7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 1/90
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
LAÍS CRISTINA DA SILVA
Desenvolv imento e validação de um novo modelo depermeabilidade intestinal ex vivo em segmentos de jejuno de
ratos para screening de novas moléculas
Goiânia2014
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 2/90
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 3/90
LAÍS CRISTINA DA SILVA
Desenvolv imento e validação de um novo modelo de
permeabilidade intestinal ex vivo em segmentos de jejuno de
ratos para screening de novas moléculas
Dissertação de mestradoapresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúdeda Universidade Federal de Goiáspara obtenção do Título de Mestreem Ciências da Saúde.
Orientadora: Dra. Kênnia RochaRezende
Goiânia2014
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 4/90
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 5/90
ii
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúdeda Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno(a): Laís Crist ina da Silva
Orientador(a): Dra. Kênnia Rocha Rezende
Membros:
1. Kênnia Rocha Rezende - UFG
2. Francisco de Assis Rocha Neves - UNB
3. Leonardo de Souza Teixeira - Instituto de Ciências Farmacêuticas
OU
4. Stephânia Fleury Taveira - UFG
5.
Data: 29/ 09/ 2014
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 6/90
iii
Dedico este trabalho...
Á minha mãe Waldivina Maria da Silva e ao meu pai João Batista Silva (in
memoriam) que, sem dúvidas, mesmo tão distante está olhando por mim e me
guiando pelos melhores caminhos da vida.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 7/90
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus pelo dom da vida.
À minha orientadora Kênnia Rocha Rezende pela oportunidade, confiança,
amizade, paciência e incomparável dedicação na minha formação acadêmica,
como profissional e como pessoa, proporcionando o desenvolvimento deste
trabalho.
À minha família pelo apoio incondicional, principalmente à minha mãe pelo
amor e apoio, sem dúvidas a melhor do mundo.
Aos meus amigos pelo imenso apoio e pelas palavras de motivação.
Aos queridos alunos de Iniciação Científica Alisson e Taynara, sem vocês
com certeza não seria possível. A todos do grupo de pesquisa BioPK, ao Instituto
de Ciências Farmacêuticas - ICF.
A todos os professores e servidores da Universidade Federal de Goiás, o
meu sincero muito obrigada!
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 8/90
v
Tabelas, figuras e anexos
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Propriedades físico-químicas, valores de dose e concentração dos
fármacos permeados ................................................................................... 30
Tabela 2. Condições cromatográficas transferidas a partir de métodos
farmacopeicos.............................................................................................. 32
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Montagem dos segmentos intestinais de ratos no sistema MTS-
Snapwell. ....................................................................................................... 3
Figura 2. Fluxo/movimento de moléculas através de uma determinada área
(A) em um dado período de tempo (t). ........................................................... 4
Figura 3. Esquema das etapas de transferência do fármaco a partir de uma
forma farmacêutica sólida para o TGI, descrevendo os três maiores
processos (Fa, Fg e F H) que afetam a absorção do local de administração até
a circulação sistêmica, processo conhecido como biodisponibilidade. .......... 7
Figura 4. Morfologia de alguns tipos básicos de epitélio. Suas diferentes
morfologias são encontradas em diferentes partes corpo, podendo
desempenhar funções de absorção e excreção........................................... 11
Figura 5. Células epiteliais absortivas. As junções intercelulares definem a
fronteira entre as membranas apical e basal e permitem expressão de
proteínas polarizadas................................................................................... 12
Figura 6. Rotas pelas quais o fármaco pode ser absorvido. ....................... 14Figura 7. Principais estruturas que promovem a coesão entre as células. As
zônulas de oclusão (em destaque) costumam ser as junções mais apicais e
o termo "zônula" refere-se à formação de uma faixa pela junção e o termo
"oclusão" à fusão das membranas nessas junções promovendo um tipo de
vedação no espaço intercelular.................................................................... 15
Figura 8.Esquema do eletrodo EndOhm-24 snap. ..................................... 16
Figura 9. Classificação de fármacos segundo o BCS baseado nasolubilidade e permeabilidade...................................................................... 17
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 9/90
vi
Tabelas, figuras e anexos
Figura 10. Requisitos para aplicação da bioisenção à fármacos e produtos.
..................................................................................................................... 18
Figura 11. Modelo in vitro de cultura de células Caco-2 utilizado em estudos
de permeabilidade........................................................................................ 19
Figura 12. Modelo in vitro com membrana artificial PAMPA utilizado em
estudos de permeabilidade. ......................................................................... 20
Figura 13. Correlação de (A) permeabilidade PAMPA e (B) permeabilidade
celular Caco-2 com grau de absorção em humanos para medicamentos
comercializados. Esses fármacos são conhecidos por serem absorvidas
principalmente via difusão passiva. Cada ponto é a média de 3 ou mais
repetições..................................................................................................... 21
Figura 14. Aparato de permeação: Câmaras de Ussing. ............................ 22
Figura 15. Correlação entre a fração da dose absorvida em humanos (Fa%)
com a permeabilidade em humanos (in vivo) e a permeabilidade através de
jejuno de ratos (in vitro). Os números representam os seguintes compostos:
1 – inogatran, 2 – enalaprilato, 3 – atenolol, 4 – terbutalina, 5- creatinina, 6 –
metoprolol, 7 – propranolol, 8 – antipirina e 9 – naproxeno. Os compostos
10, 11 e 12 não foram informados nesta figura............................................ 24
Figura 16. Destacamento da camada seromuscular do tubo intestinal
animal. ......................................................................................................... 27
Figura 17. Monitoramento da resistência elétrica transepitelial utilizando
EVOM2. ........................................................................................................ 28
Figura 18. Representação esquemática do sistema MTS-SNAPWELL. ..... 29
Figura 19. Estruturas químicas dos fármacos em estudo. .......................... 31
LISTA DE ANEXOS
Anexo A –Parecer do Comitê de Ética ...................................................... 56
Anexo B – Confirmação de submissão do artigo ....................................... 57
Anexo C – Normas de publicação do artigo ............................................... 58
Anexo D – Cromatogramas dos fármacos testados a partir da revalidação
das metodologias farmacopeicas conforme seção 3.8. .............................. 72
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 10/90
vii
Tabelas, figuras e anexos
Anexo E – Gráficos da linearidade para os fármacos testados conformeseção 3.8 ..................................................................................................... 74 Anexo F – Gráficos da precisão e exatidão para os fármacos testadosconforme seção 3.8...................................................................................... 75
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 11/90
viii
Símbolos, siglas e abreviaturas
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BCS - Biopharmaceutical Classification System
DMSO - Dimetilsulfóxido
Fa (%) - Fração do fármaco absorvida.
FDA - Food and Drug Administration
LQ – Limite de Quantificação
PAMPA - Parallel artificial membrane permeability assayPapp - Permeabilidade aparente (cm/s)
Peff - Effective permeability
P-gp – P-glicoproteína
Peff - Permeabilidade efetiva (cm/s)
TEER- Resistência Elétrica Transepitelial
USP- United States Pharmacopeia
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 12/90
ix
Resumo
RESUMO
Os principais modelos preditivos da absorção de potenciais novos fármacos
na etapa pré-clinica são focados na mucosa gastrointestinal, haja vista apredominância desta via na administração medicamentosa. Frequentemente,
a fração absorvida (Fa) pode ser predita em modelos ex vivo em câmaras de
Ussing, in vitro em monocamadas de células Caco-2, perfusão intestinal in
situ e estudos de absorção in vivo. No presente estudo, a partir de uma
adaptação do aparato Snapwell™, um novo modelo ex vivo de avaliação da
permeabilidade para substâncias absorvidas por difusão passiva é proposto.
Substâncias de alta (metoprolol, cafeína e teofilina) e baixa (atenolol,ranitidina e cimetidina) permeabilidade, foram mantidos em incubadora à
37OC, sob agitação constante (60 rpm) e atmosfera carbogênica (5% CO2). A
viabilidade da membrana jejunal (52 ± 8,0 Ω.cm2) foi observada mantendo-
se acima de 20 Ω.cm2 por até 120 min de incubação, sob todas condições
avaliadas incluindo a adição de co-solventes (DMSO 1% e EtOH 1%). Os
valores de coeficientes de permeabilidade aparente obtidos (Papp)
mostraram-se característicos de estudos ex vivo de permeação (3,8 – 12,6
x10-6 cm/s). Forte correlação foi observada entre os dados aqui obtidos
versus dados de perfusão intestinal in vivo (r = 0,89), assim como da fração
absorvida em humanos (r = 0,85), relatados na literatura. Adicionalmente, o
modelo apresenta elevada sensibilidade e precisão frente aos demais
modelos comumente utilizados na classificação da permeabilidade de
substâncias. Em consonância, pode-se inferir que o modelo MTS-
SNAPWELL demonstra, até o momento, potencial aplicação em estudos de
screening para seleção de moléculas de baixo peso molecular, tais como
potenciais fitofármacos, assim como seus análogos sintéticos avaliados com
baixa quantidade de amostra (c.a. 10 mg).
Palavras- chave: modelo ex vivo , integridade da membrana; permeabilidade
aparente,TEER.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 13/90
x
Abstract
ABSTRACT
The main predictive models of absorption of potential new drugs in preclinical
stage are focused on the gastrointestinal mucosa, given the predominance of
this pathway in drug administration. Often, the fraction absorbed (Fa) can be
predicted in ex vivo models (p.e. Ussing chambers), in vitro (p.e. Caco-2 cells
monolayers), intestinal perfusion studies in situ and in vivo absorption. In the
present study, from an adaptation of Snapwell ™ inserts, a new ex vivo
model to evaluate the permeability of substances passively absorbed is
proposed. High permeable drugs (metoprolol, caffeine and theophylline) and
low permeable drugs (atenolol, ranitidine and cimetidine) were maintained in
an incubator at 37 ° C under constant stirring (60 rpm) and carbogenic
atmosphere (5% CO2). The viability of the jejunal membrane (52 .cm2 ± 8.0)
was observed remaining above 20 .cm2 for 120 min incubation, under all
conditions evaluated, including the addition of co-solvents (1% DMSO and
1% EtOH). Values of apparent permeability coefficients obtained (Papp) were
characteristic of ex vivo permeation studies (3.8 to 12.6 x10-6 cm / s). Strong
correlation was observed between the data obtained here versus data
intestinal perfusion in vivo (r = 0.89), as well as the fraction absorbed in
humans (r = 0.85), reported in the literature. Additionally, the model features
high sensitivity and accuracy compared to other commonly used models in
classification permeability of substances. In line, we can infer that the MTS-
SNAPWELL model demonstrates, yet, potential application in studies of
screening for selection of low molecular weight, such as potential
phytochemicals, as well as their synthetic analogues evaluated with lowamount of sample (ca 10 mg).
Keywords: apparent permeability; ex vivo model, membrane integrity;
TEER.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 14/90
xi
Sumário
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 1
1.1. Fundamentos da permeabilidade ............................................................. 3
1.4.1. Condições sink..................................................................................... 6
1.2. Absorção de fármacos pelo trato gastrointestinal..................................... 6
1.1.1. Propriedades físico-químicas dos fármacos......................................... 9
1.1.2. Aspectos morfofisiológicos do tecido epitelial .................................... 11
1.3. Mecanismos de permeabilidade de fármacos através da membrana
intestinal............................................................................................................ 13
1.4. Resistência elétrica transepitelial (TEER)............................................... 151.5. Permeabilidade segundo o BCS............................................................. 16
1.6. Métodos alternativos para determinação da permeabilidade ................. 19
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 25
2.1. Objetivo geral ......................................................................................... 25
2.2. Objetivos específicos.............................................................................. 25
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 26
3.1. Materiais, solventes e reagentes utilizados ............................................ 263.2. Equipamentos utilizados......................................................................... 26
3.3. Obtenção e preparo da membrana biológica.......................................... 27
3.4. Avaliação da viabilidade tecidual na presença de vermelho de fenol e
cafeína .............................................................................................................. 27
3.5. Avaliação da viabilidade tecidual na presença de co-solventes ............. 28
3.6. ensaio de permeabilidade ex vivoHTS-SNAPWELL.............................. 28
3.7. calculos do coeficiente de permeacao................................................... 303.8. Revalidacao dos métodos analíticos em hplc-pda.................................. 31
4. RESULTADOS ............................................................................................. 33
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................... 49
6. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 50
ANEXOS ........................................................................................................... 56
6.1. Anexo A – Parecer do Comitê de Ética .................................................. 56
6.2. Anexo B – Confirmação de submissão do artigo.................................... 57
6.3. Anexo C – Normas de publicação do artigo ........................................... 58
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 15/90
xii
Sumário
6.4. Anexo D – Cromatogramas dos fármacos testados a partir da
revalidação das metodologias farmacopeicas conforme seção 3.8. ................. 72
6.5. Anexo E – Gráficos da linearidade para os fármacos testados conforme
seção 3.8. ......................................................................................................... 74
6.6. Anexo F – Gráficos da precisão e exatidão para os fármacos testados
conforme seção 3.8........................................................................................... 75
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 16/90
1
Introdução
1. INTRODUÇÃO
As abordagens atuais para avaliação da absorção de potenciais novosfármacos em diferentes fases de seu descobrimento e desenvolvimento abrangem
vários modelos. Dentre os modelos preditivos da absorção têm-se métodos in silico
e com membranas artificiais, além de modelos ex vivo como câmaras de Ussing, in
vitro com monocamadas de células Caco-2, perfusão intestinal in situ e estudos de
absorção in vivo. Em comum, todos estes modelos visam predizer a fração do
fármaco absorvida (Fa) em humanos (CARVALHO et al., 2007).
Tradicionalmente, as plantas representam uma inesgotável fonte recursos nabusca por potenciais novos fármacos. Com cerca de um terço da flora mundial, o
Brasil encontra-se numa posição pouco expressiva diante do mercado fitoterápico
mundial. Sua parcela contabilizava, aproximadamente, 4% do total do segmento
global de U$14 bilhões de dólares em 2007. Como muitos pesquisadores acreditam
que o país deveria ser líder nesta área, pois apresenta a maior biodiversidade do
planeta, acredita-se que o Brasil deixe de gerar cerca de 5 bilhões/ano, por não
conseguir transformar sua flora em medicamentos. Explicita-se assim, sua carência
em estratégias eficazes de descobrimento e exploração racional de potenciais novos
fármacos (CARVALHO et al., 2007; MIOTO, 2010).
Para se priorizar o estudo das espécies vegetais (cerrado e pantanal), a
seleção de potenciais moléculas pode ser baseada na predição da absorção de
substâncias oriundas do metabolismo secundário das plantas. Para moléculas cujo
perfil de absorção for favorecido, a biodisponibilidade prevista é virtualmente maior,
assim como seu potencial de sucesso em estudos clínicos posteriores.
Neste contexto, há modelos de investigação da Fa, que podem viabilizar a
seleção de moléculas dentre um grupo de substâncias presentes em p.e. amostras
de extratos vegetais, baseada na classificação de sua permeabilidade (alta ou
baixa). Nas maiores empresas farmacêuticas mundiais, o uso de membranas
artificiais biomiméticas (PAMPA) representa uma estratégia consolidada. Estas
abordagens são de alta capacidade de análise (high-throughput) e apresentam boa
correlação com estudos em humanos (KANSY et al., 1998).
Experimentos de permeabilidade podem ainda ser associados a métodos in
silico (ex.: iDEA TM) gerando predições mais exatas. Softwares podem ser
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 17/90
2
Introdução
alimentados com dados de permeabilidade em Caco-2 e de solubilidade obtidos em
vários pHs. Posteriormente, as substâncias de alta permeabilidade, resultantes da
pré-seleção, podem ser avaliadas em Caco-2, uma vez que as membranas artificiais
não possuem sistemas de transporte ativo e mecanismos de efluxo como as P-
glicoproteínas (PgP). Outra linhagem de células, a MDCK permite ainda
investigações mecanísticas e avaliações de interações farmacológicas quanto a
participação das PgP no processo de absorção (REZNIK et al., 1983; BOHETS et al,
2001).
Técnicas de permeação como o modelo de saco invertido e câmaras de
Ussing são priorizadas quando há necessidade de se obter informações adicionais
com respeito ao metabolismo. Já o modelo in situ de perfusão intestinal em ratos, éuma técnica confiável na investigação do potencial de absorção combinado ao
metabolismo intestinal. Entretanto, é uma técnica morosa e, portanto, não apropriada
ao screening de grande número de candidatos. Finalmente, a absorção pode ainda
ser estimada in vivo a partir de estudos de biodisponibilidade (razão entre AUC após
administração oral comparada à intravascular) (WILSON & WISEMAN, 1954;
BOHETS et al, 2001).
Mediante o emprego destas técnicas busca-se a integração entre parâmetrosfarmacocinéticos àqueles farmacodinâmicos gerados em estudos farmacológicos
não clínicos. Estes representam aspectos chave no processo de busca de potenciais
fármacos baseados na eficácia e segurança dos mesmos, em particular, no
processo de transposição dos estudos não clínicos aos clínicos. Como amplamente
divulgado, observa-se elevada taxa de fracassos durante o desenvolvimento de
novos fármacos, sendo que a causa mais frequentemente relacionada é o mau
desempenho farmacocinético dos candidatos. Prentis e colaboradores (1988),relatam que dentre 319 candidatos a novos fármacos investigados em humanos, 198
foram retirados, sendo que 77 destes (aproximadamente 40%) devido ao perfil
farmacocinético inadequado de tempo de meia-vida, pobre absorção ou extensivo
metabolismo pré-sistêmico.
