Química Analítica / JCM
TLC - Cromatografia de camada fina
� Cromatografia de camada fina� TLC - Thin Layer Chromatography
� planar / adsorção / zonal / analítica
� possibilidade de desenvolvimento bidimensional e
� de quantificação
� Fases estacionárias� Adsorventes / diferentes de absorventes
� actividade de um adsorvente é determinada pela sua área superficial, a sua natureza química e o arranjo geométrico dos átomos superficiais
� propriedades de um adsorvente:☺ não deve dissolver na fase eluente☺ não deve reagir com a fase móvel☺ não deve reagir com os solutos☺ deve dar resultados reproductíveis☺ o processo de adsorção deve ser reversível☺ o adsorvente não deve ser muito caro
distância percorrida pelo solutoRf = -----------------------------------------------------------
distância percorrida pela frente do solvente
Camada de fase estacionária : 250 µµµµmCamada de fase estacionária : 250 µµµµm
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TLC - adsorventes
� Polares� vários óxidos inorgânicos ( sílica, alumina, magnésia)
☺ ordem de eluição dos solutos segue a polaridade deste s - solutos polares são fortemente retidos
� hidrocarbonetos saturados < hidrocarbonetos aromáticos < éteres < ésteres
≈ aldeídos ≈ cetonas < álcoois ≈ aminas < amidas < ácidos carboxílicos
� Não-polares� carvão activado
☺ ordem de eluição segue a polarizabilidade das molécul as� MAIS RETIDOS - compostos aromáticos, homólogos de maior peso molecular, moléculas com
átomos de halogénio ou enxofre
F o rtes M éd io s F raco s
s ilica ge l h id róxido de cá lc io ta lcoa lum ina carbona to de ca lc io am ido
carvão ac tivado m agnés ia suc rose
Ácidos : sílica (separa ácidos) Básicos: Alumina / magnésia (separa basesÁcidos : sílica (separa ácidos) Básicos: Alumina / magnésia (separa bases
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TLC - adsorventes
� Sílica gel� suporte mais popular (5-10 µm)� preparada por hidrólise do silicato de sódio
seguida de condensação e polimerização
� actividade resulta da presença dos grupos Si -- OH (silanol) à superfície� controlo da actividade por aquecimento durante a preparação
☺ activação recomendada (110º / 30 - 60 min)
� Sílica gel é ligeiramente ácida☺ esteróides, amino-ácidos, álcoois, hidrocarbonetos, lípidos e vitaminas
� Preparação� 50g / 60 ml água destilada - espalhar rapidamente / secar / activar
☺ H - sem impregnante☺ G - com 13% de sulfato de cálcio☺ F254 - com indicador fluorescente
� impregnação com nitrato de prata (20%) - separação de compostos com duplas ligações (menos duplas > Rf)
OSi
OSi
O
OH OH
O O
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TLC - adsorventes
� Alumina� Ainda muito comum
� Preparada por condensação do hidróxido de
alumínio hidratado
� A actividade depende quer dos átomos de oxigénio quer dos de alumínio☺ mais difícil de preparar dado que geralmente contem mais impurezas
� o conteúdo de água é muito importante para obter resultados reproductíveis☺ activação a 75 - 110 º / 30 - 60 min
� Pode ser obtida com superfície ácida, neutra ou básica (a mais comum)☺ separação de corantes, vitaminas e alcalóides
� Preparação� 30g / 40 ml de água destilada - espalhar rapidamente / secar e activar
☺ pode conter impregnantes e indicadores de fluorescên cia
Al Al Al
O O
O O O O O O
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TLC - adsorventes
� Celulose� material orgânico
� diferente da cromatografia de papel☺ papel - apresenta espaços vazios onde se acumula o s olvente - a difusão leva ao alargamento
das manchas☺ celulose - são usadas partículas pequenas / distribu ição mais regular - menor difusão
� Celulose é usada para separar compostos hidrofílicos tal como açúcares, aminoácidos, iões inorgânicos solúveis e ácidos nucléicos - soluções aquosas☺ geralmente aderem muito fortemente à sílica e alumin a
� Tal como em papel o mecanismo é predominantemente de partilha
� Preparação� 400 mg amido / 10 ml água destilada + 90 ml de água a ferver + 20 g de celulose
☺ o grau de hidratação depende do tempo de agitação☺ agitação durante muito tempo leva à formação de gel
