Unitermos: lesiio de isquemia reperfusiio, endotilio, oxido nitrico, musculoesquelitico.
-DISFUNCAO ENDOTELIAL NAISQUEMIA EREPERFUSAO DOMUSCULO ESQUELETICO.
Os mecanismos das oclusoes arteriais relacionam-se, com certeza, afunvao doendotelio vascular, que e profundamente afetada pela isquemia seguida de reperfusao sangtifnea. A chamada "Iesao de isquemia reperfusao" e urn fenomenouniversal e de extremo interesse, haja vista a existencia de incontaveis investigavoes sobre 0 fenomeno. Como esta lesao parece estar mais relacionada com areperfusao, cria-se um impasse fisiopatologico, qual seja, criar-se urn novo problema serio apos a renutrivao aerobica de urn determinado tecido ou orgao.Os mecanismos da "lesao de isquemia reperfusao" relacionam-se com uma disfunvao endotelial que, entre outros processos biofarmacologicos, deve-se adiminuivao da produvao de oxido nftrico (NO) ou com a diminuivao da sua biodisponibilidade, submetendo os vasos sangtimeos ao risco de espasmo e trombose.A motivavao do presente texto foi a de revisar os conceitos relacionados com adisfunvao endotelial dependente do NO, apos isquemia seguida de repelfusao demusculo esqueletico. Esta revisao incluiu: 1) Aspectos gerais da lesao de isquemia reperfusao; 2) Aspectos especfficos da lesao de isquemia reperfusao domusculo esqueletico; 3) A via de liberavao endotelial do NO e a hipotese dadisfunvao endotelial por comprometimento da transduvao de sinal pelas G-protemas; 4) A experiencia laboratorial da Faculdade de Medicina de Ribeirao PretoU.S.P. e; 5) As possibilidades de modificavao da lesao de isquemia reperfusao domusculo esqueletico.
A s causas de oclusoes art~riais
agudas associadas a lesao dereperfusao em extremidades co
mumente relatadas sao: 0 embolismo arterial, a trombose aguda, a trombose deenxertos ou proteses arteriais, 0 pinvamento de arterias principais ou tronculares durante cirurgia reconstrutiva, a canulavao arterial durante circulavao extracorporea e 0 trauma arterial. 0 conceitode oclusao ou interceptavao do fluxo arterial foi apresentado, ja em 1628, porWilliam Harvey. No seculo seguinte, em1798, John Hunter, propos a embolectomia como procedimento para restauravao
CIR VASC ANGIOL: 17: 49-58
do fluxo sangtifneo. Cento e quarentaanos mais tarde Labey, pela primeira vez,executou este procedimento com exito 19.
20. A evoluvao clfnica e determinada parvanos fatores dentre os quais podemosdestacar 0 numero, a extensao e 0 nfvelda oclusao arterial. Alem destes, a duravao e a extensao do envolvimento de arterfolas e venulas intramusculares associadas ao tempo de reconhecimento eintervenvao, sao de importancia vital.Os mecanismos das oclusoes arteriaisrelacionam-se, com certeza, afunvao doendotelio vascular, que e profundamente afetada pela isquemia seguida de re-
Edwaldo E. JovilianoMedico-assistente e P6s-graduando da Disciplina de CirurgiaVascular Periferica.
Fernanda ViaroBiomedica do Laborat6rio de Fun9ao Endotelial da Divisao de Cirurgia Experimental.
Jesualdo CherriProfessor-doutor em Cirurgia e
Chefe da Disciplina de CirurgiaVascular Periferica.
Takachi MoryiaProfessor-doutor em Cirurgia e 00cente da Disciplina de CirurgiaVascular Periferica.
Carlos E. PiccinatoProfessor-associado e Docente daDisciplina de Cirurgia Vascular Periferica.
Paulo Roberto B. EvoraProfessor Livre-docente em Cirurgia Toracica e Cardiovascular eCoordenador do Laborat6rio deFun9ao Endotelial da Divisao deCirurgia Experimental.
Trabalho realizado no Laborat6riode Fun9ao Endotelial da Divisaode Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina deRibeirao Preto -USP
Apoio FAPESP - Funda9ao deAmparo aPesquisa do Estado deSao Paulo
Rua Rui Barbosa, 367. Apt. 714015-120 Ribeirao Preto, SP.E-mail: [email protected]
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DISFUNyAO ENDOTELIAl NA ISQUEMIA E REPERFUSAO DO MUSCUlO ESQUElETICO. EDWALDO E. JOVILIANO E COlS.
Figura 1:. Agonistas e seus locais de agao. AOP = adenosina difosfato; R = receptor demembrana; Gp = G-proternas; PL-C = fosfolipase C; PIP2 = fosfatidilinositol 4,5-bifosfato;IPs = inositoltrifosfato; OAG = diacilglicerol; ecNOS = 6xido nrtrico sintetase endotelialconstitutiva.