Estes fatos apontam a bioprospecção farmacocinética nos estágios iniciais de
desenvolvimento de novos fitofármacos como uma ferramenta fundamental para
fornecer informações decisivas já no início do processo de desenvolvimento de
candidatos a novos fármacos.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 18/90
3
Introdução
Neste contexto, o modelo MTS-SNAPWELL foi desenvolvido a partir de uma
adaptação do aparato de permeação Snapwell™ (Corning® Costar®, New Yor,
USA), comumente utilizado em culturas celulares, onde foram montados segmentos
de intestino de ratos (Figura 1), para avaliação da permeabilidade de substâncias.
Figura 1. Montagem dos segmentos intestinais de ratos no sistema MTS-Snapwell.
Fonte: Center of Mucosal Biology – University of Maryland/USA, Maio 2010.
Assim, este trabalho tem por objetivo desenvolver e validar o modelo ex vivo
de permeação MTS-SNAPWELL para posterior aplicação na seleção de potenciais
espécies vegetais e/ou sintéticas.
1.1. FUNDAMENTOS DA PERMEABILIDADE
A permeabilidade baseia-se na medida indireta da extensão da absorção(fração da dose absorvida) do fármaco em humanos e diretamente sobre a medida
da taxa de transferência de massa através da membrana intestinal. O transporte de
moléculas de uma solução através de uma barreira é geralmente medida pelo fluxo.
O fluxo de um soluto é definido como a massa ou número de moléculas movendo
através de uma determinada área em um determinado tempo (Equação 1)
(STEFFANSEN & NIELSEN, 2010):
Onde J é o fluxo da massa de uma substância m, movendo através de uma
determinada área A em um tempo t. O fluxo é expresso em mol cm-2min-1 ou
alternativamente em µg cm-2h-1.
(Equação 1)
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 19/90
4
Introdução
Figura 2. Fluxo/movimento de moléculas através de uma determinada área (A) em um dado períodode tempo (t).
Fonte: STEFFANSEN et al., 2010.
Este transporte de moléculas através de uma barreira pode ocorrer por
difusão ou migração, sendo que a migração de moléculas é causada por uma força
que atua em cada uma das moléculas do soluto, enquanto que a difusão é um
movimento térmico aleatório, que só ocorre mediante um transporte líquido das
moléculas na presença de um gradiente de concentração (STEFFANSEN &
NIELSEN, 2010).
A velocidade de difusão está relacionada ao coeficiente de difusão de um
soluto, uma constante relacionada às propriedades de uma dada molécula em um
dado solvente. Este coeficiente de difusão diminui à medida que o tamanho da
molécula aumenta, assim como pelo aumento da viscosidade do solvente.
O fluxo de difusão pode ser descrito pela relação conhecida como Lei de Fick,
sugerida pelo fisiologista Adolf Fick (Equação 2):
A lei de Fick descreve um fluxo (J), por um gradiente de concentração (δC),
em um plano ao longo do tempo (t) para um soluto (x) com um coeficiente de difusão
D.
O fluxo é comumente usado na área biofarmacêutica em estudos de
transporte de potenciais candidatos a fármacos e pró-fármacos através de uma
barreira, como em modelo de cultura de células ou modelos utilizando tecidos
intestinais. Para avaliação do fluxo nestes experimentos, os mesmos devem ser
conduzidos sob condições específicas como, um compartimento doador contendo
uma quantidade inicial de um fármaco em um volume definido, uma barreira com
(Equação 2)
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 20/90
5
Introdução
área e espessura definidas, por fim um compartimento receptor com concentração
inicial e volume definidos (JAMBHEKAR & BREEN, 2009; STEFFANSEN &
NIELSEN, 2010).
A agitação é um fator importante nos experimentos de permeação, devendo
esta ser completa nos compartimentos doador e receptor, garantindo que não haja
gradiente de concentração dentro de ambos os compartimentos, uma vez que o
único gradiente presente é através da barreira que separa os dois compartimentos.
Este fluxo, de forma simplificada, é medido por meio de coletas de amostras do
compartimento receptor em tempos pré-determinados, após a adição do fármaco no
compartimento doador (INGELS & AUGUSTIJNS, 2003; STEFFANSEN & NIELSEN,
2010).
Uma vez estabelecido o fluxo, é possível calcular o coeficiente de
permeabilidade (P), ocasionalmente denominado como Papp (aparente) ou Peff
(efetiva). Neste contexto, assumindo que o gradiente de concentração através da
barreira seja linear e constante, o coeficiente de permeabilidade pode ser calculado
simplificando a lei de Fick (Equação 3), onde assume-se que a concentração do
fármaco no compartimento doador é constante, enquanto que no compartimento
receptor, comparada com o doador, essa concentração é virtualmente zero(STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).
Como pode ser observado na Equação 3, o fluxo é proporcional ao gradiente
de concentração e a permeabilidade é uma constante que relaciona ambos.
Portanto, a permeabilidade de fármacos através de uma barreira pode ser estimada
por meio de um simples experimento de fluxo num determinado gradiente de
concentração. Os valores de permeabilidade obtidos podem ser comparados com
valores obtidos por meio de diferentes técnicas, caracterizando assim, os fármacos
em termos de permeabilidade (STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).
(Equação 3)
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 21/90
6
Introdução
1.4.1. Condições sink
Farmacologicamente, após a absorção através do epitélio intestinal, o
fármaco é rapidamente removido pelo sangue, do sistema porta. Desta forma, é
mantido um gradiente de concentração, o qual funciona como uma força motriz para
o seu transporte, esta condição é denominada condição sink (BUCKLEY et al,
2012).
De forma semelhante em modelos in vitro, as condições sink podem ser
mantidas ao longo do experimento. Para tal, deve-se garantir que o fármaco
permeado para a câmara receptora não retorne ao compartimento doador por
difusão (back difusion). Em estudos de permeabilidade, a ocorrência deste processoreverso é tida como desfavorecida quando a concentração do fármaco no
compartimento receptor não excede a 10% da concentração do inicial do mesmo, no
compartimento doador (BUCKLEY et al, 2012).
Assim, o estabelecimento das condições sink é de fundamental importância
para garantir a confiabilidade dos resultados experimentais, uma vez que as
mesmas garantem que não haja acúmulo de substância na câmara receptora
promovendo saturação do meio, o que provoca o processo de difusão de retornopara o compartimento doador. Para tal, é fundamental o desenvolvimento de
condições adequadas de agitação e meios fisiologicamente relevantes (INGELS &
AUGUSTIJNS, 2003; BUCKLEY et al., 2012).
1.2. ABSORÇÃO DE FARMACOS PELO TRATO GASTROINTESTINAL
A absorção pode ser entendida como um conjunto de processos que
conduzem ao aparecimento do fármaco na circulação sistêmica, enquanto que a
permeabilidade baseia-se indiretamente na extensão da absorção (fração da dose
absorvida e não sistêmica) do fármaco em humanos e diretamente sobre a medida
da taxa de transferência de massa através da membrana intestinal (FORSYTH et al.,
2011; CARDOT et al., 1997).
Devido à sua complexidade, o processo de absorção de fármacos pelo trato
gastrointestinal (TGI) (Figura 3) pode ser afetado por diversos fatores. Dentre estes
fatores, estão as propriedades físico-químicas das moléculas, tais como: pKa,
solubilidade, lipofilicidade, massa molecular, presença de ligações de hidrogênio,
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 22/90
7
Introdução
área superficial polar-apolar, dentre outros. Dentre os moduladores do processo de
absorção temos os fatores fisiológicos, que correspondem ao pH do TGI, trânsito
intestinal, fluxo sangüíneo, esvaziamento gástrico, dentre outros mecanismos de
absorção (AMIDON et al., 2009).
Portanto, para serem absorvidos, os fármacos devem possuir adequada
solubilidade aquosa e permeabilidade, visto que estes são os parâmetros chave que
governam o processo de absorção, pois enquanto o fármaco não se encontra em
solução, o mesmo não consegue atravessar o epitélio intestinal e, diante de uma
permeabilidade limitada, a absorção também o será (AMIDON et al., 1995;
TAVELIN, 2002).
Figura 3. Esquema das etapas de transferência do fármaco a partir de uma forma farmacêutica sólidapara o TGI, descrevendo os três maiores processos (Fa, Fg e F H) que afetam a absorção do local deadministração até a circulação sistêmica, processo conhecido como biodisponibilidade.
Fonte: GRIFFIN & DRISCOLL, 2008.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 23/90
8
Introdução
Neste contexto, a biodisponibilidade (F) pode ser definida como a fração ou
porcentagem do fármaco que atinge a circulação geral após sua administração
(LABAUNE, 1993). Segundo o FDA (2003), a biodisponibilidade indica a velocidade
e a extensão pelas quais um fármaco é absorvido, a partir de um produto
farmacêutico e torna-se disponível no local de ação. Esta depende principalmente de
três processos bastante complexos: fração absorvida (Fa), extensão da extração de
primeira passagem do fármaco pelas enzimas da parede intestinal (Eg) e extensão
do metabolismo de primeira passagem do fármaco no fígado (EH) (Equação 1)
(AMIDON et al., 1995).
F = Fa * (1 – Eg) * (1 – EH) (Equação 1)
A porcentagem do fármaco absorvido (Fa%) é o principal parâmetro
relacionado à biodisponibilidade i.e. a medida da extensão da absorção, ou seja, da
exposição do organismo ao fármaco após sua administração. A permeabilidade e a
fração dissolvida e concentração livre do fármaco no lúmen intestinal são as
variáveis chave que controlam a Fa% (AMIDON et al., 1995; STORPIRTIS et al.,
2009).
Desta forma, vários modelos não envolvendo humanos são atualmenteutilizados a fim de avaliar a permeabilidade, que é comumente apresentada como
sendo efetiva (Peff ) e/ou aparente (Papp), se diferenciando de acordo com o tipo de
modelo envolvido na sua determinação (in vitro, ex vivo, in situ e in vivo). A Peff é
determinada por meio de métodos in situ/in vivo, e pode ser calculada por meio da
equação abaixo (Equação 2) (LENNERÑAS, 2014; VOLPE, 2010):
Peff = (Cin – C out / Cout) * (Q in / 2 πrL) (Equação 2)
Onde Cin e Cout são as concentrações de entrada e saída do fármaco pelo segmento
intestinal, Qin a taxa de fluxo de perfusão e 2 πrL a área do cilindro.
Já a Papp é determinada por meio de métodos in vitro e ex vivo, podendo ser
calculada pela equação abaixo (VOLPE, 2010):
Papp = (dQ/ dt) * (C0 A) (Equação 3)
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 24/90
9
Introdução
Onde dQ/ dt é a taxa de fluxo constante, C0 é a concentração inicial do fármaco no
compartimento doador e A a área superficial efetiva.
1.1.1. Propriedades físico-químicas dos fármacos
Segundo Amidon e colaboradores (2009), as propriedades físico-químicas de
um fármaco são consideradas um dos fatores que afetam a permeabilidade e
consequentemente sua absorção, para tanto é imprescindível o conhecimento das
mesmas.
Em um trabalho publicado por Lipinski e colaboradores (2001), foi
apresentado um mnemônico chamado ‘Regra dos 5’, que é baseado em 4
parâmetros físico-químicos que são globalmente associados à solubilidade e
permeabilidade. Segundo a ‘regra dos 5’, os problemas de baixa absorção ou
permeabilidade, na sua maioria acontecem quando os compostos apresentam:
Mais de 5 doadores de ligação de hidrogênio (expresso pela soma de OHs e
NHs);
Massa molecular maior que 500 Da;
Log P maior que 5 (ou MLog P maior que 4,15);
Mais de 10 aceitadores de ligação de hidrogênio (expresso pela soma dos Ns
e Os).
Portanto, se o composto apresentar dois parâmetros fora da ‘regra dos 5’,
existe a possibilidade deste apresentar baixa permeabilidade e consequentemente
baixa absorção (LIPINSKI et al., 2001).
1.2.1.1 Coeficiente de part ição
Fundamentalmente, a lipossolubilidade de um fármaco é determinada pelo
seu coeficiente de partição entre duas fases imiscíveis, sendo um a água ou tampão
aquoso e a outra um solvente orgânico (JAMBHEKAR & BREEN, 2009).
Após sua administração por via oral, alguns fármacos podem apresentar
baixa absorção, mesmo estes se apresentando amplamente na sua forma não
ionizada, o que muitas vezes pode estar relacionado à baixa lipossolubilidade destasespécies não ionizadas, tornando assim, de grande importância o conhecimento
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 25/90
10
Introdução
coeficiente de partição de uma molécula, uma vez que este é diretamente
proporcional à taxa de fluxo de difusão através da membrana biológica podendo
influenciar diretamente na sua absorção pelo trato gastrointestinal (JAMBHEKAR &
BREEN, 2009).
1.2.1.2 Massa molecular e o processo de absorção
Muitos fármacos que possuem elevada massa molecular podem apresentar
baixa absorção. A massa molecular influencia diretamente na habilidade dos
fármacos em atravessar as membranas biológicas, i.e., quanto maior sua massa
molecular, mais difícil se torna sua passagem através da membrana, uma vez que o
transporte mais comum neste processo é a difusão passiva (KESTER et al., 2012;FLORENCE & ATTWOOD, 2006).
Em uma pesquisa realizada por Lipinski e colaboradores (2001), observaram
que, em universo de 2000 fármacos, cerca de 11% possuíam massa molecular
acima de 500 Da e 8% acima de 600 Da e o restante estando abaixo de 500 Da,o
que reflete que, moléculas de massa molecular elevada são menos susceptíveis de
serem absorvidas por via oral do que moléculas de massa molecular moderada
(FLORENCE & ATTWOOD, 2006).
1.2.1.3 Número de aceptores e doadores de ligação de hidrogênio
Outro fator que pode afetar a absorção de moléculas são as pontes de
hidrogênio, ao passo que, a grande quantidade destas nas moléculas, pode
prejudicar sua penetração através da membrana. Este fato pode estar relacionado à
alta dessolvatação da água, assim como interações desfavoráveis do hidrogênio
polarizado com cadeias alifáticas laterais de ácidos graxos presentes no interior da
membrana (ALEX et al., 2011).
As ligações de hidrogênio além de afetar o transporte de moléculas através
da membrana, também afeta a distribuição dos fármacos para dentro do sistema
biológico, muitas vezes reduzindo a solubilidade aquosa de tal forma a resultar em
propriedades farmacocinéticas desfavoráveis (KUBINYI, 2001).
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 26/90
11
Introdução
1.1.2. Aspectos morfofisiológicos do tecido epitelial
O epitélio pode ser classificado morfologicamente por três aspectos: quanto
ao número de camadas celulares, forma das células e presença de especializações
de superfície apical, como queratina e cílios (Quadro 1) (STEFFANSEN & NIELSEN,
2010).
Quadro 1. Classificações do epitélio. Este pode ser classificado quanto ao número de camadas, forma ouespecializações celulares. Frequentemente um epitélio será descrito com uma combinação destes termos.
Número de camadas
celularesFormas celulares Especializações
Plano e irregular: epitélio
escamoso
Cubóide: epitélio cubóide1: epitélio simples
> 1: epitélio estratificadoColunar alto: epitélio
colunar
Cílio apical: epitélio ciliado
Queratina na camada
apical: epitélio
queratinizado
*Fonte: Adaptado de STEFFANSEN et al., 2010.
De uma maneira geral, o epitélio simples, normalmente desempenha funçõesde absorção e excreção, enquanto que o epitélio estratificado possui função de
proteção. Suas diferentes morfologias são encontradas em diferentes partes do
corpo (Figura 4). O epitélio escamoso simples é frequentemente encontrado nas
vias aéreas, nas cavidades do corpo e vasos sanguíneos, permitindo o transporte
passivo de líquidos e gases entre os diferentes compartimentos. Já epitélio cubóide
é geralmente encontrado nos canais e tubos dos rins e glândulas. Por fim, o epitélio
colunar é encontrado em locais de alta absorção, como no intestino delgado(STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).
Figura 4. Morfologia de alguns tipos básicos de epitélio. Suas diferentes morfologias são encontradasem diferentes partes corpo, podendo desempenhar funções de absorção e excreção.
Fonte: Adaptado de STEFFANSEN et al., 2010.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 27/90
12
Introdução
Com base na resistência do fluxo paracelular de água e soluto, o epitélio
possui junções que podem ser classificadas funcionalmente como estreitas ou
frouxas. O cólon e os canais de coleta dos rins, tipicamente possuem junções
estreitas onde a absorção de água e sais são transcelulares. Já o intestino delgado
e o tubo proximal dos rins são exemplos de junções frouxas em que o transporte de
substâncias é paracelular (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; STEFFANSEN &
NIELSEN, 2010).
Tanto as junções estreitas quanto as frouxas, são junções intercelulares,
diferenciando apenas quanto à sua permeabilidade. Essa diferença é o que
determina sua resistência elétrica, sendo que as junções frouxas apresentam valores
de resistência elétrica transepitelial abaixo de 200.cm2, enquanto que as junçõesapertadas apresentam valores de resistência acima deste (MARRERO et al., 1998).
1.1.2.1. Células epiteliais e junções celulares
As células epiteliais promovem uma barreira entre o corpo e seu ambiente
externo. As junções estreitas e a expressão de proteínas polarizadas contribuem
para que as células sejam capazes de permitir uma passagem controlada de água,
nutrientes e produtos residuais, mantendo assim o ambiente intracelular estável
(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; STEFFANSEN & NIELSEN, 2010). As células
epiteliais absortivas estão representadas a seguir na Figura 5.
Figura 5. Células epiteliais absortivas. As junções intercelulares definem a fronteira entre asmembranas apical e basal e permitem expressão de proteínas polarizadas.
Fonte: http://www.sobiologia.com.br
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 28/90
13
Introdução
As células epiteliais estão conectadas por junções intercelulares pela
extremidade apical, podendo ser classificadas funcionalmente como junções de
comunicação, desmossomos, integrinas, dentre outros. Existem três diferentes tipos
de domínios de membrana: membrana plasmática apical, lateral e basal. As duas
últimas são normalmente classificadas em conjunto, denominada membrana
basolateral (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).
