of Health Assessment and Translation) approach for systematic
review and evidence integration não provê uma avaliação de qualidade
metodológica para estudos in vitro. Sugere que os autores da revisão sistemática
elaborem seu próprio esquema de avaliação. Assim, foi pesquisada uma
metodologia para a avaliação de estudos in vitro. Foi selecionada a planilha para
estudos in vitro da ferramenta ToxRTool® (Toxicological data Reliability
Assessment Tool, Institute for Health and Consumer Protection, In vitro Methods
Unit, European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM))
disponível no site https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-
publications/toxrtool para avaliar a qualidade metodológica intrínseca de cada
artigo ou a confiabilidade dos dados apresentados (Anexos 1 e 2). A ferramenta
inclui cinco grupos de critérios: I) identificação da substância testada, II)
42
caracterização do sistema teste, III) descrição do deseho do estudo, IV)
documentação dos resultados dos estudos e V) confiabilidade do desenho do
estudo e dos dados; totalizando 18 critérios de avaliação para estudos in vitro. À
cada critério pode ser conferido os valores “1”ou 0”, considerando que o critério foi
preenchido ou não. Existem alguns requisitos mínimos, indispensáveis, para que
o estudo seja considerado confiável. Os critérios cruciais são destacados em
vermelho (“critérios vermelhos”). Somente se os critérios vermelhos são
assinalados como “1”, o programa classifica a confiabilidade dos dados do estudo
como Categoria 1 (confiável sem restrições) ou Categoria 2 (confiável com
restrições), independentemente do escore obtido. A Categoria 3 (não confiável) é
assegurada aos dados dos estudos que obtiveram pontuação inferior a 11 ou não
preencheram todos os critérios vermelhos. Ao final da avaliação o software
classifica os dados dos estudos de acordo com a pontuação inicial, confronta os
critérios vermelhos e classifica novamente. Então, em casos de discordância
entre o avaliador e o programa, o avaliador pode propor uma nova categoria para
os dados avaliados, quando há uma justificativa plausível. Em nosso estudo, os
artigos avaliados e classificados na categoria 1 (máxima) de confiabilidade na
avaliação da qualidade metodológica através da ferramenta ToxRTool® foram
incluídos. Os artigos que apresentaram classificação inicial igual a categoria 1,
com posterior avaliação do programa para os critérios fundamentais (“vermelhos”)
como categoria 3 (“não confiável”), em que a única falha metodológica foi a
ausência de relato de utilização de controle positivo durante os experimentos,
foram reclassificados como categoria 1 pelos revisores em reunião de consenso
com o revisor sênior (GGA). Na planilha está descrito que : “O relato de utilização
de controle positivo embora importante nos ensaios in vitro, estará geralmente
ausente nos ensaios de avaliação do metabolismo”, caso dos testes de
citotoxicidade à base de sais de tetrazólio. A ferramenta ToxRTool® prevê a
ocorrência dessa alteração de categoria justificada pelos revisores. Com base
nessas considerações, os estudos selecionados foram avaliados quanto ao
protocolo metodológico utilizado, avaliando a extensão segundo a qual os autores
conduziram seus estudos em concordância com os melhores padrões
metodológicos possíveis.
43
A extração de dados foi executada com base no Handbook for conducting a
literature-based health assessment using OHAT (Office of Health Assessment and
Translation) approach for systematic review and evidence integration,
considerando seis blocos: i) identificação do estudo: referência bibliográfica; ii)
financiamento: fonte, relato de conflito de interesse; iii) modelo de célula/tecido:
linhagem celular ou tipo celular, gênero do animal ou humano de origem, espécie,
variedade; iv) tratamento: MOCR quanto à composição, marca comercial,
preparo, veículo utilizado nas condições experimentais/controle; v) métodos:
cumprimento de diretrizes, procedimentos de aleatorização, alocação sigilosa,
cegamento durante a avaliação dos resultados, número de réplicas por grupo,
parâmetro de ensaio (endpoint) ou categoria do ensaio, nome e fonte do kit de
ensaio, análise estatística; vi) resultados: Concentração Sem Efeito Observado
(CSEO), Menor Concentração Com Efeito Observável (MCCEO), significância
estatística, Concentração de Atividade 50 (CA50), ou outras estimativas de efeito
relatadas no artigo (Apêndice 1).
4.3.2.1.5 Extração dos dados dos artigos e avaliação dos resultados
As principais características dos artigos foram tabuladas: i) referência
bibliográfica, ii) financiamento/conflito de interesse, iii) linhagem ou tipo celular, iv)
composição/marca comercial MOCR, veículo utilizado nas condições
experimentais/controle, proporção veículo: material, número de réplicas por grupo,
tempo de exposição, percentual de soro/plasma no meio, identificação do sal de
tetrazólio utilizado e resultados, identificação do outro (s) teste (s) utilizado (s) e
resultados.
Os resultados dos testes de citotoxicidade foram expressos
quantitativamente e qualitativamente através de diferentes formas (ISO 10993-5,
2009). Assim, nas avaliações quantitativas as mensurações foram apresentadas
em valores médios com desvio padrão expressando valores percentuais de
vitalidade celular em relação ao controle experimental (somente meio de cultura)
ou ao controle negativo (material reconhecidamente não citotóxico e meio de
cultura); ou em valores percentuais de citotoxicidade celular em relação ao
controle experimental ou ao controle negativo; ou em valores de discrepância
44
ótica (DO). Qualitativamente os resultados referiram-se às alterações
morfológicas das células; ou à detecção de apoptose ou necrose celular.
Os dados quantitativos, expressos em valores percentuais de citotoxicidade
celular em relação ao controle experimental ou ao controle negativo, foram
transformados em valores de vitalidade celular em relação ao controle
experimental ou ao controle negativo, através da subtração 1- valor de
citotoxicidade. Os valores de densidade ótica foram tratados considerando o valor
de DO do controle experimental ou negativo como correspondente a 100% de
vitalidade celular.
Com a finalidade de garantir exatidão na interpretação dos resultados
quantitativos expressos nos gráficos dos artigos incluídos no estudo, foi utilizado o
programa xScope 4.0® (The Iconfactory and ARTIS software, Greensboro, EUA)
(Figura 1) através das ferramentas Rulers e Guides. Um paquímetro virtual
(Rulers) foi adicionado ao eixo vertical e através desse foram mensurados os
milímetros correspondentes à faixa percentual de interesse demarcada. Através
da ferramenta Guides foi projetada no eixo horizontal do gráfico uma linha
referente ao resultado apresentado. Através de cálculo por regra de três simples,
o valor do resultado foi identificado. Os resultados foram então avaliados
segundo a Classificação de efeito citotóxico com base nos resultados de
viabilidade celular relativa aos controles, adaptado de DAHL et al., 2006. (Tabela
4). Para facilitar a descrição foram incluídos à classificação original os símbolos (-
-), (-), (+) e (++), referentes aos termos não citotóxico, levemente citotóxico,
moderadamente citotóxico e fortemente citotóxico.
Sob o ponto de vista regulatório de acordo com a ISO 10993-5 (2009), os
materiais que causarem redução da viabilidade celular superior a 30% são
considerados citotóxicos. Assim, considerando-se a classificação de efeito
citotóxico com base nos resultados de viabilidade celular relativa aos controles,
adaptado de DAHL et al., 2006, os materiais classificados como não citotóxicos e
levemente citotóxicos com redução da viabilidade celular até 30% estão em
conformidade com a avaliação da norma ISO.
45
É importante ressaltar que de acordo com a ISO 10993-5 (2009), a
observação de efeito citotóxico é um importante indicativo para potencial efeito
tóxico in vivo, entretanto os materiais não devem ser classificados como
impróprios para o uso clínico com base unicamente nos resultados de avaliação
da citotoxicidade.
Figura 1. Exemplo de identificação dos resultados de efeito citotóxico em gráfico de artigo, através do programa xScope 4.0®
46
Tabela 4. Classificação de efeito citotóxico com base nos resultados de viabilidade celular relativa aos controles, adaptado de DAHL et al., 2006)
Efeito citotóxico Viabilidade celular em relação aos controles
Não citotóxico (--) > 90%
Levemente citotóxico (-) Entre 60 to 90%
Moderadamente citotóxico (+) Entre 30 to 59%
Fortemente citotóxico (++) < 30%
As avaliações qualitativas morfológicas descritivas foram consideradas em
comparação com a seção 8.5.1 da ISO 10993-5 (2009) (Tabela 5). As avaliações
qualitativas descritivas referentes à detecção de apoptose e necrose celular foram
consideradas como descritas pelos autores quanto a presença ou ausência.
47
Tabela 5. Classificação morfológica qualitativa da citotoxicidade dos extratos
Classificação Reatividade Condições das culturas
0 Ausente Grânulos intracitoplasmáticos discretos, sem
lise celular, sem redução do crescimento celular.
1 Leve
Não mais que 20% das células estão arredondadas, descoladas e sem grânulos
intracitoplasmáticos, ou mostram alterações morfológicas, presença de células com lise
ocasionais, somente observável leve inibição do crescimento celular.
2 Suave
Não mais que 50% das células estão arredondadas, sem grânulos
intracitoplasmáticos, sem extensiva lise celular, não mais que 50% de inibição do
crescimento celular observável.
3 Moderada
Não mais que 70% das camadas celulares contêm células arredondadas ou lisadas; camadas celulares não completamente
destruídas, porém a inibição do crescimento celular observável é superior a 50%.
4 Severa Destruição das camadas celulares quase
completa ou completa.
Iso 10993-5 (2009)
4.3.2.1.6 Análise dos dados
A comparação entre os resultados obtidos através dos testes a base de
sais de tetrazólio e através de outros testes de citotoxicidade foi executada
considerando a tendência desses ensaios em indicarem nível semelhante de
efeito citotóxico para cada material investigado. Assim foram considerados
semelhantes entre si as classificações “Não citotóxico (--) “ e “Levemente
citotóxico (-)”; “Moderadamente citotóxico (+)” e “Fortemente citotóxico (++)”.
Foram calculadas as quantidades de: i) comparações possíveis em cada
estudo, ii) o número total de comparações e iii) o número de comparações
48
concordantes (Tabela 6). Em relação a origem das células, foram calculados: o
número total de comparações executadas e o número de comparações
concordantes. A razão entre o número total de comparações executadas e o
número de comparações concordantes foi expressa percentualmente.
A avaliação quantitativa dos resultados de geração de espécies reativas de
oxigênio (ROS) através da expressão da heme oxigenase (HO-1), ou através do
teste de diacetato de diclorofloresceína (DCFH-HA), ou pelo teste de ácido
tiobarbitúrico substâncias reativas (TBARS) foi comparada aos resultados dos
testes a base de sais de tetrazólio usando-se um fold change biológico de 1,5
(WITTEN e TISHIRANI, 2007). Em outras palavras, as alterações médias de
expressão de ROS do grupo tratado superiores a 50% em relação a média de
expressão de ROS do grupo controle foram consideradas como indicativas de
citotoxicidade.
49
Tabela 6 Resultados das comparações executadas entre as diferentes metodologias de avaliação da citotoxicidade e os ensaios à bse de sais de tetrazólio
Variáveis Comparações
(n)
Comparações com tendências similares de
efeito citotóxico
(n / percentual)
Diferentes parâmetros de ensaio
Apoptose /necrose detecção
Marcadores membranares
Marcadores de DNA
Marcadores de NAC
Marcadores de components
intracelulares liberados
Marcadores de alterações morfológicas
celulares
Diferentes marcadores metabólicos
Ensaios à base de sais de tetrazólio
MTT
XTT
WST-1
MTS
50
4.3.3 Avaliação da citotoxicidade de pastas obturadoras de canais
radiculares de dentes decíduos através de modelo de simulação in
vitro da obturação de canal radicular de dente decíduo, limitando-se
a quantidade de pasta obturadora empregada e a exposição apical
4.3.3.1 Desenvolvimento do modelo de simulação in vitro da
obturação de canal radicular de dente decíduo, limitando-se
a quantidade de pasta obturadora empregada e a exposição
“apical”
No protocolo de pulpectomia desenvolvido e utilizado na Disciplina de
Odontopediatria da Faculdade de Odontologia da UFRJ a instrumentação
mecânica de canal radicular de dentes decíduos é executada com limas do tipo
Kerr para realização do avanço apical. A primeira lima a executar a
instrumentação deve ser aquela cujo calibre melhor se acoplar ao forame apical,
seguida das duas limas seguintes da série até, no mínimo, a lima número 45 em
dentes anteriores e 35 em dentes posteriores (BARCELOS et al. 2009).
O modelo de simulação in vitro da obturação de canal radicular de dente
decíduo foi desenvolvido de tal forma que atendesse aos seguintes requisitos: i)
apresentasse conicidade, ii) que o diâmetro da extremidade “do canal radicular do
modelo” fosse compatível com o diâmetro de uma lima do tipo Kerr #45, iii)
permitisse a manipulação asséptica das pastas obturadoras e controles, iv)
permitisse a manipulação asséptica do modelo durante os procedimentos
experimentais de avaliação da citotoxicidade das pastas e v) “o canal radicular do
modelo” comportasse em seu interior uma massa padronizada de pasta
obturadora de canais radiculares. A massa média (0,037g) de pasta obturadora
pesada em balança analítica, após a obturação de canais radiculares de dentes
decíduos foi a encontrada por XIMENES e CARDOSO (2012).
Foi selecionada a ponteira de pipeta de polipropileno de 0,5-10 µl (T-300,
0,5-10µl, Axygen®, California, EUA) (Anexo 3) como “modelo de canal radicular”,
dentre as várias ponteiras testadas. O dispositivo de modelo de simulação in vitro
51
da obturação de canal radicular de dente decíduo foi constituído dos seguintes
materiais estéreis: uma ponteira de pipeta de polipropileno de 0,5-10 µl (T-300,
0,5-10µl, Axygen®, Califórnia, EUA), suporte composto de tampa de microtubo
plástico de 0,5ml (Easypath, São Paulo, Brasil) recortada e perfurada para
receber alça em fio de aço (Morelli, Sorocaba, Brasil) de 0,5mm de espessura e
10mm de comprimento, e tubo eppendorf de 2ml (Alfa, Ipiranga, Brasil) (Figura
2).
Figura 2. A) Componentes do dispositivo modelo de simulação in vitro da obturação de
canal radicular de dente decíduo, B) Dispositivo montado.
4.3.3.2 Seleção das pastas obturadoras de canais radiculares de
dentes decíduos
A revisão da literatura executada (Artigo 1) embasou a seleção das pastas
obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos investigadas nesse estudo
in vitro de avaliação da citotoxicidade (Tabela 7).
A pasta UFRJ a base de hidróxido de cálcio pronta para uso foi
desenvolvida em parceria, pelos pesquisadores da linha de pesquisa em terapia
pulpar em Odontopediatria do Departamento de Odontopediatria (FO/UFRJ) e a
indústria de materiais dentários S.S.White (Rio de Janeiro, Brasil) e avaliada pela
primeira vez quanto a citotoxicidade.
52
Tabela 7: Pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos
Produto e fabricante Composição Modo de preparo
Endoflas® (Sanlor Lab, Bogotá, Colômbia)
Iodofórmio, hidróxido de cálcio, óxido de zinco, sulfato de bário, eugenol e paramonoclorofenol canforado
Espatulação de 0,5g de pó e 5 gotas de líquido
Vitapex® (Neo DenProducts Co Ltd, Tokyo, Japan)
Iodofórmio e hidróxido de cálcio
Pasta pronta comercialmente
Calcicur® (VOCO, Cuxhaven, Alemanha)
Hidróxido de cálcio Pasta pronta comercialmente
Calen® espessada com óxido de zinco (S.S.White, Rio de Janeiro, Brasil)
Calen® - Hidróxido de Cálcio 49,77%
Espatulação de 1g de Calen® acrescida de 0,65g de óxido de zinco
Pasta Guedes-Pinto (USP) (Laboratórios Buenos Ayres, São Paulo, Brasil) (Biodinâmica, Ibiporã, Brasil)
Pomada (1g de pomada carbowax,5mg de acetato de prednisolona, 1,5mg de rifamicina sódica) paramonoclorofenol canforado iodofórmio
Manipulação de partes visualmente iguais de pomada, paramonoclorofenol canforado e iodofórmio.
Pasta Guedes (Fórmula & Ação, São Paulo, Brasil)
Iodofórmio 33,33%, paramonoclorofenol 33,33%,rifamicina 0,05%, prednisolona 0,1666%
Pasta pronta para uso
Pasta UFRJ (S.S.White, Rio de Janeiro, Brasil)
Hidróxido de Cálcio, Oxido de Zinco, Polietilenoglicol Breu WW
Pasta pronta para uso
Óxido de zinco eugenol (Biodinâmica, Ibiporã, Brasil)
Óxido de zinco, eugenol e ácido acético glacial
0,5 grama de pó acrescido por espatulação a 9 gotas de líquido
53
4.3.3.3 Preparo das amostras para os testes de avaliação
multiparamétrica da citotoxicidade das pastas obturadoras
de canais radiculares de dentes decíduos através de modelo
de simulação in vitro da obturação de canal radicular de
dente decíduo, limitando-se a quantidade de pasta
obturadora empregada e a exposição apical
Os fabricantes das pastas à base de óxido de zinco e eugenol e Endoflas®
(Sanlor Lab, Bogotá, Colômbia) não diponibilizam proporções de pó e líquido fixas
para a manipulação com finalidade de obturação de canal radicular de dente
decíduo. A fim de garantir a reprodutibilidade na execução dos testes de
citotoxicidade foram padronizadas as proporções 0,5 grama de pó de óxido de
zinco para 9 gotas de eugenol para a pasta a base de óxido de zinco e eugenol
(PINTOR et al., 2015 – resumo SBPqO) e 0,5g de pó e 5 gotas de líquido para a
pasta Endoflas® (Sanlor Lab, Bogotá, Colômbia). As proporções foram
determinadas em testes de espatulação com 0,5g de pó e diferentes proporções
de líquido dispensadas gota a gota até que fosse obtida a consistência ideal para
permitir a utilização de técnica de obturação de canal radicular através de broca
lentulo em baixa rotação (BAWAZIR e SALAMA 2006), utilizada no protocolo de
obturação de canal radicular de dente decíduo na Disciplina de Odontopediatria
(FO/UFRJ). Os testes de espatulação foram executados na Disciplina de
Odontopediatria (FO/UFRJ) em duplicata pela doutoranda (AVBP), dois
mestrandos (TIV e ALM) e uma auxiliar de consultório dentário experiente (KS).