ASPECTOS GERAIS DA LESA.O DE ISQUEMIA REPERFUSA.O
cionaram-se, entao, no sentido de determinar como 0 endotelio produz 0 radical,e, culminaram com a proposi<;ao de Palmer e colaboradores 32, que postularamser a L-arginina a fonte de NO sob a a<;aode uma enzima, a oxido nftrico sintetase.Alem da atua<;ao original na musculaturalisa, como originalmente descrito, 0 NOtambern atua de maneira importante namusculatura esqueletica. Fisiologicamente 0 NO regula a contratilidade do musculo esqueletico e 0 consumo de glicoseinduzido pelo exercfcio. A enzima ecNOSsitua-se ao nfvel de membrana no musculo esqueletico, a qual facilita a difusaodo NO para a vasculatura atuando na regula<;ao da perfusao muscular 4.
A motiva<;ao do presente texto foi a derevisar os conceitos relacionados com adisfun<;ao endotelial dependente do NO,apos isquemia seguida de reperfusao demusculo esqueletico, uma vez que, umamelhor compreensao da patofisiologiadeste evento, desde seu inicio, pode resultar em oportunidades de aprimoramento das interven<;6es terapeuticas.
MusculoLiso
CelulaEndotelialCa++ CALMODULINA
YOXIDO
L-ARGININA ----+~NITRICO
Reticuloendoplasrruitico
!on%ro/do cdlcio
citoplasma
membrnna.
perfusao sangiifnea. A chamada "lesaode isquemia reperfusao" e urn fenomenouniversal e de extremo interesse, haja vista a existencia de incontaveis investiga<;6es sobre 0 assunto. Como esta lesaoparece estar mais relacionada com are:perfusao, cria-se urn impasse fisiopatologico, qual seja, criar-se urn novo problema serio apos a renutri<;ao aerobicade urn determinado tecido ou orgao.Considera-se 0 endotelio, na atualidade,como urn orgao que exerce imimeras fun<;6es metabolicas, participando da regula<;ao do tono vascular. Esta regula<;aoutiliza variados mecanismos (metabolicos, miogenicos e neuroendocrinos), existindo, na verdade, uma importante intera<;ao entre todos esses mecanismos.Furchgott & Zawadski II, descobriram
urn fato que durante muitos anos foi urngrande enigma da farmacologia: 0 porque da acetilcolina em algumas situa<;6esser urn vasoconstritor e em outras agircomo urn vasodilatador. A simples verifica<;ao de que a acetilcolina so age comovasodilatador na presen<;a do endotelioiniciou uma era de intensos trabalhos nadecada de 80, a qual estabeleceu 0 endotelio como a sede do desencadeamentoda maioria das doen<;as cardiovasculares. Postulou-se, entao, a existencia deurn fator relaxante derivado do endotelio, que em 1982 foi denominado de "endothelium-derived relaxing factor" EDRF. Apos as proposi<;6es independentes de Furchgott 12 e Ignarro e colaboradores 17 de que 0 EDRF era 0 oxido nftrico (nitric oxide - NO), as pesquisas dire-
Ebern reconhecido que a isquemia podeinduzir morte celular e necrose tecidual,o que e evidentemente secundario afaltade energia 38. Muitos estudos tern mos
trado que a lesao tecidual em determinados orgaos ocorre nao somente duranteo perfodo de isquemia, mas tambem noperfodo de reperfusao. Este evento desencadeia uma serie de fen6menos deleterios como 0 edema celular, 0 aumentoda permeabilidade na microcircula<;ao, aprodu<;ao de radicais livres pelas celulasisquemicas, a degrada<;ao de fosfolfpidesde membrana, e ainda 0 fenomeno do "noreflow". Historicamente quatro teoriastern sido descritas para explicar esse fenomeno. A primeira hipotese e a de queo edema intersticial, 0 edema celular, ou
o CIR VASC ANGIOL: 17:49-58
DISFUN2AO ENDOTELIAl NA ISQUEMIA E REPERFUSAO DO MUSCUlO ESQUElETICO. EDWAlDO E. JOVILIANO E COlS.
Figura 2: Meeanismo proposto para 0 eomprometimento da vasodilatat;ao dependente doendot€ilio ap6s lesao de reperfusao. Existem dois loeais que podem ser eomprometidos pelareperfusao: a via de transdut;ao do sinal entre 0 reeeptor(R) e a fosfolipase C(PLC) e a viaque ativa 0 influxo extraeelular de ealeio para manter a produt;ao de 6xido nftrieo(NO). PIP
2= fosfatidilinositol 4,5-bifosfato; IP
3= inositoltrifosfato; DAG = diaeilglieerol.
ambos podem causar compressao vascular de arterias e arteriolas, comprometendo 0 fluxo sangtiineo normal 43. Outrateoria seria a de que 0 decrescimo no fluxo poderia resultar da piora da autoregula~ao, ou ainda, uma auto-regula~ao inapropriada causada pelo decrescimo nademanda metab6lica do tecido p6s-isquemico. A terceira ideia e a de que alesao da musculatura lisa vascular alteraria 0 tono deteriorando a capacidadede relaxamento em resposta aos mecanismos normais. Finalmente, a piora naprodw~:ao de fatores relaxantes derivadosdo endotelio (EDRF), prostaciclinas, ouambos poderia diminuir 0 fluxo sangtiineo vascular pelo aumento no tono arterial 22.