As células epiteliais mantêm-se na membrana basal, por uma rede de
proteínas/polissacarídeos filamentosos e pelo tecido conectivo subjacente. A
permeabilidade passiva das junções estreitas e células epiteliais são os fatores que
determinam a função barreira do epitélio, assim como as propriedades da barreira
seletiva das células, a qual é determinada pela extensão do transporte de proteínas(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).
As junções estreitas constituem uma barreira para a difusão de moléculas,
assim como uma barreira para difusão lateral das proteínas da membrana para
dentro da mesma. Um padrão de expressão de proteínas de membrana polarizada
é mantido pelas células epiteliais, possibilitando o transporte vetorial de água e
nutrientes. Adicionalmente, o tecido epitelial apresenta algumas importantes
especializações denominadas microvilosidades, que são pequenas projeções damembrana plasmática, que aumentam significativamente a superfície da área de
absorção (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).
1.3. MECANISMOS DE PERMEABILIDADE DE FARMACOS ATRAVES DA MEMBRANA
INTESTINAL
O intestino delgado é dividido em três partes: duodeno, o jejuno e íleo. Seu
epitélio é bastante complexo e devido à presença de vilosidades e microvilosidades,cerca de 90% de toda absorção gastrointestinal ocorre no intestino delgado,
principalmente no duodeno e jejuno (CARDOT, 1997; BALIMANE et al., 2000).
O processo de absorção dos fármacos pela membrana intestinal ocorre por
um ou vários dos seguintes mecanismos (Figura 6), sendo que os mais comuns são
transporte passivo (transcelular/ paracelular) e ativo (TAVELIN, 2002).
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 29/90
14
Introdução
Figura 6. Rotas pelas quais o fármaco pode ser absorvido.
Fonte: Adaptado de SUGANO et al., 2010.
O transporte passivo ocorre a favor de um gradiente de concentração e não
requer energia, e pode ocorrer de duas formas: transcelular e paracelular. Oprocesso transcelular, ocorre com fármacos que possuem massa molecular
moderada (200-500 Da) e possuem certa lipofilicidade, assim a maior parte dos
fármacos que possuem rápida e completa absorção, são absorvidos via difusão
passiva transcelular. Já o processo paracelular, ocorre com fármacos que possuem
massa molecular relativamente baixa (em torno de 200-270 Da), relativa
hidrofilicidade, e desta forma, possuem maior afinidade pelo meio extracelular.
Geralmente, esta via resulta em absorção incompleta (TAVELIN, 2003;
LENNERÑAS & DRESSMAN, 2000).
Em oposição, o transporte ativo ocorre contrariamente ao gradiente de
concentração, o qual requer energia. Para um fármaco ser transportado por essa via,
o mesmo deve apresentar similaridade estrutural com o substrato. Porém,
encontram-se em número limitado estando frequentemente restritos às classes
terapêutica dos: antibióticos cefalosporínicos, citotásticos e inibidores da enzima
conversora de angiotensina, substratos para transportadores oligopeptídeos
(TAVELIN, 2002; LEE, 2000).
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 30/90
15
Introdução
A determinação da permeabilidade de uma substância através da membrana
gastrointestinal contribui na predição de sua biodisponibilidade. Atualmente existe
uma variedade de modelos experimentais para avaliar a permeabilidade intestinal de
candidatos a fármacos (SOUZA et al., 2007; BALIMANE et al., 2006).
1.4. RESISTENCIA ELETRICA TRANSEPITELIAL (TEER)
O epitélio apresenta duas características que distinguem as células epiteliais
de outros tecidos: polaridade e coesão. A polaridade é gerada pela distribuição
assimétrica das proteínas tanto no lado apical quanto basal da membrana celular. A
ligação das proteínas chamada “junções oclusivas ou zônulas de oclusão” (Figura 7),
separa ambos os lados da membrana enquanto sela as células adjacentes. Assim, oque determina a viabilidade e integridade do tecido é a formação e a permeabilidade
das junções oclusivas (LI et al., 2004).
Figura 7. Principais estruturas que promovem a coesão entre as células. As zônulas de oclusão (emdestaque) costumam ser as junções mais apicais e o termo "zônula" refere-se à formação de umafaixa pela junção e o termo "oclusão" à fusão das membranas nessas junções promovendo um tipode vedação no espaço intercelular.
Fonte: JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004.
Uma forma de avaliar a integridade e viabilidade do tecido é a medição doTEER. Atualmente existem aparelhos capazes de medir essa resistência, como o
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 31/90
16
Introdução
EVOM2 que foi o primeiro aparelho criado para realizar a análise de rotina do TEER
em culturas de tecido. A convergência da camada celular é determinada pelo
aumento do TEER, observado pelo eletrodo (STX2). O EVOM2 é movido à bateria,
produzindo uma corrente alternada (que evita os efeitos adversos sobre o tecido) e
uma corrente contínua, onde as leituras são alteradas pela capacitância bem como
pela tensão da membrana (WPI Inc., 2009).
Dentre as câmaras que podem ser usadas para a análise do TEER, está a
EndOhm-24 (Figura 8), compatível com o aparato HTS-SNAPWELL. A série
EndOhm de câmaras, é projetada para fornecer medições de resistência
reprodutíveis e precisas do tecido endotelial. Os valores de resistência obtidos
quando usado o EndOhm são compatíveis com aqueles obtidos com uso da câmarade Ussing (WPI Inc., 2009).
Figura 8. Esquema do eletrodo EndOhm-24 snap.
Fonte: Instruction Manual EndOhm-24-snap, WPI Inc. 2009.
1.5. PERMEABILIDADE SEGUNDO O BCS
O Sistema de Classificação Biofarmacêutica (BCS, Biopharmaceutical
Classification System) criado por Amidon e colaboradores (1995), fundamentou as
bases científicas para o lançamento de um guia do FDA (Food and Drug
Administration, 2000) com os métodos recomendados para classificação de
fármacos. Este se consolidou como uma ferramenta útil na bioisenção (AMIDON etal., 1995; VOLPE, 2010). Baseado nestes três fatores, principalmente na
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 32/90
17
Introdução
solubilidade e permeabilidade, o BCS divide os fármacos em quatro classes (Figura
9).
Figura 9. Classificação de fármacos segundo o BCS baseado na solubilidade e permeabilidade.
Fonte: Adaptado de RAUTIO, et al., 2008.
Segundo o BCS, a classificação da permeabilidade é baseada diretamente na
extensão da absorção intestinal do fármaco em humanos determinada pelo balanço
de massas ou comparando-se a uma dose de referência, administrada por via
intravenosa, ou ainda, indiretamente pela medida da velocidade de transferência de
massa através da membrana intestinal humana (AMIDON et al., 2009).
No entanto, a principal finalidade deste guia foi estabelecer requisitos (Figura
10) para aplicação da bioisenção a novos produtos dos estudos de bioequivalência,
nos casos de mudanças na formulação, processos de fabricação, comercialização
de novas formulações, etc., desde que os fármacos apresentem alta permeabilidade
e solubilidade (VOLPE, 2010).
Ressalta-se que os modelos classificatórios de permeabilidade sugeridos poreste guia visam classificar ativos farmacêuticos (API´s) com vistas a uma possível
caracterização como substâncias da classe BCS I e, consequente, bioisenção de
produtos farmacêuticos finais em humanos, portanto, estudos de fase clínica.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 33/90
18
Introdução
Figura 10. Requisitos para aplicação da bioisenção à fármacos e produtos.
Fonte: Adaptado de VOLPE, 2008.
Conforme descrito previamente, diversos métodos não envolvendo humanos,
podem ser utilizados a fim de classificar o fármaco quanto à permeabilidade.
A alternativa metodológica certamente inclui os modelos animais, em especial
em ratos, pois é o modelo que melhor reflete a condição humana com respeito ao
espaço paracelular e metabolismo (LE FERREC et al., 2001). Além disso, a principal
vantagem do organismo in vivo é a integração dos componentes dinâmicos da
circulação sanguínea mesentérica, a camada de muco e todos os demais fatores
que influenciam a dissolução do fármaco. Dentre estas, as propriedades físico-
químicas dos fármacos contribuem significativamente para obter informações sobre
sua permeabilidade característica (FDA, 2000).
Estudos farmacocinéticos de balanço de massas utilizando isótopos estáveis
e fármacos radiomarcados, podem ser utilizados a fim de comprovar a extensão deabsorção do fármaco no organismo. Porém, devido às estimativas altamente
variáveis encontradas por este método, outros métodos descritos a seguir são
preferíveis (FDA, 2000). Dentre os diversos métodos de avaliação da
permeabilidade, os métodos in vitro e ex vivo são os mais utilizados, uma vez que
apresentam baixo custo e tempo reduzido, além de favorecer a prática dos 3Rs
(replace, reduce, refine) dos princípios éticos no uso de animais (BALIMANE et al.,
2000; RUSSEL & BURCH, 1959).
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 34/90
19
Introdução
1.6. METODOS ALTERNATIVOS PARA DETERMINAÇÃO DA PERMEABILIDADE
1.6.1. Métodos in vitro
Dentre os modelos in vitro, aqueles mais comumente empregados incluem a
membrana lipídica artificial, tais como os ensaios de permeação por membrana
paralela artificial (PAMPA, sigla do inglês Parallel Artificial Membrane Permeation
Assay) e sistemas baseados em cultura de células de adenocarcinoma humano
Caco-2 e rim canino Mardin-Darby (MDCK sigla do inglês Mardin-Darby canine
kidney) (BALIMANE et al, 2006).
Das técnicas in vitro mais utilizadas para avaliação da permeação intestinal,está o uso de linhagens de células Caco-2 e ensaios de permeação por membrana
artificial paralela (PAMPA), sendo estas amplamente empregadas no screening de
potenciais substâncias, auxiliando no desenvolvimento de novos fármacos (DINIZ,
2007).
Nos ensaios com Caco-2, as células intestinais humanas são cultivadas in
vitro e utilizadas como uma membrana que mimetiza a barreira intestinal. Neste
modelo é avaliada a capacidade de transporte e a direção que ele ocorre, sentido
apical-basal e basal-apical, como pode ser observado na Figura 11 (DINIZ, 2007).
Também é possível avaliar a permeabilidade aparente (Papp) na membrana para
correlacioná-la à dados de absorção de fármacos in vivo (P eff e Fa).
Figura 11. Modelo in vitro de cultura de células Caco-2 utilizado em estudos de permeabilidade.
Fonte: http://www.itqb.unl.pt/ (Acesso em: setembro, 2014).
Apesar dos estudos com Caco-2 serem eficazes na previsão da taxa de
absorção de fármacos, comparadas às demais técnicas in vitro, o mesmo apresenta
desvantagens como falta de agitação no meio de permeação, a limitação dasconcentrações empregadas que não simulam a dose administrada in vivo e
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 35/90
20
Introdução
inexatidão dos valores de permeabilidade preditos além de grande variabilidade inter
laboratorial (BALIMANE et al, 2006).
Já o modelo PAMPA (Figura 12), introduzido pela vez em 1998, têm sido de
grande aplicabilidade como uma ferramenta de triagem de moléculas com alta taxa
de permeabilidade (UNGELL, 2004). O modelo consiste em um material de filtro
hidrofóbico revestido com uma mistura de lecitina/ fosfolipídios dissolvidos em um
solvente orgânico inerte (como o dodecano) criando uma barreira de membrana
lipídica artificial que mimetiza o epitélio intestinal. A taxa de permeação através da
barreira de membrana pode ser correlacionada ao grau de absorção de fármacos em
humanos (Figura 12). O uso de placas com 96 poços de microtitulação juntamente
com rápida análise utilizando um leitor de placas espectrofotométrico, torna estemodelo um sistema muito atraente para screening de permeação. Este modelo
PAMPA dispende menor carga de trabalho comparativamente aos métodos de
cultura de células, com previsibilidade similar (Figura 12). Uma de suas principais
limitações é que o modelo subestima a absorção de fármacos que são ativamente
absorvidos através de transportadores de fármacos (BALIMANE et al., 2006).
Figura 12. Modelo in vitro com membrana artificial PAMPA utilizado em estudos de permeabilidade.
Fonte: http://www.itqb.unl.pt/ (Acesso em: setembro, 2014).
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 36/90
21
Introdução
Figura 13. Correlação de (A) permeabilidade PAMPA e (B) permeabilidade celular Caco-2 com graude absorção em humanos para medicamentos comercializados. Esses fármacos são conhecidos porserem absorvidas principalmente via difusão passiva. Cada ponto é a média de 3 ou mais repetições.
Fonte: Adaptado de BALIMANE, 2006.
O modelo de célula MDCK, inicialmente descrito em 1989, é uma linhagem
bem caracterizada quanto à morfologia, resistência elétrica e a respectiva
composição das membranas celular apical e basolateral, dentre outros fatores. Este
fato proporciona uma excelente base para seu uso como modelo in vitro
padronizado para transporte de fármacos e estudos de interação entre fármacos e
excipientes (RUTISHAUSER et al, 1998). Estas células se diferenciam em epiteliais
colunares quando cultivadas em membranas semipermeáveis, com junções
semelhantes às células Caco-2. Em estudos realizados com este modelo, foi
possível determinar a permeabilidade efetiva nos sentidos apical para basolateral e
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 37/90
22
Introdução
basolateral para apical obtendo-se resultados semelhantes ao modelo Caco-2
(SOUZA et al, 2007). Sua maior desvantagem está relacionada ao fato de sua
origem “não-humana” e “não intestinal”, pois existe baixa expressão de proteínas
transportadoras e baixa atividade metabólica (DEFERME et al., 2008).
1.6.2. Métodos ex vivo
Tecidos intestinais animais são frequentemente utilizados em modelos ex
vivo, pois apresentam características similares às células endoteliais humanas e os
tecidos humanos viáveis serem relativamente difíceis de obter de forma rotineira. A
viabilidade desses tecidos deve ser mantida mediante suprimento sanguíneo eoxigenação constante, (BALIMANE et al, 2006).
A câmara de Ussing (Figura 14), criada por Hans Ussing em 1950, tem sido
conhecida como uma potencial ferramenta científica para estudar o transporte
vetorial de íons através da pele de rã. Com o passar do tempo foi sendo utilizada
para vários outros estudos, como o estudo da integridade de camadas celulares e
das propriedades das células cancerosas invasivas (BALIMANE et al, 2000).
A câmara consiste em duas metades funcionais que são presas junto aoepitélio, preenchidas com soluções fisiológicas para manutenção do mesmo (Figura
14). Uma das propriedades importantes de muitos epitélios é o desenvolvimento de
uma diferença de potencial elétrico, ou seja, uma voltagem entre o lado seroso e o
lado mucoso (DIENER, 2008), desta forma a permeabilidade é medida pelo
aparecimento da substância do lado seroso e desaparecimento do lado mucoso
(BALIMANE et al, 2000).
Figura 14. Aparato de permeação: Câmaras de Ussing.
Fonte: www.warneronline.com, maio 2011.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 38/90
23
Introdução
Hans H. Ussing desenvolveu este método para entender o fenômeno do
transporte ativo do cloreto de sódio e de eletrólitos, nutrientes e transporte de
fármacos que ocorrem através do tecido epitelial intestinal (LE FERREC et al, 2001).
A pele de sapo foi utilizada por Ussing e colaboradores como modelo devido sua
capacidade de mover o cloreto de sódio da superfície da pele para o interstício em
mais de 100 concentrações diferentes. Entretanto, a maior dificuldade era distinguir
o movimento dos íons ativamente transportados pelo epitélio daqueles passivamente
transportados.
Ussing resolveu o problema desenvolvendo um sistema onde a pele de sapo
era dessecada e colocada para separar duas câmaras, cada qual preenchida com o
mesmo volume de uma solução eletrolítica. Desta forma, o transporte paracelular deíons dirigido por forças passivas como a concentração transepitelial e os gradientes
osmóticos e hidrostáticos era eliminado. O transporte passivo criado pelo potencial
elétrico espontâneo através do epitélio era totalmente eliminado promovendo um
potencial de valor zero com um pequeno circuito externo que promovia corrente
elétrica no epitélio. A corrente na qual o potencial determinado é diferente de zero,
equivalente ao movimento de íons similar ao transporte ativo. Neste método a
permeabilidade é medida pelo aparecimento da substância do lado seroso edesaparecimento do lado mucoso da membrana biológica (BALIMANE et al, 2000).
Dados de permeabilidade em humanos foram comparados a Peff (permeação
efetiva) em segmentos intestinais de jejuno de ratos montados em câmara de Ussing
tanto para compostos transportados passivamente quanto para aquelas substancias
cujos mecanismos são mediados por carreadores. Os valores de permeabilidade
observados foram semelhantes aos encontrados em humanos, para compostos de
transporte passivo (Figura 15), obtendo-se um coeficiente de determinação de 0,95(LENNERNAS, 2007).
Assim como as demais técnicas, a Câmara de Ussing também apresenta
algumas desvantagens, pois apesar desta utilizar tecidos de ratos, tornando-se o
modelo que apresenta mais proximidade com o organismo humano, existe uma
grande dificuldade em manter a viabilidade e integridade dos segmentos de tecidos
utilizados, em que edema intestinal e rompimento das vilosidades foram descritos
logo após 20 min de incubação. Outros problemas também são apresentados, como
subestimação do transporte de fármacos através do tecido intestinal, devido à
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 39/90
24
Introdução
retenção na membrana, ocorrendo principalmente em fármacos lipofílicos
(DEFERME et al., 2008).