A pasta Calen® espessada com óxido de zinco foi preparada na proporção
1,0g de pasta Calen® para 0,65g de óxido de zinco (QUEIROZ et al., 2011). A
pasta de Guedes-Pinto foi preparada pela manipulação de 0,30g de cada um de
seus componentes. As pastas foram abertas e manipuladas de forma asséptica
em capela de fluxo laminar vertical (Labconco, Kansas City, USA) em placas de
vidro estéreis, com espátulas para cimento (24F, Duflex, Rio de Janeiro, RJ)
exclusivas para cada pasta. As pastas manipuladas de Guedes-Pinto, Endoflas® e
a base de óxido de zinco e eugenol, e a pasta UFRJ foram inseridas em seringas
descartáveis estéreis de 3ml com agulha 0,70 x 25mm (BD SoloMedTM, Curitiba,
Brasil) a fim de permitir a inserção de cada pasta nas ponteiras “modelo de canal
54
radicular”. A pasta Calen® espessada com óxido de zinco foi inserida com auxílio
de agulha 0,80 x 40mm (Becton Dickinson, Curitiba, Brasil) sem seringa,
simulando um calcador, devido a sua consistência. As pastas Calcicur, Vitapex®
e pasta de Guedes, as quais são prontas para uso e embaladas em seringas,
permitiram a dispensa dos materiais diretamente da embalagem. Cada pasta foi
inserida em uma ponteira de pipeta de polipropileno de 0,5-10 µl (T-300, 0,5-10µl,
Axygen®, California, EUA) em um tubo eppendorf de 2ml (Alfa, Ipiranga, Brasil) e
a massa igual a 0,037g (XIMENES e CARDOSO, 2012) foi pesada por diferença
em balança de precisão (Sartorius CP225D, Goetting, Germany). Após a
pesagem, a ponteira foi adaptada ao suporte e o conjunto inserido em um tubo
eppendorf de 2ml (Alfa, Ipiranga, Brasil). Como o processo total de pesagem dos
materiais teve longa duração, as pastas foram manipuladas e pesadas na
seguinte ordem: Calcicur, Vitapex®, de Guedes, UFRJ, Calen® espessada, de
Guedes-Pinto, Endoflas® e a base de óxido de zinco e eugenol. Após a pesagem,
à cada dispositivo modelo de simulação de obturação, no tubo eppendorf de 2ml
(Alfa, Ipiranga, Brasil), foi dispensado 185μl de meio de cultura Dulbecco’s
Modified Eagle’s media (DMEM) (Cultilab, Campinas, Brasil) com 1% de penicilina
e estreptomicina (Sima-Aldrich, St Loius, EUA) e bicarbonato de sódio (Sima-
Aldrich, St Loius, EUA) a 3,7g/l , sem soro fetal bovino para obtenção dos extratos
dos materiais (Figura 3). Todos os procedimentos foram executados de forma
asséptica e n = 3 para cada pasta (ISO 10993-5, 2009).
Além das pastas foram preparados também os controles para os ensaios
de avaliação da citotoxicidade: controles experimentais (somente meio de
cultura), negativo (pérolas de poliestireno) positivo (látex). Os controles negativo e
positivo foram preparados na proporção 0,2g de material para 1ml de meio de
cultura (LOURENÇO et al., 2015), proporção material: veículo já testada para
esses controles.
Todos os 33 dispositivos referentes às amostras e aos controles foram
encubados a 37°C, com 95% de humidade e 5% CO2, durante 24 horas. Após
esse período, a exposição às pastas e aos controles foi interrompida pela
remoção do “modelo de canal radicular”, de forma asséptica.
55
Figura 3. A) Pesagem de pasta obturadora (0,037g), B) Dispositivo modelo de simulação de obturação com 185μl de meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle’s media (DMEM) sem soro para obtenção do extrato do material (Vitapex®).
4.3.3.4 Cultura celular
Células semelhantes a osteoblastos humanos em passagem #4
provenientes do Laboratório de Cultura Celular da Unidade de Pesquisa Clínica
do Hospital Universitário Antônio Pedro – UFF (Niterói, RJ), foram semeados em
uma placa de cultura celular de 96 poços (Corning®, Tewskbury, USA), na
densidade de 1x104 células/poço, preenchendo 33 poços. Três outros poços
foram destinados ao controle branco. Ao redor dos poços semeados e brancos
foram dispensados 200μl de solução tampão fosfato (STF) estéril, a fim de reduzir
a evaporação do meio de cultura. As células foram mantidas em meio de cultura
DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (Cultilab,
Campinas, Brasil) e em estufa a 37ºC, com 95% de humidade e 5% de CO2 por
24 horas. Após 24 horas, o meio de cultura de cada poço foi cuidadosamente
retirado por aspiração e reposto por 180μl de extrato dos materiais e controles e
então acrescido de 20μl de soro fetal bovino inativado. As células foram
novamente encubadas por 24h em estufa a 37ºC com 95% de humidade e 5% de
CO2 previamente aos ensaios de avaliação da citotoxicidade.
56
4.3.3.5 Avaliação multiparamétrica da citotoxicidade das pastas
obturadoras de canais de dentes decíduos
A citotoxicidade dos materiais e controles foi avaliada através do kit de
ensaios mutiparamétricos In Cytotox XTT-NR-CVDE (Xenomatrix, Alschwil,
Suíça), o qual avaliou sequencialmente na mesma cultura de células, três
parâmetros de viabilidade e integridade celular em relação às amostras (DE
DEUS et al., 2009; SCELZA et al., 2012; YADLAPATI et al., 2014). Através do
ensaio do XTT (2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolio-5-carboxianilida)
foi avaliada a capacidade de células viáveis, com cadeia respiratória intacta, em
reduzirem pela ação da enzima succinato desidrogenase, as moléculas de XTT
em um sal solúvel de formazano, detectável a uma absorbância de 480nm e
quantificado espectrofotometricamente em leitor de microplaca (PowerWave MS2,
BioTek, Rio de Janeiro, Brasil). O ensaio do Vermelho Neutro avaliou a
integridade membranar e a capacidade das células viáveis em incorporar, através
de endocitose, o corante Vermelho Neutro e acumulá-lo preferencialmente nos
lisossomos. A discrepância ótica (DO) obtida a uma absorbância igual a 540nm
em leitor de microplaca (PowerWave MS2, BioTek, Rio de Janeiro, Brasil) permitiu
a quantificação das células viáveis. O teste de eluição do corante Cristal Violeta
avaliou a densidade celular através da coloração do DNA celular; após o descarte
do excesso de corante, o valor da discrepância ótica mensurada em cada poço, a
uma absorbância de 540nm foi considerado proporcional ao número de células
viáveis.
4.3.3.5.1 Teste do XTT
Após 24h de exposição das células aos extratos das pastas e controles,
esses foram cuidadosamente removidos por aspiração e os poços lavados com
solução tampão fosfato. Os extratos foram substituídos por 200μl de meio de
cultura DMEM.
A avaliação da citotoxicidade foi iniciada com o teste do XTT. As soluções
dos reagentes XTT II e XTT I foram misturadas na proporção de 1:100 e 50μl da
mistura foi acrescentado a cada poço. A placa foi coberta com papel alumínio e
encubada em estufa a 37ºC com 95% de humidade e 5% de CO2 por 2 horas e a
57
DO referente a cada poço de interesse lida, à absorbância de 480nm em leitor de
microplaca (PowerWave MS2, BioTek, Rio de Janeiro, Brasil).
4.3.3.5.2 Teste do Vermelho Neutro
Sequencialmente ao teste do XTT, as células e controle branco foram
submetidas ao teste do Vermelho Neutro. A solução remanescente do teste XTT
foi removida e os poços lavados com 300μl de solução NR I. A solução NR II
previamente diluída na proporção (1:100) em meio de cultura DMEM a 37ºC, foi
acrescentada a cada poço (200μl), e a placa de cultura foi encubada em estufa a
37ºC com 95% de humidade e 5% de CO2 por 3 horas. A solução foi removida e
200μl de solução NR III foi acrescentada a cada poço e após 1 minuto, 200μl da
solução NR IV foi dispensada a cada poço, e a placa encubada a 37ºC com 95%
de humidade e 5% de CO2 por 15 minutos. A DO referente a cada poço de
interesse lida a absorbância de 540nm em leitor de microplaca (PowerWave MS2,
BioTek, Rio de Janeiro, Brasil).
4.3.3.5.3 Teste de eluição do corante Cristal Violeta
Após a execução do teste do Vermelho Neutro, a placa de cultura foi
vertida para remoção da solução remanescente, e as células e branco lavados
duas vezes com 200μl de solução CVDE I. A solução CVDE II (100μl/poço) foi
acrescentada e a placa de cultura encubada a temperatura ambiente por 10
minutos. A solução foi removida e cada poço lavado com 200μl de água
deionizada. A placa de cultura foi seca e foi dispensada 100μl/poço de solução
CVDE III. A DO de cada poço de interesse foi registrada a uma absorbância de
540nm.
4.3.3.5.4 Análise estatística
Os resultados foram expressos como valores percentuais de células viáveis
para cada material, comparados ao controle experimental. A média e desvio
padrão foram calculados. Os dados de viabilidade celular foram analisados pelo
teste de não paramétrico de Kurskal-Wallis com pós-teste de Dunn com nível de
significância de 5% (p < 0,05).
58
4.3.1 Avaliação da citotoxicidade de pastas obturadoras de canais radiculares de
dentes decíduos através do ensaio do XTT com a proporção
veículo/material recomendada pela ISO 10993-5 (2009)
Com a finalidade de comparar os resultados de efeito citotóxico obtidos por
meio do modelo de simulação de canal radicular com os resultados obtidos
através da proporção recomendada pela ISO 10993-5 (2009), foi executado um
novo experimento. Baseado nos resultados da revisão sistemática executada em
2015 (Artigo 2) foi selecionado o teste de redução do XTT para a investigação da
avaliação da citotoxicidade das pastas obturadoras selecionadas.
4.3.1.1 Preparo das amostras
As pastas obturadoras foram manipuladas de forma asséptica e nas
proporções previamente descritas na seção 5.3.3.3. Foram pesados em balança
de precisão (Sartorius CP225D, Goetting, Germany) 200mg de cada pasta, em
tubos eppendorfs de 2,0ml (Alfa, Ipiranga, Brasil), em duplicata. A cada um dos 16
tubos eppendorfs foi acrescentado 1000μl de meio de cultura DMEM com
antibiótico e sem soro fetal bovino. Além das pastas foram preparados também
em duplicata, os controles experimental (meio de cultura), negativo (pérolas de
poliestireno) e positivo (látex) (LOURENÇO et al., 2015). Os 22 tubos eppendorfs
foram encubados a 37ºC com 95% de humidade e 5% de CO2 por 24h. Após esse
tempo, os tubos eppendorfs foram centrifugados (Alfa, Ipiranga, Brasi) a 3000
r.p.m., por 15 minutos, a temperatura ambiente. Foram então retirados 1500μl de
extrato sobrenadante e dispensados em dois tubos eppendorfs, garantindo a
interrupção do preparo dos extratos.
4.3.1.2 Cultura de células
Células semelhantes a osteoblastos humanos em passagem #4
provenientes do Laboratório de Cultura Celular da Unidade de Pesquisa Clínica
do Hospital Universitário Antônio Pedro – UFF (Niterói, RJ), foram semeados em
uma placa de cultura celular de 96 poços (Corning®, Tewskbury, USA), na
densidade de 1x104 células/poço, preenchendo 55 poços. Cinco outros poços
foram destinados ao controle branco. Ao redor dos poços semeados e brancos
59
foram dispensados 200μl de solução tampão fosfato (STF) estéril, a fim de reduzir
a evaporação do meio de cultura. As células foram mantidas em meio de cultura
DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (Cultilab, campinas,
Brasil) e em estufa a 37ºC com 95% de humidade e 5% de CO2 por 24 horas.
Após 24 horas, o meio de cultura de cada poço foi cuidadosamente retirado por
aspiração e reposto por 180μl de extrato dos materiais e controles e então
acrescido de 20μl de soro fetal bovino inativado. As células foram novamente
encubadas por 24h em estufa a 37ºC com 95% de humidade e 5% de CO2
previamente ao ensaio de avaliação da citotoxicidade.
4.3.1.3 Teste do XTT
Após 24h de exposição das células aos extratos das pastas e controles,
esses foram cuidadosamente removidos por aspiração e os poços lavados com
solução tampão fosfato. Os extratos foram substituídos por 200μl de meio de
cultura DMEM. A avaliação da citotoxicidade foi executada através do teste do
XTT. As soluções dos reagentes XTT II e XTT I foram misturadas na proporção de
1:100 e 50μl da mistura foi acrescentado a cada poço. A placa foi coberta com
papel alumínio e encubada em estufa a 37ºC com 95% de humidade e 5% de
CO2 por 2 horas e a discrepância ótica referente a cada poço de interesse lida à
absorbância de 480nm em leitor de microplaca (PowerWave MS2, BioTek, Rio de
Janeiro, Brasil).
60
5. Resultados
5.1 Artigo 1: A critical review of the root canal filling materials mostly
used in the recent pediatric studies
Andréa Vaz Braga Pintora
Queila Braga Oliveirab
Roberta Barcelosc
Rogério Gleiser d
Laura Salignac Guimarães Primoe
ª PhD student, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
b MSc student, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
c Professor, Department of Pediatric Dentistry, Institute of Health, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
d Associate Professor, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
e Adjunct Professor, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
Corresponding author: Dr. Laura S. Guimarães Primo
Disciplina de Odontopediatria da FO-UFRJ
Caixa postal: 68066
21941—971 Cidade Universitária CCS RJ Brazil
Phone: + (55) 21 2562-2098 Fax: + (55) 21 2590-2771
email:[email protected]
61
Generic heading: Pediatric Dentistry
Title of article: A critical review of the root canal filling materials mostly used in
the recent pediatric dentistry studies
Abstract: The aim of this study was to describe the mostly used and evaluated
root canal filling materials in clinical pediatric dentistry research. A search was
performed on May 2016, in Pubmed, Cochrane and LILACS databases
considering the terms “pulpectomy “and “primary teeth”, limited to the last 10
years. A total of 21 papers were included in this review. ZOE paste is still the most
used root canal filling material for primary teeth in pediatric clinical research,
although a tendency in the use of iodoform with calcium hydroxide pastes was
observed.
Clinical Relevance: The aim of this study was to review in literature, the root
canal filling materials mostly used, and evaluated in recent clinical pediatric
dentistry research
Objective statements: The reader should understand which root canal filling
materials are considered of interest and confidence.
Introduction
Pulpectomy is the treatment indicated for primary teeth diagnosed with
irreversible pulpitis, with minimal physiological or pathological root resorption, not
exceeding 1/3 of the root length, which could receive a final restoration. This
procedure rationale is based on the cleaning, disinfecting and filling the root canal
with a resorbable paste. However, the morphology of the root canal system of the
primary molars is complex and turns the ideal cleanliness hard to achieve. Thus,
the root canal filling materials with antibacterial and anti-inflammatory properties
are recommended. Until now, there is no consensus in literature concerning the
best root canal filling material for primary teeth (1,2), although there is a moderate
62
evidence for zinc oxide and eugenol (ZOE) based paste, and iodoform with
calcium hydroxide based pastes (2).
Since the first described root canal therapy in 1930 by Sweet with a final
procedure of canal filling with ZOE based paste, this material has been used in
primary teeth (3). High success rate have been described for ZOE (4–6) although
this material presents a low resorbing rate, which has been associated to ectopic
eruption of permanent successors teeth (7) and cytotoxicity (8). Aiming to
overcome such drawbacks, alternative pastes have been proposed for the root
canal filling of primary teeth; among them the iodoform with calcium hydroxide
based pastes. These pastes have been used with reported high rates of clinical
and radiographic success (5,9), show antibacterial properties and are easily
resorbed compared to ZOE based pastes (2).
The aim of this study was to review in literature, the root canal filling
materials mostly used, and evaluated in recent clinical pediatric dentistry research,
including the clinical and radiographic success rates reported. The result could
give an overview for both pediatric dentists and researchers of which root canal
filling materials are considered of interest and confidence.
Methods
We searched the terms pulpectomy and primary teeth in the databases
Pubmed (Title/abstract field), Cochrane Library and LILACS. The 10 years
publication limit was applied in the search performed on May 2016, by two review
authors (AVBP, OQB). A hand search was performed in the last four years (2012 -
2016) papers.
This narrative literature review included clinical and randomized controlled
trials conducted on children, who undergone pulpectomy as root canal therapy,
with at least 6 months of clinical and radiographic follow-up. There were no
restrictions regarding patients’ age, gender, ethnicity, tooth type or initial pulpal
diagnostic condition.
The titles and abstracts of articles obtained in the electronic search were
read and evaluated independently by two review authors, following the eligibility
63
criteria described. Papers appearing in more than one database search were
considered only once. Any differences between the two readers were solved by
consensus or by a third reviewer (RB).
Data extraction included: references (title, authors, year of publication,
geographic location), type of study (clinical, clinical controlled, randomized
controlled trial), filling materials used, sample size, radiographic and clinical follow-
up period, and outcomes with success percentage rate.
Results
We identified 108 articles. One hundred were screened after duplicates
removal and 17 papers were assessed for eligibility. After a manual search on the
last 4 years selected papers, 4 more studies were included for eligibility. A total of
21 studies were included in this review according to the established inclusion and
exclusion criteria.
The main characteristics of the selected studies were compiled (Table 1).
The zinc oxide and eugenol based paste was the most used root canal filling
material (n=12). ZOE was the control material for the evaluation of pulpectomies
performed with other filling materials (5,10–13). Also, ZOE was the filling material
chosen when the evaluation of other endodontic technique parameters was the
main objective (14–17). In the selected studies, the frequency of overall clinical
and radiographic success ranged from 63.3% (11) to 93.3% (18), however, no
statistically significant variation was observed between the ZOE based paste
groups and the other root canal filling materials evaluated (5,11–13,18). Likewise,
ZOE was used in a study that evaluated restorative techniques (19).
Iodoform based with calcium hydroxide (I/CH) pastes were the canal root
filling material used in 8 studies (5,6,9,10,13,20,21). Such material was considered
as the control material in the evaluation of the pulpotomy procedure performed
with other materials (20). And in the evaluation of a biologic approach, lesion
sterilization and tissue repair technique, in the treatment of carious lesions with
pulpal and periapical involvement using a mixture of three antibiotics (ciprofloxacin
200mg, metronidazole 500mg, minocycline 100mg, mixed in a 1:1:1 ratio) (9).
64
Furthermore, an I/CH paste was the root canal filling material used in a study that
evaluated different irrigant solutions (21). The frequency of overall success
reported ranged from 89% (5) to 100% (18).
Calcium hydroxide was the root canal filling material used in 3 studies (22–
24). One study evaluated different restorative techniques (22) and another
compared pulpotomies with formocresol and ZOE paste as filling material, with
pulpectomies with calcium hydroxide a root canal filling material (23). Only one
study (24) evaluated the frequency of success of a calcium hydroxide based
material in a long-term follow-up.
Discussion
For many years, ZOE paste has been the first choice material for the filling
of primary teeth with pulpectomy indication (15). Furthermore, the ZOE based
paste remained as the preferred material aiming to the root canal filling of primary
teeth (85%) of the Pediatric Dentistry Programs of the U.S. Dental Schools,
although the iodoform paste with calcium hydroxide has its use increased (25).
However, the ZOE based paste present as some drawbacks the limited
antibacterial effect, lower resorbing pace compared to the physiologic exfoliation of
the primary teeth and irritation to the periapical tissues caused by eugenol (2,11)
Alternatively, to ZOE based pastes, other vehicles have been added to the
zinc oxide powder, which is a mild astringent and topical protectant with a relative
antiseptic property. The combination of ozonated oil to zinc oxide, aiming to a long
lasting of antibacterial action, showed clinical and radiographic overall result of
93.3% compared to the 70% result obtained with ZOE based paste (11). When
aloe vera, an anti-inflammatory, antibacterial and pain relieving substance, was
associated, the success rates observed were 100% and 73.34% for the clinical
and radiographic parameters (26). Likewise, the association of propolis, a natural
antibacterial product, showed a high frequency of clinical success (93.8%)
compared to other materials, although the radiographic success rate was lower
(62.5%) (13).
