Função das Membranas Celulares
5_Transporte Activo Transmembranar
Licenciatura em Engenharia Biomédica
Luís Martinho do Rosário[Depto. de Bioquímica / FCTUC]
#46
EQUILÍBRIO DE DONNAN
K+
A- Cl-K+
i
proteínas carregadasnegativamente
membrana permeável a K+ e Cl-
(impermeável a A-)
volume constante(não há fluxos líquidos de H2O)
Inicialmente [KA]i,t=0 = [KCl]o,t=0
o
Gradiente de concentração para Cl-
Fluxo de Cl- de o para i
Fluxo de K+ de o para i de igual magnitudeAo fim de t=∆t
[K+]i ≠ [K+]o e [Cl-]i ≠ [Cl-]o
[K+]i [Cl-]i = [K+]o [Cl-]o
Em = RT/F ln([K+]o/[K+]i) = RT/F ln([Cl-]i/[Cl-]o)
Regra de Donnan
(electroneutralidade)
Pela regra de Donnan e aplicando o princípio da electroneutralidade a ambos os compartimentos... [K+]i
2 = [K+]o2 + [A-]i[K+]i
[K+]i > [K+]o e [Cl-]o > [Cl-]i
K+> K+
Cl- < Cl-A-i
o
33 67
133 67166 134
Cl-
K+
Total
i o
(mM)
Exemplo [KA]i,t=0 = [KCl]o,t=0 = 100 mM
+ A- (100 mM)
Osmolaridade em i > Osmolaridade em o
Fluxo de H2O de o para i
Aumento de volume e ruptura da célula
(membrana elástica)
Na+ como compensador osmótico
[K+]i + [Cl-]i + [A-]i + [Na+]i ≅[K+]o + [Cl-]o + [Na+]o
Bomba de Na+
Na+/K+-ATPase#47
Exercícios
1 – Aplicando a Regra de Donnan e o princípio da electroneutralidadea ambos os compartimentos considerados em #50, derive a expressão indicada no topo de #51
Na+/K+-ATPase
Estequiometria 3Na+/2K+
Energética Transporta iões contra gradiente electroquímico(acoplamento à hidrólise de ATP)
Inibidores Glicosídeos cardíacos (ex: ouabaína)
Substratos Na+ e MgATP no lado intracelular; K+ (ou Rb+, NH4
+...) no lado extracelular
Estrutura Heterodímero (subunidades α e β)
Mecanismo Transições E1-E2 promovidas por fosforilação /desfosforilação)
Fosforilação Transição E1 → E2E2~P tem elevada afinidade a K+ e baixaafinidade a Na+
Desfosforilação Transição E2 → E1E1 tem elevada afinidade a Na+ e baixaafinidade a K+
#48
Ca2+-ATPases
Estequiometria 1Ca2+ / CicloEnergética Transporta iões contra gradiente electroquímico (acoplamento à hidrólise de ATP)
Inibidor Vanadato
Substratos Ca2+ e MgATP no lado intracelular
Mecanismo Transições E1-E2 promovidas por fosforilação / desfosforilação (E1: alta afinidade a Ca2+; E2~P: baixa afinidade a Ca2+)
Regulação Calmodulina
Função Neutralização da entrada passiva de Ca2+
Membrana plasmática
[Ca2+]o >> [Ca2+]i
[Ca2+]i (rep.) ≅ 100 nM
Retículo endoplasmático / sarcoplasmático
Estequiometria 2 Ca2+ / Ciclo
Inibidor Tapsigargina
Regulação Fosfolambana
Função Armazenamento intracelular de Ca2+
E
E-Ca++2
2Ca++
ER cytosol membrane lumen
2Ca++
E~P-Ca++2 E~P-Ca++
2 ADP
Pi
ATP
#49
Ca++
enzyme phosphorylation
phosphate hydrolysis
SERCA Conformational Cycle
Structure/Function Relationships in the Calcium ATPasehttp://www.utoronto.ca/maclennan/rint1.htm
Toyoshima Lab – Movie, see “Resources”http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/StrBiol/E1-E2 transition
Stokes Structural Biology Labhttp://skirball.med.nyu.edu/~stokes/Download movie (reaction cycle of Ca-ATPase)
Alguns sites e animações de interesse
ATPases
ATPases tipo P
