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Laboratório de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto
Cori, G. T. & Cori, C. F. (1952) Glucose-6-phosphatase of the liver in glycogen storage disease, J Biol Chem. 199, 661-7.
Este paper é um marco histórico na medicina e na bioquímica.
Foi a primeira vez que se conseguiu provar uma hipótese que havia sido formulada no início do século XX: que algumas doenças congénitas poderiam ter como causa o deficit de uma enzima.
O trabalho foi feito por dois investigadores que tinham ganho o prémio Nobel da medicina em 1947.
Fosforílase do glicogénio
fosfoglicomútase
Glicose-6-fosfátase
Em 1952, já se conhecia a via de degradação do glicogénio. A via de síntese só foi descoberta no final dessa década (por Luis Leloir em 1959).
H2O
Alguns doentes tinham acumulação de glicogénio no fígado e episódios de hipoglicemia e porque em 1929 von Gierke tinha descrito os achados morfológicos em doentes com estas características a doença (de facto um síndrome a que correspondem várias doenças) tinha sido designada de “doença de von Gierke”.
Com base no que se conhecia sobre o metabolismo do glicogénio, Cori e Cori formularam hipóteses acerca da patogenia da doença de von Gierke e testaram essas hipóteses.
De acordo com o que se conhecia na época que hipóteses seriam plausíveis?
Será que o defeito está na glicose-6-fosfátase? Como testar esta hipótese?
1- Colheram amostras de fígado em indivíduos normais, em doentes com patologias hepáticas não relacionadas e com “doença de von Gierke”.
2- Prepararam homogeneizados de fígado a partir dessas amostras.
3- Mediram a actividade da enzima suspeita nesses homogeneizados.
4- Compararam os resultados obtidos com as diferentes amostras.
5- Procuraram interpretar os resultados.
6- Formularam novas hipóteses com base nesses resultados e testaram-nas.
Biopsia hepática
Homogeneizado de fígado
Método geral usado para medir a glicose-6-fosfátase.
A actividade da enzima foi calculada subtraindo os valores de Pi formado em ensaios gémeos que não incluíam o substrato.
Reagente que desnatura a enzima e reage com o Pipermitindo o seu doseamento
G6P
Meio de ensaio:
Volume = 1 mLTampão = citrato 30 mM, pH 6.8Homogeneizado hepático equivalente a 4 a 33 mg de fígado.Substrato = glicose-6-fosfato 5 mMTemperatura = 30ºCTempo de ensaio = 1 horaPararam a reacção com ácido tricloroacético, filtraram e dosearam a Pi formado.Expressaram os resultados em Pi formado por 100 mg de fígado.
A análise do glicogénio de CH mostrou que era anormal: demasiado ramificado.
Porque é que o resultado de CH era algo mais baixo que o normal?
Que doentes tinham, claramente valores muito baixos de glicose-6-fosfátase?
1- Dando-se a coincidência de 2 dos 3 resultados com valores muito baixos corresponderem a material de autópsia poderia isto querer dizer que a glicose-6-fosfátase sofreu degradação após a morte dos pacientes MAS e PS?
Os dados pareciam negar esta hipótese…que dados?
Perguntas?
2- Será que o fígado de MAS continha um inibidor que impedia a acção catalítica da glicose-6-fosfátase?Testaram e os dados obtidos também pareciam negar esta hipótese. Que dados?
3- Será a glicose-6-fosfátase era normal mas faltava uma substância não enzímica no fígado de MAS e PS que era essencial à actividade da enzima?
Ferveram fígado de CS… e os dados obtidos também pareciam negar esta hipótese.Que dados?
4- Será que o deficit poderia ser na fosfoglicomútase (e não na glicose-6-fosfátase) ?
5- Também se testaram as actividades de duas enzimas conhecidas como fosfátase ácida e alcalina. Usaram como substrato glicerofosfato e pH 5 no primeiro caso e pH 9 no segundo.
pH 5 pH 9
CS (controlo sem doença) 135 48
CH (deficit de enzima desramificante ?) 127 17
PS (deficit de glicose-6-fosfátase) 122 39
Para isso substituíram a glicose-6-P por glicose-1-P no meio de ensaio voltaram a testar a formação de Pi.No caso MAS: baixo Pi formado nos dois ensaios, acumulação de glicose-6-P quando se usou glicose-1-P como substrato.No caso CS (controlo): alta produção de Pi nos dois ensaios e não ocorreu acumulação de glicose-6-P quando se usou glicose-1-P como substrato.
Serão estes dados compatíveis com deficit de fosfoglicomútase?
Serão estes dados compatíveis com deficit de fosfátase ácida ou com deficit de fosfátase alcalina?
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