65
On the basis of this literature review, the most used root canal filling
material of primary teeth was the ZOE based paste. From the 21 articles of our
literature search, 12 used ZOE as filling material. Our result corroborates the
interest of two systematic reviews of the literature on the ZOE based paste for root
canal filling of primary teeth. Barcelos et al. (1) compared the clinical and
radiographic performance of ZOE based paste with other root canal filling
materials for primary on a long-term follow-up. The overall success for the
pulpectomies performed with the ZOE based paste, the iodoform based with
calcium hydroxide and calcium hydroxide were respectively 85-100%, 89-100%
and 80%. Barja-Fidalgo et al. (2) evaluated the effectiveness of other root canal
filling materials for primary teeth with the ZOE based paste and concluded that
both the latter and the iodoform based with calcium hydroxide were suitable
materials.
The iodoform based pastes have several favorable characteristics: i) are
effective in removing remaining infections, ii) resorb quickly when extruded beyond
the root canal apex and iii) are easily applied (5). Different formulations of root
canal filling materials containing iodoform are available and were identified on our
search: i) iodoform, camphor, menthol, and parachlorophenol (27); ii) iodoform,
zinc oxide, calcium hydroxide, barium sulfate, eugenol, and
paramonochlorophenol (18); iii) ZOE with iodorform (6) and iv) calcium hydroxide
and iodoform (5). In recent studies, an I/CH was used as control material for
pulpotomies (20) and for the evaluation of pulpectomies that used the antibiotic
paste (9). Nakornchai et al. (9) found a frequency of radiographic success similar
between the I/CH and antibiotic based pastes groups in the initial 6 months of
follow-up. However, after 12 months, only 56% of the evaluated teeth were still
filled in with the I/CH paste. Trairatvorakul and Chunlasikauan (5) also observed
the resorption of the material inside the root canals of primary teeth. Despite this
I/CH drawback, the comparison of the overall success rates of the ZOE based
paste and iodoform based with calcium hydroxide was 89% and 85% (5) and 89 to
100% (1).
It is worth of mentioning that the clinical and radiographic frequencies of
success should be carefully analyzed and compared, since there is not a
66
consensus with regard to an ideal standard protocol for the pulpectomy procedure
(2). However, we observed the reporting of high clinical and radiographic success
rates on the selected studies, for the proposed treatments.
The diversity of root canal filling materials identified in this study show that
the search for an ideal material for primary teeth is still an object of concern of the
pediatric dentistry researchers. Although the use of the iodoform based with
calcium hydroxide pastes as root canal filling material has increased, the ZOE
based paste is still the mostly used endodontic filler for primary teeth, as control
material for other materials and for the evaluation of different technique
parameters.
Conclusions
In the light of this literature search, ZOE paste is still the most used root
canal filling material for primary teeth with an overall frequency of success from
63.3% to 93.3%, although a tendency in the use of iodoform based with calcium
hydroxide pastes was observed, which showed success rates from 89 % to 100%.
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21. Louwakul P, Prucksathamrongkul W. The effect of 2% chlorhexidine
as root canal irrigant in pulpectomies of primary molars. Pediatr
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69
22. Zulfikaroglu BT, Atac AS, Cehreli ZC. Clinical performance of Class
II adhesive restorations in pulpectomized primary molars: 12-month
results. J Dent Child (Chic). 2008; 75: 33–43.
23. Coser RM, Gondim JO, Aparecida Giro EM. Evaluation of 2
endodontic techniques used to treat human primary molars with
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Quintessence Int. 2008; 39: 549–57.
24. Sari S, Okte Z. Success rate of Sealapex in root canal treatment for
primary teeth: 3-year follow-up. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral
Radiol Endod. 2008; 105: e93–6.
25. Dunston B, Coll JA. A survey of primary tooth pulp therapy as taught
in US dental schools and practiced by diplomates of the American
Board Of Pediatric Dentistry. Pediatr Dent. 2008; 30: 42–8.
26. Khairwa A, Bhat M, Sharma R, Satish V, Maganur P, Goyal AK.
Clinical and radiographic evaluation of zinc oxide with aloe vera as
an obturating material in pulpectomy: An in vivo study. J Indian Soc
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27. Holan G. Long-term effect of different treatment modalities for
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28. Aminabadi NA, Huang B, Sciences H, Samiei M, Agheli S, Student
P, et al. A Randomized Trial Using 3Mixtatin Compared to MTA in
Primary Molars with Inflammatory Root Resorption: A Novel
Endodontic Biomaterial. 2016; 40: 95–102.
70
Table 1: Characteristics of included studies
Reference Geographic
location Filling material Sample size
Follow up (months)
Outcome (success rate)
Overall success
Clinical success
Radiographic success
Aminabadi et al.
(28) Iran ZOE
40 M previous perforation repair with antibiotics and simvastatin
24
96.8 %
40 M previous perforation repair with MTA
0%
Al-Ostwani et al. (13)
Syria
ZO + propolis 16 M
12
93.5% 62.5%
ZOE + I + CH (Endoflas®-chlorphenol-free)
16 M 87.5% 81.3%
I + CH (Metapex®) 16 M 87.5% 75%
ZOE 16 M 87.5% 56.3%
Pramilla et al. (10)
India
ZOE + I (RC Fill) 35 mandibular M
30
94%
I + CH (Vitapex®) 35 mandibular M 90%
ZOE (Pulpdent) 36 mandibular M 97%
Rewal et al. (12) India ZOE 24 M
9 83% 100%
ZOE + I + CH (Endoflas®) 26 M 100% 100%
Khairwa et al. (26)
India ZO + aloe vera gel 15 mandibular M 9 86.67% 73.34%
Chandra et al. (11)
India ZOE 30 M
12 63.31%
ZO + ozonated sesame oil 30 M 93.3 %
Howley et al. (20)
USA I + CH (Vitapex®) 74 I 23 73%
Barcelos et al. (15)
Brazil
ZOE 40 T (G1=smear layer removal)
24
91.2%
ZOE 42 T (G2=smear layer not removal)
70.0%
Louwakul & Prucksathamrongkul. (21)
Thailand I + CH (Vitapex®)
32 mandibular M (irrigated with saline solution)
18
97%
32 mandibular M (irrigated with 2% chlorhexidine solution)
93%
Tannure et al. (16)
Brazil ZOE 47 T 60 91.5%
Tannure et al. (17)
Brazil ZOE 18 I (G1=smear layer removal)
36 82.3%
ZOE 18 I (G2=smear layer not removal) 88.2%
71
Subramaniam et al. (18)
India
ZOE 15 M
18
93.3%
ZOE +I + CH (Endoflas®) 15 M 93.3%
I + CH (Metapex®) 15 M 100%
Ramar & Mungara (6)
India
I + CH (Metapex®) 30 M
9
90.5%
ZOE + I (RC Fill) 34 M 84.7%
ZOE + I + CH (Endoflas®) 32 M 95.1%
Nakornchai et al. (9)
Thailland I + CH (Vitapex®) 25 M
12 96% 56%
Antibiotics 25 M 100% 76%
Aminabadi & Farahani (19)
Iran ZOE 144 T 24 81,5%
Zulfikaroglu et al. (22)
Turkey CH (Calcicur®)
15 T amalgam
12
73%
15 T TPH resin / Prime & Bond NT 93%
15 T Dyract / Prime & Bond NT 73%
15 T Dyract NRC / Prime & Bond NT
80.0%
15 T F-2000 / Prompt L-loop 87 %
Coser et al. (23) Brazil CH (Calen®) 23 M 48 90%
Traitratvorakul & Chunlasikauan (5)
Thailland ZOE 27 M
12 85%
I + CH (Vitapex®) 27 M 89%
Sari et al., 2008
(24) Turkey CH (Sealapex®) 62 T 36 92.3%
Holan (27) Israel I + camphor+ menthol +PCFC (Kri paste)
25 I
Until permanent teeth eruption
72%
Bawazir & Salama (14)
Saudi Arabia ZOE
25 M (obturation with mounted lentullo spiral)
6
96% 81.8%
25 M obturation with hand-held lentullo spiral)
92% 72%
Note: ZOE = zinc oxide and eugenol; I = iodoform; CH = calcium hydroxide; PCFC = parachlorophenol; M = molars; I = Incisors; T = teeth
72
5.2 Artigo 2: Are the results of the cytotoxicity of the root canal filling materials
evaluated through the tetrazolium salt-based tests and other cell viability
parameters conflitant? A systematic review
Authors:
Andréa Vaz Braga Pintora
Luciana Domênicob
Gutemberg Alves c
Juliana Côrtesd
Roberta Barcelose
Laura Salignac Guimarães Primof
ª PhD student, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
b Underdraduate student, Biomedicine, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
c Adjunct Professor, Department of Molecular and Cellular Biology , Biology Institute, Fluminense Federal University, Niterói, Brazil.
d PhD student, Clinical Research Unit, Antonio Pedro Hospital, Fluminense Federal University, Niterói, Brazil.
e Adjunct Professor, Department of Pediatric Dentistry, Institute of Health, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil..
fAdjunct Professor, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
Corresponding author: Dr. Laura S. Guimarães Primo
Disciplina de Odontopediatria da FO-UFRJ
Caixa postal: 68066
21941—971 Cidade Universitária CCS RJ Brazil
Phone: + (55) 21 2562-2098 Fax: + (55) 21 2590-2771
email:[email protected]
73
SUMMARY
The diversity of methodologies for evaluating the cytotoxic effect of root
canal filling materials hinders the comparison of the studies results and the search
for evidences. The aim of this systematic review was to compare the cytotoxicity
results for root canal filling materials (RCFM), obtained through MTT and other
tetrazolium salt-based tests (TSBT) with those obtained through other cell viability
(CV) assays. A search was performed on Pubmed, Scopus and Web of Science.
No limits or filters were applied. According to the PECO criteria were included in
vitro studies, which evaluated the cytotoxic effect of RCFM on animal and/or
human cells, through TSBT and at least one different CV parameter. The inner
methodological quality of selected papers was assessed through the ToxRTool®. A
total of 4051 articles were found, after removal of duplicates, 3054 remained. After
applying the eligibility criteria, 42 studies were selected for data extraction and
methodological evaluation, 29 papers were included in this review. A total of 279
comparisons were performed and 86.02% of them (n = 240) showed similar trends
of CE results using different assays. The TSBT and the Neutral Red uptake dye
assay results pointed to similar trends of CE in 86.95% (n = 17) of the
comparisons. Among TSBT, MTT (n = 166) and XTT tests (n = 81) pointed to
similar trends of CE in 87.95% and 92.59% of the comparisons. This review
results support the value of the XTT and MTT for the cytotoxicity screening of root
canal filling materials, since these assays do not present conflicting results
compared to other cell viability parameters assays.
Keywords: root canal filling materials, MTT, tetrazolium salt-based tests,
biocompatibility, cytotoxicity
1. Introduction
The root canal filling procedure aims, ultimately, the filling and the sealing of
the root canal complex (Orstavik, 2005) with the complete three-dimensional
obturation of the main and the accessories root canals (Schilder, 1967). For this
purpose, different materials have been designed for the primary teeth (Barcelos et
al., 2011) and the permanent teeth (Hauman and Love, 2003). Whether pastes for
74
the primary teeth, sealers or cements for the permanent, these materials contact
intimately the dentinal tissue of the root canal walls and may contact the
periradicular tissues if accidentally extruded from the apices or through the
eluents. Furthermore, the root-end-filling materials used in periapical surgery
endodontic therapy are kept in close contact with both dental and periapical
tissues (Yanez et al., 2008). For such reasons, the root canal filling materials were
classified as permanent-contact implant devices and therefore this category
candidate materials must be submitted to a flow of investigation assays aiming to
determine whether these are too toxic to be therapeutically used (ISO 7405,
2008). The first in vitro cell-based assays approach or cytotoxic basal screening is
widely used to determine if the tested materials have effects on the cell viability
and/or cell proliferation or toxic effects that could lead to cell death (Eisenbrand et
al., 2002; Riss et al., 2015).
There are a variety of assays methodologies applied in the toxicological
screening for the measurement of the cell viability or the cell proliferation after the
direct or indirect exposure to different materials (Riss et al., 2015). Among the cell
viability assays, the tetrazolium salt-based tests are widely used both as a single
strategy (Schwarze et al., 2002; Silva et al., 2013) or associated to other
parameter assays in a multiparametric approach (Osorio et al., 1998; Scelza et al.,
2012; Silva et al., 2015) for the evaluation of root canal filling materials. The
associated strategy is advocated for the possible increase in the chances of
detection of the cytotoxic effect of such materials and the observing of the feasible
different cytotoxic pathways (De Deus et al., 2009; Scelza et al., 2012). Moreover,
the comparison of the metabolic activity of the exposed cells, with the results
obtained through other cell viability parameters, would enable a proper
interpretation of the results (Wang et al., 2007).
Among the tetrazolium salt-based tests, the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-
yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) is the most used tetrazolium compound, and
the MTT reducing assay is considered as the “gold standard” for cytotoxic testing
(van Tonder et al., 2015). However, this assay has been criticized for the
possibility of over/underestimation of the cell viability results for different
75
substances (van Tonder et al., 2015) and in anti-cancer drugs screening studies
performed with tumor cells (Stepanenko and Dimitrenko, 2015).
Considering the root canal filling materials, the diversity of methodologies
for the cytotoxic screening hinders the comparison of the studies results, and any
possible impairment on the cytotoxic effects results for these materials obtained
through the MTT assay compared to those obtained through other cell viability
parameters has not been accessed yet. Therefore the purpose of this systematic
review was to compare the results of the cytotoxic effect of root canal filling
materials obtained through the tetrazolium salt-based tests with those obtained
through, at least, one different cell viability assay performed on the same cell
types/lineages in order to observe if the results of the different methodologies
would imply a concordant or not concordant trend of cytotoxicity.
2. Methods
This systematic review was performed based on the Handbook for
conducting a literature-based health assessment using OHAT (Office of Health
Assessment and Translation) approach for systematic review and evidence
integration.
2.1. Eligibility criteria
According to the PECO criteria (Table 1) we included in this review in vitro
studies, which evaluated the cytotoxic effect of non-solid root canal filling materials
(RCFM) on animal and/or human cells, through tetrazolium salt-based tests and at
least one different cell viability parameter.
The exclusion criteria were applied to the following studies designs and
publication types: clinical studies, case reports, review articles, retrospective,
editorials, opinions, technique articles, surveys, guidelines, conferences,
commentary articles and animal studies. Studies conducted in non-animal
organisms, or those, which evaluated other materials or other dental materials or
evaluated RCFM with other objectives, were also excluded.
76
2.2. Information source
We conducted electronic searches up to September 2015 using the
following electronic bibliography databases: PubMed, Scopus and Web of
Science. No filters were applied to the language or year of the publications.
2.3. Search strategy
Two review authors performed the search process independently
(AVBP/RB). MesH (Medical Subject Headings) Terms and keywords identified on
the Health Science Descriptors site and in the published papers served as the
basis for preparing the search strategy, which included appropriate changes in the
terms and followed the syntax rules of each database (Table 2). No filters or limits
were applied in the searches. Papers appearing in more than one database
search were considered only once. The title and, when needed, title, abstract and
methodology of selected studies were read and evaluated for the identification of
eligible studies. Any doubts were solved by consensus meeting with the senior
reviewer (GGA).
The selected articles (Figure 1) were read for quality assessment and data
extraction. The full texts of the studies were assessed for eligibility, and a form
was filled to guarantee eligibility according to the PECO criteria. In case of doubt,
this was summarized and discussed the reasons in the consensus meetings.
2.4. Quality assessment of the selected studies and data extraction
Each selected study was evaluated for inner methodological protocol
aiming to evaluate the extent to which study authors conducted their research in
accordance to the higher possible standards. The ToxRTool® (Toxicological data
Reliability Assessment Tool, Institute for Health and Consumer Protection, In vitro
Methods Unit, European Centre for the Validation of Alternative Methods
(ECVAM)) was used to assess the inherent quality, or reliability of the reported
data. The tool comprises 18 criteria for in vitro studies. Each criterion can be
assigned either a “1” or “0” whether the criterion was met or not met. There are
some minimmum requirement criteria indispensable for a study to be considered
77
as reliable. Those crucial criteria are highlighted in red (red criteria). Only if the red
criteria are rated as “1”, the software ToxRTool® assigns a data reliability of
Category 1 (reliable without restrictions) or Category 2 (reliable with restrictions),
irrespective to the total score obtained. The Category 3 (not reliable) is assigned to
the data that sores less than 11 points or not all the red criteria are met. As a
summary, the tool rates the data according to the numerical score and checks the
red criteria and rates the data again. Then, in cases of disagreement, the
evaluator can propose a Category for the data, since there is a plausible
justification for such change. (Supplementary material)
Data extraction was performed according to six domains: i) study
identification: paper reference; ii) funding: source, reporting of conflict of interest;
iii) cell/tissue model: cell line or cell type, source of cells, sex of human or animal
of origin, species, strain; iv) treatment: RCFM chemical composition, brand,
prepare, vehicle used in experimental/control conditions; v) methods: guideline
compliance, randomization procedure, allocation concealment, blinding during
outcome, number of replicates per group, percent serum/plasma in medium, use
of negative control, report of data from positive controls, endpoint or assay
category, name and source of assay kit, statistical methods; vi) results: No
Observed Effect Concentration (NOEC), Lowest Observed Effect Concentration
(LOEC), statistical significance, AC50 or other estimates of effect reported in the
paper.
The results of the cytotoxic effect evaluations were expressed quantitatively
and qualitatively through different forms (ISO 109993-5, 2009). Seen in these
terms, quantitative measurements were reported as mean values and standard
deviations expressing percent values of cell viability in relation to the experimental
or to the negative control; or percent values of cell toxicity in relation to the
experimental or to the negative control; or as optical density (OD) values.
Qualitatively, the results reported cell morphological overall changes; or the
detection of cell apoptosis or necrosis.
The quantitative results reported as cell toxicity values were transformed
into cell viability results through the subtraction 1- cell toxicity value. The optical
78
density values were dealt with considering the OD values of the experimental or
negative controls as correspondent to 100% cell viability.
Aiming the correct interpretation of the quantitative values reported on the
graphs of the selected studies, the software xScope 4.0® (The Iconfactory and
ARTIS software, Greensboro, USA) was used through the tools Rulers and Guides
to obtain the precise values. The cytotoxic effect results were evaluated based on
cell viability relative to controls as not cytoyoxic – >90% cell viability, slightly
cytotoxic – 60-90% cell viability, moderately cytotoxic – 30-59% cell viability and
strongly cytotoxic – <30% cell viability (Dahl et al., 2006).
The qualitative morphological descriptive evaluations were considered for
comparison with the descriptions of the “Qualitative morphological grading of
cytotoxicity of extracts”, section 8.5.1 from ISO 10993-5 (2009). The qualitative
descriptive evaluations regarding the detection of cell apoptosis or cell necrosis
were considered as reported by the authors for the presence or absence.
Data analysis consisted of the comparisons between the results obtained
through the tetrazolium salt-based tests and those obtained through at least one
different cell viability parameter, considering the trend of such assays to indicate
similar cytotoxic effect level for each investigated root canal filling material. Thus
the classifications “Not cytotoxic” and “Slight cytotoxic” have been defined as
similar to each other and therefore concordant, as well as “Moderately cytotoxic”
and “Strongly cytotoxic” (Dahl et al., 2006). The comparisons enabled the
performing of the following measurements: i) comparisons in each study, ii) total
number of comparisons and iii) number of concordant comparisons. The number
of total and concordant comparisons were evaluated to different variables: i) origin
of cells, whether animal or human; ii) assays parameters and iii) type of
tetrazolium salt-based test.
The quantitative results reported for the generation of reactive oxidative
species (ROS) through the expression of heme oxygenase-1 (HO-1), or through
the dichlorofluorescein diacetate test (DCFH-DA) or through the thiobarbituric acid
reactive substances (TBARS) were compared to the tetrazolium salt-based tests
results using a biological fold change of 1.5 (Witten and Tibshirani, 2007). That is
79
to say the changes in the mean of ROS expression of the treated group higher
than 50% in relation to the mean of ROS expression of the control group were
considered as indicative of cytotoxicity.
