Técnicas analíticas para la monitorización de fármacos biológicos
Dra. MD Bellés Medall
21 Octubre 2017
Fundamento del E.L.I.S.A
Equipos comerciales: diferencias
Inmunogenicidad
Otras técnicas
Interpretación resultados
Coste-efectividad monitorización farmacocinética anti-TNFs
La técnica ELISA de captura, empleada para lamonitorización de fármacos biológicos presentaentre sus ventajas, las siguientes; excepto:
A. Sencillez y automatización
B. Amplificación de la señal
C. Rapidez
D. Cuantificación fármaco biológicamente activo
¿Qué técnica analítica es considerada “goldstandard” para la determinación de fármacosbiológicos?
A. ELISA de captura
B. Radioinmunoensayo
C. Cromatografía
D. Ninguna de las anteriores
Paciente en tratamiento con IFX a dosis de 5 mg/Kg c/8semanas. Cmin=0.7 mcg/mL.¿Recomendarías la cuantificación del anticuerpo anti-IFX,mediante la técnica ELISA puente?(IT=3-7 mcg/mL, límite detección=0.3 mcg/mL)
A. Si, es muy probable que el paciente haya desarrollado inmunogenicidad
B. No, realizaría seguimiento farmacocinético estrecho.
C. Si, se recomienda cuantificar anticuerpo anti-fármaco en todas las muestras.
D. No, el paciente no presenta inmunogenicidad.
Resultado negativo para una determinación deanticuerpos anti-fármaco mediante técnica ELISApuente. ¿Cómo interpretaríamos este resultado?
A. Ausencia de inmunogenicidad
B. Resultado “no concluyente”
C. Presencia de inmunocomplejos fármaco/anticuerpo anti-fármaco
D. La técnica no cuantifica inmunogenicidad
¿Podemos comparar los resultados obtenidos porlos distintos equipos ELISA comercializados parala cuantificación de fármacos anti-TNF?
A. Si, son equipos idénticos.
B. No, son necesarios mas estudios de concordancia.
C. No, son equipos completamente distintos.
D. Si, se han contrastado con estudios de concordancia.
Disponemos de un equipo ELISA para cuantificarInfliximab. ¿Podríamos utilizar el mismo equipopara medir el fármaco biosimilar?
A. Si
B. No
C. Habrá que adquirir un equipo específico para el biosimilar
D. Se deberá confirmar con el fabricante la compatibilidad
Conjugado Ac-HRP Ac biotiniladoEstreptavidina-HRP
Sustrato TMB TMB
Solución parada ClH H2SO4
CP + +
CN + -
Calibración 6 ptos(0,024-12 mcg/mL)
5 ptos(0,1-16 mcg/mL)
Nº muestras/placa 40 42
Diluciones 1:10; 1:200 1:101
Infliximab-AAI X X X X X
Adalimumab-AAA X X X X X
Etanercept-AAE X X X X
Rituximab-AAR X X X X
Golimumab-AAG X X X X X
Certolizumab-AAC X X
Tocilizumab-AAT X X
Ustekinumab-AAU X X
Bevacizumab-AAB X X X
Trastuzumab-AAT X X X
Vedolizumab-AAV X X
Cetuximab-AAC X
Denosumab-AAD X
Nivolumab-AAN X X
Pembrolizumab-AAP X
Ipilimumab-AAI
Omalizumab-AAO X X
Aflibecept X
Unión No-covalente
Tª, pH, humedad, luz
Aspectos prácticos:
o Almacenamiento micropocillos
o Alicuotar muestras
o Homogeneizar
o Atemperar reactivos
Automatizado
Sencillo y rápido (2,5-3h)
Nº muestras/sesión = 40-42
Cuantificación del fármaco libre
Poco espacio (80x150cm, 1,9m3)
Amplificación de la señal
especificidad
Pérdida de reactividad (humedad, Tª,
luz)
Curva calibración/sesión
Ausencia patrón estándar
ELISA puente• Ac (-): datos “no–concluyentes”
• Baja especificidad:
oNo detecta IgG4
o Falsos positivos: FR, complemento activado
Disociación ácida20 μl suero + 100 ml ácido acético 300 mM (pH=3)
15 min , Tª amb
+ 31 μl Tris base sol (neutralizar)
5 min, agitar
+ 49 μl sol buffer (dil 1:10)
Disociación ácida• Estrategia para detectar precozmente inmunogenicidad
• Técnica cualitativa
• No se detecta IgG4
• % recuperación AAF :
o Desnaturalización de los AAF tras acidificación
o AAF baja afinidad pérdida por lavados
o Parcial formación de inmunocomplejos tras
neutralización.
• Técnicas: elevada variabilidad con diferencias
sistémicas.
• Resultados no comparables.
• Ensayos > sensibilidad para AAF: HMSA y RIA.
• concordancia en clasificación de los pacientes
según fallo secundario.
• Tras seguimiento a largo plazo: resultados
comparables.
Interpretación resultados
• No comparar resultados entre técnicas, ni equipos.
• ELISA puente:
o Datos “no concluyentes”
o Técnica cualitativa
o Unidades medida no estandarizadas (ng/mL;
AU/mL)
• Titulaciones bajas de Ac :
o Falso positivo
o Ac “transitorios”
o Fracaso secundario por inmunogenicidad
34 €/determinación 1 sesión trabajo/placa
(42 niveles/sesión)
40 €/determinación 2 sesiones trabajo/placa
(18 niveles/sesión)
60 €/determinación 4 sesiones trabajo/placa
(6 niveles/sesión)
Paracetamol
MTX
48 €/determinación 3 sesiones trabajo/placa
(10 niveles/sesión)
CysA
Teofilina €
La técnica ELISA de captura, empleada para lamonitorización de fármacos biológicos presentaentre sus ventajas, las siguientes; excepto:
A. Sencillez y automatización
B. Amplificación de la señal
C. Rapidez
D. Cuantificación fármaco biológicamente activo
¿Qué técnica analítica es considerada “goldstandard” para la determinación de fármacosbiológicos?
A. ELISA de captura
B. Radioinmunoensayo
C. Cromatografía
D. Ninguna de las anteriores
Paciente en tratamiento con IFX a dosis de 5mg/Kg c/8 semanas. Cmin=0.7 mcg/mL.¿Recomendarías la cuantificación del AAI, conELISA puente?(IT=3-7 mcg/mL, límite detección=0.3 mcg/mL)
A. Si, es muy probable que hay desarrollado inmunogenicidad
B. No, realizaría seguimiento farmacocinético estrecho.
C. Si, se recomienda cuantificar AAF en todas las muestras.
D. No, el paciente no presenta AAF.
Resultado negativo para una determinación deanticuerpos anti-fármaco mediante técnica ELISApuente. ¿Cómo interpretaríamos este resultado?
A. Ausencia de inmunogenicidad
B. Resultado “no concluyente”
C. Presencia de inmunocomplejos fármaco/anticuerpo anti-fármaco
D. La técnica no cuantifica inmunogenicidad
¿Podemos comparar los resultados obtenidos porlos distintos equipos ELISA comercializados parala cuantificación de fármacos anti-TNF?
A. Si, son equipos idénticos.
B. No, son necesarios mas estudios de concordancia.
C. No, son equipos completamente distintos.
D. Si, se han contrastado con estudios de concordancia
Disponemos de un equipo ELISA para cuantificarInfliximab. ¿Podríamos utilizar el mismo equipopara medir el fármaco biosimilar?
A. Si
B. No
C. Habrá que adquirir un equipo específico para el biosimilar
D. Se deberá confirmar con el fabricante la compatibilidad
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