As celulas endoteliais sao particularmente sensiveis areperfusao. A lesao resultante desse processo e manifestada peloaumento da permeabilidade e pela perdada vasorreatividade dependente do endotelio. Intera~6es entre os elementos
/.lIII---:'-.~Calmodulina
de isquemia e reperfusao produz alteras:6es estruturais e funcionais semelhantes a aquelas encontradas em tecidosp6s-isquemicos 5. 0 tratamento comsubstancias que limitam a produs:ao deoxidantes, ou mesmo que efetivamenteeliminem sua as:ao ("scavenger") ap6ssua produs:ao, atenua a lesao da isquemia-reperfusao 13. A geras:ao de especies reativas de oxigenio durante a reperfusao pode contribuir diretamente na patogenese da isquemia-reperfusao, modificando por oxidas:ao a estrutura dasbiomoleculas encontradas nos tecidos,provocando alteras:6es na funs:ao celular I.
Outro aspecto a ser considerado e a interas:ao dos neutr6filos com as celulas endoteliais na reperfusao tecidual. Os neutr6filos tern sido implicados como urn mediador fundamental no mecanismo delesao. Uma vez ligados asuperficie endotelial, os neutr6filos aceleram a disfuns:ao celular alem de causar destruis:ao tecidual atraves de vanos mecanismos citot6xicos, que incluem a produs:ao desubstancias deleterias como radicais deoxigenio, enzimas citot6xicas, e citocinas18. Muitas dessas substancias tambernrecrutam leuc6citos adicionais com adesividade acentuada ao endotelio vasc'ular. Esses eventos nao sao restritos asuperficie da celula endotelial. Com les6es mais severas os neutr6filos infiltramos tecidos envolvidos onde enzimas eradicais de oxigenio podem causar danatecidual. Os neutr6filos sao fontes importantes de per6xido de hidrogenio eanions super6xidos, os quais inativam 0
NO e contribuem para a formas:ao de per6xinitrito; esse podendo desencadear aperoxidas:ao de fosfolipides de membrana e a inativas:ao de uma serie de enzimas28. Os fatores responsaveis pela interas:ao entre os neutr6filos e as celulas endoteliais sao complexos e somente parcialmente compreendidos. A adesao dosneutr6filos ao endotelio vascular e medi-
NO
Ca2+
/
sangtiineos e 0 endotelio vascular saoresponsaveis pela injuria tecidual. A observas:ao, de que a reintrodus:ao molecular do oxigenio na reperfusao e necessaria para produzir lesao celular p6s-isquemica e a disfuns:ao, e consistente com 0
ponto de vista de que a lesao decorrenteda isquemia-reperfusao pode resultar daformas:ao de radicais de oxigenio. Muitos estudos suportam esse conceito esao baseados em algumas evidencias. Aprodus:ao de substancias oxidantes emtecidos p6s-isquemicos pode ser detectada pelo uso de espectroscopia de ressonancia do spin eletron (eletron spinresonance-ESR) 29. A demonstras:ao que,produtos de oxidas:ao, derivados de peroxidas:ao lipidica (malondialdeido, hidroxiper6xidos lipidicos, etc.) sao formadosem tecidos p6s-isquemicos, tambem ternsido utilizado como evidencia da produ~ao de radicais durante a reperfusao 26.
A exposis:ao de tecidos a oxidantes ex6genos gerados em sistemas na ausencia
Proteina Proteina(inativa) (ativa)
NO sintetaseL-Arginina
PIP2Citoplasma
ReticuloEndoplasmatico
IR VASe ANGIOL: 17:49-58 51
DISFUN2Ao ENDOTELIAL NA ISQUEMIA E REPERFUsAo DO MUSCULO ESQUELETICO. EDWALDO E. JOVILIANO E COLS.
Ach(-logM)___ controle/E+ -.- 190R60/E+
____ Isquemia120/E+ --.- 1120R90/E+
Figura 3: Curvas dose-respostas a aceti/colina g(10'9 a 10'4 M) em arterias femorais caninas com endotelio(E+) contrafdas com norepinefrina 10'6M na presen9a de indometacina 10'5M. Resultados foram expressos em porcentagem sob a forma de medias ± erros-padr6es(N=6).