Figura 15. Correlação entre a fração da dose absorvida em humanos (Fa%) com a permeabilidadeem humanos (in vivo) e a permeabilidade através de jejuno de ratos ( in vitro). Os númerosrepresentam os seguintes compostos: 1 – inogatran, 2 – enalaprilato, 3 – atenolol, 4 – terbutalina, 5-creatinina, 6 – metoprolol, 7 – propranolol, 8 – antipirina e 9 – naproxeno. Os compostos 10, 11 e 12não foram informados nesta figura.
Fonte: Adaptado de LENNERÑAS 2007.
Diante do exposto previamente, é premente a busca por modelos preditivos
da absorção de fármacos pelo trato gastrointestinal em humanos, fornecendo dados
essenciais logo no início do processo de desenvolvimento de novos fármacos.
Neste sentido, o modelo ex vivo MTS-SNAPWELL, apresentado pioneiramente
neste trabalho, é proposto como um modelo alternativo de avaliação depermeabilidade ex vivo , empregando segmentos intestinais de ratos montados em
placas Snapwell™, sob agitação e condição sink. Propõe-se, sobretudo, atingir
elevada capacidade preditiva associada à rápida execução, baixo custo e alto
rendimento para posterior aplicação à seleção de potencias fitofármacos dos biomas
brasileiros, em especial do Cerrado e Pantanal, sob grave ameaça de extinção.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 40/90
25
Objetivos
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Validar o método MTS-SNAPWELL como modelo ex vivo de predição
da permeabilidade aplicado a potenciais novos fármacos, empregando seis
fármacos modelo.
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Adequação das condições de preparo da membrana biológica a partir do
segmento jejunal de ratos Wistar e avaliação das possíveis variáveis
experimentais como temperatura, pH, agitação e oxigenação do meio e,
consequentemente, o tempo de viabilidade tecidual;
Avaliação e monitoramento da integridade da membrana biológica na
presença de co-solventes de amostras fracamente hidrofílicas, por meio da
resistência elétrica transepitelial (TEER);
Revalidação de metodologias analíticas farmacopeicas por HPLC-DAD
para quantificação das amostras permeadas; Obtenção de dados de permeabilidade aparente (Papp) de seis
fármacos hidrossolúveis representativos de alta e baixa permeabilidade
(BCS I e III), descritos no “Guidance for Industry: Waiver of in vivo
Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate-Release Solid Oral
Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System” (FDA,
Agosto de 2000);
Correlação entre dados de Papp obtidos em MTS-SNAPWELL parafármacos (BCS I e III), relativamente aos dados de Papp e Peff em diferentes
modelos (CACO-2, Ussing e perfusão intestinal), previamente descritos na
literatura.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 41/90
26
Métodos
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. M ATERIAIS, SOLVENTES E REAGENTES UTILIZADOS
• Membranas de Policarbonato Isopore, Millipore™;
• Placa de permeação Transwell, Corning®;
• Tartarato de metoprolol, cafeína, teofilina, ranitidina, atenolol e cimetidina,
grau farmacêutico, Sigma Aldrich™;
• Acetonitrila grau HPLC, Merck;
• Metanol grau HPLC, Merck;
•
Água ultrapura Option-Q, Elga;• Fosfato de sódio dibásico anidro P.A., J. T. Baker®;
• Acetato de sódio anidro P.A., Sigma Aldrich™;
• Ácido 1-pentanossulfonato de sódio monohidratado P.A., Sigma Aldrich™;
• Ácido acético gracial P.A., Vetec;
• Ácido ortofosfórico P.A., Scharlau;
• Hidróxido de sódio P.A., J. T. Baker®;
•
Cloreto de sódio P.A., Sigma Aldrich™;• Cloreto de potássio P.A., Sigma Aldrich™;
• Fosfato de sódio monobásico P.A., Sigma Aldrich™;
• Sulfato de magnésio heptahidratado P.A., Sigma Aldrich™;
• Cloreto de cálcio dihidratado P.A., Sigma Aldrich™;
• Bicarbonato de sódio P.A., Sigma Aldrich™.
3.2. EQUIPAMENTOS UTILIZADOS
• Voltímetro transepitelial EVOM 2, World Precision Instruments;
• Eletrodo EndOhm-24-snap, World Precision Instruments;
• Incubadora de CO2 MCO 18-AC, Sanyo;
• Agitador orbital Orbit 1000, Labnet;
• Cromatográfo a líquido de alta eficiência modelo Infinity 1260, composto
por sistema de bomba quaternário, injetor automático, detectores DAD e
FLD, Agilent Technologies;Balança analítica AUW220D, Shimadzu.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 42/90
27
Métodos
3.3. OBTENÇÃO E PREPARO DA MEMBRANA BIOLOGICA
A membrana mucosa foi preparada a partir de segmentos (2-3 cm) da
porção jejunal do intestino delgado obtidos de ratas Wistar (200 ± 25g; 12
semanas), após jejum por um período de aproximadamente 12 h antes do
experimento. Após sedação dos animais com ketamina/xilazina (90,0 / 7,5
mg/Kg), o intestino delgado foi removido e imediatamente mantido em banho
de gelo com solução de Krebs-Ringer Bicarbonato (KRB).
Na seqüência, realizou-se o procedimento de retirada da camada
seromuscular (Figura 16) e abertura dos segmentos intestinais junto à borda
mesentérica do tecido, seguida pela limpeza do conteúdo intestinal com
solução de KRB refrigerada (LENNERÑAS et al., 1997).
Figura 16. Destacamento da camada seromuscular do tubo intestinal animal.
Fonte: Center of Mucosal Biology – University of Maryland/USA e Laboratório deBiofarmácia e farmacocinética- UFG.
Após o experimento, o animal foi eutanasiado por punção cardíaca de
acordo com as normas de conduta da Comissão de Ética no Uso de Animais
da UFG, protocolo CEUA UFG nº 013/11 (Anexo A).
3.4. AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE TECIDUAL NA PRESENÇA DE VERMELHO DE
FENOL E CAFEINA
A viabilidade e integridade da membrana foram avaliadas pela adição
do marcador não absorvível vermelho de fenol e cafeína como marcador de
alta permeabilidade. Leituras da resistência elétrica transepitelial (TEER)
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 43/90
28
Métodos
foram realizadas ao longo do experimento, em intervalos regulares (15/15
min) utilizando o aparelho EVOM2 (Figura 17).
Figura 17. Monitoramento da resistência elétrica transepitelial utilizando EVOM 2.
Fonte: Laboratório de Biofarmácia e farmacocinética- UFG.
3.5. AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE TECIDUAL NA PRESENÇA DE CO-SOLVENTES
A avaliação da integridade da membrana na presença dos co-solventes
mais utilizados na diluição de amostras de baixa solubilidade, foi realizada
adicionando-se DMSO 1% e EtOH 1% à câmara doadora. Leituras da
resistência elétrica transepitelial (TEER) foram realizadas ao longo do
experimento, em intervalos regulares (15/15 min) utilizando o aparelho
EVOM2 (Figura 17).
3.6. ENSAIO DE PERMEABILIDADE EX VIVO HTS-SNAPWELL
Os segmentos intestinais viáveis (2-3 cm), com leituras de TEER
superiores a 30 .cm2 (ZAKELJ et al., 2004; NARAI et al., 1997;
POLENTARUTTI et al,1999) foram selecionados e os demais, descartados.
Os primeiros foram montados no sistema MTS-SNAPWELL (Figura 18) no
sentido apical - basolateral, utilizando uma membrana filtrante de
policarbonato e discos de acrílico para fixação do mesmo.
Antes do início da permeação, foi realizada a estabilização dos
segmentos jejunais e, preenchimento das câmaras doadoras e receptoras,
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 44/90
29
Métodos
com solução de KRB (400 µL e 2 mL, respectivamente). Em seguida as
placas de permeação foram levadas à incubadora de CO2, sob atmosfera
controlada de oxigênio (95%) e temperatura (37 ± 0,5°C), sob agitação (Orbit
1000, Labnet) constante a 60 rpm por 30 min. As condições de
experimentação foram estabelecidas visando mimetizar o sistema vivo
(STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).
Figura 18. Representação esquemática do sistema MTS-SNAPWELL.
Após a estabilização dos segmentos, os fármacos em estudo (Figura
14) foram adicionados no compartimento doador (lado mucoso da
membrana) em concentrações de 0,30 - 12,68 mM, solubilizados em solução
de KRB. As amostras (1 mL) foram coletadas do compartimento receptor
(lado seroso da membrana) a intervalos constantes (20, 30, 40, 60, 80, 100 e
120 min) com reposição do mesmo volume de solução de KRB.
As concentrações das soluções contendo os fármacos foram definidas
com base na sua maior dose administrada, dissolvida em 250 mL conforme
descrito pelo guia do FDA, para definição de uma substância altamente
solúvel (FDA, 2000) (Tabela 1).
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 45/90
30
Métodos
Tabela 1. Propriedades físico-químicas, valores de dose e concentração dosfármacos permeados
*Drug Bank Open Data Drug & Drug Target Database: http://www.drugbank.ca/.
3.7. CALCULOS DO COEFICIENTE DE PERMEAÇÃO
Após análises das alíquotas de fármacos permeadas, calculou-se a
quantidade acumulada no lado receptor no decorrer do tempo. A seguir,
calculou-se o fluxo de permeação (J) em função da área (0,10 cm2) por meio
do coeficiente de inclinação angular, descrito pela equação da reta. O
coeficiente de permeabilidade (Papp) foi calculado segundo a Equação 4.
Papp =
Onde: é o fluxo, ou seja, quantidade de fármaco permeado através da
membrana no tempo t. A corresponde à área de exposição da membrana
(0,1 cm2) e C0 a concentração inicial do fármaco na câmara doadora. Os
valores de Papp obtidos foram comparados com os de Peff da literatura.
Para todos os experimentos, os dados foram resultantes de triplicatas
de amostras, representados como média ± DP. Quando aplicável comparou-
se as médias entre dois tratamentos distintos, segundo Teste-t de Student
(Microsoft Excel 2010; Action® 2.6) para variáveis independentes.
FármacoClasse
BCS
M. M.
(g/mol)*Log P* Dose (mg)
Concentração
(mM)
Tartarato de
metoprololI 684,81 1,88 100 0,58
Teofilina I 180,16 -0,77 300 6,66
Cafeína I 194,19 -0,55 50 0,30
Atenolol III 266,33 0,16 50 0,75
Ranitidina III 314,40 0,98 150 1,91
Cimetidina III 252,34 -0,11 800 12,68
(Equação 4)
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 46/90
31
Métodos
3.8. REVALIDACAO DOS METODOS ANALÍTICOS EM HPLC-PDA
As amostras permeadas foram quantificadas utilizando-se adaptações
de métodos cromatográficos das Farmacopéias Norte-Americana (USP 36) e
Brasileira FB 5ª ed. (Tabela 2).
Figura 19. Estruturas químicas dos fármacos em estudo.
A. tartarato de metoprolol; B. cafeína; C. teofilina; D. ranitidina; E. atenolol e F. cimetidina.
As revalidações parciais dos métodos de análise das amostras obtidos
em estudos de permeação foram conduzidas após adaptações dos métodos
compendiais enfatizando a sensibilidade e o menor tempo de análise,
resguardando os parâmetros de eficiência cromatográfica. Para tanto,
procedeu-se análise dos parâmetros de seletividade, curva de calibração,
limite de quantificação, precisão e exatidão dos métodos durante dois dias
distintos, segundo critérios da Resolução 899, 2003 (ANVISA).
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 47/90
32
Métodos
Tabela 2. Condições cromatográficas transferidas a partir de métodosfarmacopeicos.
Fármaco Condições cromatográficas
Atenolol *
ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm
Tp. Fosfato pH 3,0: MeOH (80:20)
0,6 mL/min; 226 nm; 10µL
Cafeína*
ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm
Tp. Fosfato pH 9,2: MeOH (55:45)
1,0 mL/min; 275 nm; 10µL
Cimetidina**
ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm
H3PO4 0,03%: MeOH (80:20)
1,0 mL/min; 220 nm; 20µL
Ranitidina*
ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm 35ºC
Tp. Fosfato pH 7,0: ACN (78: 22)
1,0 mL/min; 230 nm; 10µL
Tartarato de metoprolol*
ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm
Tp. Acetato pH 3,8: MeOH (58: 42)
1,0 mL/min; 275 nm; 10µL
Teofilina*
ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm
Tp. Acetato pH 4,0: ACN (93: 7)
1,0mL/min; 280 nm; 10µL
* United States Pharmacopeia (2013** Farmacopeia Brasileira 5ª ed. (2010)
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 48/90
33
Resultados
4. RESULTADOS
Ar tigo Científi co
A sensit ive medium-throughput method to pred ict in testinal absorpt ion
in humans using rat intestinal tissue segments
Laís Cristina da Silva, Taynara Lourenço da Silva, Alisson Henrique Antunes,
Kênnia Rocha Rezende*
Laboratory of Biopharmacy and Pharmacokinetics- School of Pharmacy-
Federal University of Goiás, Brazil
*Corresponding author
Kênnia Rocha Rezende
Laboratory of Biopharmacy and Pharmacokinetics- School of Pharmacy-
Federal University of Goiás, 74605220 Goiânia, Goiás, Brazil
Tel: +55 6232096181
E-mail Address: [email protected]
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 49/90
34
Resultados
Abstract
In recent years, several in vitro, ex vivo, and in vivo approaches are currently
used in drug development. Highly predictive human intestinal absorption
models remain lagging behind the times due to profusion of variables
concerning permeability through gastrointestinal tract in humans. However, it
is clear the need for drug permeability models early on new drugs
development process phases that do not represent compromise between
high throughput with low predictive potential and, low throughput with high
predictive potential. In the present study, the MTS-Snapwell ex vivo model is
showed as an alternative method in the permeability investigation. Rat small
intestine tissue segments were mounted in commercial Snapwell™ inserts.
Unidirectional drug transport (A-B) was measured by collecting samples from
receptor chamber at different time points. Viability of intestinal tissue
segments was measured by transport of phenol red and caffeine, in addition
to TEER measurement at three time points. The apparent permeability (Papp;
x10-6 cm/s) results were: metoprolol 12.6±0.7, caffeine 17.6±3.1, theophylline
15.3±1.6, atenolol 10.7±1.2, ranitidine 3.8±0.4, and cimetidine 6.9±0.1. All
drugs were classified in high/low permeability according to BCS, high
correlation with human data (r = 0.89) suggests potential predictive capacity
of the model here proposed for passively absorbed molecules (paracellular
and transcellular).
Keywords: intestinal permeability, rat intestine, ex vivo model, TEER,membrane integrity.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 50/90
35
Resultados
1. Introduction
It is widely acknowledged that highly attrition rate in the drug discovery
process relates to toxicity and inefficacies as a result of poor pharmacokinetic
properties during ADME phases (Li, 2001).To circumvent this, the major
approach points towards assessment of drug permeability performance
during the less costly, earlier stages of DDD process to be conducted in
parallel with bioactivity assays. Although in recent years, several in silico, in
vitro, in vivo and ex vivo methods are currently used, highly predictive human
intestinal absorption models remain lagging behind the times due to
profusion of variables concerning permeability through gastrointestinal tract
in humans (Larregieu & Benet 2014).
Once to predict potential human intestinal absorption, great emphasis
is currently on excised tissue permeability models p.e Ussing chambers used
to measure drug transport along rat intestinal segments (Tukker, 2000).
Main advantages include original expression of influx and efflux
transporters found in vivo tissues (Tukker, 2000). In addition, there is the
interplay of many absorption mechanisms as passive and carried-mediated
diffusion (Lennernäs 2014) allowing for high correlation between both
process i.e. fraction of drug absorbed (Fa) in humans and apparent
permeability (Papp) in rat tissues models. Moreover, ex vivo permeability
systems on tissue segments can be a valuable tool regarding morphological
and physiological characteristics which closely mimics in vivo intestinal
epithelium features. It is also recognized by the FDA as most ideal one for
preclinical human intestinal permeability (FDA, 2000). For instance, it shows
a combination of metabolism capacity and expression of mucus layer on theluminal side working as protective cell damage coating from sample co-
solvents, often useful in DDD phases.
Despite this, maintenance of ex vivo integrity and viability of tissues
needs close attention on experimental conditions, mainly avoiding drug
transport misestimating, membrane retention and low-throughput (Deferme et
al., 2008;Yamashita et al., 1997; Westerhout et al., 2014). Shortly, tissue
segments should be continuously oxygenated with carbogen (95%O2, 5%
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 51/90
36
Resultados
CO2) and kept in physiologically buffer, at 37 oC, under stirring reducing the
unstirred water layer at high humidity incubations set sample evaporation.
In this context, it is clear the need for drug permeability models early on new
drugs development process phases that do not represent compromise
between high throughput with low predictive potential and, low throughput
with high predictive potential. Here, the MTS-Snapwell ex vivo model is
showed as a new alternative model in the permeability investigation, using
female rat small intestine tissue segments mounted in commercial
Snapwell™ inserts, under stirring and sink conditions.
2. Materials and methods
2.1. Chemicals and reagents
Metoprolol tartrate, caffeine, theophylline, atenolol, cimetidine,
ranitidine hydrochloride, sodium chloride, potassium chloride, monobasic
sodium phosphate, magnesium sulfate heptahydrate, calcium chloride
dihydrate and sodium bicarbonate were purchased from Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, USA). Sodium hydroxide and dibasic sodium phosphate
anhydrous were purchased from J.T. Baker (Mexico City, Mexico), glacial
acetic acid from Vetec (Rio de Janeiro, RJ, Brazil) and orthophosphoric acid
from Scharlau (Barcelona, Spain), while HPLC chromatographic grade
acetonitrile and methanol were from Merck (Darmstadt, Germany).
