DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE
MICRORGANISMOS
INTRODUÇÃO
No processo geral de divisão das bactérias, uma célula se divide
produzindo duas novas células. Assim, se iniciarmos com uma célula, o
aumento na população se verifica em progressão geométrica: 1-2-4-8-16-32,etc
O intervalo de tempo necessário para uma célula se dividir ou a
população duplicar chama-se tempo de geração e é específico para cada
microrganismo.
Para melhor representar o crescimento microbiano convencionou-se
dividi-lo em 4 fases a saber:
fase lag;
fase logarítmica;
fase estacionária;
fase de declínio.
OBJETIVO
Definir a curva de crescimento do microrganismo e determinar as velocidades
específicas de crescimento.
MATERIAL
Suspensão de Saccharomyces cerevisiae .
Erlenmeyer com meio a ser preparado.
Tubos de ensaio.
Pipetas de 1 mL esterilizadas
Água esterilizada (150 mL)
2 provetas esterilizadas. (50 mL)
Mecanismo de filtração à vácuo.
PROCEDIMENTO
MEIO DE CULTURA
Composição do meio de cultura:
Dextrose (40 g/L)
NaH2PO4.4H2O (1,0 g/L)
MgSO4.7H2O (0,25 g/L)
Extrato de levedura (1,0 g/L)
SUSPENSÃO DAS CÉLULAS DE Saccharomyces cerevisae
0,5 g de Saccharomyces cerevisiae em 5 mL de H2O destilada e
esterilizada.
MONTAGEM DA PRÁTICA
1. Esterilizam-se o meio (em erlenmeyer), as vidrarias (pipetas para a coleta
de amostras)
2. Em condições assépticas, mistura-se a suspensão de células de
Saccharomyces cerevisae preparada anteriormente ao erlenmeyer
contendo o meio.
3. Ajusta-se “shaker” para 150 rpm e a temperatura para 30°C.
4. Com o auxílio de uma pipeta estéril e em condições assépticas, coleta-se a
amostra referente a tempo “zero” (t = 0).
5. Procede-se com a coleta de amostras durante as 30 horas de fermentação
a cada 2 horas. As amostras são conservadas em geladeira.
6. PREPARO DAS CÉLULAS IMOBILIZADAS
A imobilização das células será conduzida preparando-se 35 mL de
solução de alginato de sódio a 3%, em banho maria. Nesta solução, adiciona-
se uma suspensão feita com 5 g de levedura e 15 mL de água destilada estéril.
Esta suspensão será gotejada de uma altura de 10 cm em 500 mL de solução
de CaCl2 0,1M utilizando uma bureta. As esferas assim obtidas deverão
permanecer por 1 hora na solução de cloreto de cálcio.
FERMENTAÇÃO
O meio de cultura deve ter a mesma composição do meio para células
livres.
Após esterilização dos meios e das vidrarias, será misturada ao meio as
células imobilizadas.
A fermentação será realizada em incubador rotativo (shaker), numa
rotação de 150 rpm, temperatura de 37°C, durante 30 horas.
A coleta das amostras (2 mL), será feita a cada hora. Cada amostra
coletada deverá ser armazenada em geladeira para posterior dosagem
analíticas e retirar 10 esferas de alginato de cálcio da solução de fermentação
CONTAGEM DAS CÉLULAS
Para a determinação da concentração celular durante a fermentação,
será utilizado o método de Turbidimetria, já visto anteriormente. Entretanto as
esferas de imobilização devem ser dissolvidas da seguinte forma:
Dissolução das esferas de alginato
A dissolução das esferas de alginato de cálcio se dá em tampão citrato
0,2 M e pH 5.
Tampão citrato:
Para preparar 500 mL:
Dissolver 21,12 g de ácido cítrico em 300 mL de água destilada e ajustar
o pH para 5 com NaOH 4N e completar o volume para 500 mL em balão
volumétrico.
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR
A concentração celular será determinada pelos métodos de “Peso Seco”
e da “Turbidimetria.