eg. Na+/K+-ATPase, Ca2+-ATPases, H+/K+-ATPases (mucosa gástrica)
Fosforilação reversível de um resíduo de ácido aspárticodurante o ciclo catalítico
Outras ATPases
eg. H+-ATPase mitocondrial (F1.F0-ATPase, tipo F)H+-ATPases de outros organelos (tipo V)
P-Class Pumps
ATP
C
O
O P O-
O-
O
C
O
OH
ADP
Enzyme-
Enzyme-
Pi
H2O
#50
Transporte activo
◘ Primário Uso directo de ATP como fonte de energia (ATPases). Proteína de transporte alterada por ligação covalente de fosfato
◘ Secundário Uso do gradiente electroquímico de um ião como fonte de energia.Proteína de transporte alterada por modulação alostérica, como resultado da ligação de iões (ex: Na+, Cl-)
Soluto
Soluto
Na+
Na+
[Na+] elevada
[Na+] baixa
►Co-transporte Soluto transportado no mesmosentido do ião
►Contra-transporte Soluto e ião transportados em sentidos opostos
Na+
Na+ X
X
Na+
Na+
X
X#51
Trocador Na+/Ca2+
Ca2+
3Na+
i
o
Estequiometria 3Na+/1Ca2+
Energética Transporta iões Ca2+ contra gradiente electroquímico(acoplamento ao contra-transporte de Na+)
Afinidade a Ca2+ Baixa em repouso. Aumenta quando a [Ca2+]iaumenta (regulação alostérica)
Reversão Potencial de reversão ENa/Ca = 3ENa – 2ECa
Modos Directo / inverso
Modo directo (efluxo)Em < ENa/Ca
Modo inverso (influxo)Em > ENa/Ca
Potencial de acção
Influxo de Ca2+
ENa/Ca
Efluxo de Ca2+
Digitalis e insuficiência cardíaca
Digitalis Inibição bomba Na+ [Na+]i [Ca2+]i Força contracção músculocardíaco
#52
Transportadores de equivalentes ácidos e regulação do pH citossólico
H+
-- - - -
Em
pHipHo
Distribuição passiva de H+s: EH ≈ Em
EH = RT/F ln ([H+]o/[H+]i) = 60(pHi-pHo)
Em repouso
Em = -60 mV pHi = pHo–1 (ou ∆pH = 1.0)Em = -90 mV pHi = pHo–1.5 (ou ∆pH = 1.5)
previsão para pHo = 7.4: pHi (repouso) ~ 5.9-6.4na realidade 6.9-7.2
H+
Na+
i
o
sítio de regulaçãoalostérica
Trocador Na+/H+
Bloqueado por amilorida e derivados
Alostericamente activado por H+sInibido quando pHi → 7.2
#53
Exercícios
1 – Derive a expressão que define o potencial de reversão do trocador Na+/Ca2+, considerando que a energia livre associada ao gradiente electroquímico de um ião X+ é dada por ∆GX=zF(Em-EX)
2 – Calcule o potencial de reversão do trocador Na+/Ca2+ para um miócitocardíaco em repouso, sabendo que [Na+]i/o ~ 10/140 mM e [Ca2+]i/o ~ 100 nM/2 mM. Qual é o modo de funcionamento do trocador nestas condições?
3 – O trocador Na+/H+ é um dispositivo fundamental para a regulação do pH intracelular. Explique por que razão o trocador contraria a tendência para a acidificação intracelular causada pelo influxo passivo de protões através da membrana celular (ou por exposição das células a pulsos breves de baixas concentrações de nigericina, um trocador K+/H+ artificial)
4 – A K+/H+-ATPase localizada na face luminal das células parietais do estômago está na base da acidificação do lúmen estomacal (essencial para a digestão de proteínas). Explique por que razão certos inibidores terapêuticos da bomba de H+ são comummente utilizados na terapia do excesso de acidez estomacal
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