DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE

MICRORGANISMOS

INTRODUÇÃO

No processo geral de divisão das bactérias, uma célula se divide

produzindo duas novas células. Assim, se iniciarmos com uma célula, o

aumento na população se verifica em progressão geométrica: 1-2-4-8-16-32,etc

O intervalo de tempo necessário para uma célula se dividir ou a

população duplicar chama-se tempo de geração e é específico para cada

microrganismo.

Para melhor representar o crescimento microbiano convencionou-se

dividi-lo em 4 fases a saber:

fase lag;

fase logarítmica;

fase estacionária;

fase de declínio.

OBJETIVO

Definir a curva de crescimento do microrganismo e determinar as velocidades

específicas de crescimento.

MATERIAL

Suspensão de Saccharomyces cerevisiae .

Erlenmeyer com meio a ser preparado.

Tubos de ensaio.

Pipetas de 1 mL esterilizadas

Água esterilizada (150 mL)

2 provetas esterilizadas. (50 mL)

Mecanismo de filtração à vácuo.

PROCEDIMENTO

MEIO DE CULTURA

Composição do meio de cultura:

Dextrose (40 g/L)

NaH2PO4.4H2O (1,0 g/L)

MgSO4.7H2O (0,25 g/L)

Extrato de levedura (1,0 g/L)

SUSPENSÃO DAS CÉLULAS DE Saccharomyces cerevisae

0,5 g de Saccharomyces cerevisiae em 5 mL de H2O destilada e

esterilizada.

MONTAGEM DA PRÁTICA

1. Esterilizam-se o meio (em erlenmeyer), as vidrarias (pipetas para a coleta

de amostras)

2. Em condições assépticas, mistura-se a suspensão de células de

Saccharomyces cerevisae preparada anteriormente ao erlenmeyer

contendo o meio.

3. Ajusta-se “shaker” para 150 rpm e a temperatura para 30°C.

4. Com o auxílio de uma pipeta estéril e em condições assépticas, coleta-se a

amostra referente a tempo “zero” (t = 0).

5. Procede-se com a coleta de amostras durante as 30 horas de fermentação

a cada 2 horas. As amostras são conservadas em geladeira.

6. PREPARO DAS CÉLULAS IMOBILIZADAS

A imobilização das células será conduzida preparando-se 35 mL de

solução de alginato de sódio a 3%, em banho maria. Nesta solução, adiciona-

se uma suspensão feita com 5 g de levedura e 15 mL de água destilada estéril.

Esta suspensão será gotejada de uma altura de 10 cm em 500 mL de solução

de CaCl2 0,1M utilizando uma bureta. As esferas assim obtidas deverão

permanecer por 1 hora na solução de cloreto de cálcio.

FERMENTAÇÃO

O meio de cultura deve ter a mesma composição do meio para células

livres.

Após esterilização dos meios e das vidrarias, será misturada ao meio as

células imobilizadas.

A fermentação será realizada em incubador rotativo (shaker), numa

rotação de 150 rpm, temperatura de 37°C, durante 30 horas.

A coleta das amostras (2 mL), será feita a cada hora. Cada amostra

coletada deverá ser armazenada em geladeira para posterior dosagem

analíticas e retirar 10 esferas de alginato de cálcio da solução de fermentação

CONTAGEM DAS CÉLULAS

Para a determinação da concentração celular durante a fermentação,

será utilizado o método de Turbidimetria, já visto anteriormente. Entretanto as

esferas de imobilização devem ser dissolvidas da seguinte forma:

Dissolução das esferas de alginato

A dissolução das esferas de alginato de cálcio se dá em tampão citrato

0,2 M e pH 5.

Tampão citrato:

Para preparar 500 mL:

Dissolver 21,12 g de ácido cítrico em 300 mL de água destilada e ajustar

o pH para 5 com NaOH 4N e completar o volume para 500 mL em balão

volumétrico.

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

A concentração celular será determinada pelos métodos de “Peso Seco”

e da “Turbidimetria.