456
colaboradores 42 observaram, em umaserie de experiencias com caes, que anecrose do musculo esqueletico ap6s 5horas de isquemia total pode ser reduzida controlando-se 0 fomecimento de oxigenio no perfodo de reperfusao. 0 efeitobenefico de uma hemodilui~ao aumentaquando sao ministrados varredores deradicais Iivres. Em urn modele de oclusaoa6rtica infr"a-renal temporaria no rato,Perry & Fantini 34 notaram que a super6xido dismutase impede a progressao dadisfun~ao da membrana celular se administrada simultaneamente arestaura~ao
do fluxo sangiifneo a6rtico. Recentemente, Grisotto e colaboradores 15 demonstraram tambem que, depois de uma isquemia total de 3 horas(tomiquete), pode-seobservar sinais de lesao de fosfolipidesde membrana e pouca ou nenhuma altera~ao oxidativa, e que, depois de 45 minutos de reperfusao, altera~6es oxidativas de componentes lipoproteicos da
789
0 0...s:::G) 20ECO>< 40CO-G)'-G) 60"C
~800
100
rancia do tecido especffico ahip6xia e adura~ao da interrup~ao circulat6ria, como
tambem de altera~6es locais que prejudicam a restaura~ao de urn fluxo sangiifneo normal depois da corre~ao das causas precipitantes 31. Seria 0 fenomeno do"no reflow'" anteriormente descrito.Varios estudos sugerem que curtos perfodos de isquemia podem causar lesaocelular que pode nao ser evidente quando se examina a fun~ao global por sistema organico. Por exemplo, demonstrouse que a oclusao a6rtica temporaria empacientes submetidos a cirurgia vascular deterrnina altera~6es metab61icas nomusculo esqueletico das pernas, queduram pelo menos 16 horas 9. Perry e associados demonstraram, em dois estudosexperimentais em caes, que 3 horas deisquemia parcial resultam em uma disfun~ao duradoura da membrana celular, quee maior do que 3 horas de isquemia comtomiquete 33. Posteriormente, Walker e
ASPECTOS ESPECfF!COS DA LESAODEISQUEMIAREPERFUSAONOMUSCULOESQUELEnCO.
Ate 0 final da decada de 80, a lesao dereperfusao do musculo esqueletico foiestudada do ponto de vista metab61ico,ja se ressaltando a importancia dos radicais livres na sua fisiopatologia. A partirda identifica~ao do NO, como sendo 0
EDRF, as pesquisas sobre a fun~ao endotelial aumentaram em ritmo vertiginoso.Ediffcil avaliar a tolerancia das extremidades aisquemia porque algumas celu- •
las sao mais susceptfveis, provavelmente como resultado de diferen~as nas necessidades de oxigenio. Por exemplo, osnervos e musculos perifericos tern umaresistencia relativamente menor aisquemia do que a pele e parece que a pele e 0
tecido subcutaneo sao capazes de sobreviver a perfodos de hip6xia que naoserao tolerados pelo musculo esqueletico ou pelos nervos perifericos 30. Ha urn
volume consideravel de evidencias sugerindo que 0 resultado final de urn perfodo de isquemia depende nao s6 da tole-
ada pela adesao de complexos de glicoprotefnas, ambas na superffcie dos neutr6filos e na superffcie da cHula endotelial. Muitos fatores influenciam a expressao dessas glicoprotefnas, regulando acapacidade de conexao entre as celulas.o complexo glicoproteico de adesao dosneutr6filos, ou complexo CDll/CD18,atua mediando distintas intera~6es 8. Aexpressao do complexo CDll1CD18 nasuperffcie do neutr6filo e induzida parradicais super6xidos 35 e e inibida peloNO. Ap6s isquemia-reperfusao, a abundancia de super6xidos combinado com adiminui~ao da produ~ao de NO aumentaa expressao na superffcie celular do neutr6filo do complexo de adesao CDIIICD18, aumentando a afinidade do neutr6fJlo pela celula endotelial.
2 CIR VASC ANGIOL: 17:49-58
DISFUNCAO ENDOTELIAL NA ISQUEMIA E REPERFUSAO DO MUSCULO ESQUELETICO. EDWALDO E. JOVILIANO E COLS.
Figura 4: Curvas dose-respostas ao fluoreto de sodio (0.5 a 9.5 mM) em arterias femoraiscaninas com endotelio(E+) contrafdas com norepinefrina (106M) na presenya de indometacina (105M). Resultados foram expressos em porcentagem sob a forma de medias ±
erros-padr8es (N=6).
Existe hoje uma serie de eventos que participam de uma cascata de formac;ao doNO. Tomando-se como, por exemplo, 0
relaxamento dependente do endotelio, induzido pela acetilcolina, simplificadamente 0 processo assim ocorreria: a acetilcolina estimula urn receptor muscarfnico, libe
ra NO que se difunde para a musculaturalisa vascular, provocando urn aumento doGMP cfclico com vasodilatac;ao. Esta eapenas uma visao parcial, ja que 0 processo e urn pouco mais elaborado, envolven
do urn sistema de transduc;ao com mensageiros secundarios que incluem G-protefnas, as quais fazem a conexao com a viafosfatidilinositol que, por sua vez, mobiliza 0 calcio intracelular necessario para aformac;ao do 6xido nftrico, a partir da Larginina pela ac;ao da 6xido nftrico sintetase. 0 sistema envolvido na liberac;ao doNO pode ser estudado pela utilizac;ao deseus agonistas e receptores. (Figura I)No caso especffico do estudo no endotelio vascular, investigadores tern sugerido que receptores da celula endotelial saoligados com a produc;ao e liberac;ao doNO atraves de G-protefnas. Estudos anteriores realizados por Evora e colaboradores 10 evidenciaram urn possfvel mecanismo de comprometimento seletivo daliberac;ao do NO mediada por receptorap6s isquemia global e reperfusao docorac;ao. Acresc;a-se ao fato de que as G-
A VIADELIBERAc;AOENDOTELIALDO OXIDO NfrRIco EA HIP6TESEDADISFUNc;AO ENDOTELIALPOR COMPROMETIMENTO DA TRANSDUc;AoDO SINAL PELAS G-PROTEINAS
presente estudo ap6iam a hip6tese deque, na verdade, ocorreria uma menorproduc;ao do NO, dependente de umadisfunc;ao seletiva de mecanismos dependentes de receptores de membranada celula endotelial, ou uma maior destruic;ao de NO, pela participac;ao do estresse oxidativo 14.