3. Results
We exported all the articles (4051) found to End Note Web software® in
database groups (1442 from Pubmed, 1728 from Scopus and 881 from Web of
Science. We removed the duplicates, leaving 3054 papers. Based on the
exclusion criteria, we excluded: 412 animal studies; 4 book chapters; 199 case
reports, 101 clinical studies; 25 conference abstracts; 4 guidelines; 7 letters; 79
patents; 305 reviews; 41 retrospective studies; 154 studies which evaluated RCFM
through other cytotoxic tests; 502 studies which evaluated other dental materials;
356 studies which evaluated other materials; 650 studies which evaluated RCFM
with other objectives; and 79 studies which evaluated the cytotoxic effect of RCFM
only through tetrazolium salt-based tests (Figure 1). Finally, we retrieved 136
papers as potentially eligible and selected 38 for the inner methodological
assessment.
The papers evaluated through the ToxRTool® and classified as category 1
(higher), reliable without restrictions, were include in this review (n = 5). The
studies initially classified as Category 1, with posterior re-evaluation by the
software against the major importance red criteria as Category 3 (not reliable),
which the only methodological failure was the absence of reporting the use of
positive control during the experiments (n = 24), were re-classified as category 1
by the reviewers in a consensus meeting with the senior reviewer (GGA). One
paper classified as Category 2 and eight articles rated as Category 3 were
excluded after the methodological assessment. A total of 29 papers evaluated as
performed in accordance with the highest standards possible, were included in this
review.
The studies characteristics are compiled in Table 3. Different root canal
filling materials were evaluated in the selected studies: MTA (n = 26), resin-based
(n = 18), zinc-oxide and eugenol based (n = 14), Portland cement (n = 8), calcium
hydroxide based (n = 8), silicon-based (n = 4), glass ionomer cement (n = 5),
80
partially stabilized cement (n = 4), flowable resins (n = 3), antibiotic based (n = 2),
chrohexidine based (n = 1), iodoform based (n = 1) and bioceramic particulate
cement (n = 2). The compositions or brands of the root canal filling materials were
described in Table 4.
The cytotoxic effect results data and the number of comparisons were
tabulated (Table 5). Among the tetrazolium salt-based compounds, the MTT and
the XTT (2,3-bis(2-methoxi-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-
tetrazolium hydroxide) reducing assays were the most used for the cytotoxicity
screening of the root canal filling materials (n = 19) and (n = 6), respectively.
Followed by the WST-1 (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-
2H-tetrazolium, monosodium salt) (n = 2) and the MTS (5-(3-
carboximethoxyphenyl)-2-(4,5-dimethyltiazolyl)-3-(4-sulphonyl) tetrazolium, inner
salt) (n = 1) reducing assays. The total number of comparisons performed was
279 and 86.02% (n = 240) of them showed similar trends of cytotoxic effect.
Considering the origin of the cells used in the each evaluated comparison, animal
cells were used in 106 comparisons with 88.67% (n = 94) of them pointing to
similar trends of cytotoxicity, while human cells were used in 173, with similar
trends observed in 84.39% (n = 146) of the comparisons. Considering the different
cell viability parameters used in each comparison evaluated, the data results were
described in Table 6.
4. Discussion
The ideal root canal filling materials should present some properties and
characteristics relative to their functions and location: i) be easily inserted in the
root canal complex and easily removed if necessary ii) promote proper three-
dimensional sealing of the main and accessories root canals, iii) not shrink after
being inserted, iv) be bacteriostatic or not allow bacterial growth, v) be impervious
to moisture, vi) be radiopaque, vii) not stain the dental structure, viii) be
biocompatible and ix) be sterile (Orstavik, 2005). Furthermore, considering the
pastes for the primary teeth, other ideal characteristic should be added: i)
resorbing rate compatible to the physiologic ryzolisis process, ii) be rapidly
resorbed if extruded from the apices and iii) be antimicrobial (Holan and Fuks,
81
1993). Finally, a biocompatible root canal filling material should assist or stimulate
the tissues healing (Huang et al., 2002). Currently existing materials do not fulfill
all the ideal characteristics, but we can say that there is a great interest in the
development and evaluation of materials with higher biocompatibility.
Seen in these terms, the development of the root canal filling materials aims
to reach the ideal proposals and, ultimately, the healing of the involved tissues. In
opposition to the anti-cancer drugs, which are formulated and designed focusing
specific cell killing (Stepanenko and Dmitrenko 2015), with desirable negative
effects on the cell viability or cell proliferation of a target cell population through
different pathways (Freshney, 2005). For such reason, results of
under/overestimation of the cell viability, as reported for the anti-cancer drugs,
evaluated through the tetrazolium salt-based tests compared to other cell viability
parameters would not be expected for the root canal filling materials. Although,
these materials could present cytotoxic effects, which could potentially generate a
struggle or effort of the exposed cell population to overcome the cell imbalance
(Fulda et al., 2010; Stepanenko and Dmitrenko, 2015). This adaptive metabolism
effort could be detected by the biocompatibility metabolic assays, as a higher cell
metabolism and quantified as cellular viability, not really reflecting the material
cytotoxic effect.
Therefore, the cytotoxic screening of the root canal filling materials based
on a multi-parametric approach including metabolic and non-metabolic assays
present advantages over a single cell viability parameter strategy (De-Deus 2009;
Scelza 2012). However, our review results showed that, among the tetrazolium
salt-based tests, the MTT and XTT reducing assays showed similar trends of
cytotoxic effect in 87.95% and 92.59% of the comparisons with other cell viability
parameters. The MTS reducing assay showed 75% of similar trends of cytotoxic
effect between the assays. The WST-1 showed a lower frequency of similar
results (50%). Nonetheless, in one study the comparisons were performed
between the WST-1 and the observation of the overall cellular morphological
changes parameter, which showed the lower number of concordant results with
the tetrazolium salt-based tests (65.62%). It is worth of notice that the MTT
reducing assay showed a 100% of similar trends of cytotoxic effect compared to
82
the Alamar blue test, another metabolic marker (Camilleri et al., 2005).
Furthermore, the Neutral Red uptake dye assay results performed with murine
Balb 3T3 cells, validated for the estimative of starting doses of Acute Oral Toxicity
(OECD, 2010) showed similar trends of cytotoxicity in 100% of the comparisons (n
= 4) with the XTT reducing assay (Silva et al., 2014). Despite the high number of
concordant comparisons pointing to similar trends of in vitro biocompatibility
between the MTT and XTT reducing assays results and those obtained through
other cell viability parameters, we cannot recommend the use of such tetrazolium
salt-based tests as a single strategy for the evaluation of the root canal filling
materials. Since, the multi-parametric approach could possibly increase the
chances of detection of the cytotoxic effects. Although, we can say that these
assays do not present conflicting results considering the evaluation of the root
canal filling materials, compared to other cell viability parameters.
Considering the experimental conditions of the included papers, we
observed a diversity of methodologies. Nonetheless, the rate of comparisons that
showed similar trends of cytotoxicity was not affected while using animal or human
cells. We observed that most of the studies conducted with human cells used
primary cells, meanwhile those performed with animal cells, used continuous cell
lines. The use of primary human cells, as well as mammalian cell lines is admitted
by the current literature, provided these cells cultures present enough quality to
allow cell reproducibility over the time and maintained the phenotypic
characteristics (NIH, 2001, Freshney, 2005). Aiming to the extrapolation of the in
vitro biocompatibility results to the in vivo human studies and to add the data
obtained to the human toxicity databases, the use of human cells would be more
interesting (NIH, 2001).
According to Gstraunthaler (2003) the fetal bovine serum (FBS), is the most
widely used animal serum supplement in cell culture. Our findings corroborated
this statement, since the FBS applied in the concentration of 10% related to the
culture medium, was the most used animal serum supplement. However, different
concentrations of FBS, animal serum supplements and serum-free methodologies
were also reported. We did not observe differences relating the use of the
83
different animal serum supplements methodologies with the number of concordant
comparisons.
The present study included papers that evaluated different materials
representative of the main groups of the root canal filling materials indicated both
for the permanent (Hauman and Love, 2003) and some for the primary teeth
(Barcelos et al., 2011). Even though it was not the objective of this study, our
results of the cytotoxic effect reported in the selected articles, allowed an overview
of the cytotoxicityity of such materials. Moreover, the studies were evaluated
through the ToxRTool® in vitro studies assessment, which considered the
reporting of the information related to the five groups of criteria: i) test substance
identification, ii) test system characterization, iii) study design description, iv) study
results documentation and v) plausibility of the study design and results. We
observed as some methodological failures of the potentially eligible studies the
lack of reporting of: the number of cells used, the vehicle/material ratio, the
number of replicates, a complete methodology description and the use of a
positive control. Based on our experience acquired with this systematic review,
we suggest the use of this tool as one possible guide for the design and reporting
of the in vitro studies aiming to achieve the higher methodological and reliability
standards. Finally, our review results unpretentiously assessed the root canal
filling materials through an evidence-based toxicology view (Silbergeld and
Scherer, 2012). Therefore, considered the number of the included studies, the
assessment pointed to good in vitro cell-based biocompatibility for the Mineral
trioxide aggregate.
5. Conclusion
In the light of the findings of this systematic review, we can say that the
tetrazolium salt-based tests concerning the XTT and the MTT reduction assays do
not present conflicting results compared to other cell viability parameters assays
for the in vitro biocompatibility of the root canal filling materials.
84
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90
Figure 1. Study selection flow diagram (Moher et al., 2015)
91
Table 1. Outlines the populations, exposition, comparisons, and outcomes (PECO format).
PECO format
Population Animal and/or human cells
Exposition Exposed to root canal filling materials (RCFM) with cytotoxicity evaluation through different tests
Comparison Exposed to root canal filling materials (RCFM) with cytotoxicity evaluation through tetrazolium salt-based tests
Outcome Cytotoxic effects results
Table 2. Electronic database and search strategy
Database Search strategy
Pubmed cytotox*[Title/Abstract] OR biocompat*[Title/Abstract] AND endod*[Title/Abstract] OR root canal filling[Title/Abstract]
Scopus “cytotox*” OR “biocompat*” AND “endod* “OR “root canal filling”
Web of Science
cytotox* OR biocompat* AND endod* OR root canal filling
92
Table 3. Characteristics of the included studies
Reference Cell line or cell type RCFM chemical composition/brand
Vehicle used in experimental/control conditions Vehicle/material ratio Number of replicates per group Exposition time Percent serum/plasma in medium
Camilleri et al., 2005.
Human osteoblast cell line
(HOS TE 85)
GOPC, WOPC, GMTA ProRoot MTA,WMTA ProRoot MTA,
Proto A, Proto B
DMEM with antibiotics 10mm discs:10ml, 3 ml test sample/ replaced with fresh medium at each time interval (ISO
10993 (1992)) Technical: 8 for MTT and 3 for Alamar Blue (AB)
1,3,7,days/at 24h (MTT); 1,3,7, days (AB) 10% FCS
Chang et al., 2014
Primary Human dental pulp
PSC with 3 different 3 Ca sulfate ratio (9/1, 7/3, 5/5),
White MTA.
DMEM 0.2 g:1 mL (ISO 10993-5)
Technical: 6 24 and 72h 10% FBS
De-Deus et al., 2009.
Adhered mesenchymal cells from human bone
marrow
BioAggregate and White Pro-Root MTA.
Alpha-MEM Not applicable/root model
Technical: 3 for each experimental period 24, 48 and 72h
10% FCS
De-Deus et al., 2012.
Human osteoblasts iRoot and White Pro-Root MTA.
DMEM with antibiotics Not applicable/root model
Technical: 3 for each experimental period 24 and 48 h 10% FCS
Diomede et al., 2014
Human dental pulp stem cells, human periodontal ligament stem cells, human gingival fibroblasts, human osteoblastsh
EndoRez
DMEM with antibiotics 200 μL medium: rings (4 mm x 3mm)
Biological: 2 / Technical: 6 for each time point 24,48,72h and 1 week
5%FCS in DMEM used for HGF
93
Huang and Chang, 2007
Humna gingival fibroblasts
N2 and Topseal
DMEM with antibiotics Cylinder 35 mm x 2 mm:40 mL medium in 5% CO2 and 95% air at 37°C for 72 h. Final
dilution: 1:2, 1:4, and 1:8) Biological: 3 / Technical: 3 for each concentration
24h for MTT, 0,1,2,4 and 8hs for HO-1 analysis 10%FCS
Trichaiyapon et al., 2012
Human periodontal ligament cells
Tetric Flow, Filtek Flow, Aeliteflo,White ProRoot MTA
DMEM with antibiotics Discs (6-mm x 1.5-mm):200μl of medium
Biological: 3 /Technical: 3 for MTT (direct and indirect), Technical 2 for SEM1 to 4 days 10% heat-inactivated FCS
Karimjee et al., 2006
Human periodontal ligament cells
Contour, Fuji II LC, MTA mixed with sterile distilled water, MTA
mixed with KY jelly
Alpha-MEM with antibiotics Cylinder (4 mm x 6 mm):1 mL medium
Technical: 3 for each time point 24, 48 and 72h
0.2%FBS
Kim Ryan et al., 2014
MG-63 cells and Human gingival
fibroblasts EndoSeal, AH Plus ,Sealapex
DMEM sealer (0.1 cc):200 μL medium. 100 μL of eluate/replenished with fresh 100 μL DMEM every two days, to obtain the eluates containing any toxic substances released from the sealers at
1, 3, 7 days. 100 μL of the eluate:to the cells Technical: 3 for each time point
1,3 and 7 days Not reported
Lee et al., 2012 MG-63 GIC (Fuji II); IRM, Ortho MTA,
ProRoot MTA Dentsply
6 discs (5 mm x 3 mm): 0.5 mL serum-free DMEM with 1% antibiotics. After 1/4/7 days, the extracts were collected and diluted with DMEM with 10% FBS and 1% antibiotics such that
the extracts would contain 2% FBS. All extracts were sterilized by filtration. Biological: 2 / Techinical: 3
1, 4 and 7 days (XTT), 24,48 and 72 hs (SEM) 2%FBS
Pires et al., 2015
Peripheral blood mononuclear cells
(CHX); (MAX); (NEB); Guedes-Pinto; Calen thickened with zinc
oxide, calcium hydroxide thickened with zinc oxide
(CH/ZO), UltraCal XS paste
RPMI 1640 with 10% FBS and antibiotics. Each extract (1 : 1) (1000 lL) was mixed with a suspension of the previously plated cells
(1000 lL). The final concentration was 1:2. Technical: 3 24 and 48h 10%FBS
Scelza et al., 2012
Human osteoblasts
Sealapex, Real Seal SE, Pulp Canal Sealer EWT, MTA
Fillapex
serum free Alpha-MEM 0.1 g: 1 mL
Biological:3 / Technical: 3 24h
Serum free medium
94
Testarelli et al., 2012.
Peripheral blood monocytes
Thermafil, Auroseal, Superseal, Realseal1™
DMEM with antibiotics Surface:volume medium (0.5 cm2/mL) Technical: 6 for MTT and 3 for ROS
2h 10%FCS
Xu P et al, 2010.
Human osteoblast-like MG63
RealSeal sealer and core material, AH Plus, gutta-percha
Eagle basal medium 1.25 cm2/mL Technical: 3 1 and 3 days
10%FBS
Lin et al., 2004. Human periodontal ligament fibroblasts
MTA, Fuji II SC GIC, Amalgam Valiant Ph.D., IRM, Super EBA
DMEM with antibiotics 3mm in a transwell insert : 1ml DMEM
Technical: 6 for Trypan blue 1, 3, 5 days
10%FCS
Eldeniz et al., 2007
Human gingival fibroblasts and L929
AH Plus, EndoREZ, Epiphany, RC Sealer, Acroseal, Apexit,
GuttaFlow, RoekoSeal
DMEM with antibiotics for HGF/ MEM for L929 with antibiotics 1.25 cm2/mL between the surface
of the samples and the volume of medium Biological: 2/ Technical: 6 24h for MTT; 4h for SEM
5%FCS
Osorio et al., 1998
L929 mouse fibroblasts and human gingival
fibroblasts
Endomet, CRCS, AH26, Amalgam, Gallium, GF2, Ketac
Silver, MTA, and Super-EBA
MEM for L929 and DMEM for HGF Extraction medium was added to each sample at 1:5(wt/vol) ratio (i.e. 1g of test material/5ml
of medium) Technical: 5
72h 10%FBS
Eid et al., 2014
Rat odontoblsast-like cells derived from the apical papilla (MDPC-
23)
MTA Plus (WMTAP, GMTAP), ProRoot MTA (WMTA, GMTA),
IRM
DMEM direct test, disks (5-mm diameter and
3-mm thick) in Transwell inserts with additional 2ml DMEM. Indirect test (1 disk/2 mL) for 4 days to collect the eluents.
Technical: 3 3 days for direct contact , 4 days for indirect contact, in 1,2 and 3 cycles (weeks), , for flow
cytometry (2 cycles, weeks) 10%FBS
Gomes Cornélio et al., 2011
Immortalized murine periodontal ligament
cells and rat osteosarcoma (ROS)
White PC, PCBi, PCZir, PCCa, ZOE
RPMI 1640 medium (500 mg of prepared cement/mL of RPMI). Other dilutions of those cement elutes were
prepared: (stock solution, 1/ 5, 1/50, 1/500, 1/5000). At morphologic and apoptosis/necrosis experiments, 3 elute concentrations were selected: 1, 10, and 100 mg/mL.
Technical: 3 24h
10% FBS
95
Wei Wei et al., 2012
Murine dental papila-derived odontoblast-like cells (MDPC-23)
Quick-Set,ProRoot MTA (WMTA)
DMEM direct test, disks (5-mm x 3-mm) in Transwell inserts with additional 2ml DMEM. Indirect test (1 disk/2 mL) for 4 days to collect the eluents. Each eluent concentrate collected after the 2-week aging period was diluted with fresh growth medium to 1:1, 1:10, and 1:102 of its original
concentration to achieve a final volume of 2 mL Technical: 12 for MTT and flow cytometry.
3 days for direct contact , 4 days for indirect contact, in 1,2 and 3 cycles (weeks), for flow cytometry (2 cycles, weeks)
10% FBS
Dartar Oztan et al., 2003.
L929 AHPlus and Roeko Seal
DMEM area 1cm diameter to 6ml DMEMBiological: 10 for each material and time period
0, 24, 48, 72h 10%FBS
Souza et al. 2006
Cell line derived from Chinese hamster lung
fibroblasts (V79)
N-Rickert (F&A), N-Rickert, SuperEBATM, MTA ProRootTM ,MTA Angelus, Amalgam GS-
80TM and gutta-percha
DMEM with antibiotics 1g/5ml of medium
Biological: 3 / Technical: 3 1 and 3 days Not reported
Lee DH et al., 2007
Rat clonal dental pulp cells RPC-C2A
AH26
DMEM/ DMSO for AHPlus AHPlus (1,2,3,4,5mg/ml). The initial vehicle/material ratio was reported only for AHplus
(5mg/ml) Technical: 3
24h 10%FBS
Lessa et al., 2010
Immortalized MDPC-23
White-MTA, MTA-Bio
DMEM (2 mm x 2 thick): 1 mL of DMEM (without FBS)
Technical: 3 replicates 24h and 7 days
10% FBS
Silva et al., 2014
Fibroblasts cells 3T3 EndoBinder,
WMTA
DMEM 1.25 cm2/mL ratio between the sample surfaces and the medium volume.