1. Peso Seco

Pesa-se uma membrana e anota-se seu peso e em seguida submete-se a

mesma ao microondas em potência de descongelamento até peso

constante (aproximadamente 4 minutos), anotando este valor. Determina-se

o teor de umidade da membrana (H);

Prepara-se o sistema de vácuo com a membrana;

Filtra-se 2 mL de amostra no sistema montado com a membrana, lavando o

sedimento com água destilada;

A membrana, com o sedimento, é acomodada num vidro de relógio e levada

ao microondas pelo mesmo tempo utilizado para a membrana, na mesma

potência;

Retira-se a membrana imediatamente do microondas e coloca-se no

dessecador por 15 minutos;

Decorrido este tempo, pesa-se a membrana com o sedimento e determina-

se a massa do microrganismo (MM) na amostra:

Massa do microrganismo(MM) = Massa1(membrana+microrganismo) –

Massa2(membrana seca)

A concentração celular da amostra presente no meio de cultivo é

determinada pela seguinte expressão:

Onde:

XM = concentração celular no meio (g/L)

MM = massa do microrganismo

H = teor de umidade da membrana (%)

Va = volume de amostra (L)

O teor de umidade é determinado para uma membrana e este valor é

utilizado em todos os cálculos. Presume-se, neste experimento, que o teor de

umidade é igual para todas as membranas.

2. Método da Turbidimetria

Neste método, é necessário construir uma curva padrão para relacionar

os valores de absorbância com a concentração celular em g/L.

a. Construção da Curva Padrão

Pesa-se 0,1 g de células de Saccharomyces cerevisae, transferindo-as para

um balão volumétrico de 100 mL;

Completa-se o volume do balão com água destilada;

Agita-se o balão vigorosamente até obter uma suspensão turva e

homogênea;

Com esta solução, prepara-se a curva padrão conforme Tabela 1;

Procede-se a leitura da absorbância da cada um dos padrões em

espectrofotômetro a 600 nm, contra um branco de água destilada;

Com os valores da absorbância correspondente a cada solução de

concentração conhecida constrói-se uma curva padrão, linear, com

correlação não inferior a 0,99.

Onde:

Y = absorbância

X = concentração celular (mg/L)

“a” = coeficiente angular da reta

“b” = coeficiente linear da reta

A partir desta equação, calcula-se a concentração celular nas amostras

provenientes da fermentação, fazendo diluições das mesmas, se

necessário.

Tabela 1. Dados para construção da curva padrão da concentração celular

TuboVolume da solução padrão

(mL)

Volume de água

(mL)

Concentração da

solução obtida

(mg/L)

1 1,0 9,0 100

2 2,0 8,0 200

3 2,5 7,5 250

4 3,0 7,0 300

5 4,0 6,0 400

6 5,0 5,0 500

7 6,0 4,0 600

8 7,0 3,0 700

9 8,0 2,0 800

10 9,0 1,0 900

11 10 - 1000

CÁLCULO DAS VELOCIDADES ESPECÍFICAS

1. Velocidade específica de crescimento microbiano

A determinação da velocidade específica de crescimento é feita com

base na seguinte equação:

Onde:

X = concentração celular (g/L)

AUTOCLAVE

Coloca-se água na autoclave até cobrir a serpentina. No cesto, acomoda-se o

material a ser esterilizado, fechando o aparelho. Liga-se, com a chave seletora no

máximo e a válvula de segurança totalmente aberta. Com o início de saída do vapor,

fecha-se a válvula e espera-se a autoclave atingir a pressão de trabalho, 1,1 atm

(manométrica). Ajusta-se a chave seletora para o “médio” e conta-se o tempo de

esterilização. Passado este tempo, desliga-se a autoclave e abre-se a válvula de

segurança. Após saída total do vapor e com o aparelho frio, abre-se e retira-se o material

esterilizado.

Em todos os demais procedimentos, o manuseio dos materiais é feito sempre por

trás da chama do bico de Bunsen, de preferência em câmara de fluxo laminar.