9.57.5
-.- 190R60/E+
-'-1120R90/E+
36. Se os dados obtidos com ratos foremvaIidos para comparac;oes com 0 modelocanino, pode-se inferir que no caso dalesao de isquemia e reperfusao do musculo esqueletico, a disfunc;ao endotelialprecede a lesao celular.Trabalhos anteriores, com outros modelos experimentais com isquemia total, jademonstravam uma disfunc;ao endotelialassociada a reperfusao 6, porem os mecanismos farmacol6gicos envolvidos noevento permaneciam sem esclarecimento. A discussao basica consistiu em seatribuir como causa dessa disfunc;ao,uma maior destruic;ao do NO normalmente produzido. Porem, esta teoria nao ecompatfvel com achados recentes de quena isquemia-reperfusao do musculo esqueletico ocorre uma diminuic;ao na concentrac;ao de metab6litos derivados doNO, como os nitritos e nitratos 3. Efato,que anions super6xidos podem destruiro NO, mas os resultados encontrados no
3.5 5.5NaF(mM)
1.5
-e-controle/E+
---Isquemia120/E+
0.5
5090r100
o -10...s:::CU
~ 10><CO-e 30CU"C
'if!.
membrana celular puderam ser constatados.Esses estudos sugerem que 0 musculoesqueh~tico e sensfvel a lesao por radicais livres derivados do oxigenio, comofoi demonstrado no intestino, no rim eno corac;ao. Alem do mais, parece que aisquemia parcial, geralmente 0 caso napnitica clfnica de cirurgia vascular, e capaz de lesar a celula e que, em algunscasos, essa lesao e mais grave do que acausada pela isquemia total.A adesao leucocitaria no musculo esqueletico de ratos submetidos a 90 minutosde isquemia com 0 pinc;amento a6rtico e60 minutos de reperfusao foi demonstrada por Kishi e colaboradores 21. Outrosautores encontraram danos mfnimos (2%)no musculo esqueletico de caes submetidos a isquemia total de 3 horas, lesoesmoderadas (30, I %) com 4 horas de isquemia, porem, lesoes graves (90%) nogrupo submetido a isquemia de 5 horas
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DISFUN2Ao ENDOTELIAL NA ISQUEMIA E REPERFUsAo DO MUSCULO ESQUELETICO. EDWALDO E. JOVILIANO E COLS.
Nitroprussiato de Sadio, 10·sM
Figura 5: A90es do nitroprussiato de sodio (1o-SM) administrado em banho organico, napresen9a de indometacina, em aneis com e sem endotelio. Os asteriscos indicam quehouve diferen9a estatfstica significante entre os aneis com e sem endotelio do IV e osdemais grupos (P<O.05).
proteinas sao mediadores de muitas vias
dependentes de receptores. Estes estu
dos sugerem que a isquemia global e re
perfusao do miocardio pioram a produ
~ao de NO devido a mecanismos demembrana, mas nao afeta a capacidade
da ceIula endotelial em produzi-Io a partir
da L-arginina. Em outras palavras, os
mecanismos intracelulares da produ~ao
de NO pela celula endotelial parecem pre- ~
servados na lesao de isquemia global
seguida de reperfusao. Existem eviden
cias da importincia das G-proteinas tam
bern no mtisculo esqueletico. Liu e cola
boradores 27 relacionaram em seu estudo
a possivel disfun~ao de G-proteinas no
endotelio do mtisculo esqueletico com a
deteriora~ao da resposta vasodilatadora
a acetilcolina, em ratos hipertensos ou
normotensos com ingestao cronica de
NaCI em nlveis elevados (Figura 2).
Considerando-se 0 papel dos calcios in
tra e extracelulares na sintese do NO, Como ja foi mencionado, a celula endo-
AEXPERIENCIA LABORATORIAL DA
FACULDADEDEMEDICINADERIBEI
RAOPRETO- USP.
fatidilinositol, pode-se inferir a importin
cia deste mecanismo para a eleva~ao ini
cial do calcio intracelular associada com
a produ~ao do NO 25, isto pode explicar a
atenua~ao da sua libera~ao dependente
do endotelio ap6s a reperfusao coronari
ana, e finalmente; 3) A G-proteina asso
ciada com 0 canal de caIcio na membrana
celular pode estar disfuncional, deven
do-se levar em conta este fato no com
prometimento do relaxamento dependen
te do endotelio mediado por receptores
ap6s a reperfusao coronariana. 0 calcio
extracelular e necessario para 0 relaxa
mento normal dependente do endotelio,
eo ion fluoreto e urn ativador especffico
de uma G-protefna associada ao canal de
calcio presente na membrana da celula
endotelial. Logo, pode-se inferir que 0
comprometimento do relaxamento depen
dente do endotelio a agonistas que agem
atraves de receptores, ap6s a reperfusao,
deve-se a uma atenua~aodo influxo ex
tracelular do calcio necessario para a pro
du~ao continua de NO. Outros autores
constataram urn decrescimo de niveis de
nitritos e nitratos, metab6litos do NO,
ap6s isquemia-reperfusao de extremida
des sugerindo urn decrescimo da produ
~ao do NO. 0 fato e que 0 mecanismo
exato da lesao endotelial pela reperfusao
permanece sem elucida~aocompleta, pro
vavelmente devido a sua alta complexi
dade. A hip6tese de lesao seletiva de re
ceptores e mecanismos de transdu~aode
sinais, como, por exemplo, a disfun~ao
das G-proteinas, deve ser investigada
tambem no endotelio dos vasos segmen
tares de extremidades ja que fortes evi
dencias indicam a sua participa~ao no
mecanismo de lesao da celula endotelial
coronariana.