� espalhar rapidamente / secar a 110º
� pode conter indicadores de UV
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Placas comerciais
� Adsorventes� Sílica; alumina
� Suportes� Vidro, alumínio ou plástico (tereftalato de polietileno)
� Espessura� 0,25 mm / 0,5 mm / 1,0 mm / 2,0 mm
� Maior amostra exige maior espessura (TLC preparativa)
� Activação� 15 minutos ao ar + 30 minutos a 110 ºC
� Nalguns casos pode elevar-se a temperatura a 200 ºC (4 horas) para maior activação
� Conservação� Após secagem / activação as placas devem ser guardadas num excicador
� As placas de sílica desactivam-se muito rapidamente☺ 50% de actividade perde-se em 3 minutos numa atmosf era com 50% de humidade
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TLC – outros adsorventes
� Kieselguhr� Diatomite - terra de diatomáceas
☺ sílica com plâncton marinho (diatoms)
� elevada porosidade e área superficial - muito usada como ajudante de filtração
� muito usada como suporte de fase estacionária líquida - partilha
� Sephadex� gel dextran - hidrofílico e neutro
� habitualmente usado na filtração em gel - de acordo com os pesos moleculares
� Fase reversa / inversa� a separação de soluto de polaridade semelhante é difícil com sílica gel mesmo para
moléculas de pesos moleculares diferentes
� é possível alterar a superfície da sílica (OH reagem com silanos orgânicos)
� RP-2, RP-8 , RP-18 ☺ a fase estacionária orgânica apresenta uma retenção preferencial dos compostos não-
polares (fase reversa) e a separação depende dos pes os moleculares
� a fase móvel é polar (acetonitrilo)
� cromatografia de partilha
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TLC - fase eluente
� Características - a fase móvel é o componente de mais fácil substituição� boa qualidade - a composição não deve variar de lote para lote
� não reactiva - de outro modo os resultados seriam difíceis de interpretar
� baixo ponto de ebulição - preferível para a secagem da placa
� Alta pureza (Analar) e preço razoável !!
� Escolha� a fase eluente deve ser activa ( retirar o soluto da fase estacionária) e selectiva (separar dois
solutos diferentes)
� actividade (capacidade de eluição) em relacção a sílica-gel☺ água > metanol > etanol > propanol > propanona > tric lorometano >☺ diclorometano > benzeno > metilbenzeno > tricloroetil eno > tetraclorometano >☺ ciclohexano > hexano
� Misturas de solventes☺ o mais usual - capacidade de eluição não é proporcional à composição
� amostra desconhecida☺ usar sílica gel e um solvente pouco polar (pentano)☺ acrescentar solvente polar (2, 4, 8, 16, 32%)
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Separação de pigmentos
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Série eluotrópica para adsorventes polares
A escala vai até cerca de 0,75 para uma placa de sílica
Tabela definida para placa de alumina
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Uso de misturas de misturas de solventes (sílica)
J.C. Touchstone (Practice of TLC)
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Uso de misturas de misturas de solventes (sílica)
J.C. Touchstone (Practice of TLC)
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Uso de misturas de misturas de solventes (sílica)
J.C. Touchstone (Practice of TLC)
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Exemplo de fases móveis
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TLC - aspectos experimentais
� Preparação� preparar a mistura eluente nas proporções adequadas ao ensaio� saturar a câmara - manter fechada e à temperatura do ensaio� evitar evaporação da mistura eluente - alteração da composição� controlar o grau de humidade da placa
� Aplicação da amostra� usar micropipeta (1 -2 µl) - não danificar o suporte� colocar a amostra a cerca de 1,5 cm da base - todas a amostras na
mesma linha� a mancha deve ser de reduzidas dimensões (1,5 mm)
☺ no caso de amostras diluídas colocar por diversas v ezas, secando após cada aplicação
� evitar que a mancha toque a superfície do solvente (5 - 8 mm)