2.3. Rat excised tissue segments
The study protocol for using rat intestine tissues were approved by
Ethics Committee on Animal Use from Federal University of Goiás under
number 013/2011. Female Wistar rats (200 ± 25g) were housed under
controlled conditions including temperature (22°C), 12 h light/ dark cycle with
access to standard food and tap water ad libitum during one week minimum
period for acclimatization. Prior to each experiment, animals were fasted for
12h (Salphati et al. 2001; Kim et al. 2006)with free access to water.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 52/90
37
Resultados
Female Wistar rats were anesthetized with ketamine/xilazine (90mg/kg
and 7.5mg/Kg, respectively). The small intestine was excised, washed and
kept in an ice-cold oxygen saturated Krebs-Ringer bicarbonate solution
(KRB).Proximal jejunal tissue (the first 12 cm from stomach) was excised and
put into beakers containing ice-cold KBR (10oC) which was continuously
gassed with a O2:CO2 (95:5) gas mixture. Next, serosal-muscular layer was
carefully stripped from the mucosal and cut into tissue segments (20 mm).
During such procedure, tissues were humidified with 10oC KBR solution.
After that, the intestinal segment was mounted with the basolateral side set
above polycarbonate filter membrane (Isopore™ 0.4 µm, 13 mm, Millipore,
Darmstadt, Germany). Using acrylic disks (02) with an internal diameter of 3
mm over and above filter membrane (Fig. 1) and mucosal membrane facing
upwards, the permeability apparatus was set-up. Next, it was mounted at
donor chamber (Snapwell™ device) and, checked for any leakage with 1 mL
KRB solution. MTS-Snapwell system was completed after filling receiver (2
mL) and donor (0,4 mL) compartments of KRB solution.
Viable intestinal segments (TEER > 30 cm 2), as described on item
2.4, were mounted on permeation apparatus and submitted to a pre-
incubation period (30 min)under controlled atmosphere(95% O2 and 5% CO 2)
inside of a humidified incubator (MCO-18AC, Sanyo, UK) at 37ºC and gentle
shaking (60 rpm) for equilibration. After, KRB blank solution was aspirated off
from donor compartment and replaced with dose solutions (400 µL) at
variable concentrations (0.30 -12.68 mM). Drug dose to be assayed was
defined as the highest human commercial one divided by 250 mL, as
described in FDA guide (FDA, 2000). After drug incubation, unidirectional
drug transport from apical to basolateral side was measured by collectingsamples from receptor chamber (1 mL) at different time points (0, 20, 30, 40,
60, 90 and 120 min). Replacement of the sampling volume was carried out
immediately with the same volume of fresh pre-warmed (37oC) KRB solution.
Samples were analyzed as described in section 2.5.
For each drug, the apparent permeability coefficient (Papp) was
calculated according to the following equation (Eq. 1) (Zur et al. 2014; Zakelj
et al. 2004; Sjöberg et al. 2013; Li et al. 2013):
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 53/90
38
Resultados
Eq. 1
Where dQ/dt is the rate is the appearance rate of the drug at receiver
compartment, C0 is the initial concentration of the drug at the donor
compartment and A is the surface area (0.1 cm2) of the tissue segment.
2.4. Viability and integrity barrier
Viability of intestinal tissue segments mounted in MTS-Snapwellsystem was measured by transport of marker molecules, e.g. phenol red and
mannitol besides transepithelial resistance (TEER) during incubation time
(120 min) at 37 oC95% O2 and 5% CO 2). TEER was measured at three
different time points (0, 30 and 120 min). Additionally, potential damage to
the barrier function were evaluated for commonly used co-solvents (DMSO
1% and EtOH 1%) of poorly water soluble drugs (Krishna et al. 2001;
Takahashi et al. 2002; Watanabe et al. 2004).
Integrity of intestinal barrier function was measured by linearity of
mucosal to serosal transport of permeability markers over 2h. Caffeine was
evaluated as a highly absorbed marker transported by passive transcellular
mechanism, in addition to phenol red as a non-absorbable one.
2.5. Analytical methods
Sample drug analysis was assessed by HPLC-DAD (Infinity 1260,
Agilent Technologies, USA) an ACE 5 C18 column (100 x 4.6 mm, 5µm)
using compendia transferred methods from United States and Brazilian
Pharmacopeia. The chromatographic conditions are described in Table 1.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 54/90
39
Resultados
2.6. Data analysis
Comparison of TEER values in the presence and absence of co-
solvents was determined using Student's test for two independent samples at
the 5% significance level (Microsoft Excel 2010; Action®). Results were
shown as arithmetic mean ± SD.
Potential correlation of Papp values obtained from MTS-Snapwell model and
Papp values from literature data (Ussing chamber, rat perfusion or %Fa in
humans) were plotted. Linear regression were performed and expressed as a
measurement of goodness of fit (R2) on predicting human drug absorption.
3. Results and discussion
3.1. Viability and barrier integrity
In order to assess viability of tissues, reference TEER values were set
at 30 .cm2, as previously described in literature (30.cm2; 34±6.2.cm2;
20-50.cm2) (Zakelj et al., 2004; Narai et al., 1997; Polentarutti et al,1999).
In this protocol, the initial TEER value for rat jejunal tissue was found to
be53±8.0 .cm2 (n = 20) remaining above 20 .cm2 during incubation time
(120 min). Maximum acceptable value for TEER reduction was 61.9±9.5%,
consistently to literature (Borchard et al. 1996; Petersen et al. 2012).
Potential co-solvents damage was also evaluated for DMSO 1% and
EtOH 1% as per TEER values. Starting values found were of 48±9.2 .cm2
(n = 10) and 54±5.8 .cm2 (n = 10). After co-solvents addition, TEER values
showed no significant difference (P > 0.05) from blank samples, remainingabove 20 .cm2 during all incubation time (2h). While we did measure mucus
thickness, intestinal protective feature appear to be functional during
incubation time making this model closer to physiological tissue. Additionally,
integrity of intestinal barrier during incubation time was assessed for non-
absorbable (phenol red) and high permeability (caffeine) markers (Fig 2).
Phenol red showed no permeation at all, as expected. For caffeine, drug
transport remained linear during incubation time ensuring integrity of barrierfunction during 120 min (Dixit et al., 2012). Therefore, epithelium integrity
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 55/90
40
Resultados
was confirmed both by monitoring transepithelial resistance as well as by
drug markers, as recommended (Sjöberg et al., 2013). For that, standardized
experimental conditions for MTS-Snapwell model also includes maintaining
close control of room temperature (18°C±2) and KRB solution saturated(5%
CO2, 95% O2) and ice-cooled (10°C±2) as a tissue preservation bath, during
experimental procedure.
3.2. Permeability studies
The sampling interval and maximum time of exposure (120 min)
showed to be adequate, completing before the equilibrium concentration of
the system has reached. The lag times showed to be approximately 20-40
min, where in 60 min the steady concentration gradient was established
across the tissue segments. The agitation of 60 rpm, was adequate to
prevent the stagnant water layer, ensuring the sink conditions (Ingels &
Augustijns, 2003).
Apparent permeability coefficient (Papp) of six selected compounds of
BCS I and III, as recommended by FDA guidance (FDA, 2000), were
measured across rat jejunal tissue segments (AP-BL) mounted in MTS-
SNAPWELL system under sink conditions.
Papp values obtained ranged from 3.8±0.4 to 17.6±3.1cm/s pointing to
metoprolol as a low-high permeability class boundary marker as seen in
Table2. As a result, the same BCS classification was attained for all tested
drugs. Drug permeability classification was obtained when ratio between
Papptest/Pappmetoprolol was calculated, as reported by Kim et al. (2006). Drugs
showing Papp ratio greater than 1.0 were considered as highly permeable.Otherwise, they were classified as a low permeability drug (Table 2).
Regarding the high permeability marker (metoprolol), one should be aware of
its characteristic pH-dependent permeability. Zur et al. (2014),reported it can
be2-fold higher than pH 7.0. Herein, metoprolol showed good inter-assay
precision (RSD = 0.52%; n = 3) at pH 7.4. Additionally, MTS-SNAPWELL
Papp values displayed the same ranking order (ranitidine < atenolol
<metoprolol< theophylline < caffeine) as seen in Ussing chamber (Li et al.,2013)i.e. a classical ex vivo assay in rat intestinal tissues. Previously
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 56/90
41
Resultados
reported Papp and Peff data from often used techniques such as Caco-2,
intestinal perfusion and fraction of drug absorbed were compared assuming
linear regression. Overall, Papp values showed weaker linear goodness of fit
for in vivo (R2 = 0.76-0.79) when compared to ex vivo (R 2 = 0.83) (Fig. 3).
Our Papp results was also compared to oral fraction dose absorbed in human
(Fa) showing linear correlation suggesting potential predictive capacity for the
model herein proposed (Fig.4), as for passively transported molecules (both
paracellular and transcellular) (Corti et al. 2006). Accordingly, Pearson's
correlation (r) on MTS-SNAPWELL system showed strong values to human
data (r=0.89) as compared to in vivo rat perfusion model (r=0.84) previously
published (Kim et al., 2006; Salphati et al., 2001; Pratap et al., 2012).
Although, our dataset in too small to be able to predict human oral
bioavailability.
Moreover, analytical method sensitivity for MTS-SNAPWELL system
showed to be high (slope=19.68), as measured by the slope of linear
regression curve (IUPAC, 1997) as compared to slope from Caco-2 (5.22),
Ussing chambers (8.99) and rat perfusion model (3.55).Theoretically, it would
be able to give very different response to distinct compounds. About method
precision, it showed to be relatively low, as expressed by RSD, when Papp
measurement was performed with rat intestinal tissue for MTS-Snapwell
(0.52-17.61%) compared to Ussing chamber (24.79-42.24%) or perfusion in
rats (27.94-82.19%) described by (Li et al. 2013; Kim et al. 2006; Salphati et
al. 2001; Pratap et al. 2012).
As a final point, the validated conditions for MTS-SNAPWELL system
showed some advantages as high sensitivity and precision when at sink
conditions. Experimental settings was carefully adjusted to mimicsgastrointestinal tract physiology, highlighting its potential ability to suitable
measure drug permeability in excised rat tissue segments mounted in
Snapwell™ system. Taken together, our results point towards MTS-
SNAPWELL as a value tool in the screening of new molecular entities during
drug discovery and development process after expanding dataset of
molecules tested.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 57/90
42
Resultados
4. Conclusions
Our results revealed that rat intestinal tissue mounted in Snapwell
system has potential to be an alternative method to classify drug substances
in high/low permeability. Moreover, our method can be seen as an
innovative, easy and fast way to measure ex vivo permeability. Once viability
and barrier integrity of the rat jejunal tissue segments were preserved along
120 min, at sink conditions, MTS-Snapwell system is ready to be challenged
for low solubility drugs.
5. Acknowledgments
We thank the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível
Superior (CAPES, Brazil), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
Goiás and Rede Pro Centro-Oeste for financial support.
6. References
1. Borchard G, Luegen L & Boer AG, 1996. The potential ofmucoadhesive polymers in enhancing intestinal peptide drugabsorption . III : Effects of chitosan-glutamate and carbomer onepithelial tight junctions in vitro. J Control Release, 39: 131–138.
2. Castillo-Garit JA, Ponce IM, Torrens F, Domenech RG. 2008.Estimation of ADME Properties in Drug Discovery : Predicting Caco-2Cell Permeability Using Atom-Based Stochastic and Non-stochasticLinear Indices. J Pharm Sci 97(5): 1946–1976.
3. Corti G, Maestrelli F, Cirri M, Zerrouk N, Mura P. 2006. Developmentand evaluation of an in vitro method for prediction of human drug
absorption II. Demonstration of the method suitability. EurJPharmSci27(4): 354–62.4. Deferme S, Annaert P, Augustijns P. 2008. In vitro screening models
to assess intestinal drug absorption and metabolism, in: Ehrhardt C &Kim K. Drug absorption studies. In situ, in vitro and in silico models.Ed. Springer, New York, pp. 182-215.
5. Dixit P, Jain DK & Dumbwani J. 2012. Standardization of an ex vivomethod for determination of intestinal permeability of drugs usingeverted rat intestine apparatus. J Pharm Tox Met 65(1): 13–17.
6. FDA. Guidance for industry: Waiver of in vivo bioavailability andbioequivalence studies for immediate-release solid oral dosage forms
based on a biopharmaceutical classification system; Center for DrugEvaluation and Research: 2000.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 58/90
43
Resultados
7. Gan LS, Hsyu P H, Pritchard JF, Thakker D. 1993. Mechanism ofIntestinal Abasorption of Ranitidine and Ondansetron: Transport Across Caco-2 Cells Monolayers. Pharm Res 10 (12): 1722-1725.
8. Gato-Peciña JJ & Ponz F. 1990. Use of the paracellular way for theintestinal absorption of sugars.RevEspFisiol46 (4): 343-352.
9. Ingels FM& Augustijns PF. 2003. Biological, pharmaceutical, andanalytical considerations with respect to the transport media used inthe absorption screening system, Caco-2. J Pharm Sci 92(8): 1545–1558.
10. IUPAC. 1997. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the"Gold Book"). Compiled by A. D. McNaught and A. Wilkinson.Blackwell Scientific Publications, Oxford.
11. Kim JS, Mitchell S, Kijek P, Tsume Y, Hilfinger J, Amidon GL. 2006.The suitability of an in situ perfusion model for permeabilitydeterminations: utility for BCS class I biowaiver requests. MolecPharm 3(6): 686–694.
12. Krishna G,Chen KJ, Lin CC, Nomeir AA. 2001. Permeability oflipophilic compounds in drug discovery using in-vitro humanabsorption model, Caco-2. Int J Pharm 222(1): 77–89.
13. Larregieu C& Benet LZ. 2014. Distinguishing between the permeabilityrelationships with absorption and metabolism to improve BCS andBDDCS predictions in early drug discovery. Molec Pharm 11(4):1335–1344.
14. Lennernäs, H., 2014. Regional intestinal drug permeation:biopharmaceutics and drug development. Eur J Pharm Sci 57: 333–341.
15. Li P. 2001. Screening for human ADME/Tox drug properties in drugdiscovery. Drug Disc Tod 6(7):357–366.
16. Li H, Jin HE, Shim WS, Shim CK. 2013. An improved prediction of thehuman in vivo intestinal permeability and BCS class of drugs using thein vitro permeability ratio obtained for rat intestine using an Ussingchamber system. Drug Develop Indust Pharm 39(10): 1515–1522.
17. Mols R, Brouwers J, Schinkel AH, Annaert P, Augustijns P. 2009.Intestinal perfusion with mesenteric blood sampling in wild-type andknockout mice Evaluation of a Novel Tool in Biopharmaceutical DrugProfiling. Drug Metab Disp 37(6): 1334–1337.
18. Mummaneni V & Dressman, JB.1994.Intestinal Uptake of Cimetidine
and Ranitidine. PharmRes 11 (11): 1599-1604.19. Narai A, Arai S & Shimizu M. 1997. Rapid decrease in transepithelialelectrical resistance of human intestinal Caco-2 cell monolayers bycytotoxic membrane perturbents. Toxicology in vitro 11(4): 347–354.
20. Petersen, Nolan G, Maher S, Rahbek UL, Gulddrandt M, Brayden DJ.2012. Evaluation of alkylmaltosides as intestinal permeationenhancers: comparison between rat intestinal mucosal sheets andCaco-2 monolayers. Eur JPharm Sci 47(4): 701–712.
21. Pollentaruti BI, Peterson AL, Sjöberg AK, Anderberg EKI, Utter LM,Ungell ALB. 1999. Evaluation of viability of excised rat intestinalsegments in Ussing chamber: Investigation of morphology, electrical
parameters and permeability characteristics. Pharm Res16 (3): 446-454.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 59/90
44
Resultados
22. Pratap SS, Wahajuddin, Raju KSR, Nafis A, Jain GK. 2012.Simultaneous determination of nine model compounds in permeabilitysamples using RP-HPLC : Application to prove the cassetteadministration principle in single pass intestinal perfusion study in rats.J Pharm Biom Anal, 68:71–76.
23. Salphati L, Childers K, Pan L, Tsutsui K, Takahashi L. 2001.Evaluation of a single-pass intestinal-perfusion method in rat for theprediction of absorption in man. J Pharmacy and Pharmacology 53(7):1007–1013.
24. Sjöberg Å,Lutz M, Tannergren C, Wingolf C, Borde A, Ungell AL.2013. Comprehensive study on regional human intestinal permeabilityand prediction of fraction absorbed of drugs using the Ussing chambertechnique. Eur JPharm Sci 48(1-2):166–180.
25. Smetanova L, Stetinova V, Kholova D, Kvetina J, Smetana J, SvobodaZ. 2009. Caco-2 cells and Biopharmaceutics Classification System(BCS) for prediction of transepithelial transport of xenobiotics (model
drug: caffeine). Neur Endoc Lett 30 (1): 101-105.26. Takahashi Y, Kondo H, Yasuda T, Watanabe T, Kobayashi SI,
Yokahama S. 2002. Common solubilizers to estimate the Caco-2transport of poorly water-soluble drugs. Inter JPharm 246(1-2): 85–94.
27. Tukker, J.J., 2000. In vitro methods for the assessment ofpermeability. In: Dressman, J.B., Lennernas, H. (Eds.), Oral Drug Absorption: Prediction and Assessment. Marcel Dekker, New York,pp. 51–72.
28. Watanabe E, Takahashi M& Hayashi M. 2004. A possibility to predictthe absorbability of poorly water-soluble drugs in humans based on ratintestinal permeability assessed by an in vitro chamber method. EurJPharm Sci 58(3): 659–665.
29. Westerhout J, Steeg EV, Grossouw D, Zeijdner EE, Krul CAM, VerweiM, Woterlboer HM. 2014. A new approach to predict human intestinalabsorption using porcine intestinal tissue and biorelevant matrices.Eur JPharm Sci 63C: 167–177.
