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Laboratório de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto

ruifonte@med.up.pt

Cori, G. T. & Cori, C. F. (1952) Glucose-6-phosphatase of the liver in glycogen storage disease, J Biol Chem. 199, 661-7.

Este paper é um marco histórico na medicina e na bioquímica.

Foi a primeira vez que se conseguiu provar uma hipótese que havia sido formulada no início do século XX: que algumas doenças congénitas poderiam ter como causa o deficit de uma enzima.

O trabalho foi feito por dois investigadores que tinham ganho o prémio Nobel da medicina em 1947.

Fosforílase do glicogénio

fosfoglicomútase

Glicose-6-fosfátase

Em 1952, já se conhecia a via de degradação do glicogénio. A via de síntese só foi descoberta no final dessa década (por Luis Leloir em 1959).

H2O

Alguns doentes tinham acumulação de glicogénio no fígado e episódios de hipoglicemia e porque em 1929 von Gierke tinha descrito os achados morfológicos em doentes com estas características a doença (de facto um síndrome a que correspondem várias doenças) tinha sido designada de “doença de von Gierke”.

Com base no que se conhecia sobre o metabolismo do glicogénio, Cori e Cori formularam hipóteses acerca da patogenia da doença de von Gierke e testaram essas hipóteses.

De acordo com o que se conhecia na época que hipóteses seriam plausíveis?

Será que o defeito está na glicose-6-fosfátase? Como testar esta hipótese?

1- Colheram amostras de fígado em indivíduos normais, em doentes com patologias hepáticas não relacionadas e com “doença de von Gierke”.

2- Prepararam homogeneizados de fígado a partir dessas amostras.

3- Mediram a actividade da enzima suspeita nesses homogeneizados.

4- Compararam os resultados obtidos com as diferentes amostras.

5- Procuraram interpretar os resultados.

6- Formularam novas hipóteses com base nesses resultados e testaram-nas.

Biopsia hepática

Homogeneizado de fígado

Método geral usado para medir a glicose-6-fosfátase.

A actividade da enzima foi calculada subtraindo os valores de Pi formado em ensaios gémeos que não incluíam o substrato.

Reagente que desnatura a enzima e reage com o Pipermitindo o seu doseamento

G6P

Meio de ensaio:

Volume = 1 mLTampão = citrato 30 mM, pH 6.8Homogeneizado hepático equivalente a 4 a 33 mg de fígado.Substrato = glicose-6-fosfato 5 mMTemperatura = 30ºCTempo de ensaio = 1 horaPararam a reacção com ácido tricloroacético, filtraram e dosearam a Pi formado.Expressaram os resultados em Pi formado por 100 mg de fígado.

A análise do glicogénio de CH mostrou que era anormal: demasiado ramificado.

Porque é que o resultado de CH era algo mais baixo que o normal?

Que doentes tinham, claramente valores muito baixos de glicose-6-fosfátase?

1- Dando-se a coincidência de 2 dos 3 resultados com valores muito baixos corresponderem a material de autópsia poderia isto querer dizer que a glicose-6-fosfátase sofreu degradação após a morte dos pacientes MAS e PS?

Os dados pareciam negar esta hipótese…que dados?

Perguntas?

2- Será que o fígado de MAS continha um inibidor que impedia a acção catalítica da glicose-6-fosfátase?Testaram e os dados obtidos também pareciam negar esta hipótese. Que dados?

3- Será a glicose-6-fosfátase era normal mas faltava uma substância não enzímica no fígado de MAS e PS que era essencial à actividade da enzima?

Ferveram fígado de CS… e os dados obtidos também pareciam negar esta hipótese.Que dados?

4- Será que o deficit poderia ser na fosfoglicomútase (e não na glicose-6-fosfátase) ?

5- Também se testaram as actividades de duas enzimas conhecidas como fosfátase ácida e alcalina. Usaram como substrato glicerofosfato e pH 5 no primeiro caso e pH 9 no segundo.

  pH 5 pH 9

CS (controlo sem doença) 135 48

CH (deficit de enzima desramificante ?) 127 17

PS (deficit de glicose-6-fosfátase) 122 39

Para isso substituíram a glicose-6-P por glicose-1-P no meio de ensaio voltaram a testar a formação de Pi.No caso MAS: baixo Pi formado nos dois ensaios, acumulação de glicose-6-P quando se usou glicose-1-P como substrato.No caso CS (controlo): alta produção de Pi nos dois ensaios e não ocorreu acumulação de glicose-6-P quando se usou glicose-1-P como substrato.

Serão estes dados compatíveis com deficit de fosfoglicomútase?

Serão estes dados compatíveis com deficit de fosfátase ácida ou com deficit de fosfátase alcalina?