Technical: 3 24 and 48h 10% FBS
Pelliccioni et al., 2004
MG-63
ProRoot MTA cement, Super EBA, Valiant PhD Amalgam
DMEM with antibiotics 1g/5ml medium
Biological: 3 / Technical: 3 24h
10%FBS
96
Valois e Azevedo, 2008
Fibroblasts cells 3T3 AH Plus, Endofill Sealer 26
DMEM with antibiotics 300 mg in a round plastic mold (10 mm diameter): 3 mL of serum-free culture medium.
Eluates were sterilized by filtering with a 0.2- mm-pore filter and then were diluted in culture medium.
Biological: 2/ Technical: 3 24h
10%FCS
Yu MK et al., 2010
Mouse osteoblast-like cell line MC3T3-E1
AH26
Alpha-MEM with antibiotics Rings (6-mm x15-mm) :30 mL medium
Eluates were collected with a sterile filter (0.22 m m). Dilutions (10%-50%) of extraction media were tested. The extraction sample of 30% of 1-day elution was tested to confirm the
apoptosis pathway and signal regulation. Biological: 3
1 day 10% heat-inactivated FBS
Wang et al., 2007
Rat primary osteoblasts
PSC, PSC with 5% of CoO, PSC with 5% of Cr2O3, and PSC with
5% of ZnO. MTA as control.
DMEM with antibiotics 0.1g/1ml of serum free medium
Technical: 6 1, 3 and 7 days
10%FBS
Human cells
97
Table 4. Root canal filling materials brands / compositions
Reference RCFM chemical composition/brand
Camilleri et al., 2005.
Grey Portland Cement - GOPC (Italcementi SPA, Bergamo, Italy); White Portland cement -WOPC (Lafarge Asland, Valencia, Spain), Grey MTA (ProRoot MTA),White MTA (ProRoot MTA), White Portland cement clinker inter-ground without gypsum -Proto A (Aalborg White, Aalborg, Denmark), White Portland cement clinker inter-ground without gypsum and mixed with 4:1 bismuth oxide - Proto B (Aalborg White, Aalborg, Denmark) (Sigma –Aldrich, Dorset, UK)
Chang et al., 2014 PSC (partially stabilized cement) with 3 different 3Ca sulfate: 3 Ca aluminate (9/1, 7/3, 5/5), and White MTA (Dentsply, Tulsa Dental Products Tulsa, OK, USA).
De-Deus et al., 2009 BioAggregate (Innovative, BioCeramix Inc, Vancouver, BC, Canada) and White Pro-Root MTA (Dentsply, Tulsa Dental Products Tulsa, OK, USA)
De-Deus et al., 2012 iRoot BP Plus (Innovative, BioCeramix Inc, Vancouver, BC, Canada) and White Pro-Root MTA (Dentsply, Tulsa Dental Products Tulsa, OK, USA)
Diomede et al., 2014 EndoRez (Ultradent Corp, South Jordan, USA)
Huang and Chang, 2007
N2 (Indrag-Agsa, Losone, Switzerland) and Topseal (Dentsply/Maillefer, Ballaigures, Switzerland)
Trichaiyapon et al., 2012
Tetric Flow (Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein), Filtek Flow flowable resin composite, (3M ESPE, St Paul, MN, USA), and Aeliteflo (Bisco, Schaumburg, IL, USA). And white ProRoot MTA
Karimjee et al., 2006 Contour (Kerr Manufacturing Co, Romulus, MI); 2) Fuji II LC (GC America, Alsip, IL); 3) MTA mixed with sterile distilled water; and 4) MTA mixed with KY jelly (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ).
Kim Ryan et al., 2014 EndoSeal (MTA ,Maruchi, Seoul, Korea), AH Plus Epoxy resin, (Dentsply DeTrey Konstanz, Germany), Sealapex (Calcium hydroxide, SybronEndo, Romulus, MI, USA)
Lee et al., 2012 GIC (Fuji II) (GC Corp, Tokyo, Japan); IRM (Dentsply Tulsa Dental, Tulsa, OK); Ortho MTA (BioMTA, Seoul,
98
Republic of Korea); ProRoot MTA (Dentsply Tulsa Dental, Tulsa, OK)
Pires et al., 2015
Chlorhexidine (Nova Derme, Santa Maria, Brazil) (CHX); Maxitrol (Alcon, São Paulo, Brazil) (MAX); neomycin sulphate + bacitracin (EMS, Hortolândia, Brazil) (NEB) Guedes-Pinto; Calen (S.S. White, Rio de Janeiro, Brazil) thickened with zinc oxide (Calen/ZO) (1g:0.65g); calcium hydroxide thickened with zinc oxide (CH/ZO) in a 3 : 1 ratio; UltraCal XS paste (Ultradent, Indaiatuba, Brazil)
Scelza et al., 2012 Sealapex (Kerr, Romulus, MI, USA), Real Seal SE (SybronEndo, Orange, CA, USA), Pulp Canal Sealer EWT (Sybron Endo, Orange, CA, USA); MTA Fillapex (Angelus, Curitiba, Brazil)
Testarelli et al., 2012. Thermafil (Tulsa Dental, Tulsa, OK, USA) AUROSEAL (Giovanni OGNA S.p.A., Milan, Italy), SUPERSEAL (Giovanni OGNA S.p.A., Milan, Italy), REALSEAL 1™ (SybronEndo, Orange, CA, USA)
Xu P et al, 2010. RealSeal sealer and core material (SybronEndo, Orange, CA), AH Plus (Dentsply,DeTrey, Konstanz, Germany), and gutta-percha (Dentsply DeTrey)
Lin et al., 2004. MTA (Dentsply, Maillefer, Switzerland), Fuji II SC GIC (GC Corp., Tokyo, Japan), Amalgam, Valiant Ph.D. (Dentsply Caulk, Milford, DE), IRM (Dentsply Caulk, Milford, DE), Super EBA (Bosworth, Skokie, IL).
Eldeniz et al., 2007 AH Plus (De Trey/Dentsply, Konstanz, Germany); EndoREZ (Ultradent/USA); Epiphany (Pentron, Wallingford, CT, USA); RC Sealer (Sun Medical/Japan); Acroseal (Septodont, France); Apexit (Vivadent, Schaan, Liechtenstein); GuttaFlow (Colthane/Whaleden, Langenau/Germany); RoekoSeal (Colthane/Whaledent, Langenau/Germany)
Osorio et al., 1998
Endomet (Septodont, France), CRCS (Hygenic Corp, Ohio, USA), AH26 (De trey Dentsply, Weybridge, UK), Amalgam (Vallium PhD, Vivadent, Amherst, USA), Gallium (Tohuriki , Honten Co, Japan), GF2 (Tohuriki , Honten Co, Japan), Ketac Silver (Espe-Premier, St Paul, USA), MTA (Loma Linda, University of California, USA), and Super-EBA (Harry J. Bosworth Co. Gibbstown, USA)
Eid et al., 2014 MTA Plus (White MTAP, Grey MTAP) (Avalon Biomed Inc, Bradenton, USA), ProRoot MTA (White MTA, Grey MTA) (Dentsply, Tulsa Dental Products Tulsa, OK, USA) , IRM (Dentsply CaulK, Milforf, USA)
Gomes Cornélio et al., 2011
White Portland cement (PC) (Votorantin, São Paulo, Brazil) alone or associated with bismuth oxide (PCBi), zirconium oxide (PCZir), and calcium tungstate (PCCa), added in 20% in weigth. Radiopacifying agents (Sigma Aldrich, St Louis, MO) ZOE
99
Wei Wei et al., 2012 (Quick-Set; Primus Consulting, Bradenton, FL), ProRoot MTA (WMTA)
Dartar Oztan et al., 2003.
AHPlus (Dentsply, De Trey, UK) and Roeko Seal (Roeko, Langenau, Germany)
Souza et al. 2006 N-Rickert (F&ATM, São Paulo, SP, Brazil), N-Rickert (InodonTM, São Paulo,SP, Brazil), SuperEBATM (Bosworth Company, Skokie, IL, USA), MTA ProRootTM ,MTA Angelus (AngelusTM, Londrina, PR, Brazil), Amalgam GS-80TM (SDI, Bayswater, Victoria, Australia) and gutta-percha (TanariTM, Manacapuru, AM, Brazil)
Lee DH et al., 2007 AH26 (Detrey Dentsply, Switzerland)
Lessa et al., 2010 White-MTA, MTA-Bio (AngelusTM, Londrina, PR, Brazil)
Silva et al., 2014 EndoBinder (Binderware, São Carlos, SP, Brazil), WMTA (Angelus (Londrina, PR, Brazil)
Pelliccioni et al., 2004 ProRoot MTA cement (Dentsply Tulsa Dental, Tulsa , OK); Super EBA (Harry J. Bosworth Co, Skokie, Ill); Valiant PhD Amalgam (Dentsply Caulk, Dentsply International Inc, Milford, DE)
Valois e Azevedo, 2008
AH Plus (DeTrey Dentsply, Konstanz, Germany), Endofill (Dentsply, Brazil), Sealer 26 (Dentsply, Brazil)
Yu MK et al., 2010 AH26 (Dentsply [Lot:0906000950] Detrey [Lot:0907001187] GmbH, Konstanz, Germany
Wang et al., 2007 Partial-stabilized cement (PSC) was prepared at the temperature of 1400C as described in the 2003 study. PSC with 5% of CoO addition, PSC with 5% of Cr2O3 addition, and PSC with 5% of ZnO addition, respectively. MTA as control.
100
Table 5. Results of the cytotoxic effect evaluation and comparisons
Reference Tetrazolium salt-based test used/result trend
Other cytotoxic test used/result trend
Number of comparisons/ concordant comparisons
Camilleri et al., 2005. MTT/ (24h) 1 and 3 days all materials (--), 7 daysGOPC, WOPC, Proto A (--), Proto B (-), WMTA (-), GMTA (--)
Alamar Blue (AB)/ 1 day GOPC and GMTA (--), WOPC, Proto A , Proto B and WMTA (-), at 3 and 7 days all materials (-).
18 comparisons other metabolic maker 18 concordant
Chang et al., 2014 WST-1/All materials (--) at days 1 and 3.
Lactate dehydrogenase (LDH)/All materials (-) at day 3. PSC-91, PSC-73, MTA (-) and PSC-55(+) at day 1.
8 comparisons Released intracellular component marker 7 concordant
De-Deus et al., 2009.
XTT/(MTA not cytotoxic at 24h (--); slightly cytotoxic at 48 and 72h (-))/ (Bioaggregate slightly cytotoxic at 24,48 and 72h(-))
Neutral Red (NR), Crystal violet dye elution (CVDE)/ (NR) (MTA at 24,48 and 72h (-); Bioaggregate at 24 and 48h (-) and at 72h (+))//(CVDE) (MTA at 24, 48h and 72h (-); Bioaggregate at 24,48 and 72h(-))*
6 comparisons Membrane marker (NR) + 6 comparisons ( DNA marker, CVDE) 11 concordant
De-Deus et al., 2012. XTT/(MTA at 24 and 48h (--))/ iRoot at 24h (--) and at 48h (-)
Neutral Red (NR), Crystal violet dye elution (CVDE)/ (NR) and (CVDE) (MTA at 24h and 48h (--)/ iRoot at 24h and at 48h (--)
4 comparisons Membrane marker (NR) + 4 comparisons DNA marker, (CVDE) 8 concordant
Diomede et al., 2014
MTT/(hDPSCs, hPDLSCs and HGF: At 24h (+), at 48, 72hand 1 week (-))//(hOSTs: At 24 and 48h (+), at 72h and 1 week (-))
Trypan blue staining//(hDPSCs, hPDLSCs and HGF: At 24h (+), at 48, 72hand 1 week (-))//(hOSTs: At 24 and 48h (+), at 72h and 1 week (-))
16 comparisons Membrane marker (TB) 16 concordant
Huang and Chang, 2007 MTT/ (N2, dilutions 1:8 (-), 1:4 (+), at 1:2 dilution (++)) (Topseal dilutions 1:8 and 1:4 (-) and 1:2 (+)
Heme oxygenase-1 (HO-1) analysis/ Topseal 1:4 showed a HO-1 expression 148% higher than the control; N2 1:8, was 58% higher.
2 comparisons Released intracellular Component marker (HO-1) 0 concordant
101
Trichaiyapon et al., 2012 MTT/(At 1, 2, 3 and 4 days all materials were (--), except Filtex Flow, at 1 day (+))
SEM/ Overall morphological changes were rated as “mild”by authors according ISO.
4 comparisons (SEM) marker cellular morphological changes) 3 concordant
Karimjee et al., 2006 (70)
MTS/ At 24 and 48h, Amalgam, MTA/water, MTA/KY were (+), GIC (++); and at 72h all materials were (++))
Lactate dehydrogenase (LDH) At 24h Amalgam, MTA/KY, GIC (-) and MTA/water (+) at 48h all materials (+), 72h Amalgam, MTA/KY, GIC (+) MTA/water (++))
12 comparisons Released intracelular component marker (LDH) 9 concordant
Kim Ryan et al., 2014
WST-1/ MG-63, EndoSeal at days 1 and 3 (++), at day 7 (-); AHPlus at day 1 (++), day 3 (+) and day 7 (-)// HGF, EndoSeal at day 1 (++), day 3 (+), at day 7 (-); AHPlus at days 1,3 and 7 (++)
SEM/at MG-63 and HGF, the overall morphological changes “slight” (overnight), and “none” (7 days) on both AHPlus and EndoSeal.
4 comparisons (1 and 7 days) marker (SEM) cellular morphological changes 3 concordant
Lee et al., 2012
XTT/at 1,4 days GIC (-), Ortho MTA at day 1 (--), at day 4 (+), ProRoot MTA at day 1 (--), day 4 (-), IRM at days 1 and 4 (++)
SEM/ at 24, 48 and 72 h, reactivity considered as “None” for GIC (Fuji II) Ortho MTA and ProRoot MTA. At the same time points the reactivity was moderate for IRM.
12 comparison cellular morphological changes marker (SEM) 11 concordant
Pires et al., 2015 XTT/ At 72h all materials (--), at 24h CHX, GP< Calen/ZO, CH/ZO,Ultracal (--), MAX and NEB (-)
Oxidative stress (ROS)/ (DCFH-DA) ROS expression compared to control. At 72h and 24 h respectively: CHX 94%, 33% higher; MAX 68%, 13% higher; NEB 56% higher, 7% lower; GP 37%, 18% higher; Calen/ZO 13%, 29% higher; CH/ZO 16% lower, 39% higher; Ultracal 4% lower, 20% higher. // (TBARS) ROS expression compared to control. At 72h and 24 h respectively: CHX 11%, 5% lower; MAX 9% higher, 20% lower; NEB 12% and 16% lower; GP no difference, 5% lower; Calen/ZO 19%,
14 comparisons ROS expression. ( DCFH-DA) 11 concordant + 14 comparisons TBARS 13 concordant
102
50% higher; CH/ZO 50% and 36% higher; Ultracal 39% and 58% higher.
Scelza et al., 2012 XTT/ at day 1 all materials (++), at day 7 MTA, Real Seal, Sealapex (++) and PCSealer (--)
NR/CVDE/ at day 1 all materials (++), at day 7 MTA, Real Seal, Sealapex (++) and PCSealer (--)*
4 comparisons Membrane marker + 4 comparisons CVDE 8 concordant
Testarelli et al., 2012. MTT/4 all materials (-)
Oxidative stress (ROS)/ SS showed ROS expression 64% lower than control; AUS showed ROS expression 76% lower than control; RS showed ROS expression 8% lower; RS1 increased ROS expression 92% to the control.
4 comparisons ROS expression 3 concordant
Xu P et al, 2010. MTT/ At 3 days, Real Seal 100% (++), AHPlus 100% - 12,5% (-), Real Seal Core (--)
FC/At 3 days, (100%) Real Seal (++), AHPlus (+), Real Seal Core (-)
3 comparisons apoptosis/Necrosis 2 concordant
Lin et al., 2004.
MTT(1day, all materials were (--); 3 days, MTA and GIC (--), Amalgam was (+) and IRM and SEBA were (++); 5 days, MTA was (--), GIC (+), IRM and SEBA (--))
Trypan blue exclusion dye/ (1 day, MTA, GIC and SEBA were (--), Amalgam was (-), IRM (++); 3 days MTA (--), Amalgam and GIC were (-) , SEBA (+), IRM (++))
10 comparisons membrane marker 8 concordant
Eldeniz et al., 2007
MTT/ (HGF) AHPlus (--); RCSealer, GuttaFlow and RoekoSeal were (-); EndoREZ, Epiphaby, Acroseal and Apexit were (++))//(L929)(AH Plus, GuttaFlow and RoekoSeal were (-); RC Sealer (+); EndoRez, Ephiphany, Acroseal, Apexit were (++))
Trypan blue exclusion dye/ SEM (HGF)/ AHPlus, Gutta Flow and RoekoSeal cells showed typical appearance; RC Sealer cells showed atypical morphology;Epiphany, EndoRez, Apexit and Acroseal cells exhibited changes in shape and lost their structure, most could not exclude Trypan blue)
8 comparisons membrane marker /SEM 8 concordant
103
Osorio et al., 1998
MTT/(hGF//AH26, CRGS and Endomet were (++), Ketac,SEBA and Amalgam (++); GF2 (-); and MTA was not cytotoxic (--))// (L929//, AHPlus, CRCS, Endomet, Ketac Silver, SuperEBA (++), Gallium (+), Amalgam (-), MTA (--)
Crystal Violet/(hGF// AH26, CRGS and Endomet were (+), MTA s (-), GF2 (--), Ketac (--), SEBA (+), Amalgam (++)// (L929)/ Endomet, Ketac Silver (++), AHPlus SuperEBA (+), CRCS, Gallium (-), MTA (-), Amalgam (--)
16 comparisons 8 (HGF) 7 concordant + 8 (L929) 6 concordant
Eid et al., 2014 XTT/2 cycle (WMTA,GMTA ,WMTAP,GMTAP (-)// IRM (+) *
Flow cytometry/2cycle (WMTA,GMTA, WMTAP,GMTAP (-)// IRM(++)
5 comparisons Apoptosis/necrosis marker 5 concordant
Gomes Cornélio et al., 2011
MTT/(mPDL/at the dilutions 0.1mg/ml, 1mg/ml all materials (--); at 10mg/ml all materials (--) except ZOE (-); at 100mg/ml all materials (++), except PC (--); at 500mg/ml all materials (++)). (ROS similar to the mPDL results, except that at 10mg/ml ZOE (-)
Apoptosis/necrosis/ mPDL/ PC 1mg/ml (--), 10mg/ml, 100mg/ml (-); PCBi 1mg/ml (--), 10mg/ml (-), 100mg/ml (+); PCZir 1mg/ml (--), 10mg/ml, 100mg/ml (-); PCCa at 1mg/ml (--), 10mg/ml, 100mg/ml (-); ZOE 1mg/ml (-), 10mg/ml, 100mg/ml (++);/ ROS 17/2.8/ PC1mg/ml (--), 10mg/ml (-), 100mg/ml (+); PCBi 1mg/ml (--), 10mg/ml (-), 100mg/ml (+); PCZir 1mg/ml (--), 10mg/ml (--), 100mg/ml (+); PCCa at 1mg/ml,10mg/ml(--),100mg/ml (-); ZOE 1mg/ml (--), 10mg/ml(-), 100mg/ml (+)
15 comparisons Apoptosis/necrosis marker 12 concordants + 15 ROS 14 concordants 26 concordant
Wei Wei et al., 2012 MTT/Quick-Set at 1st and 2nd weeks (--); Pro Root MTA at 1 week (-) and at 2 weeks (--).