**
~190R60/E+
rn:m 190R60/Ernm 1120R90/E+~ 1120R90/E-
pode-se considerar como hip6teses pelo
menos tres mecanismos para 0 compro
metimento da libera~ao mediada por re
ceptor do NO ap6s a lesao de reperfu
sao: 1) Receptores da superficie da celu
la endotelial, que se Iigam a compostos
que induzem relaxamento dependente do
endotelio, podem estar lesados ou inca
pazes de ligar-se, eficientemente, a urn
agonista. Entretanto, cronicamente, ap6s
oclusao coronariana aguda, 0 relaxamen
to dependente do endotelio a alguns
agonistas dependentes de receptores e
normal, ao passo que aqueles relaxamen
tos dependentes do endotelio mediados
pelas plaquetas encontram-se compro
metidos. Com base nestes dados pode
se propor uma disfun~aoseletiva de cer
tas popula~6es de receptores na superfi
cie celular; 2) A G-proteina que liga 0
receptor da celula endotelial afosfolipa
se C pode ser disfuncional. Como a fos
folipase C promove a ativa~ao da via fos-
40
o
60
20
80
100 controle/E+c::::J controle/E~ Isquemia120/E+IZ::2Z) Isquemia120/E-
o...c:Q)
Eco><co-!Q)
"C
~o
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DISFUN9AO ENDOTELIAL NA ISaUEMIA E REPERFUSAO DO MUSCULO ESaUELETICO. EDWALDO E. JOVILIANO E COLS.
telial produz NO em resposta a uma seriede agonistas incluindo noradrenalina,histamina, ADP, trombina, fluoreto des6dio, fosfolipase C, ion6foro do calcio(A23 187), serotonina, angiotensina, prostaglandina F, ions potassio, endotelina,e estimulac;ao eletrica. Estes farmacospertencem a duas classes distintas deagonistas: agonistas dependentes de receptores - acetilcolina, ADP, serotonina,noradrenalina, e histamina - e agonistasindependentes de receptores - fluoretode s6dio, fosfolipase C, ions potassio, eion6foro do calcio (A23l87). Utilizandose alguns desses agentes farmaco16gicos foi possivel investigar "in vitro"cada passo da via de produc;ao do NOidentificando e localizando os mecanismos que sao afetados nessa fase inicialdo evento. 0 modelo empregado foi 0 deisquemia parcial e reperfusao de muscu10 esqueletico em des, obtido pelo pinc;amento a6rtico infra-renal.Recentes estudos realizados no Laborat6rio de Func;ao Endotelial da Divisao deCirurgia Experimental da Faculdade deMedicina de Ribeirao Preto - USP mos
traram alguns achados fundamentais: 1)o modelo experimental do pinc;amentoinfra-renal mostrou-se adequado e de facil padronizac;ao para 0 estudo da dis"func;ao endotelial causada pela isquemiaseguida de reperfusao da pata traseirade caes; 2) A isquemia da pata traseirapelo pinc;amento a6rtico infra-remi!, por120 minutos, nao foi capaz de causar disfunc;ao endotelial da arteria femoral; 3) Aisquemia da pata traseira pelo pinc;amento a6rtico infra-renal por 90 minutos, seguidos de urn perfodo de 60 minutos dereperfusao, tambem nao causou disfunc;ao endotelial, embora ja se observasseuma tendencia a comprometimento dosrelaxamentos dependentes do endoteliopela ac;ao do fluoreto de s6dio; 4) A isquemia da pata traseira pelo pinc;amentoa6rtico infra-renal por 120 minutos, seguidos de urn periodo de 90 minutos de
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reperfusao causou disfunc;ao, endoteliaI, constatada pela diminuic;ao da capacidade de liberar NO pelo endotelio daarteria femoral; 5) 0 mecanismo alteradoda liberac;ao do NO ocorreu ao nivel damembrana da celula endotelial, revelando urn comprometimento de receptores(Figura 3) e da transduc;ao do sinal pelasG-proteinas (Figura 4); 6) A isquemia dapata traseira pelo pinc;amento a6rtico infra-renal por 120 minutos, seguidos deurn perfodo de 90 minutos de reperfusaocausou, tambem, disfunc;ao da musculatura lisa vascular da arteria femoral (Figura 5).A ideia de que a disfunc;ao