30. Yamashita S, Tanaka Y, Endoh Y, Taki Y, Sakane T, Nadai T, SezakiH. 1997. Analysis of drug permeation across Caco-2 monolayer:Implication for predicting in vivo drug absorption. Pharm Res14 (4):486-491.
31. Zakelj S, Legen I, Veber M, Kristl A.The influence of buffer
composition on tissue integrity during permeability experiments “invitro”. Inter JPharm, 272(1-2): 173–80.32. Zhou SY, Piyapolrungroj N, Pao LH, Li C, Liu G, Zimmerman E,
Fleisher D. 1999. Regulation of Paracellular Absorptionof Cimetidineand Aminosalicylate in Rat Intestine. Pharm Res16 (11): 1781-1785.
33. Zur M, Gasparini M, Wolk O, Amidon GL, Dahan A. 2014. Thelow/high BCS permeability class boundary: physicochemicalcomparison of metoprolol and labetalol. Molec Pharm 11(5): 1707–1714.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 60/90
45
Resultados
Figures
Fig. 1. Schematic representation of Snapwell™ adaptation using rat intestine tissuesegments.
Fig. 2. Barrier integrity assessment by means of permeability markers as phenol red (non-absorbable) and caffeine (high permeability) across rat jejunal tissue segments, expressed in% of drug dose versus incubation time (120 min). Data represented mean ± SD (n = 4).
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 61/90
46
Resultados
Fig. 3. Relationship between apparent permeability coefficients (Papp) in rat jejunal tissuemounted in MTS-SNAPWELL system and (A) Peff rat perfusion (Kim et al., 2006; Salphati et
al., 2001; Pratap et al., 2012); (B) Peff human perfusion (Kim et al., 2006); (C) Papp Ussingchamber (Li et al., 2013).
Fig. 4. Relationship between apparent permeability coefficients (Papp) in rat jejunal tissuemounted in MTS-SNAPWELL system and oral dose absorbed fraction in human (Fa %) (Kimet al. 2006).
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 62/90
47
Resultados
Tables
Table 1.Chromatographic conditions for quantification of tested drugs.
Compound LQ(µg/mL)
Chromatographic
conditions on ACE 5 C18 (100 x 4.6 mm,
5µm)
(nm)
Metoprolol1 1.0
Acetate buffer pH 3.8:
MeOH (58: 42)
1.0 mL/min; 10µL at 45°C
275
Caffeine1 0.05
Phosphate buffer pH 9.2:
MeOH (55:45);1.0 mL/min;
10µL
275
Theophylline1 1.2 Acetate buffer pH 4.0: ACN
(93: 7); 1.0mL/min; 10µL280
Atenolol1 0.3
Phosphate buffer pH 3.0:
MeOH (80:20);0.6 mL/min;
10µL
226
Ranitidine1 0.08
Phosphatebuffer pH 7,0:
ACN (78: 22)
1.0 mL/min; 10µL at 35ºC
230
Cimetidine2 0.5
Phosphoric acid 0.03%:
MeOH (80:20)
1.0 mL/min; 20µL
220
1
United States Pharmacopeia;2
Brazilian Pharmacopeia.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 63/90
Table 2.Drug transport mechanism across intestinal barrier, Papp values measured in MTS-S
toreported Papp in Caco-2 andUssing Chamber. Reported Peff inrat and human perfusionsplusabso
also included. Data is showed as mean ± SD (N=3).
Papp x 10-6 cm/s Peff x 10-6 cm/
Compound Passive Transport
mechanisma
BCSbMTS-
SnapwellCaco-2c UssingChamber d Rat e Hum
Metoprolol transcellular I 12.6 ± 0.7 25.7 16.1 ± 6.859.0 ±
13.0 1
Caffeine transcellular I 17.6 ± 3.1 38.9 37.2 ± 3.2 54.0 ±17.0 2
Theophylline paracellular I 15.3 ± 1.6 44.7 27.7 ± 8.268.0 ±
19.0 2
Atenolol paracellular III 10.7 ± 1.2 0.32 10.7 ± 1.8 18.0 ± 9.0 2
Ranitidine paracellular III 3.8 ± 0.4 0.49 6.1 ± 1.5 7.3 ± 6.0 2
Cimetidine paracellular III 6.9 ± 0.1 1.29 N.A. 10.5 ± 6.0 2
N.A=notavailableaSmetanova et al., 2009; Mols et al., 2009; Gato-Peciña & Ponz, 1990; Zhou et al., 1999; Mummaneni & bBiopharmaceutical Classification System (http://tsrlinc.com). cCastillo-Garit et al., 2008. dLi et al., 2013; Lennernas,
2001; Pratap et al., 2012.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 64/90
49
Considerações Finais
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
As condições experimentais padronizadas para o modelo HTS-
SNAPWELL foram satisfatórias, pois observou-se a preservação da função
de barreira do segmento da membrana jejunal em ambiente ex vivo ,
conforme evidenciado.
Adequada sensibilidade e seletividade (ANEXOS D-F) foi obtida na
quantificação das amostras de fármacos permeadas no modelo HTS-
SNAPWELL empregando-se métodos HPLC-PDA farmacopeicos (USP e
FB) revalidados segundo parâmetros do FDA, assegurando confiabilidade e
segurança aos dados.
Para o modelo HTS-SNAPWELL há evidências de sua potencial
aplicação na classificação de moléculas em alta e baixa permeabilidade,
empregando-se metoprolol como limite inferior de alta permeabilidade.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 65/90
50
Referências
6. REFERÊNCIAS
ALEX, A.; MILLAN, D. S.; PEREZ, M.; WAKENHUT, F.; WHITLOCK, G. A.Intramolecular hydrogen bonding to improve membrane permeability andabsorption in beyond rule of five chemical space. Med Chem Comm, 2, p.669-674, 2011.
AMIDON, G. L. et al. A theoretical basis for a biopharmaceutic drugclassification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivobioavailability. Pharmaceutical Research, v. 12, n. 3, p. 413-20, Mar 1995.
AMIDON, G. L.; DAHAN, A.; MILLER, J. M. Prediction of solubility andpermeability class membership: provisional BCS classification of the world'stop oral drugs. AAPS Journal, v. 11, n. 4, p. 740- 746, Dec 2009.
BALIMANE, P. V.; CHONG, S.; MORRISON, R. A. Current methodologiesused for evaluation of intestinal permeability and absorption. J PharmacolToxicol Methods, v. 44, n. 1, p. 301-12, 2000 Jul-Aug 2000.
BALIMANE, P. V.; HAN, Y. H.; CHONG, S. Current industrial practices ofassessing permeability and P-glycoprotein interaction. AAPS Journal, v. 8, n.1, p. E1-13, 2006. ISSN 1550-7416.
BOHETS, H.; PIETER ANNAERT, GEERT MANNENS, LUDY VANBEIJSTERVELDT, KATELIJNE ANCIAUX, PETER VERBOVEN, WILLEMMEULDERMANS, KAREL LAVRIJSE. Strategies for Absorption Screening inDrug Discovery and Development. Current Topics in Medicinal Chemistry2001, 1, 367-383.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003. Determina a publicação do“Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos”. Diário Oficial daUnião. Brasília, 02 de junho de 2003.
BUCKLEY, S.T.; FISCHER, S M.; FRICKER, G.; BRANDL, M. In vitro modelsto evaluate the permeability of poorly soluble drug entities: challenges andperspectives. European journal of pharmaceutical sciences : official journalof the European Federation for Pharmaceutical Sciences, 45(3), pp.235–50,2012.
CARDOT, J. M. Absorção, em: LEBLANC, P. P.; AIACHE, J. M.; BESNER, J.G.; BURI, P.; LESNE, M. Tratado de Biofarmácia e Farmacocinética, ed.Ciência e Técnica, Lisboa, PRT, 27-59, 1997.
CARVALHO A. C. B.; NUNES D. S. G.; BARATELLI T. G.; SHUQAIR N. S.
M. S. A. Q.; NETTO E. M. Aspectos da legislação no controle dosmedicamentos fitoterápicos. T & C Amazônia, ano V, n° 11, junho de 2007.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 66/90
51
Referências
DEFERME, S. et al., 2008. In vitro screening models to assess intestinaldrug absorption and metabolism, in: Ehrhardt, C. & Kim, K, Drug absorptionstudies. In situ, in vitro and in silico models. Ed. Springer, New York, pp. 182-215.
DIENER, M. Ussing chamber. Scitopics, 2008. Disponível em:http://www.scitopics.com/Ussing_chamber.html. Acesso em: 11/01/2012.
DINIZ, A. Avaliação do perfil de absorção da vicenina-2 e desenvolvimentode extrato seco padronizado de Lychnophora ericoides com máximaextração deste flavonóide. 2007. 120p. Tese (Doutorado em Farmácia).Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade de SãoPaulo, Ribeirão Preto, 2007.
DRESSMAN, J. B. & LENNERÑAS, H. Membrane permeability, in: Oral Drug Absorption Prediction and Assessment, ed. Marcel Dekker, Inc, New York,
USA, p. 31-119, 2000.
FAWCETT, D. W. Chapter 3: Junctional Specializations. The Cell, 2 ed., W.B. Saunders Company, p.124-187, 1966.
FDA Guidance for industry: waiver of in vivo bioavailability andbioequivalence studies for immediate-release solid oral dosage forms basedon a biopharmaceutics classification system. Rockville: FDA, 2000. p.1-13.
FDA Guidance for industry: Bioavailability and Bioequivalence Studies forOrally Administered Drug Products — General Considerations. Rockville:FDA, 2003. p.1-13.
FLORENCE, A. T. & ATTWOOD, D. Drug absorption and routes ofadministration, in: Physicochemical Principles of Pharmacy, ed.Pharmaceutical Press, London, UK, p. 329-391, 2006.
FORSYTH, C. B.; SHANNON, K. M.; KORDOWER, J. H.; VOIGT, R. M.;SHAIKH, M.; JAGLIN, J. A.; ESTES, J. D.; DODIYA, H. B.; KESHAVARZIAN A. Increased Intestinal Permeability Correlates with Sigmoid Mucosa alpha-Synuclein Staining and Endotoxin Exposure Markers in Early Parkinson’s
Disease. Plos One, 6 (12), p. 1-10, 2011.GRASS, G. M.; SWEETANA, S. A. In vitro Measurement of gastrointestinaltissue permeability using a new diffusion cell. Pharmaceutical Research, 5,372-376, 1988.
GRIFFIN, B. & DRISCOLL, C. Models of the small intestine, in: Ehrhardt, C.& Kim, K, Drug absorption studies. In situ, in vitro and in silico models. Ed.Springer, New York, pp. 34-65.
INGELS, F.M. & AUGUSTIJNS, P.F., 2003. Biological, pharmaceutical, and
analytical considerations with respect to the transport media used in the
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 67/90
52
Referências
absorption screening system, Caco-2. Journal of pharmaceutical sciences,92(8), pp.1545–58.
JAMBHEKAR, S.S. & BREEN, P. J. Drug absorption from the gastrointestinaltract, in: Basic Pharmacokinetics, ed. Pharmaceutical Press, London, UK p.
87-96, 2009.
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Cap. 4. Tecido Epitelial- As formas e ascaracterísticas das células epiteliais. Histologia Básica 10ª ed., p. 67-72, ed.Guanabara Koogan, 2004.
KANSY, M.; SENNER, F.; GUBERNATOR, K. Screening : Parallel ArtificialMembrane Permeation Assay in the Description of Passive AbsorptionProcess. Journal of Medicinal Chemistry, 41(7): 1007–1010, 1998.
KESTER, M.; KARPA, K. D.; KENT, E. V. Pharmacokinetics, in: Elsevier’s
Integrated Reviews Pharmacology, ed. Elsevier Saunders, Philadelphia, PA,p. 1-16, 2012.
KIM, J. L.; MITCHEL, S.; KIJEK, P.; TSUME, Y.; HILFINGER, J.; AMIDON,G. L. The Suitability of an in Situ perfusion Model for PermeabilityDeterminations: Utility for BCS Class I Biowaiver Requests. MolecularPharmaceutics, vol. 3, nº 6, p. 686- 694, 2006.
KRISHNA G.; CHIN K.; Lin, CHING-CHUNG L.; NOMEIR A. Permeability oflipophilic compounds in drug discovery using in-vitro human adsorptionmodel, Caco-2. International Journal of Pharmaceutics, v. 222, p. 77 - 89.2001.
KUBINYI, H. Hydrogen Bonding: The Last Mystery in Drug Design?Pharmacokinetic optimization in drug research, pp. 513-524.
LABAUNE, J. P. o Trajeto do medicamento no organismo em direção àcirculação geral, em: Farmacocinética, ed. John Wiley & Sons Inc, NJ, USA,1991.
LE FERREC, E. et al. In vitro models of the intestinal barrier. The report and
recommendations of ECVAM Workshop 46. European Centre for theValidation of Alternative methods. Altern Lab Anim, v. 29, n. 6, p. 649-68,2001 Nov-Dec 2001. ISSN 0261-1929.
LENNERÑAS H. Animal data: the contributions of the ussing chamber andperfusion systems to predicting human oral drug delivery in vivo. AdvancedDrug Delivery Reviews, v. 59, p.1103-1120, 2007.
LENNERNÄS, H.,. Regional intestinal drug permeation: biopharmaceuticsand drug development. European journal of pharmaceutical sciences :official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences, 57,
pp.333–41, 2014.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 68/90
53
Referências
LI, H.; SHEPPARD, D. N.; HUG, M. J. Transepithelial electricalmeasurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros, v. 3 Suppl 2, p. 123-6, Aug 2004.
LIPINSKI C. A.; LOMBARDO F.; DOMINY B. W.; FEENEY P. J.
Experimental and computational approaches to estimate solubility andpermeability in drug discovery and development settings. Advanced DrugDelivery Reviews 46, p. 3 – 26, 2001.
MARRERO A, OSTROVSKIY DA, MATKOWSKYJ KA, KOUTSOURISS., HECHT G., BENYA R. V. Electrophysiological characterisation of humandistal colon using a novel technique. Dig. Dis. Sci. 43: 2439–2445, 1998.
MIOTO R. O mercado brasileiro de fitoterápicos é muito menor do quepoderia ser, 08 de junho de 2010. Disponível em <http://boaspraticasfarmaceuticas.blogspot.com/2010/06/o-mercado-
brasileiro-de-fitoterapicos-e.html>. Acesso em 31/01/2011.
NARAI, A.; ARAI, S.; SHIMIZU, M. Rapid decrease in transepithelialelectrical resistance of human intestinal Caco-2 cell monolayers by cytotoxicmembrane perturbents. Toxicology in vitro : an international journalpublished in association with BIBRA, 11(4), pp.347–54, 1997.
PEREIRA, T. M. Avaliação da solubilidade e da permeabilidade intestinal defármacos antirretrovirais. Aplicações na Classificação Biofarmacêutica.. 175f. Dissertação (Mestrado em ciências farmacêuticas) – Faculdade deCiências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.
POLLENTARUTI, B. I.; PETERSON, A. L.; SJÖBERG, A. K.; ANDERBERG,E. K. I.; UTTER, L. M.; UNGELL, A. L. B. Evaluation of viability of excised ratintestinal segments in Ussing chamber: Investigation of morphology,electrical parameters and permeability characteristics. PharmaceuticalResearch, 16 (3), pp. 446-454, 1999.
PRENTIS R. A.; LIS Y.; WALKER S. R. Pharmaceutical innovation by theseven UK-owned pharmaceutical companies (1964-1985). Br. J. Clin.Pharmac., v. 25, p. 387-396, 1988.
RAUTIO, A.; KUMPULAINEN, H.; HEIMBACH, T.; OLIYAI, R.; OH, D.;JÄRVINEN T.; SAVOLAINEN, J. Prodrugs: design and clinical applications.Nature Reviews, vol. 7, p. 255-270, 2008.
REZNIK VM, VILELA J, MENDOZA SA: Serum stimulates Na entry and theNa-K pump in quiescent cultures of epitheial cels (MDCK). J Cel Physiol17:21—214, 1983.
RUSSEL, W. M. S.; BURCH, R. L. The Principles of Humane ExperimentalTechnique. John's Hopkins University, Baltmore, 1959.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 69/90
54
Referências
RUTISHAUSER, B. R.; KRÄMER, S. D.; BRAUN, A.; GÜNTHERT, M.; ALLENSPACH, H. W. MDCK Cell Cultures as an Epithelial In Vitro Model:Cytoskeleton and Tight Junctions as Indicators for the Definition of Age-Related Stages by Confocal Microscopy. Pharmaceutical Research, v.15, nº7, p. 964-971, 1998.
SALPHATI, L.; CHILDERS, K.; PAN, L.; TSUTSUI, K.; TAKAHASHI, L.Evaluation of a single-pass intestinal-perfusion method in rat for theprediction of absorption in man. Journal of Pharmacy and Pharmacology, vol.53, p. 1007-1013, 2001.
SOUZA J.; FREITAS Z. M. F.; STORPIRTIS S. Modelos in vitro paradeterminação da absorção de fármacos e previsão da relaçãodissolução/absorção. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 43(4),p. 515-527, out-dez 2007.
STEFFANSEN, B.; BRODIN, B.; NIELSEN, C. U. Membrane transport ofdrug candidates, in: Molecular Biopharmaceutics, ed. Pharmaceutical Press,London, UK, p. 113-254, 2010.
STORPIRTIS, S.; GONÇALVES, J. E.; CHIANN, C.; GAI, M. N.Biofarmacotécnica: Princípios de Biodisponibilidade, Bioequivalência,Equivalência Farmacêutica, Equivalência Terapêutica e Intercambialidade deMedicamentos. Biofarmacotécnica, p. 4-5, ed. Guanabara Koogan, 2009.