Flow cytometry (FC) Quick-Set 1st week (-) and at 2nd week (--); ProRoot MTA at 1st week (-) and at 2nd week (--).
4 comparisons Apoptosis/necrosis marker 4 concordant
Dartar Oztan et al., 2003. MTT/(AHPlus 24h (--), and at 48 and 72h (-))/ RSA at 24,48 and 72h(--).
Cell counting assay (Trypan blue)/(AHPlus 24h (--) and at 48 and 72h (-)/ (RSA 24h (--) and at 48 and 72h (-))
6 comparisons Membrane marker 6 concordant
104
Souza et al. 2006 MTT(SEBA,MTA ProRoot, MTA Angelus, Amalgam and N-Rickert (Inodon) were (-); N-Rickert (F&A) (+)
NR//NAC/(NR) (MTA Pro Root, MTA Angelus and Amalgam were (--); SEBA and N-Rickert Inodon) were (-); N-Rickert(F&A)(+))//(NAC)( SEBA,MTA ProRoot, MTA Angelus, Amalgam and N-Rickert (Inodon) were (-), N-Rickert (F&A)(+))
12 comparisons 6 comparisons Membrane marker+ 6 comparisons NAC (nucleic acid content) 12 concordant
Lee DH et al., 2007 MTT/AHPlus (++) Apoptosis (Flow cytometry)/ Induction of apoptosis detected.
1 comparisons Apoptosis necrosis1 concordant
Lessa et al., 2010 MTT/ at 24h and 7days White MTA (-), MTA Bio at 24h (--), 7 days (-)
SEM/ The control cells reactivity was “None”, and for the MTA extracts exposed cells “Slight”
4 comparisons cellular morphological changes marker (SEM) 4 concordant
Silva et al., 2014 XTT/ (24h, MTA (-) and EndoBinder (--); 48h, MTA and EndoBinder (--))
NR/CVDE//(NR) (24h MTA and EndoBinder (-); 48h MTA and EndoBinder (--))// (CVDE)/(at 24 and 48h, MTA and EndoBinder (--))
4 comparisons Membrane Marker + 4 comparisons CVDE 8 concordant
Pelliccioni et al., 2004 MTT/ (MG-63) MTA (--); SEBA (++); Amalgam (--).
NR/ (MG-63) MTA (-); SEBA (-); Amalgam (+).
3 comparisons Membrane marker 1 concordant
Valois et al., 2008 MTT/ All materials at eluates 5% (--), 10% (-), 20% (+)
Flow cytometry// All materials compared to control: at eluates 5% (no differences were found in the proportion of cells in different cell-cycle phases and for sub-G1 population. At 10% decrease in G1 population and increase in S/G2/M phases. At 20% decrease in G1 and S/G2/M phases and increase in sub-G1.
9 comparisons Apoptosis/Necrosis 9 concordant
Yu MK et al., 2010 MTT/ At 24h AH Plus (+) Induction of apoptosis was detected by
1 comparison Apotosis/necrosis detection
105
NR = Neutral red, CVDE = Crystal violet dye elution/ Not concordant comparisons
Hoechst33258 staining and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) activation.
1 concordant
Wang et al., 2007
MTT/ MTA at days 1 and 3 (--), day 7 (-); PSC at days 1 and 7 (--), day 3 (-); PSC-Co at days 1 and 3 (--), day 7 (-); PSC-Cr at days 1, 3 and 7 (--); PSC-Zn at days 1, 3 and 7 (--)
LDH/ MTA at days 1, 3 and 7 (--), PSC at day 1 (--), day 3 and 7 (-); PSC-Co at days 1 and 7 (-) and at day 3 (+); PSC-Cr at days 1, 3 (+) and 7 (-) PSC-Zn at days 1 and 7 (-) and at day 3 (+).
15 comparisons Released Intracellular component marker. 11 concordant
106
Table 6. Comparisons results considering the different assays parameters
Variables Comparisons
(n)
Comparisons with similar trends of cytotoxic effect
(n / percentage)
Different assays
parameters
Apoptosis/necrosis detection
38 34 / 89.47%
Membrane markers 67 62 / 92.53%
DNA markers 34 31 /91.17%
NAC marker 6 6 / 100%
Released intracellular component marker
84 68 / 80.95%
Cellular morphological changes marker
32 21 / 65.62%
Other metabolic marker 18 18 / 100%
Tetrazolium salt-based
tests
MTT 166 146 / 87.95%
XTT 81 75 / 92.59
WST-1 20 10 / 50%
MTS 12 9 / 75%
107
5.3 Artigo 3: Multiparametric evaluation of the cytotoxicity of selected root
canal filling materials for primary teeth through a root canal simulating model
Authors:
Andréa Vaz Braga Pintora
Luciana Domênicob
Gutemberg Alves c
Adriana Brandão Ribeiro Linharesd
Roberta Barcelose
Laura Salignac Guimarães Primof
ª PhD student, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
b Underdraduate student, Biomedicine, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
c Adjunct Professor, Department of Molecular and Cellular Biology , Biology Institute, Fluminense Federal University, Niterói, Brazil.
d MsC, PhD,,Clinical Research Unit, Antonio Pedro Hospital, Fluminense Federal University, Niterói, Brazil.
e Adjunct Professor, Department of Pediatric Dentistry, Institute of Health, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
fAdjunct Professor, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
Corresponding author: Dr. Laura S. Guimarães Primo
Disciplina de Odontopediatria da FO-UFRJ
Caixa postal: 68066
21941—971 Cidade Universitária CCS RJ Brazil
Phone: + (55) 21 2562-2098 Fax: + (55) 21 2590-2771
email:[email protected]
108
Summary
Background: Although most of the root canal filling materials for primary
teeth such as zinc oxide and eugenol (ZOE), calcium hydroxide and iodoform
based pastes present cytotoxic effects in in vitro studies, they show high success
clinical frequencies. Aim: To evaluate the cytotoxicity of eight pastes through a
model simulating in vitro the clinical conditions of root canal filling of such teeth, by
controlling the apical exposure and the amount of pastes used. Pippete tips (5-
10μL) (n = 3) with a final diameter compatible to the apical diameter of a #45 K file,
were filled with 0,037g of each paste. Extracts of the pastes were prepared by
exposing the pippete tips to culture medium for 24hs. Primary human osteoblast-
like cells were exposed to extracts and controls for 24 h, at 37 °C with 5% CO2.
Cell viability was analyzed sequentially through a multi-parametric approach (XTT,
NR, CVDE). The pastes biocompatibility was also assessed using 0.2g to 1ml ratio
(ISO 10993-5, 2009), through the XTT assay (n = 5). Results: Through the model,
Calcicur, Endoflas, Guedes-Pinto and ZOE were considered slightly cytotoxic and
Vitapex as moderately cytotoxic by all three assays. Calen thickened with zinc
oxide was considered non-cytotoxic through the XTT and slightly cytotoxic by the
NR and CVDE tests. A new calcium hydroxide with zinc oxide paste (UFRJ) was
evaluated as slightly cytotoxic through the XTT and moderately cytotoxic by the
NR and CVDE assays. The Guedes paste was considered as strongly cytotoxic by
all the assays. Through the XTT reducing assay, using the 0.2g to 1ml ratio,
Calcicur was considered moderately cytotoxic while the other pastes were
evaluated as strongly cytotoxic. Conclusions: It can be concluded that within the
proposed model, the pastes presented lower cytotoxic effects, compared to those
obtained through the ISO approach. The exception was the Guedes paste
considered as strongly cytotoxic by all the evaluations.
Keywords: root canal filling materials; tooth, deciduous; osteoblasts,
cytotoxicity, biocompatibility
109
1. Introduction
Pulpectomy is the recommended endodontic treatment for primary teeth
diagnosed with an irreversibly inflamed or necrotic pulpal condition. The final
endodontic procedure is the root canal filling of the treated teeth with a resorbable
paste (1-3). The ideal root canal filling material should present some
characteristics and properties that would be compatible to these teeth short life
span due to the physiological root resorption, and the close proximity to the
successor permanent teeth. Thus the ideal paste should: (i) resorb at a similar rate
to that of the root resorbing process, (ii) be biocompatible to the periodontal
tissues and permanent developing teeth, (iii) be resorbable when extruded beyond
the apex, (iv) adapt to the canal walls, (v) be antiseptic, (vi) be radiopaque (vii) and
not cause teeth discoloration (4). Until present, no existing root canal filling
material for the primary teeth fulfills all the ideal requirements (5).
The most used root canal filling paste for primary teeth is zinc-oxide and
eugenol based paste (ZOE) (3,4), although recently a trend in the use of the
iodoform with calcium hydroxide pastes was observed (6). In the literature, the
pulpectomies performed with the ZOE based paste present high frequencies of
success (5,7-11), although this material has been associated to ectopic eruption of
the permanent successor teeth (12) and cytotoxicity (13-15). Therefore, aiming to
overcome such drawbacks, alternative materials have been proposed for the root
canal filling of the primary teeth. At the present, the materials recommended by the
international pulp therapy guidelines are the calcium hydroxide (2), the iodoform-
based (1), the iodoform with calcium hydroxide pastes and the zinc oxide and
eugenol based pastes (1,2).
The calcium hydroxide based pastes present antimicrobial properties due to
its ionic dissociation into Ca2+ and OH- ions, and alkaline pH (16,17). Aiming the
root canal filling of primary teeth, the compound has been associated to different
vehicles, water (Calcicur®, VOCO, Cuxhaven, Germany) (7) and viscous (Calen®,
S.S.White, Rio de Janeiro, Brazil) (18). The use of a polymeric paste was also
reported (Sealapex, Kerr, Romulus, USA) (7,20). Moreover, the addition of zinc
110
oxide to the Calen® paste was advocated aiming to reduce the velocity of paste
phagocytosis (19). The clinical and radiographic success rates reported for
pulpectomies performed with Calcicur® and Sealapex® were lower compared to the
results obtained with zinc oxide and eugenol based paste (7), although a high
overall success frequency was reported for Sealapex® (20). Considering the in
vitro biocompatibility, the calcium hydroxide based sealers present lower cytotoxic
effect compared to the ZOE containing materials (15).
Iodoform, which presents disinfectant and resorbability properties (9), has
been associated to different materials, among them: calcium hydroxide (Vitapex®,
Neo DenProducts Co Ltd, Tokyo, Japan) (7,8,21,22); prednilosone acetate,
ryfamicin sodium salt and canphorated parachlorophenol (Guedes-Pinto paste)
(23) and calcium hydroxide, zinc oxide, barium sulfate, eugenol and
paramonochlorophenol (Endoflas®, Sanlor Lab, Bogota, Colombia) (24). Recent
randomized clinical controlled trials showed high clinical and radiographic success
frequencies for the pulpectomies performed with Vitapex® (7,8) and Endoflas®
(11). However, cytotoxic effects were reported for Endoflas® (24) and Vitapex®,
which showed lower cytotoxicity result compared to ZOE based and calcium
hydroxide based materials added with formocresol (25).
The aim of this study was to compare the cytotoxicity of eight root canal
filling pastes for primary teeth, including a new calcium hydroxide with zinc oxide
material, through a multi-parametric assay employing human primary cells related
to the periapical region, simulating in vitro the clinical root canal filling of primary
teeth, by controlling the amount of paste used and the apical exposure.
Furthermore this study evaluated the cytotoxicity of such pastes using the material
/ vehicle ratio recommended by the ISO 10993-5 (2009), through the XTT reducing
assay.
2. Material and methods
This work is part of a project approved by the Antonio Pedro Hospital /
Fluminense Federal University Committee of Research Ethics (CCM/HUAP
232/08). This paper was reported considering the eighteen methodological
111
parameters of the in vitro sheet of the ToxRTool® (Toxicological data Reliability
Assessment Tool, Institute for Health and Consumer Protection, In vitro Methods
Unit, European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).
2.1. Root canal filling materials
Eight root canal filling materials for primary teeth were evaluated: ZOE
paste, Calcicur®, Vitapex®, Endoflas®, calcium hydroxide/zinc oxide, Calen®
thickened with zinc oxide (Calen/ZO), Guedes-Pinto paste (GP), and a ready-
made Guedes paste (GD). The tested materials, manufacturers and components
are listed in Table1.
2.2. Dispositive simulating in vitro the clinical root canal filling of primary
teeth
A 5-10 μL pippete tip (T-300, 0,5-10µl, Axygen®, California, USA) was
selected for it’s inner final diameter, which was compatible to the root canal apex
diameter following root canal preparation up to K-file 45 on primary teeth. The
pippete tip also showed a conical design, similar to root canal morphology. The
pippete tip was attached to a 0.5ml eppendorf tube lid (Easypath, São Paulo,
Brazil). The eppendorf lid was perforated with a 330 bur mounted in a high-speed
handpiece, and a 1.5mm of a 0.5mm wire (Dentaurum, Ispringen, Germany) was
attached and bended to form a handle. The lid was also cut to fit inside a 2.0ml
eppendorf tube (Alfa, Ipiranga, Brazil). The system was closed (Figure 1).
2.3. Samples preparation
Considering the prepare of the root canal filling pastes for primary teeth that
required mixing of the components, we observed that the manufacturers did not
recommend a fixed powder to liquid ratio for the zinc oxide and eugenol based
paste and Endoflas® for the root canal filling. Therefore, we proposed a powder to
liquid ratio for these materials to provide a consistency compatible to the technique
of root canal filling for pimary teeth using a lentulo spiral mounted at a hand-piece
(26).
112
The ZOE paste was prepared by manipulation of 0.5g of zinc oxide
(powder) with 9 drops (280µl) of eugenol. Endoflas® was prepared in a rate of 0.5g
of powder with 5 drops of liquid (160µl). Calen® was prepared mixing 1.0g of
Calen® to 0.65g of zinc oxide.(19) Guedes-Pinto paste was prepared by mixing of
0.30g of each component. The materials were manipulated in sterile glass plates
with proper spatulas, exclusive for each one. Calcicur®, Vitapex®, Guedes paste
and calcium hydroxide/zinc oxide were ready-made. The filling materials were
only opened and manipulated in aseptic conditions in vertical laminar flow cabin
(Labconco, Kansas City, USA). Each material was inserted in 3 pippete tips and
2.0ml eppendorfs tubes (Alfa, Ipiranga, Brazil), closed and weighted 0.037g (27)
on a high precision balance (Sartorius CP225D, Goetting, Germany). Then each
filled pippete tip was attached to the dispositive that simulated in vitro the clinical
root canal filling.
The test samples (n = 3) consisted of conditioned culture media obtained as
follows. The filled pippete tips were immersed at least 3mm in 185μL of
Dulbecco’s Modified Eagle’s media (DMEM) without serum, with 1% penicillin-
streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) and sodium bicarbonate (Sigma-
Aldrich, St. Louis, USA) at 3.7g/l (Figure 1). The samples were incubated at 37°C,
95% of humidity and 5% CO2 for 24 hours. Positive (latex) and negative
(polystyrene pearls) controls were prepared (28) and exposed in the model
conditions (n = 3). After 24 hours, the pippete tips were removed and discarded.
2.4. Cell viability evaluation through a multi-parametric in vitro approach
Cytotoxic of controls and tested materials was assessed in vitro with a
multiparametric assay kit (In Cytotox, XTT-NR-CVDE kit, Xenomatrix, Alschwil,
Switzerland) which evaluated sequentially in the same cell culture, three different
cell viability parameters of cell survival and integrity, on the same sample (29-31).
The XTT (2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny]-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide
inner salt) reducing assay evaluated the ability of metabolic active cells to reduce
the XTT molecules to a soluble salt of formazan, detectable by its absorbance at
480nm, by a microplate UV/Vis spectrophotometer (PowerWave MS2, BioTek, Rio
de Janeiro, Brazil). The same cells submitted to the XTT reducing assay were
113
washed and then assayed through the Neutral red uptake dye (NR) assay, which
evaluated the membrane integrity and the ability of viable cells to actively
incorporate the NR dye and to accumulate it preferentially on the lysosomes. The
amount of dye incorporated was measured at 540nm absorbance. Sequentially the
Crystal violet dye elution (CVDE) test evaluated the cell density, by DNA staining;
after discarding the excess of dye, the optical discrepancy measured at the
absorbance of 540nm was proportional to the amount of cells in each microplate
well.
Human primary osteoblast-like cells were obtained from the Biobank at the
Clinical Research Unit of the Antônio Pedro Hospital, Fluminense Federal
University, Niterói, Brazil. The cells on the fourth passage were seeded at a
density of 1 × 104 cells/well, filling in 33 wells of a 96-well plate (Corning®,
Tewskbury, USA). Three wells were assigned for experimental blank control, and
all border wells were filled in with 200μl of sterile phosphate buffered saline (PBS)
to reduce the medium evaporation. The cells were sub cultured for 24 h at 37°C,
95% humidity and 5% CO2. After 24 h, the medium (DMEM) was aspirated from
each well and replaced with 180μL of the materials and controls extracts, and
20μL of 10% fetal bovine serum (FBS) (Cultilab, Campinas, Brazil) was added to
each well, for further incubation at 37°C, 95% of humidity and 5% CO2 for 24 h.
After 24 the extracts were aspirated, and the cells washed with PBS. The extracts
were replaced with 200μL of culture medium (DMEM).
Then, the cell viability was initially assessed through the XTT assay. XTT II
and XTT I reagents solutions were mixed in a rate of 1:100, and 50μl of the
mixture were added to each well. The plate was covered and incubated at 37°C,
95% of humidity and 5% CO2 for 2 h and optical discrepancy (OD) was read at
480nm. Sequentially the cells and blank control were submitted to the NR assay.
The XTT identification solution was removed, and the cells were washed with
300μl of NR I solution, which was removed. NR II solution diluted in cultured
media at 37°C (1:100), was added (200μl) to each well, and the plate was
incubated at 37°C, 95% of humidity and 5% CO2 for 3 h. The solution was
removed, and 200μl of NR III was added to each well, after 1 minute, 200μl of NR
IV was added to each well, and the plate was incubated at 37°C, 95% of humidity
114
and 5% CO2 for 15 minutes. The OD was read at 540nm. After NR measurement,
the liquid was removed, the cells were washed twice with 200μL of CVDE I
solution. CVDE II solution was added, 100μl/well, and the plate was incubated at
room temperature for 10 minutes. The solution was removed, and each well
washed with 200μl of deionized water. The plate was dried and 100μl/well of
CVDE III solution was added. The OD was read at 540nm.
Cytotoxicity was rated based on the cell viability relative to the control as
not cytotoxic – > 90% cell viability, slightly cytotoxic – 60% - 90% cell viability,
moderately cytotoxic – 30% -59% cell viability and strongly cytotoxic – < 30% cell
viability (32).
2.4.1. Statistical analysis
The results were expressed as a percentage of viable cells for each
material, compared to the control group. The mean values and standard deviations
were calculated. Cell viability data was analyzed using nonparametric test of
Kruskal-Wallis and Dunn’s multi comparisons test, with a confidence interval of
95%.
2.5. Cell viability evaluation through the ISO 10993-5 (2009) material /
vehicle recommendation
Test samples (n = 5) consisting of conditioned medium were obtained
according to the International Standardization Organization (ISO 10993-5, 2009)
material / vehicle ratio for the evaluation of the cell viability of irregular materials.