endotelial,com diminuic;ao da produc;ao de NO, pelocomprometimento da transduc;ao do sinal pela fallllua das G-proteinas, e que acelula endotelial manteria a capacidadede produzir NO, foi a principal hip6tesedesta investigac;ao. Esta hip6tese foiembasada na ja mencionada evidenciaexperimental obtida por Evora e colaboradores 10, estudando a disfunc;ao endotelial de arterias coronarianas que se segue aisquemia global miocardica seguida de reperfusao. Neste estudo, as respostas aos agonistas da via de liberac;aodo NO foram absolutamente uniformes,com comprometimento dos relaxamentosdependentes do endotelio estimuladospela acetilcolina e ADP (receptores demembrana) e pelo fluoreto de s6dio(transduc;ao do sinal pelas G-proteinas).Tambem, de modo absolutamente uniforme, os relaxamentos dependentes do endotelio estimulados pela fosfolipase C epelo ion6foro do calcio, que sao agonistas nao dependentes de receptores, foram normais. Por outro lado, constatouse uma func;ao normal da musculatura lisavascular mediada pelos sistemas GMPc(nitroprussiato de s6dio) e AMPc (isoproterenol). Quando se comparam estesdados obtidos pelo estudo da circulac;aocownariana, com os dados do estudoenvolvendo a musculatura esqueletica,
algumas diferenc;as foram observadas: a)A arteria femoral apresentou, alem da disfunc;ao endotelial, tambem uma disfunc;ao da musculatura lisa vascular quandose aumentou os periodos de isquernia(120 minutos) e reperfusao (90 minutos);b) Ao contrario da circulac;ao coronariana, observou-se uma inesperada resposta alterada ao ion6foro do calcio. A disfunc;ao da musculatura lisa pode ser facilmente explicada pelos tempos de isquernia e reperfusao, pois nos experimentos com a circulac;ao coronariana os tempos adotados foram, respectivamente, 45e 60 minutos para a isquemia global (pinc;amento da aorta) e reperfusao. Ja a diferenc;a encontrada para as respostas aoion6foro do calcio nos dois protocolosde isquemia-reperfusao, fica mais diffcilde explicar. Por este achado, seria obrigat6rio concluir-se por urn comprometimento da capacidade da celula endotelial de liberar calcio do reticulo endoplasmatico, e, consequentemente, da sua capacidade de produzir NO, a partir da Larginina. Embora, envolva especulac;ao,e provavel que 0 comprometimento daac;ao do ion6foro do calcio, esteja relacionado com 0 tipo de caes utilizados, quesao caes capturados nas ruas e, nao criados em bioterios. Alguns caes apresentaram respostas normais ao ion6foro docalcio. A resposta normal afosfolipase Creforc;a esta ideia. Talvez urn aumento donumero de experimentos, pudesse reverter esta perspectiva.Do ponto de vista experimental 0 pinc;amento a6rtico infra-renal, como metodoexperimental indutor de isquemia, ternsido utilizado em varios estudos e emvarios modelos animais, para a compreensao dos efeitos da isquemia reperfusao no musculo esqueletico. Outros modelos de estudo experimentais, utilizando-se de caes, propuseram avaliar alterac;6es metab6licas decorrentes do pinc;amento a6rtico infra-renal e da reperfusaosecundaria ao evento 40. Baue & Mac-
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D1SFUNCAO ENDOTELIAL NA ISQUEMIA E REPERFUSAO DO MUSCULO ESQUELETICO. EDWALDO E. JOVILIANO E COLS.
clerkin 2 estudaram a funs.;ao miocardicaem caes submetidos a isquemia parcial ereperfusao tambern utilizando a tecnicade pins.;amento a6rtico infra-renal. Estudos experimentais com caes demonstraram que as extremidades inferiores saoresponsaveis por consumir 6% do debito cardiaco antes do pins.;amento a6rtico,0,6% durante 0 pins.;amento, e 24% ap6surn pins.;amento de 4 horas 37.
POSSIBILIDADES DE MODIFICA<;AODA LESAO DE ISQUEMIA REPERFUSAO DO MUSCULO ESQUELETICO.