TAVELIN S.; GRASJO, J.; TAIPALENSUU, G. O.; ARTURSSON, P. Applications of Cell Culture in Studies of Drug Transport. Methods inMolecular Biology, vol 188: Epithelial Cell Culture Protocols, p.233 - 272, Ed.Humana Press, 2002.
UNGELL, A. L. B. Caco-2 replace or refine? Drug Discovery Today:Technologies, v. 1, p. 423-430, 2004.
VOLPE, D. A. Application of method suitability for drug permeabilityclassification. AAPS Journal, v. 12, n. 4, p. 670- 677, Dec 2010. ISSN 1550-7416.
WAHAJUDDIN; SINGH, S. P.; RAJU, K. S. R.; NAFIS, A.; JAIN, G. K.Simultaneous determination of nine model compounds in permeabilitysamples using RP-HPLC: Application to prove the cassette administrationprinciple in single pass intestinal perfusion study in rats. Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 67-68, p. 71-76, 2012.
WILSON, T.H.; WISEMAN, G. The use of sacs of everted small intestine forthe study of the transference of substances from the mucosal to the serosalsurface. J. Physiol. 123, 116-125,1954.
WPI- World Precision Instruments Inc. EVOM2 and EndOhm Manual of
instructions. Sarasota Center Boulevard, FL, USA.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 70/90
55
Referências
ZAKELJ S, LEGEN I, VEBER M, KRISTL A. The influence of buffercomposition on tissue integrity during permeability experiments “in vitro”.International journal of pharmaceutics, 2004.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 71/90
56
Anexos
ANEXOS
6.1. ANEXO A – P ARECER DO COMITE DE ÉTICA
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 72/90
57
Anexos
6.2. ANEXO B – CONFIRMAÇÃO DE SUBMISSÃO DO ARTIGO
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 73/90
58
Anexos
6.3. ANEXO C – NORMAS DE PUBLICAÇÃO DO ARTIGO
Journal of Pharmaceutical Sciences
Copyright © 2014 Wiley Periodicals Inc. and the American Pharmacists Association
Edited By: Dr. Ronald T. Borchardt
Impact Factor: 3.007
ISI Journal Citation Reports © Ranking: 2013: 20/58 (Chemistry Medicinal); 43/148
(Chemistry Multidisciplinary); 76/254 (Pharmacology & Pharmacy)
Online ISSN: 1520-6017
Author Guidelines
NIH Public Access Mandate
For those interested in the Wiley-Blackwell policy on the NIH Public Access
Mandate, please visit our policy statement.
Author Services – Online production tracking is now available for your article
through Wiley-Blackwell's Author Services. Author Services enables authors to track
their article - once it has been accepted - through the production process to
publication online and in print. Authors can check the status of their articles online
and choose to receive automated emails at key stages of production. The author will
receive an email with a unique link that enables them to register and have their articleautomatically added to the system. Please ensure that a complete email address is
provided when submitting the manuscript. Visit http://authorservices.wiley.com for
more details on online production tracking and for a wealth of resources including
FAQs and tips on article preparation, submission and more.
• Permission Request Form
• NIH Statement
Author Guidelines
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 74/90
59
Anexos
All submitted manuscripts should contain previously unpublished original
research. Submitted manuscripts should not be under consideration for
publication elsewhere.
1. Online Submission and Peer Review
Authors should ensure that papers conform to the scientific and style instructions
given below. In order to expedite the publication process the Journal requires that
manuscripts be submitted online at http://mc.manuscriptcentral.com/jpharmsci .
Journal of Pharmaceutical Sciences has a completely digital submission, review, and
production process. We therefore ask for production-quality files at the time of
submission of your manuscript. This will speed the production and distribution of
your work across a variety of print and electronic platforms. If you don’t follow the
simple guidelines given below, your submission will be returned to you for
additional revision. This will of course delay review and, in the event that your work
is accepted, would delay publication. Therefore we ask that you pay careful attentionat this time and we thank you for your cooperation.
If you have not already done so, create an account for yourself in the system at the
submission site, http://mc.manuscriptcentral.com/jpharmsci by clicking on the
"Create an Account" button (you may check the progress of your manuscript
throughout the review process by logging in and checking your Author Center).
Please follow on-screen instructions and the system will guide you through the
submission process. At the “File Manager” screen, you will be asked to upload
manuscript files. Please designate the Peer-Review Version of your manuscript
(incorporating all elements) as a “File For Review” (by selecting “Yes” in the drop-
down box). Production-ready files (separate elements) should be designated as “Files Not For Review” (by selecting “No” in the drop-down box).
Online help is available to you at all times during the process. You are also able to
exit/re-enter at any stage before finally "submitting" your work. All submissions are
kept strictly confidential. You may contact the Journal's Editorial Assistant, Tammy
Dunning, at [email protected], or at tel.785-864-5919, fax 785-864-5875.
TEXT
Submit your text in DOC format. Do not embed figures or tables in this document.
These should be submitted as separate files.
TABLES
Tables should be created with a word processor and saved in either DOC or RTF
format. Do not embed tables in your text. Tables should be on separate pages and
saved as one file in DOC format.
FIGURES
To ensure the highest print quality, your figures should be submitted in either TIF or
EPS format at 300 dpi. For more instructions on preparing high quality figures,
please see our Graphics FAQ.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 75/90
60
Anexos
COLOR FIGURES
In addition to the above resolution guidelines, color figures must be submitted in a
CMYK color. Do not submit color figures as RGB.
2. Scope of the Journal of Pharmaceutical Sciences.
JPharmSci® focuses on two major questions of importance to pharmaceutical
scientists: (i) What are the physical and biological barriers that limit the access of
drugs to their therapeutic targets?; and (ii) How can drugs, excipients, traditional
formulations, novel drug delivery systems and drug products be designed to
maximize therapeutic efficacy? Answers to these questions have in the past and will
in the future be forthcoming from research in a variety of scientific disciplines
including but not limited to the following: physical pharmacy; pharmaceutics;
pharmaceutical technology; drug delivery; pharmaceutical engineering; materials
science; nanotechnology; animal, human, cellular and molecular biopharmaceutics;
animal and human pharmacokinetics, pharmacodynamics and pharmacogenomics;
drug metabolism and transport; biotechnology; medical chemistry, including drugdesign and prodrug strategies; biophysical chemistry; analytical and bioanalytical
chemistry; physical organic, organic, and computational chemistry; molecular
modeling; immunology; biochemistry; and cell and molecular biology. The scientific
content of manuscripts submitted to JPharmSci® should fit into one of the following
subject categories:
Drug Discovery-Development Interface: Manuscripts in this scientific category
should include descriptions of quantitative and mechanistic research in
pharmaceutics, biopharmaceutics, pharmacokinetics, pharmacodynamics and drug
metabolism and transport that are normally conducted during the discovery of
organic chemistry-based and biotechnology-based hits, leads and potential drugcandidates. Research results of particular interest to the readers of JPharmSci®
would include those that afford valuable, new information about how a molecule's in
vitro and in vivo behavior are influenced by its molecular and physico-chemical
properties, traditional formulations and novel delivery systems used in lead
optimization studies. This scientific category would also encompass manuscripts that
describe: (i) new and novel analytical methodologies and that would facilitate and/or
more accurately and completely characterize the physico-chemical and biological
properties of hits, leads and potential drug candidates; and (ii) new and novel
formulations strategies and drug delivery systems, including those built on bio-and
nanotechnologies, that would enhance the delivery of these molecules to their
pharmacological targets in animal models.
Pharmaceutical Biotechnology: Manuscripts in this scientific category should
include descriptions of quantitative and mechanistic research in pharmaceutics, drug
delivery and pharmaceutical technology that are normally conducted during the
preclinical and clinical drug development of biotechnology-based drug candidates
and drugs (e.g. peptides, proteins, antibodies, vaccines, DNA, RNA). Research
results of particular interest to the readers of JPharmSci® would include those that
afford valuable, new information about how a molecule's in vitro and in vivo
behavior is influenced by its molecular and physico-chemical properties, traditional
formulations and novel drug delivery systems used in preclinical and clinical studies
and the manufacturing processes that give rise to the final drug product. This
scientific category would also encompass manuscripts that describe: (i) new and
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 76/90
61
Anexos
novel analytical methodologies that would facilitate and/or more accurately and
completely characterize the physico-chemical and biological properties of
biotechnology-based drug candidates and drugs; and (ii) new and novel formulations
strategies and drug delivery systems, including those built on bio-and
nanotechnologies, that would enhance the delivery of these types of molecules to
their pharmacological targets in animals and humans.
Pharmaceutics, Drug Delivery and Pharmaceutical Technology:
Manuscripts in this scientific category should include descriptions of quantitative and
mechanistic research in pharmaceutics, drug delivery and pharmaceutical technology
that are normally conducted during the preclinical and clinical development of
organic chemistry-based drugs based drugs or drug candidates. Research results of
particular interest to the readers of JPharmSci® would include those that afford
valuable, new information about how the in vitro and in vivo behavior of a drug
molecule or formulation excipient is influenced by its molecular and physico-
chemical properties, traditional formulations and novel drug delivery systems used in pre-clinical and clinical studies and the manufacturing processes that give rise to the
final drug product. This scientific category also encompasses manuscripts that
describe: (i) new and novel analytical methodologies that facilitate and/or more
accurately and completely characterize physico-chemical and biological properties of
biotechnology-based drugs and drug candidates; (ii) new and novel pro-drug
strategies and formulation strategies and drug delivery systems, including those built
on bio- and nanotechnologies, that enhance the delivery of these types of molecules
to their pharmacological targets in animals and humans; and (iii) new and novel
developments in manufacturing of drugs and drug delivery systems, including
continuous manufacturing and the Quality by Design concept.
Pharmaceutical Nanotechnology:
Manuscripts in this scientific category should describe quantitative and mechanistic
experimental or theoretical research in nanoscale-based pharmaceuticals or
diagnostics in which the innovation resides specifically in the nanoscale aspects of
the work. Manuscripts reporting advances in pharmaceutical nanotechnology that are
being disclosed for the first time would be of particular interest. Suitable topics in
this category include advances in the fabrication of nanoscale materials with
demonstrably new or significant functionality potential for pharmaceutical
applications. Additional topics include improved quantitative methods ofcharacterization of nanoscale pharmaceutical materials and mechanistic studies that
contribute to an improved understanding of functionality of nanoscale-based
technologies with clear therapeutic implications. The manuscript's conclusions
should be supported by relevant in vitro and/or in vivo experimenal data and
appropriate statistical analysis. Notable exceptions to the requirement for appropriate
physical and biological characterization are : (i) comprehensive and complete
theoretical or computational studies; and (ii) meta-analyses of historical data or
reviews of the existing literature.
Pharmacokinetics, Pharmacodynamics and Drug Transport and Metabolism:
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 77/90
62
Anexos
Manuscripts in this scientific category should encompass quantitative and
mechanistic research normally conducted during the preclinical and clinical drug
development of organic chemistry-based or biotechnology-based drug candidates or
drugs that affords valuable, new information (e.g. drug-drug interactions) about the
molecule's in vitro metabolism and/or in vitro absorption, distribution, metabolism
and excretion (ADME) and how these properties relate to the molecule's in vivo pharmacological and toxicological properties. This scientific category would also
encompass manuscripts that describe new and novel analytical methodologies that
would facilitate and/or more accurately and completely characterize the
pharmacokinetics, pharmacodynamic and drug metabolism and transport properties
of these types of drug candidates and drugs in animals and humans.
Global Health: Manuscripts in this scientific category should encompass
descriptions of quantitative and mechanistic research in pharmaceutics,
biopharmaceutics, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and metabolism and
transport properties that are normally conducted during the discovery of organic
chemistry-based and biotechnology-based hits, leads and potential drug candidatesand the preclinical and clinical development of drug candidates and drugs targeting
diseases common in developing countries. Research results of particular interest to
the readers of JPharmSci® would include those that afford valuable, new information
about how a molecule's in vitro and in vivo behavior are influenced by its molecular
and physico-chemical properties, traditional formulations, novel drug delivery
systems and manufacturing processes. The scientific category would also encompass
manuscripts that describe new and novel analytical methodologies that would
facilitate and/or more accurately and completely characterize the pharmaceutics,
pharmacokinetics, pharmacodynamics, drug metabolism, drug delivery and
manufacturing properties of these types of drug candidates and drugs in animals and
humans.
3. Types of Manuscripts.
The Editor-in-Chief and one Editor, as well as members of the Journal's Editorial
Advisory Board and independant experts, will review most manuscripts submitted to
JPharmSci®. However, the Editor-in-Chief and the Editors reserve the right to reject
a manuscript without conducting an in-depth review if they feel that the manuscript
is "out of scope" or it does not meet the minimal acceptance criteria for publication
in JPharmSci®.
Rapid Communications are preliminary accounts of significant and originalexperimental and/or theoretical results that fit within the scope of JPharmSci®. The
results must be of sufficient significance, originality and general interest to justify
accelerated publication. Authors are asked to write their manuscripts in a clear and
concise manner and to include only data crucial to arriving at their final conclusions.
Preferably manuscripts should not exceed 2,000 words of text and a total of 4 figures
and/or tables. Extra experimental and/or theoretical data in the form of figures and
tables should be deposited under Supporting Information.
Research Articles are comprehensive accounts of significant and original
experimental and/or theoretical results that fit within the scope of JPharmSci®.
Authors are asked to write their manuscripts in a clear and concise manner and to
include only data crucial to arriving at their final conclusions. Preferably manuscripts
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 78/90
63
Anexos
should not exceed, 5,500 words of text and a total of 8 figures and/or tables. Extra
experimental and/or theoretical data in the form of figures and tables should be
deposited under Supporting Information.
Notes differ from Rapid Communications in that they are final reports and fromResearch Articles in that they are limited in scope. Authors are asked to write their
manuscripts in a clear and concise manner and to include only data crucial to arriving
at their final conclusions. Preferably manuscripts should not exceed 2,000 words of
text and a total of 4 figures and/or tables. Extra experimental and/or theoretical data
in the form of figures and tables should be deposited under Supporting Information.
Lessons Learned are short articles (600 words) which provide authors with a means
of informing other scientists about critical issues, experiences and observations, the
descriptions of which would not be appropriate for a typical Research Article,
Communication, Note, Commentary or Review. Examples include, but are not
limited to, key insights into an unanticipated manufacturing problem, knowledgeaccumulated over a career of "tricks of the trade" for a given analytical or
formulation method, how to avoid a mistake that is repeated over and over again by
scientists in industry and academia. Each article will be reviewed directly by an
Editor who has expertise in the relevant scientific area. Because each of these articles
represents the personal opinion, experience and/or insights of the author(s), data are
not required (but could be described) nor does the identity of a given drug need to be
divulged. Articles may contain up to three key references.
General Commentaries, Global Health Commentaries and Clinical Trials and
Translation Medicine Commentaries (by invitation only) present author’s
considered opinion on a scientific or technical subjects within the scope JPharm Sci ®.
If the Commentary criticizes an article published in the JPharmSci®, the authors of
the original article will be given an opportunity to reply in the same issue in which
the Commentary is published. An author interested in preparing a Commentary for
JPharmSci® should provide a brief outline to Professor John Carpenter (Editor in
charge of General Commentaries and Global Health Commentaries) or Professor
Rodney Ho(Editor in charge of Clinical Trials and Translational Medicine),
requesting an invitation to submit a manuscript in one one of these categories.
Perspectives (by invitation only) articles summarize the viewpoints of distinguished pharmaceutical scientists with regard to the current status and future direction of the
field. Perspectives are similar in length to Commentaries and Reviews, and may be
submitted only by invitation. An author interested in preparing a Prespective for
JPharmSci® should provide a brief outline to Professor John Carpenter requesting an
invitation to submit a manuscript in this category.
Reviews (by invitation only) provide a comprehensive summary of broadly-based
topics of general interest to pharmaceutical scientists. Reviews are not limited as to
the number of words, tables, figures and references that may be included. An author
interested in preparing a Review for JPharmSci®
should provide a brief outline to
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 79/90
64
Anexos
Professor John Carpenter requesting an invitation to submit a manuscript in this
category.
Minireviews (by invitation only) are well-focused, well-documented examinations
of timely issues in the pharmaceutical sciences. The issues may be of a controversialnature, or may address a more narrowly focused area than those typically covered in
a Review. Minireviews are limited to approximately 3,000-4,000 words, including
tables, figures and references. An author interested in preparing a Minireview for
JPharmSci® should provide a brief outline to Professor John Carpenter requesting an
invitation to submit a manuscript in this category.
4. Preparation of Manuscripts.
(a) General Considerations. In order to expedite peer review, authors are required
to submit their manuscripts online at http://mc.manuscriptcentral.com/jpharmsci .
(See Section 1 above for details about the on-line submission process.)
Authors should write manuscripts in clear, concise English. The responsibility for all
aspects of manuscript preparation rests with the authors. Authors should note that
extensive changes or rewriting of the manuscript will not be undertaken by the
editors.
There are no page charges for publication in the Journal of Pharmaceutical Sciences.
(b) Suggested Reviewers. The Journal requires that submitting authors suggest at
least four reviewers, up to a maximum of six reviewers, two of which must be
Editorial Advisory Board (EAB) members; one must be a Scientific Advisor. Pleaseinclude suggested reviewers' contact information. A list of Editorial Advisory Board
(EAB) members and a list of Scientific Advisors can be found by clicking on the
corresponding link.
http://mc.manuscriptcentral.com/societyimages/jpharmsci/List_of_EAB_Members_Keywor
ds.xlsx
http://mc.manuscriptcentral.com/societyimages/jpharmsci/List%20of%20Scientific%20Advi
sor%20Keyword%20List.xlsx
(c) Title. Titles are of great importance for current awareness and for informationretrieval. The wording of titles should be chosen carefully to provide information on
the contents and to function as "points of entry" for information retrieval. Symbols,
formulas, or arbitrary abbreviations should not be included in the title, except
chemical symbols to indicate the structure of isotopically labeled compounds.