The pastes were prepared as previously described in aseptic conditions, and
200mg of each paste was immersed in 1000μl of the culture medium (DMEM) in
sterile microtubes (Alfa, Ipiranga, Brazil), twice for each paste. The samples were
incubated at 37°C, 95% of humidity and 5% CO2 for 24 hours. Positive (latex) and
negative (polystyrene pearls) controls were prepared (28) and exposed in the
model conditions. After 24 h, the extracts were centrifuged for 15 min at 3000 rpm
(Sorvall ST 6R, Thermo Fischer Scientific, Kalkberg, Germany). The supernatant
was aspirated (1500μL).
115
The cell seeding and cultivation was performed as previously described.
After 24 h, the medium (DMEM) was carefully removed from each well and
replaced with 180μl of the materials and controls extracts, and 20μl of 10% fetal
bovine serum (FBS) was added to each well, for further incubation at 37°C, 95% of
humidity and 5% CO2 for 24 h. After 24 the extracts were aspirated, and the cells
washed with PBS. The extracts were replaced with 200μl of culture medium
(DMEM), and the XTT reducing assay was performed as previously described.
3. Results
Figure 2 shows cell viability as evaluated by the multiparametric assay,
after the exposure of the root canal filling materials extracts for 24 h, through the in
vitro root canal filled simulating model (A, B and C) and through the XTT reducing
assay, using the 0.2g to 1ml ratio of the ISO 10993-5 (2009) (D). The results were
expressed as a percentage of the experimental control (cells exposed to
unconditioned medium).
Considering the cytotoxic rating (32) and through the model, Calcicur®,
Endoflas®, Guedes-Pinto and ZOE were considered slightly cytotoxic and Vitapex®
as moderately cytotoxic by all three assays. Calen® thickened with zinc oxide was
considered non-cytotoxic through the XTT and slightly cytotoxic by the NRU and
CVDE tests. The new calcium hydroxide paste (UFRJ) was evaluated as slightly
cytotoxic through the XTT and moderately cytotoxic by the NRU and CVDE
assays. The Guedes paste was considered as strongly cytotoxic by all the assays.
Considering the ISO 10993-5 (2009) regulatory cytotoxicity limit, Calcicur®,
Vitapex® , ZOE, UFRJ and Guedes paste (GD FA) reduced the cell viability more
than 30% relative to the control and were considered cytotoxic, through the XTT
reducing assay.
When the cell viability was measured by the XTT reducing assay, after 24h
cells exposure to the investigated pastes, through the 0.2g to 1ml material /
vehicle recommended by the ISO 10993-5 (2009), Calcicur® was considered
116
moderately cytotoxic while the other pastes were evaluated as strongly cytotoxic
(D).
4. Discussion
The diversity of methodologies for evaluating the in vitro biocompatibility of
root canal filling materials hinders the comparison of the studies results and the
search for evidences. Therefore, in our study we evaluated the cytotoxicity of eight
root canal filling materials for primary teeth, including one new developed calcium
hydroxide with zinc oxide material through a multi-parametric approach on the
same cell samples. The cell viability assays, XTT reducing, Neutral red uptake dye
and the Crystal violet dye elution, evaluated three different parameters
respectively: the ability of metabolic viable cells in reducing a tetrazolium salt
(XTT) into soluble formazan, the cells membrane integrity and the cell density.
Furthermore, this is the first multi-parametric evaluation of these materials,
simulating in vitro the clinical root canal filling of primary teeth, by controlling the
amount of paste (27) used and the apical exposure. It is worth to notice that we
used primary human osteoblast-like cells, which are intimately related to bone
tissue repair and regeneration (30,33). Bone repair is one of the objectives of the
pulpectomy treatment, since the common radiographic criteria for success applied
in the clinical studies are the observation of solving or a reduction in the size of the
pre-existing radiolucent areas and no newly formed radiolucent areas associated
to the treated teeth during the follow-up period (8,10,22).
Aiming the evaluation of the in vitro cell-based biocompatibility, some
studies were performed with root models using extracted permanent roots for the
evaluation of root canal filling materials for permanent teeth (34-36). Extracted
permanent roots were also used for an in situ root-end model (29) and a root-end
using a three-dimensional cell culture model aiming to the investigation of the
biocompatibility of root-end filling materials (37). Yadlapati et al. (2015) (31)
developed a simulating root canal model for the evaluation of an antibiotic
intracanal medication used for regenerative endodontic procedure in the treatment
of immature permanent teeth with necrotic pulpal diagnostic. These root canal
117
models aimed the evaluation of materials designed for the endodontic therapy of
permanent teeth, simulating the clinical conditions. Otherwise, our root canal
model was designed for simulating in vitro the clinical conditions of the primary
teeth root canal filling without the need of primary teeth extracted roots, since
these are difficult to be obtained due to the physiological root resorption. We
understand that the lack of interaction between the investigated pastes with the
dentine tissue would possibly represent a limitation of our model.
Camps et al. (2003) (35) and Susini et al. (2005) (36) compared the results
of the sealers cytotoxicity obtained through the root-dipping technique with those
obtained through the ISO 10993-5 (1994) protocol. The ISO standards cytotoxic
results were higher than those obtained through the root models (35,36).
According to them, the root-dipping model corresponded to a classical root filling,
while the ISO standards may clinically correspond to a large overfilling condition.
Our results of the in vitro biocompatibility of the investigated pastes expressed as
cell viability relative to the control, through the simulating model, were higher than
those obtained with the material / vehicle ratio recommended by the ISO 10993-5
(2009) through the XTT reducing assay. The higher material concentration
proposed in the latter approach possibly exaggerated the clinical use conditions,
aiming to determine the potential toxicological hazard. Our model, as well as the
proposed root models (29,31,34-37) aimed to simulate the clinical conditions, for
the same purpose. Although different, both strategies are mentioned at the
extracting conditions section of the ISO 10993-5 (2009).
Through the XTT reducing test, the zinc oxide and eugenol based paste
was considered slightly cytotoxic by the simulating model, while strongly cytotoxic
through the ISO 10993-5 (2009) material / vehicle ratio, with the cell viability
ranging from 65.8% (model) to 1% (ISO). Our results were similar to those
obtained by Camps et al. (2003) (35) for a ZOE based sealer assayed through the
MTT reducing test, another tetrazolium salt-based assay, with reported 15% of cell
mortality for the root model group and 95% for the ISO standards group. In the
present study, the zinc oxide and eugenol based paste was considered slightly
cytotoxic by the simulating model, through the membrane integrity and the cell
density evaluation assays, with 61% and 76% of cell viability. Considering the ISO
118
10993-5 (2009) 70% cell survival cut-off for cytotoxicity, the paste would be rated
as not cytotoxic only according to the Crystal violet dye elution assay result.
The other investigated root canal filling materials for primary teeth were for
the first time evaluated through a root canal simulating model. We observed that
most of the pastes showed higher results of cytotoxic effect when evaluated
through the ISO material / vehicle ratio, compared to model, except the Guedes
paste (Fómula & Ação, São Paulo, Brazil). This paste was considered strongly
cytotoxic through both strategies and all the assays. Among the calcium hydroxide
based pastes, the Calen® thickened with zinc oxide and Calcicur® showed the
higher cell viability results, with the lowest result obtained through the XTT assay,
indicating a possible metabolic pathway of cytotoxicity. Its worth of notice that the
Calen® thickened with zinc oxide was the less flowable paste, due to the viscous
vehicle and the adding of zinc oxide in a 65% w/w ratio. Therefore, the paste
would probably be more self-contained inside the pippete tip and/or released fewer
components to the medium. The new calcium hydroxide based with zinc oxide
(UFRJ) paste although presents a viscous vehicle, the zinc oxide adding was
lower compared to the Calen® thickened with zinc oxide paste. The UFRJ paste
showed moderately cytotoxicity with results around 55%-58% of cell viability,
which were similar to those obtained with the iodoform based with calcium
hydroxide paste (Vitapex®). Endoflas® liquid is mainly composed by eugenol, and
parachlorophenol, both considered cytotoxic. However, our results showed a
slightly cytotoxicity, with the higher cell viability result obtained through the XTT,
suggesting a non-metabolic toxicity pathway. The Guedes-Pinto paste was
considered slightly cytotoxic, indicating a non-metabolic cytotoxicity pathway. It
should be highlighted that from a regulatory point of view, considering the ISO
10993-5 (2009) 70% cell survival cut-off for cytotoxicity, only the Calen® thickened
with zinc oxide and the Guedes-Pinto pastes were rated as not cytotoxic through
the evaluation of the three assays endpoints. Considering the XTT reducing assay
results, the rank of the pastes according to the cell viability was Guedes-Pinto >
Calen® thickened with zinc oxide > Endoflas® > ZOE > Calcicur® > Vitapex® >
UFRJ > Guedes paste.
119
Considering the results obtained through the ISO approach, all the pastes
were considered strongly cytotoxic, except Calcicur®, which was rated as
moderately cytotoxic. It was also observed that the calcium hydroxide based and
the iodoform-based with calcium hydroxide pastes showed the better results of cell
viability. The rank of the pastes according to the cell viability was Calcicur® >
Vitapex® > UFRJ > Calen® thickened with zinc oxide > Guedes-Pinto > Endoflas®
> ZOE > Guedes paste.
Recently, a study evaluated the Guedes-Pinto and the Calen® thickened
with zinc oxide pastes for the cytotoxicity through the MTT reducing assay, the
generation of reactive oxygen species (ROS) and the potential damage to the
deoxyribonucleic acid (DNA) of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) (38).
Both pastes increased the cell viability and the generation of ROS at the 24 h
period of exposure. However, the Guedes-Pinto paste did not cause DNA
damage, while the Calen® thickened with zinc oxide paste led to a higher DNA
damage at the 24 h period. According to the authors the Guedes-Pinto paste was
associated to a better biocompatibility. The conclusion is in accordance with our
root-simulating model results obtained through the XTT reducing assay for those
pastes.
Considering the Endoflas® paste our results obtained through the model
and the ISO standards are similar to the observations of Petel et al. (2013) (24) for
the evaluation of the in vitro biocompatibility of such material to macrophages and
epithelial cells. While high concentrations of Endoflas® showed a cytotoxic effect
with a decrease in cell viability by approximately 70%, lower concentrations led to
cell viability increase up to 60% relative to the control.
The present study demonstrated the cytotoxic effects of eight root canal
filling materials through a root canal simulating model and the ISO 10993-5 (2009)
material / vehicle ratio. Based on our results, we would suggest for future
investigations the evaluation of the potential of DNA damage of these pastes, as
well as the release of intracellular component markers and the detection of
apoptosis and necrosis of the exposed cells. Furthermore, the evaluation of the
120
leached components to the culture medium on the same conditions of the root
canal simulating model, would assist the elucidation of the cytotoxic pathways.
5. Conclusion
It can be concluded that within the proposed model the pastes presented
lower cytotoxic effects, compared to those obtained through the ISO approach.
The exception was the Guedes paste considered as strongly cytotoxic by all the
evaluations.
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125
Figure 1. A) Components of the root canal simulating model; B) Filled root canal simulating
model.
A B
126
Figure 2. Cytotoxicity assay results through the root canal simulating model (A, B, C) and through the ISO 10993-5 (2009) material / vehicle standard (D). Cytotoxic effects of the positive control (C+), negative control (C-), Calcicur®, Vitapex®, Guedes paste (Fórmula & Ação) (GD), UFRJ paste, Endoflas®, Calen® thickened with zinc oxide (CALEN/ZO), Guedes-Pinto paste (GP), and ZOE paste on primary human osteoblast-like cells measured by Crystal violet dye elution (A), NRU (B) and XTT tests (C, D) and expressed as a percentage of experimental control (cells exposed to unconditioned medium) cell viability. *Statistically significant differences between groups relative to the control (p < 0.05).
127
Table 1. Components of the root canal pastes tested
Material Presentation Components
Endoflas® (Sanlor & Cia. S. en C.S., Bogotá, Colombia)
Powder Liquid
Tri-iodomethane and iodine dibutilorthocresol (40.6%), zinc oxide (56.5%), calcium hydroxide (1.07%), and barium sulfate (1.63%) Eugenol and paramonochlorophenol
Vitapex® (Neo DenProducts Co Ltd, Tokyo, Japan)
Paste Iodoform (40.4%), calcium hydroxide (30.3%), silicone (22.4%)
Calcicur® (VOCO, Cuxhaven, Germany)
Paste Calcium hydroxide, water, cellulose derivatives, barium sulphate
Calen® thickened with zinc oxide (S.S.White, Rio de Janeiro,Brazil) (S.S.White, Rio de Janeiro,Brazil)
Paste Powder
Calcium hydroxide (30,16%), zinc oxide (45.42%), polyethilene glycol (23,82%), colophony ww (0,60%) Zinc oxide 99% to 100.5%
Guedes-Pinto paste (Laboratórios Buenos Ayres, São Paulo, Brazil) (Biodinâmica, Ibiporã, Brazil) (Biodinâmica, Ibiporã, Brazil)
Ointment Liquid Powder
Pomada (prednisolone acetate 5mg g -1, sodium rifamycin 1.5mg g -1 , carbowax ointment 10g) Camphorated paramonochlorophenol Iodoform
Guedes paste (Fórmula & Ação, São Paulo, Brazil)
Paste
Iodoform (33.33%), paramonochlorophenol (33.33%), rifamycin (0.05%), prednisolone (0.1666%), vehicle 5g)
UFRJ paste(S.S.White, Rio de Janeiro,Brazil)
Paste Calcium hydroxide, zinc oxid, polyethilene glycol, colophony ww
Zinc oxide and eugenol (Biodinâmica, Ibiporã, Brasil) (Biodinâmica, Ibiporã, Brasil)
Powder Liquid
Zinc oxide 99% to100.5% Eugenol and glacial acetic acid
128
6. Considerações finais
Em linhas gerais, no presente estudo executamos uma revisão narrativa da
literatura de forma estruturada, que nos orientou na seleção das pastas
obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos a serem investigadas.
Através da revisão sistemática, concluímos que os ensaios de redução do MTT e
do XTT não apresentaram resultados conflitantes com os determinados através
de outras metodologias para a avaliação da citotoxicidade de materiais
obturadores de canais radiculares. Outrossim, obtivemos um panorama dos
diversos ensaios para a avaliação da citotoxicidade desses materiais. Ademais,
nosso estudo avaliou, pela primeira vez, as pastas obturadoras indicadas para
canais radiculares de dentes decíduos selecionadas através de um modelo inédito
de simulação de canal radicular para dentes decíduos.
A seleção das pastas obturadoras de canais radiculares de dentes
decíduos para o estudo de avaliação da citotoxicidade teve como base uma
revisão da literatura sobre as pastas mais investigadas em estudos clínicos de
Odontopediatria nos últimos dez anos. Inicialmente, fizemos uma revisão em
janeiro de 2013 que incluiu 18 estudos e mostrou que a pasta à base de óxido de
zinco e eugenol (n = 11) era a mais investigada nos estudos clínicos
selecionados, seguida das pastas à base de iodofórmio com hidróxido de cálcio (n
= 7). Enquanto as pastas à base de hidróxido de cálcio foram avaliadas em 4
estudos e a pasta Endoflas® o foi em dois. As pastas antbiótica 3 Mix, Kripaste® e
uma associação de óxido de zinco e óleo ozonizado foram avaliadas em apenas
um estudo cada.
A fim de provermos dados mais atualizados para submissão do nosso
artigo, atualizamos a revisão em maio de 2016 com os resultados apresentados
no primeiro artigo da tese. Nessa revisão, incluímos 21 estudos e observamos
resultados similares para as pastas à base de óxido de zinco e eugenol (n = 12) e
à base de iodofórmio com hidróxido de cálcio (n = 8). Entretanto, observamos um
maior interesse na avaliação da pasta Endoflas® (n = 4), sendo que um estudo
avaliou uma versão sem clorofenol e de pastas compostas de óxido de zinco
129
associadas a outros veículos diferentes do eugenol (n = 3). As associações visam
melhorar as propriedades antimicrobianas, anti-inflamatórias e a
biocompatibilidade das pastas obturadoras de canais radiculares de dentes
decíduos (KHAIRWA et al., 2014; Al-OSTWANI et al., 2016). Os resultados de
avaliação clínica e radiográfica foram considerados satisfatórios: 86,67% e
73,34% para a associação de óxido de zinco com aloe-vera (KHAIRWA et al.,
2014) e 93,5% e 62,5% para a formulação com própolis (Al-OSTWANI et al.,
2016).
Assim, no estudo da avaliação da citotoxicidade incluímos as pastas à base
de óxido de zinco e eugenol, à base de iodofórmio com hidróxido de cálcio
(Vitapex®), a pasta Endoflas® e a pasta Calcicur® à base de hidróxido de cálcio.
Além dessas, incluímos as pastas nacionais de Guedes-Pinto, Calen® espessada
e pasta UFRJ, material novo sem avaliação prévia, com a finalidade de compará-
las aos demais. A comparação é relevante visto que a pasta de Guedes-Pinto, à
base de iodofórmio com preparo através de manipulação imediata dos
componentes (chairside), é amplamente utilizada nas Faculdades de Odontologia
Brasileiras (PAULA et al. 2010; COSTA et al., 2012). Além disso, na literatura
estão descritos resultados favoráveis para a avaliação da biocompatibilidade
tecidual das pastas de Guedes-Pinto (CERQUEIRA et al., 2007) e Calen®
espessada (QUEIROZ et al., 2011). Entretanto, a avaliação multiparamétrica da
biocompatibilidade in vitro dessas pastas foi pouco explorada, contando somente
com o estudo de PIRES et al. (2015).
A citotoxicidade da pasta de Guedes-Pinto quando manipulada e estocada
à temperatura ambiente e em refrigerador por um período de 1, 3 e 5 meses foi
investigada por LOPES-MAROTTI (2003). O autor concluiu que o armazenamento
em ambas as condições aumentou o efeito citotóxico da pasta. Atualmente sob
encomenda, uma pasta que apresenta os mesmos componentes da pasta de
Guedes-Pinto e pronta para uso, denominada pasta de Guedes, é disponibilizada
no mercado nacional. Incluímos esse material no estudo, pois, se o resultado da
avaliação fosse satisfatório, a dispensa de manipulação representaria um passo
clínico a menos na prática Odontopediátrica. Além disso, um dos componentes da
pasta de Guedes-Pinto original, a pomada Rifocort, deixou de ser fabricada.
130
Assim sendo, tornou-se necessária a manipulação de um substituto em uma
farmácia da cidade de São Paulo. Soma-se a essa dificuldade, o prazo de
validade curto de dois meses da pomada manipulada.
Em relação aos métodos de avaliação da citotoxicidade de materiais
obturadores de canais radiculares, investigamos a possibilidade dos resultados
obtidos através de testes a base de sais de tetrazólio, como o de redução do XTT,
em implicar tendências concordantes ou não quando comparados aos obtidos
através de outros parâmetros de viabilidade celular. A execução dessa revisão
sistemática da literatura foi desafiadora, pois trabalhamos com base em uma nova
metodologia (OHAT, 2015) voltada para uma área de estudo em
desenvolvimento: a Toxicologia baseada em evidências (SILBERGELD e
SCHERER, 2012). Através da metodologia aplicada conseguimos construir uma
abordagem para a questão no formato PECO (população, exposição, comparação
e resultados, outcomes) que permitiu definir com clareza os critérios de inclusão e
exclusão. Como possível limitação da metodologia observamos a falta de uma
proposta para a avaliação da qualidade metodológica dos estudos in vitro.