oprocesso bioquimico normal dentro dascelulas metabolicamente ativas resulta naformas.;ao de radicais livres de oxigenio.Para se proteger dos efeitos adversosdestes produtos metab6licos, as celulasproduzem uma serie de seqiiestradores eantioxidantes tais como: glutationa, glutationa peroxidase, catalase e a super6xido dismutase. Portanto, tais elementos eo manitol podem atuar no processo deprevens.;ao e tratamento da lesao de reperfusao. Embora muito da as.;ao do manitol na isquemia se deva ao efeito osm6tico, e importante ressaltar a sua as.;aocomo seqiiestrador de radicais hidroxila.A hip6xia causa a redus.;ao na concentras.;ao de antioxidantes end6genos e, simultaneamente, a reperfusao ativa mon6citos, macr6fagos e neutr6filos levando aurn aumento da produs.;ao e liberas.;ao dos'radicais livres de oxigenio. De maneirasemelhante, a xantina oxidase endotelial,a ciclooxigenase, a lipooxigenase, a mitoc6ndria, 0 reticulo sarcoplasmatico e aauto-oxidas.;ao das catecolaminas, fome-
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cern fontes adicionais de radicais livres.Assim, em teoria, 0 bloqueio das reas.;6esdesencadeadas por estes elementos poderia ter urn papel na modificas.;ao da lesao de reperfusao. 0 bloqueio da xantinaoxidase pelo alopurinol tern sido testado, experimental e clinicamente, com estafinalidade. Existem evidencias de que osantagonistas do calcio, como 0 verapamil e 0 diltiazem, possam prevenir ou diminuir as conseqiiencias da lesao de reperfusao por diminuir 0 influxo celular docalcio. A habilidade da amilodipina emlimitar a lesao da celula endotelial podeestar relacionada com a formas.;ao do ionper6xinitrito. Alem disso, a via comumda NO sintetase envolve a formas.;ao decomplexos calcio-calmodulina. Assim,bloqueando-se a entrada do calcio extracelular, a arnilodipina pode diminuir a formas.;ao destes complexos, interferindo naliberas.;ao do NO que em meio rico emanions pode limitar a formas.;ao do iont6xico per6xinitrito, lirnitando a lesao tissular 39.
A modificas.;ao da lesao de reperfusaorelacionada com os neutr6filos e motivode grandes controversias. Modelos experimentais utilizando musculo esqueletico sugerem que a deples.;ao de neutr6filos reduz a severidade da lesao de reperfusao 23,24. Epreciso, entretanto, ressal
tar que a depressao neutrofilica nuncafoi demonstrada como uma maneira deprevens.;ao da lesao de reperfusao, somente diminui sua severidade. A impossibilidade dos seqiiestradores de radicaislivres em reverter a lesao mediada porneutr6filos sugere outros mecanismospara a sua citotoxicidade 18. Existem evi-
dencias experimentais de que 0 bloqueioda aderencia neutrofilica, utilizando anticorpos monoclonais, possa ser beneficapor reduzir 0 acumulo de neutr6filos quese segue a isquemia-reperfusao. Entretanto, os trabalhos nesta area, que estudam a eficacia da limitas.;ao do acumulode neutr6filos, sao extremam~nte conflitantes 41. Outros metodos de modificas.;ao da lesao de isquemia-reperfusao menos citados incluem a inibis.;ao da sintesede prostaglandinas por varios antiinflamat6rios nao ester6ides e as tentativas de preservas.;ao da funs.;ao mitocondrial.A possibilidade da utilizas.;ao de doadores de NO e da L-arginina para setentar a modificas.;ao da lesao de isquemia-reperfusao tern sido estudada emmodelos de isquemia regional ou infarto. Investigas.;6es laboratoriais sugeremque 0 NO tenha urn efeito cadioprotetor na isquemia-reperfusao, 0 que evidentemente deve ser avaliado tambemna musculatura esqueletica. Os potenciais mecanismos deste efeito incluem:o seqiiestro de radicais livres de oxige
nio, melhora da microcirculas.;ao e diminuis.;ao da interas.;ao entre leuc6citos eplaquetas com 0 endotelio.Utilizando-se de modelo com isquemiatotal estudos previos tern verificadobons resultados com 0 uso de pentoxifilina, na prevens.;ao da deterioras.;ao dorelaxamento arterial induzido pela acetilcolina no evento isquemia-reperfusao 7. Observou-se, tambem, que a concentras.;ao de NO aumenta ap6s a administras.;ao, em humanos, de heparina soba forma de bolus endovenoso 16.
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DISFUNc;:Ao ENDOTELIAl NA ISQUEMIA E REPERFUsAo DO MUSCUlO ESQUElETICO.
SUMMARY
EDWAlDO E. JOVILIANO E COlS.
ENDOTHELIUMDYSFUNCTIONINISCHEMIAREPERFUSIONOFTHESKELETALMUSCLE.
The mechanisms of the arterial occlusions link, with certainty, to the vascular endothelium function, which it is deeply affected
by ischemia following by blood reperfusion. The "ischemia reperfusion injury," is a universal target of experimental and
clinical interests have seen the existence of countless investigations about the phenomenon. As this lesion might be more
related with the reperfusion, it grows up a physiopatological dilemma, which is to create a new serious problem after the
aerobics nutrition of a certain tissue or organ.
The mechanisms of the "ischemia reperfusion injury" link with an endothelial dysfunction, which, among other biopharmaco
logical processes, it is due to the impairment of nitric oxide release (NO) or with the decrease of its biodisponibility, submitting
the blood vessels to risk of spasm and thrombosis.
The motivation of the present text was it of revising the concepts related with the endothelial dysfunction NO-dependent,
after ischemia following by reperfusion of skeletal muscle. This review includes: 1) General aspects of the ischemia reperfusion
injury; 2) Specific aspects of the skeletal muscle ischemia reperfusion injury; 3) The pathway of endothelial NO release and the
hypothesis of the endothelium dysfunction caused by impairment of the G-proteins signal transduction; 4) The Ribeiriio Preto
School of Medicine - U.S.P. laboratorial experience and; 5) The possibilities of modification of the skeletal muscle ischemia
reperfusion injury.
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