(d) Abstract. The abstract should briefly (80-200 words) present, in one paragraph,
the problem and experimental approach and state the major findings and conclusions.
It should be self-explanatory and suitable for reproduction without rewriting.
Footnotes or undefined abbreviations may not be used. If a reference must be cited,
complete publication data must be given.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 80/90
65
Anexos
(e) Keywords. Please provide up to 10 keywords that reflect the scientific content of
your manuscript. At least 5 of your selected keywords must come from the Journal's
official keyword list ( Official Keyword List (.pdf) ). In addition to facilitating
indexing of articles, our keyword system assists in the assignment of qualified
reviewers for your manuscript. In addition, each member of our Editorial Advisory
Board has selected keywords that are applicable to their own work.
(f) Abbreviations. Abbreviations are used without periods. Standard abbreviations
should be used throughout the manuscript. All nonstandard abbreviations should be
kept to a minimum and must be defined in the text following their first use and in a
footnote at the beginning of the manuscript.
(g) QSAR/QSPR. All manuscripts dealing with quantitative structure activity
relationships (QSAR) and quantitative structure property relationships (QSPR) must
identify individual chemical structures using Chemical Abstracts Service (CAS)
SciFinder. To aid authors in the use of CAS SciFinder for structure searching, please
click here for a Commentary written by Dr. Christopher Lipinski describing the procedure. This Commentary appears in Journal of Pharmaceutical Sciences 91(12):
2470-2472.
(h) Experimental Section. The experimental procedures should be described in
sufficient detail to enable others to repeat the experiments. Names of products and
manufacturers [with city, state, and country (if other than the U.S.)] should be
included only if alternate sources are deemed unsatisfactory. Brand names may be
used only once in the manuscript. For subsequent designation, use "formulation A",
product B", etc. Novel experimental procedures should be described in detail, but
published procedures should merely be referred to by literature citation of both the
original and any published modifications. The purity of key compounds and
descriptions(s) of the method(s) used to determine purity should be included in this
section. For buffers, use terminology such as "20 mM potassium phosphate buffer
(pH 7.7) containing...". Also, state w/v or v/v when appropriate.
Identification of and precautions for handling hazardous chemicals and dangerous
procedures should be placed at the beginning of the section. An example would be "
Caution: The following chemicals are hazardous and should be handled carefully;
(list of chemicals and handling procedures or references) ".
Manuscripts containing data generated from animal and/or human studies mustspecify the committee and the institution that approved the experimental protocols
used to generate these data.
(i) Results. The results should be presented concisely. Tables and figures should be
designed to maximize the presentation and comprehension of the experimental data.
Attention should be paid to the matter of significant figures (usually, no more than
three). The same data should not be presented in more than one figure or in both a
figure and a table. As a rule, interpretation of the results should be reserved for the
discussion section of a Research Article , but under some circumstances it may be
desirable to combine results and discussion in a single section.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 81/90
66
Anexos
(j) Discussion. The purpose of the discussion is to interpret the results and to relate
them to existing knowledge in the field in as clear and brief a fashion as possible.
Information given elsewhere in the manuscript should not be repeated in the
discussion. Extensive reviews of the literature should be avoided.
(k) References and Notes. Literature references and notes must be numbered in oneconsecutive series by order of mention in the text, with numbers as unparenthesized
superscripts. The accuracy of the references is the responsibility of the author. The
complete list of references and notes should be typed double-spaced on separate
page(s) at the end of the manuscript and follow the format shown. All references
should include titles. For journals: Yoneto K, Li SK, Higuchi WI, Jiskoot W, Herron
JN 1996. Fluorescence probe studies of the interactions of 1-alkyl-2-pyrrolidones
with stratum corneum lipid liposomes. J Pharm Sci 85:511-517. For edited books:
Rall TW, Schleifer LS. 1985. Drugs effective in the therapy of the epilepsies. In
Gilman AG, Goodman LS, Rall TW, Murad F, editors. The pharmacological basis of
therapeutics, 7th ed., New York: Macmillan Publishing Co. p 446-472. List
submitted manuscripts as "in press" only if formally accepted for publication;otherwise, use "unpublished results" after the names of authors. Any footnotes to the
text should be incorporated in the correct numerical sequence with the references.
(l) Supporting Information. The Supporting Information format of this journal can
accommodate and make readily available almost any type of supplementary figures
or data (e.g., reproductions of spectra, experimental procedures, tabulated data,
expanded discussion of peripheral findings, etc.). The author should include a
Supporting Information Available statement that describes the material at the end of
the printed manuscript text. Consult a current issue of the Journal for the proper
wording of this statement. Supporting Information should be clear and of high
contrast (suitable for direct photoreproduction) and submitted in quadruplicate on
8.5- × 11-in. paper. All pages of Supporting Information must be consecutively
numbered. Captions or legends for figures, spectra, etc., must appear directly on the
figure. Supporting Information is available free of charge via the Internet
(www.wileyonlinelibrary.com).
(m) Acknowledgments. This section should acknowledge financial support,
technical assistance, advice from colleagues, gifts, etc. Permission must be received
from persons whose contribution to the work is acknowledged in the manuscript.
(n) Spectral Data. It may be desirable to include such data for representativecompounds in a series, for novel classes of compounds, and in structural
determinations. Usually, it is not desirable to include routine spectral data for every
compound in the manuscript. Papers where interpretations of spectra are critical to
structural elucidation and those in which band shape or fine structure needs to be
illustrated may be published with spectra included. When such presentations are
deemed essential, only pertinent sections should be reproduced.
(o) Experimental Data. Experimental methods must be referenced or described in
sufficient detail to permit the experiments to be repeated by others. Detailed
descriptions of experimental methods should be placed in the experimental
procedures section. Data may be presented as numerical expressions in tables or ingraphical form with no duplication of information in the text. If tables or figures
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 82/90
67
Anexos
include a minimal number of experimental values (< four), the data should be
presented in the text. Units should be abbreviated without punctuation and with no
distinction between singular and plural forms (e.g., 1 mg, 25 mg).If possible,
statistical significance of the experimental data should be provided. Statistical
probability ( p ) in tables, figures, figure legends and text should be expressed as * p
< 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001. For multiple comparisons within a table,footnotes italicized in lower case, superscript letters should be used and defined in
the table legend. References to statistical methods of calculation should be provided.
If statistical limits cannot be provided, the number of determinations and some
indication of the variability and reliability of the results should be provided. For
animal experimental data, doses and concentrations should be expressed as molar
quantities (e.g., mmol/kg, mM) when comparisons are made between compounds
having large differences in molecular weights. The routes of administration of test
compounds and vehicles used should be indicated. For animal and human studies,
authors must specify the committee and the institution that approved the
experimental protocols used to generate these data.
If experimental data on proprietary compounds (i.e. compounds whose chemical
structures are not available in the public domain) and/or using proprietary procedures
(i.e. experimantal procedures and/or components of procedures that are not described
in the public domain) are provided in a manuscript, authors should carefully read the
next two paragraphs.
Traditionally, scientific papers must reveal sufficient information for the work to be
repeated by others. That tradition led to the policy that JPharmSci™ has applied to
manuscripts that contain information on proprietary small molecules. This policy
essentially states that information pertaining to proprietary (small molecule)
compounds can be published providing that, in the opinion of the reviewers and
editors, the paper would be publishable based solely on the information derived from
studies of known compounds. Thus, information on proprietary compounds has been
considered to be supplemental while the decision to publish or not has relied on
compounds for which structures were disclosed.
Studies of proprietary proteins and other biologicals pose a difficult situation for
JPharmSci™. In some cases, complete structures may not have been determined or,
even if the structure is available, compounds having identical structures may be
difficult for others to generate (e.g., the amino acid sequences of immunoglobulin
hypervariable regions). Yet, interesting studies of proprietary biologicals cannevertheless be envisioned that may be deemed to have sufficient value that the
failure to reveal detailed structural information should not be a deterrent to
publication. Therefore, the journal will determine the acceptability of such papers on
an individual basis. Decisions of acceptability will be made using the following
criteria: (a) the structural information provided is adequate for the purpose of
evaluating the paper using rigorous scientific standards; (b) the structural information
provided is sufficient to enable others to verify the results by conducting essentially
the same experiments; and (c) the work is judged to be of sufficient importance that a
lack of complete structural information does not significantly detract from its
scientific contributions.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 83/90
68
Anexos
(p) Tables. Tabulation of experimental results is encouraged when this leads to more
effective presentation or to more economical use of space. Tables should be
numbered consecutively with Arabic numerals. Provide a brief title with each table
and a brief heading for each column. Clearly indicate the units of measure
(preferably SI). Data should be rounded to the nearest significant figure. Explanatory
material referring to the whole table is to be included as a footnote to the title (a).Footnotes in tables should be given lower case letter designations and cited in the
tables as italicized superscripts. Tables that require special treatment, such as
insertion of arrows or other special symbols under or over alphanumeric characters,
or contain many structures should be submitted as camera-ready copy. All tables
should be cited in the text.
(q) Illustrations. The quality of the illustrations printed in your paper depends on the
quality of the originals you provide. Electronic submission of illustrations is
required. Preferred formats for graphics and artwork are TIFF (tagged image file
format) and EPS (Encapsulated PostScript). John Wiley & Sons, Inc. journal pages
are now produced completely electronically. Please see our Graphics FAQ for moreinformation.
In preparing illustrations, contrast is important. Use dark black ink on high quality,
smooth, opaque white paper. Ordinary white bond paper works well. Avoid tracing
paper or textured "artist" papers.
Illustrations must fit a one- or two-column format on the journal page: For efficient
use of journal space, single column illustrations are preferred.
Single (preferred) Double
Minimum Width
9 cm (3.5 in)
Maximum Width
8 cm (3.125 in) 16.5 cm (6.5 in)
Maximum Depth
23 cm (9 in) 23 cm (9 in)
For best results, submit illustrations in the actual size at which they should
appear in the journal. Original illustrations which do not need to be reduced to fit a
single or double column will yield the best quality. Lettering should be no smaller
than 6 points. (Helvetica type works well for lettering.) Lines should be no thinner
than 0.5 point. Lettering and lines should be of uniform density. If you must submit
artwork that must be reduced, use larger lettering and thicker lines so that, when
reduced, the artwork meets the above-mentioned parameters. Avoid using complextextures and shading to achieve a three-dimensional effect. To show a pattern, choose
a simple cross-hatch design.
Color . All color figures will be reproduced in full color in the online edition of the
journal at no cost to the authors. Authors are encouraged to submit color illustrations
that highlight the text and convey essential scientific information. For best
reproduction, bright, clear colors should be used. Dark colors against a dark
background do not reproduce well; please place your color images against a white
background whenever possible. Please email [email protected] for further
information.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 84/90
69
Anexos
Chemical Structures . Structures should be produced with the use of a drawing
program such as ChemDraw. Authors using the current versions of ChemDraw,
ChemIntosh, and ChemWindows will find the necessary parameters incorporated
into these programs ("JOC Document" under the Windows menus for ChemDraw
and "Reduce 60% for JOC Style" under the Options menu for
ChemIntosh/ChemWindows). In ChemDraw version 4.5, files should be saved inTIFF format to allow use of electronic files in production (see journal home page
"Information for Authors" for further guidelines).
(r) Nomenclature. It is the responsibility of the authors to provide correct
nomenclature. All nomenclature must be consistent and unambiguous and should
conform with current American usage. Insofar as possible, authors should use
systematic names similar to those used by Chemical Abstracts Service, the
International Union of Pure and Applied Chemistry, and the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology.
The chemical names for drugs should be used. If the terminology is unwieldy,nonproprietary names of drugs may be used throughout the manuscript after the first
mention and identification. Formally adopted nonproprietary names listed in United
States Adopted Names(USAN) should be used. In cases in which a name has not
been assigned by USAN, the International Nonproprietary Names (INN) , approved
by the World Health Organization, should be used. Trade names and laboratory
codes should not be used except as additional information.
(s) Analyses. Adequate evidence to establish identity and purity should be provided
for new compounds. When possible, this should include elemental analysis. The
purity of compounds used for biological testing should be stated with a description of
the method used to evaluate it.
(t) Hazardous Materials. All hazardous chemicals should be clearly identified as
such. Precautions for handling dangerous materials or for performing hazardous
procedures should be explicitly stated and referenced.
5. Proofs and Reprints. Proofs are sent to the author who submitted the papers.
Authors are directed via email to download proofs from Wiley Author Services.
Proofs should be verified against the manuscript and appropriate corrections made.
Substantial changes in a manuscript after type has been set require editorial approval
and in some cases may be cause for re-reviewing. An order form for reprints will besent with the proofs. Please return the reprint order form, along with a purchase order
or check, to John Wiley & Sons, Inc. Reprints will be shipped within 2 weeks after
the printed journal date.
6. Publication Online. Articles accepted for publication in the Journal of
Pharmaceutical Sciences will be posted in Early View and then into the Online
version of the journal (www.wileyonlinelibrary.com) as soon as author corrections to
proofs are received and incorporated. This can occur anywhere from 2 to 6 weeks
well in advance of the cover date of the printed issue. Authors should take this into
account when planning their intellectual and patent activities related to an article.
The actual date on which the article is posted online is recorded in a separate line atthe bottom of the first page of the article in the printed issue.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 85/90
70
Anexos
7. Corrections. If errors of consequence are found in the published paper, a
correction of the error should be sent by the author to the Editor-in-Chief for
publication in the journal’s Errata Section.
8. Copyright Transfer Agreements (CTA) are located in Wiley Author Services.
You will be notified by email after acceptance on how to access and submit yourCTA for the Journal.
9. Confirmation of manuscript content must accompany initial submission. Manuscripts submitted to the Journal of Pharmaceutical Sciences should contain
significant, unpublished and original data not being considered simultaneously for
publication elsewhere. All authors should be aware of and in agreement with the
submission of this manuscript and share responsibility for its content. The
manuscript should provide full and appropriate credit to those who contributed to the
underlying hypothesis and the generation and interpretation of the experimental data.
Related research in the field should be acknowledged in the manuscript through
appropriate literature citations. Manuscripts should be devoid of any forms of plagiarism with respect to ideas, data, words, graphic materials or other forms of
communication. All authors should be aware that this manuscript will be checked for
plagiarism using CrossCheck anti-plagiarism software.
10. Scientific Misconduct Issues. An alleged violation of any of these basic rules of
scientific ethics will be investigated confidentially in accord with the procedures set
forth in the American Medical Association Manual of Style: A guide for Authors and
Editors (10th Edition). If the violations are deemed to be sufficiently serious, the
Editor-in-Chief will request that the authors provide a written explanation. If the
authors do not provide an explanation or the explanation is unsatisfactory, such that
the Journal's Editorial Team believes that the evidence clearly shows that scientific
misconduct did occur, the Editor-in-Chief would promptly reject the manuscript or
proceed to retract a published manuscript. In addition, the Editor-in-Chief reserves
the right to notify the authors's institution for the violation of the Journal's scientific
ethics policy. The Editor-in-Chief also reserves the option to request the author's
institution initate a formal investigation into the alleged violation of scientific ethics
and to report back to the Journal in a timely manner. If the formal institutional
investigation confirms scientific misconduct, the Editor-in-Chief will promptly reject
a pending manuscript or proceed to retract a published manuscript. Further,
JPharmSciTMEditorial Team reserves the right to impose punitive actions (e.g. ban on
publishing in the Journal) on authors proven to have violated any of the basic rules ofscientific ethics.
11. Conflicts of Interest Guidelines: Authors. Authors should acknowledge all
sources of funding used to generate the research results described in a manuscript
submitted to the journal. This includes government, corporate, foundation, private or
institutional funding. Authors should also disclose in their submitted manuscript any
personal financial or non-financial interests that, based on their knowledge, might be
affected by the publication of the results contained in the authors' manuscript. If
authors have no financial or non-financial interests that represent conflicts of interest,
they should inform the Editor-in-Chief in writing in the manuscript submission letter.
If authors have financial or non-financial interests that represent potential conflicts ofinterest, they should disclose these conflicts in a footnote or in the acknowledgement
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 86/90
71
Anexos
section of the manuscript. In the process of selecting "preferred reviewers" for their
manuscripts, authors should avoid suggesting individuals with whom they have
personal or professional relationships that might bias their judgment of the
manuscript's scientific merits.
12. Conflicts of Interest Guidelines: Reviewers. Reviewers should not evaluate amanuscript authored or co-authored by a person with whom the reviewer has
personal or professional relationships that might bias their judgment of the
manuscript's scientific merits. Reviewers should be sensitive to the appearance of
potential conflicts of interest when the content of the manuscript relates directly to
the reviewer's published or unpublished research. If in doubt, the reviewer should
immediately notify the appropirate Editor and seek their advice on whether to
proceed with the review. Reviewers should also be sensitive to the appearance of
potential conflict of interest when the manuscript describes results from experiments
using patented technologies, which are competitive with patented technologies
invented by the reviewer or the reviewer's employer.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 87/90
72
Anexos
6.4. ANEXO D – CROMATOGRAMAS DOS FARMACOS TESTADOS A PARTIR DA
REVALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS FARMACOPEICAS CONFORME SEÇÃO 3.8.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 88/90
73
Anexos
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 89/90
74
Anexos
6.5. ANEXO E – GRÁFICOS DA LINEARIDADE PARA OS FÁRMACOS TESTADOS
CONFORME SEÇÃO 3.8.
7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014
http://slidepdf.com/reader/full/dissertacao-lais-cristina-da-silva-2014 90/90
75
6.6. ANEXO F – GRAFICOS DA PRECISÃO E EXATIDÃO PARA OS FARMACOS
TESTADOS CONFORME SEÇÃO 3.8.
Top Related