Entretanto, identificamos uma recomendação no site do European Centre for the
Validation of Alternative Methods (ECVAM) que abriga metodologias alternativas
aos estudos em animais: a ferramenta ToxRtool. O software ToxRTool através da
planilha para estudos in vitro, permite a avaliação dos dados relatados pelos
autores em relação a cinco grupos de critérios: identificação da substância
testada, caracterização do sistema teste, descrição do desenho do estudo,
documentação dos resultados dos estudos e plausibilidade do desenho do estudo
e dos resultados. A ferramenta classifica os estudos segundo três categorias de
confiabilidade, mas também permite que o avaliador interfira no resultado final,
mediante uma justificativa prevista na planilha. Nos nossos resultados 24 artigos
potencialmente elegíveis que apresentaram como única falha metodológica
associada aos critérios cruciais (“vermelhos”) a falta de uso de controle positivo,
puderam ser reclassificados como confiáveis sem restrições e incluídos na
revisão. Para os dados de avaliações de atividade metabólica celular, a
possibilidade dessa falha estava prevista na planilha, com autorização para a
mudança de categoria pelo avaliador.
131
Outra dificuldade observada na realização da revisão sistemática foi a
diversidade de formas de apresentação dos resultados de citotoxicidade nos
estudos incluídos. Os resultados quantitativos foram apresentados em valores
médios com desvio padrão expressando valores percentuais de vitalidade celular
em relação ao controle experimental ou ao controle negativo; em valores
percentuais de citotoxicidade celular em relação ao controle experimental ou ao
controle negativo; ou em valores de discrepância ótica. Inicialmente, foi
necessária a identificação dos valores nos gráficos, para tanto, utilizamos um
software e cálculos. A etapa seguinte requereu a transformação dos valores em
resultados de viabilidade celular expressos percentualmente em relação aos
controles experimental ou negativo para todos os estudos incluídos.
Em relação à normalização dos resultados de efeito citotóxico para os
materiais obturadores dos estudos selecionados, optamos pela utilização da
classificação proposta por DAHL et al. (2006). Essa classificação propôs faixas de
efeito citotóxico que variam de não citotóxico até fortemente citotóxico com base
nos resultados de viabilidade celular. Através dela, podemos avaliar melhor o grau
de efeito citotóxico apresentado por um material quando comparado ao único
limite de redução da viabilidade, até 30%, considerado para a determinação do
efeito citotóxico na metodologia da ISO 10993-5 (2009).
Os resultados da revisão sistemática foram compensadores. Concluímos
que os dados de avaliação da citotoxicidade dos materiais obturadores de canais
radiculares obtidos através dos ensaios de redução do XTT e do MTT não foram
conflitantes com os obtidos através de outros parâmetros de viabilidade celular.
Ademais, obtivemos um panorama dos ensaios de viabilidade celular utilizados na
avaliação desses materiais. No entanto, observamos que as pastas obturadoras
de canais radiculares de dentes decíduos à base de óxido de zinco e eugenol e à
base de iodofórmio com hidróxido de cálcio (Vitapex®) não foram consideradas
nos resultados da revisão. Todavia, em nosso estudo multiparamétrico
observamos que os resultados obtidos através do ensaio de redução do XTT não
foram conflitantes com os obtidos através da avaliação da integridade
membranar, tão pouco através da avaliação da densidade de células aderidas.
132
Para a avaliação da citotoxicidade das pastas selecionadas,
desenvolvemos um modelo cujo objetivo foi simular a situação clínica de
obturação de canais radiculares de dentes decíduos. O modelo foi projetado para
permitir a reprodutibilidade e execução dos testes de avaliação da citotoxicidade
sem a utilização de raízes de dentes decíduos, que são de difícil obtenção em
virtude do processo de reabsorção fisiológica própria desses dentes. Entendemos
que a falta de interação da pasta obturadora com a dentina pode representar uma
limitação do modelo. Todavia, o controle da quantidade de pasta utilizada -
avaliada previamente (XIMENES e CARDOSO, 2012) - e da exposição “apical”
podem representar pontos favoráveis ao modelo.
A metodologia multiparamétrica adotada para a avaliação da citotoxicidade
das pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos selecionadas já
foi utilizada em estudos para a avaliação de materiais obturadores de canais
radiculares de dentes permanentes (DE DEUS et al.,2009; SCELZA et al., 2012;
SILVA et al., 2014). A abordagem incluiu a avaliação da viabilidade celular pelos
ensaios do Vermelho neutro, da eluição do corante Cristal violeta e da redução do
XTT. A avaliação através de diferentes parâmetros de viabilidade celular visou
aumentar as chances de detecção de possíveis efeitos citotóxicos, bem como
sugerir indícios para as vias de toxicidade.
Com base nos resultados da revisão sistemática, elegemos o ensaio de
redução do XTT para a avaliação das pastas segundo proporção de material e
veículo (meio de cultura) recomendada pela ISO 10993-5 (2009). Os resultados
da avaliação da citotoxicidade frente as células primárias semelhantes a
osteoblastos humanos mostraram forte efeito citotóxico para a maioria das pastas,
com exceção da pasta Calcicur que se mostrou moderadamente citotóxica. Essa
pasta contém aproximadamente 45% de hidróxido de cálcio em veículo aquoso
sem a adição óxido de zinco. Recentemente, a presença de íons zinco nos
extratos de cimentos à base de óxido de zinco e eugenol foi atribuída a redução
da viabilidade de queratinócitos humanos orais imortalizados, avaliada pelo teste
WST à base de sal de tetrazólio (LEE et al., 2016). A avaliação da citotoxicidade
de cimentos à base de óxido de zinco com e sem eugenol apresentaram
resultados semelhantes de efeito citotóxico (KWON et al., 2014). A presença dos
133
íons zinco poderia explicar a diferença de efeito citotóxico encontrada entre as
pastas UFRJ, Calen espessada com óxido de zinco e Calcicur®. A pasta UFRJ,
que apresenta óxido de zinco em menor proporção comparada à pasta Calen®
espessada, reduziu a viabilidade celular em 74,2%, enquanto a última reduziu em
82,7%.
O estudo da avaliação multiparamétrica da citotoxicidade das pastas
obturadoras selecionadas através do modelo de simulação apresentou algumas
dificuldades associadas ao grande número de pastas testadas ao mesmo tempo.
Assim, o período de pesagem foi longo e para garantir que os materiais fossem
avaliados frescos, isto é, sem tomar presa, os materiais Endoflas e pasta à base
de óxido de zinco e eugenol foram os útimos a serem manipulados e pesados.
Além disso, foi necessário obter um grande número de células para o
plaqueamento, a fim de obter a densidade celular de 1 x 104 por poço. O próprio
plaqueamento das células em tantos poços requereu extrema atenção durante o
processo.
Em relação às pastas, observamos maior facilidade para a inserção das
pastas Calcicur® e Vitapex® nas ponteiras de pipetas. Essas pastas já prontas
para uso, são apresentadas em seringas com ponteira própria angulada. A pasta
de Guedes pronta para uso apresentou aspecto pouco homogêneo, tanto na
própria seringa quanto nas ponteiras de pipetas preenchidas. Inicialmente,
tentamos inserir as pastas que requeriam manipulação usando seringas para
insulina com agulha curta (BD Ultra-FineTM, Curitiba, Brasil), mas observamos um
efeito de filtração associado à diminuta luz da agulha para as pastas à base de
óxido de zinco e eugenol e de Guedes-Pinto. Passamos a utilizar seringas de 3ml
com agulha 0,70 x 25mm (BD SoloMedTM, Curitiba, Brasil) que mostraram-se
adequadas para a maioria das pastas, à exceção da pasta Calen espessada com
óxido de zinco. Essa pasta que apresenta pouca fluidez, foi inserida utilizando-se
uma agulha simulando um calcador estéril.
Na nossa experiência durante a condução dos ensaios de avaliação da
viabilidade celular multiparamétrica nas células primárias semelhantes a
osteoblastos humanos, observamos que em relação à temperatura do ambiente e
134
das soluções, a temperatura ambiente mais quente e das soluções a 37°C
favoreceu a execução do experimento multiparamétrico (NIH, 2003).
Os resultados do estudo multiparamétrico para as pastas selecionadas
mostraram menor efeito citotóxico comparados aos resultados obtidos pela
abordagem da ISO. Os resultados obtidos através do modelo de simulação
mostraram-se mais condizentes com os resultados de frequência de sucesso
clínico e radiográfico identificados para as pastas à base de óxido de zinco e
eugenol, à base de iodofórmio com hidróxido de cálcio e à base de hidróxido de
cálcio identificadas na literatura e apresentadas no primeiro artigo que compõe a
nossa tese. Fato que sugere que o modelo de simulação de obturação de canal
radicular de dente decíduo desenvolvido pode representar uma metodologia mais
fidedigna para avaliação da citotoxicidade inicial dessas pastas.
Considerando o processo de reabsorção fisiológica dos dentes decíduos e
os resultados de avaliação da citotoxicidade das pastas obturadoras obtidos
através do modelo de simulação do canal radicular e da abordagem ISO,
podemos estimar que clinicamente o efeito citotóxico das pastas se manifeste
entre os resultados obtidos pelas duas metodologias. Inicialmente, quando a raiz
do dente decíduo está íntegra ou apresente até um terço de reabsorção, os
tecidos periapicais estarão menos expostos às pastas obturadoras. Ao passo que
a medida que a rizólise progride, possivelmente ocorrerá maior exposição dos
tecidos periapicais às pastas obturadoras. Pensando assim, o desenvolvimento
de pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos mais
biocompatíveis, menos citotóxicas, torna-se ainda mais relevante.
Através do estudo de avaliação multiparamétrica da citotoxicidade in vitro
das pastas obturadoras selecionadas, obtivemos resultados que sugeriram
possíveis vias para o efeito citotóxico observado. Todavia, outros ensaios in vitro
são necessários para a compreensão dos mecanismos envolvidos. Assim,
sugerimos para estudos futuros: a avaliação das pastas selecionadas quanto ao
potencial de dano ao DNA, a liberação componentes intracelulares marcadores de
estresse oxidativo e a detecção de apoptose e/ou necrose. Além dessas
investigações, a avaliação dos componentes das pastas liberados para o meio de
135
cultura nas mesmas condições do experimento de citotoxicidade poderia ajudar
na elucidação dos mecanismos de toxicidade envolvidos. Recentemente, um
modelo de simulação de obturação de canais radiculares a partir de raízes de
dentes permanentes extraídos foi associado à uma cultura de células em
suspensão em agregados celulares ou cultura em três dimensões para avaliação
de materiais obturadores (SILVA et al., 2016). A cultura em três dimensões
apresenta características mais próximas das condições in vivo, de tal forma que a
interação entre as células pode favorecer os estudos de avaliação da viabilidade
celular (RAVI et al., 2015). Assim, a utilização do nosso modelo em associação à
uma cultura de células tridimensional fica como sugestão final para estudos
futuros.
136
Conclusões:
Revisou-se a literatura quanto aos materiais obturadores utilizados em
pulpectomias de dentes decíduos; avaliou-se comparativamente métodos de
avaliação da citotoxicidade à base de sais de tetrazólio com outros parâmetros de
avaliação de viabilidade celular e, finalmente, avaliou-se a citotoxicidade de
diferentes pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos através
de um modelo de simulação de canal radicular. Diante da metodologia empregada
pode-se concluir que:
À luz da revisão narrativa da literatura, a pasta obturadora à base de óxido de zinco e eugenol ainda é a pasta obturadora de canais radiculares de dentes decíduos mais estudada e avaliada nos estudos clínicos de Odontopediatria no período de 2006 a 2016, apresentando uma frequência de sucesso total clínico e radiográfico entre 93,3% e 70%. Embora tenha sido observada uma tendência na utilização das pastas à base de iodofórmio e hidróxido de cálcio, que mostraram frequências de sucesso total entre 100% e 89%.
Através da revisão sistemática da literatura, podemos afirmar que os testes de avaliação da citotoxicidade à base na redução dos sais de tetrazólio XTT e MTT não apresentaram resultados de citoxicidade conflitantes com os obtidos através de outros parâmetros de avaliação da viabilidade celular. Os ensaios de redução do XTT e do MTT apontaram tendências similares de efeito citotóxico em 92,59% e 87,95% das comparações executadas.
A avaliação multiparamétrica da citotoxcidade das pastas Calcicur®, UFRJ, Endoflas®, Calen/OZ, Guedes-Pinto, Vitapex®, Guedes e à base de óxido de zinco e euegenol através do modelo de simulação de canal radicular de dentes decíduos mostrou: pelo teste de redução do XTT, efeito citotóxico leve para: Calcicur®, UFRJ, Endoflas®, Calen/OZ, Guedes-Pinto e à base de OZE. Vitapex® e Guedes apresentaram efeito citotóxico moderado e forte, respectivamente. Através do ensaio de incorporação do Vermelho neutro o efeito citotóxico foi leve para Calcicur®, Endoflas®, Calen®/OZ, Guedes-Pinto e à base de OZE; moderado para Vitapex® e UFRJ e forte para Guedes. Os resultados do teste de eluição do corante Cristal violeta (CVDE) foram similares aos do ensaio do Vermelho neutro, com exceção da pasta Calen®/OZ, não citotóxica. Segundo a proporção material / veículo recomendada pela ISO 10993-5 (2009), a pasta Calcicur® mostrou efeito citotóxico moderado e o demais efeito citotóxico forte. Concluiu-se que as pastas apresentaram resultados de efeito citotóxico menores quando avaliadas através do modelo proposto comparados aos obtidos com a proporção da ISO. A exceção foi a pasta de Guedes pronta para uso considerada fortemente citotóxica em todas as avaliações.
137
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151
Anexos
Anexo 1 . Instruções para uso da ferramenta ToxRTool
152
153
154
Anexo 2. Planilha para avaliação de estudos in vitro da ferramenta ToxRTool
Explanations to ToxRTool
Objective: ToxRTool is designed to assess the inherent quality, also called reliability, of toxicological data as reported in a publication or a test report.
This tool essentially comprises a list of evaluation criteria. Criteria are subdivided in five groups:
I: Test substance identification, II: Test system characterisation, III: Study design description, IV: Study results documentation, V: Plausibility of study design and data
Per criterion either one ('1') or no ('0') point can be assigned. If a criterion is met, assign '1', if not assign '0'. Please choose from the respective drop-down list. All criteria must be answered!
In total 21 points for in vivo studies, 18 points for in vitro studies can be assigned. A reliability categorisation based on the total number of points is given below.
Criteria written in red have special importance: points for each of the red criteria are necessary to achieve Reliability category 1 or 2. Please evaluate with special care!
Data entry is requested in (and is also restricted to) the fields shaded in green.
Reliability categorisation (definition of categories according to Klimisch et al. 1997) (Proposed) consequence
in vivo in vitro
1 18-21 15-18 reliable without restrictions useful, check relevance for intended purpose
2 13-17 11-14 reliable with restrictions potentially useful, check relevance for intended purpose
3 <13 or not all red criteria met
<11 or not all red criteria met
not reliable generally not to be used as key study, but depending on the shortcomings of the study it may still be useful in weight-of-evidence approaches or as supportive information
4 not assignable: documentation insufficient (reviews, handbooks, other secondary sources)
generally not to be used as key study, but depending on the shortcomings of the study it may still be useful in weight-of-evidence approaches or as supportive information. (This category is not an outcome of this evaluation tool!)
In addition to the criteria for assessing data reliability, at the bottom of the worksheets there are some questions to be answered optionally ("Optional documentation of observations with importance to relevance"). These questions allow to document observations in a non-formalised way, which may be of importance for the further use of the information for regulatory or other purposes.
Reliability assessment of in vitro toxicity studies
Study under evaluation
Authors:
155
Titel:
Testing facility, year, sponsor, study no. or bibliographic reference:
Explanations are available for most criteria and show up, when the cursor is moved over the criteria field. Please read carefully! Red criteria: the maximum score is needed for these criteria to achieve reliability category 1 or 2 (see worksheet Explanations): Please evaluate with special care!
Criteria Evaluator's explanations, comments on criteria, etc.
No. Criteria Group I: Test substance identification Score
1 Was the test substance identified?
2 Is the purity of the substance given?
3 Is information on the source/origin of the substance given?
4 Is all information on the nature and/or physico-chemical properties of the test item given, which you deem indispensable for judging the data (see explanation for examples)?
0
Criteria Group II: Test system characterisation
5 Is the test system described?
6 Is information given on the source/origin of the test system?
7 Are necessary information on test system properties, and on conditions of cultivation and maintenance given?
0
Criteria Group III: Study design description
8 Is the method of administration given (see explanations for details)?
9 Are doses administered or concentrations in application media given?
10 Are frequency and duration of exposure as well as time-points of observations explained?
11 Were negative controls included (give also point, if not necessary, see explanations)?
156
12 Were positive controls included (give also point, if not necessary, see explanations)?
13 Is the number of replicates (or complete repetitions of experiment) given?
0
Criteria Group IV: Study results documentation
14 Are the study endpoint(s) and their method(s) of determination clearly described?
15 Is the description of the study results for all endpoints investigated transparent and complete?
16 Are the statistical methods for data analysis given and applied in a transparent manner (give also point, if not necessary/applicable, see explanations)?
0
Criteria Group V: Plausibility of study design and data
17 Is the study design chosen appropriate for obtaining the substance-specific data aimed at (see explanations for details)?
18 Are the quantitative study results reliable (see explanations for arguments)?
0 WARNING: check for unprocessed
criteria! (for each criterium a score has to be selected)
0
A Numerical result leads to initial Category: 3
B Checking red scores leads to revised Category: 3
C Evaluator's proposal: Category:
D Justification in case evaluator deviates from B:
Optional documentation of observations with importance to relevance (not part of the reliability assessment)
157
During the course of the quality assessment observations may be made which are important for discussing the relevance of the data for specific purposes. The optional possibility is provided here to document these observations for future use.
What is the purpose of this quality evaluation (data documentation for use under REACH, classification activity under GHS, ECVAM validation activities, other)?
Study conducted according to recent OECD or EU guidelines (or other, e.g. national guidelines)? If yes, which ones? Study conducted under GLP conditions?
(If not a guideline study): Does a guideline exist for the study endpoint(s) under investigation?
Are you aware of relevant deviations from the guideline(s) in the study evaluated? If yes, which one?
Did you make observations with importance to the regulatory use of the data (example 1: evaluator may hint that a whole body inhalation study was performed with a substance, for which profound percutaneous absorption is expected or known, leading to substantial percutaneous uptake in addition to inhalation uptake; example 2: an Ames reversion assay was performed with strains able to identify frame-shift mutations only or without external metabolic activation; example 3: evaluator is in possession of positive evidence that the results obtained with the in vitro study under evaluation, in conjunction with known toxicokinetic data, are useful to assess the nephrotoxicity of the substance in humans)?
Would you like to make other/general comments on the usability of the data?
158
Anexo 3. Desenho técnico da ponteira de pipeta T-300 (Axygen)
159
Apêndice
Artigo 2 Tabela de extração de dados
Domain Data extracted
Study identification (Reference)
Funding
Source reporting ( ) Yes ( ) No Conflict of interest reporting ( ) Yes ( ) No
Cell/tissue model
Cell line or cell type: Source of cells: Sex of human or animal of origin: Species:
Treatment
8. RCFM chemical composition: RCFM brand: RCFM prepare: Fresh ( ) yes ( ) no; Set ( ) yes , time _24h___ ( ) no Vehicle used in experimental/control conditions: Vehicle/material ratio:
Methods
Guideline compliance: Randomization procedure, allocation concealment, blinding during outcome: Number of replicates per group: Percent serum/plasma in medium: Exposition time: Use of a negative control: Report of data from positive controls: Endpoint category: Endpoint or assay name and source of assay kit: Statistical methods:
Results:
Tetrazolium- based test result: Other tests results: NOEC: LOEC: Statistical significance: AC50: Other estimates of effect:
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