1. Peso Seco
Pesa-se uma membrana e anota-se seu peso e em seguida submete-se a
mesma ao microondas em potência de descongelamento até peso
constante (aproximadamente 4 minutos), anotando este valor. Determina-se
o teor de umidade da membrana (H);
Prepara-se o sistema de vácuo com a membrana;
Filtra-se 2 mL de amostra no sistema montado com a membrana, lavando o
sedimento com água destilada;
A membrana, com o sedimento, é acomodada num vidro de relógio e levada
ao microondas pelo mesmo tempo utilizado para a membrana, na mesma
potência;
Retira-se a membrana imediatamente do microondas e coloca-se no
dessecador por 15 minutos;
Decorrido este tempo, pesa-se a membrana com o sedimento e determina-
se a massa do microrganismo (MM) na amostra:
Massa do microrganismo(MM) = Massa1(membrana+microrganismo) –
Massa2(membrana seca)
A concentração celular da amostra presente no meio de cultivo é
determinada pela seguinte expressão:
Onde:
XM = concentração celular no meio (g/L)
MM = massa do microrganismo
H = teor de umidade da membrana (%)
Va = volume de amostra (L)
O teor de umidade é determinado para uma membrana e este valor é
utilizado em todos os cálculos. Presume-se, neste experimento, que o teor de
umidade é igual para todas as membranas.
2. Método da Turbidimetria
Neste método, é necessário construir uma curva padrão para relacionar
os valores de absorbância com a concentração celular em g/L.
a. Construção da Curva Padrão
Pesa-se 0,1 g de células de Saccharomyces cerevisae, transferindo-as para
um balão volumétrico de 100 mL;
Completa-se o volume do balão com água destilada;
Agita-se o balão vigorosamente até obter uma suspensão turva e
homogênea;
Com esta solução, prepara-se a curva padrão conforme Tabela 1;
Procede-se a leitura da absorbância da cada um dos padrões em
espectrofotômetro a 600 nm, contra um branco de água destilada;
Com os valores da absorbância correspondente a cada solução de
concentração conhecida constrói-se uma curva padrão, linear, com
correlação não inferior a 0,99.
Onde:
Y = absorbância
X = concentração celular (mg/L)
“a” = coeficiente angular da reta
“b” = coeficiente linear da reta
A partir desta equação, calcula-se a concentração celular nas amostras
provenientes da fermentação, fazendo diluições das mesmas, se
necessário.
Tabela 1. Dados para construção da curva padrão da concentração celular
TuboVolume da solução padrão
(mL)
Volume de água
(mL)
Concentração da
solução obtida
(mg/L)
1 1,0 9,0 100
2 2,0 8,0 200
3 2,5 7,5 250
4 3,0 7,0 300
5 4,0 6,0 400
6 5,0 5,0 500
7 6,0 4,0 600
8 7,0 3,0 700
9 8,0 2,0 800
10 9,0 1,0 900
11 10 - 1000
CÁLCULO DAS VELOCIDADES ESPECÍFICAS
1. Velocidade específica de crescimento microbiano
A determinação da velocidade específica de crescimento é feita com
base na seguinte equação:
Onde:
X = concentração celular (g/L)
AUTOCLAVE
Coloca-se água na autoclave até cobrir a serpentina. No cesto, acomoda-se o
material a ser esterilizado, fechando o aparelho. Liga-se, com a chave seletora no
máximo e a válvula de segurança totalmente aberta. Com o início de saída do vapor,
fecha-se a válvula e espera-se a autoclave atingir a pressão de trabalho, 1,1 atm
(manométrica). Ajusta-se a chave seletora para o “médio” e conta-se o tempo de
esterilização. Passado este tempo, desliga-se a autoclave e abre-se a válvula de
segurança. Após saída total do vapor e com o aparelho frio, abre-se e retira-se o material
esterilizado.
Em todos os demais procedimentos, o manuseio dos materiais é feito sempre por
trás da chama do bico de Bunsen, de preferência em câmara de fluxo laminar.
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