� Desenvolvimento� manter a temperatura� deixar desenvolver o cromatograma até cerca de 3 cm do topo da placa
� Revelação� usar luz UV (254 / 366 nm) ou revelador adequado (H2SO4)� determinar Rf, definir tamanho das manchas - quantificar se desejável
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Placa de TLC
� Saturar a câmara / equilibrar a placa
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Efeito da insaturação da placa
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TLC - maus exemplos
� Polaridade� soluto muito polar é retido na origem
� Amostra em demasia / amostra mal seca� demasiada amostra cria tailing / amostra mal seca cria anéis
� Câmara mal saturada� saturação insuficiente leva a demasiada evaporação da fase eluente
� Colocação muito baixa / demasiada humidade� amostra baixa difunde-se na fase eluente / muita humidade leva a maior difusão das manchas
e também a uma separação deficiente
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TLC - reveladores
� Métodos químicos / métodos físicos
� Métodos não-destructivos� radiação visível e UV (254 nm e 366 nm)� Vapor de iodo
☺ evaporação / placa sem alteração
� água
� indicadores de pH (bromocresol / bromofenol)
� Métodos destructivos� 50% H2SO4 / 110 C
� 5% dicromato de potássio ou 5% ácido nítrico em40% H2SO4 seguido de aquecimento a 110 C
� UV (vitaminas) / água (hidrólise - ésteres) / iodo (ácidos gordos poliinsaturados)
� Reagentes específicos são conhecidos para quase todas as classes de compostos
NOTA: o uso de métodos destructivos é desaconselhado sempre que a quantificação seja o objectivo da separação cromatográfica
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TLC - amostras
� Classificação (energias de adsorção)� Grupo 1: moléculas neutras - hidrocarbonetos
☺ forças de Van der Waal - físicas (não há formação deligações químicas
☺ grupos metileno - não há separação por peso molecular☺ separações boas e manchas redondas
� Grupo 2: ligações polares (C - Cl / C - NO2)☺ dipolo induzido - físicas / manchas redondas
� Grupo 3: moléculas polares ( ácidos, álcoois)☺ Grupos de superfície polar - nucleofílica☺ interação com adsorvente via lig. H-H☺ forte - possibilidade de “caudas” nas manchas
� Grupo 4: ligações químicas (covalentes)☺ ligações fortes - má separação
Energias de adsorção(sílica gel)
Grupo Qi interação
R-CH3 +0.07 VdW
R-CH2- -0.05 VdW
R-Cl +1.32 dip. ind.
R-O-R +3.61 receptor H
R-CHO +4.97 receptor H
R-NO2 +5.71 dip.ind
R-CO2R +5.27 rec.H /dip.ind.
R-COR +5.27 rec.H/dip.ind.
R-OH +5.60 H-H
R-NH2 +8.00 H-H
R-CO2H +7.60 H-H
Cs
Cm
Cs
Cm
Cs
Cm
A forma das manchas depende do equilíbrio de concentrações estabelecido entre as fasesmóvel e estacionária
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Casos especiais
� TLC preparativo� Colocar bandas largas de amostra e desenvolver a placa
� Retirar a sílica de cada mancha e dissolver usando um solvente adequado
� Analisar noutro equipamento (HPLC, LCMS, FTIR)
� TLC bidimensional� Colocar a amostra no lado esquerdo da placa e desenvolver
� Secar a placa e desenvolver de novo noutro eluente (colocar o lado esquerdo da placa para baixo)
� Revelar
Separação de aminoácidos
F. estacionária: sílica gel
F. Móvel 1: tolueno:2-cloroetanol:piridinaF. Móvel 2: clorofôrmio:álcool benzílico:ac. Acértico
1: ac. Aspártico, 2: ac. Glutámico, 3: serina4: alanina, 5: glicina, 6: alanina, 7: metionina,8: valina, 9: isoleucina, 10: cisteina
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TLC - vantagens e desvantagens
� Vantagens� Técnica simples e versátil - aplica-se a quase todas as classes de compostos
� Pequenas quantidades de amostra – sem grande preparação
� A separação pode ser obtida com custos razoáveis - bom adsorvente e solventes puros
� As separações podem ser obtidas em tempos relativamente curtos☺ começa a não ser vantagem em relação às pequenas col unas de HPLC
� O processo de separação é “visível” e pode ser melhorado alterando suportes ou a fase eluente☺ ao contrário do GC ou HPLC e que os solutos muito re tidos podem passar despercebidos
� Desvantagens� A preparação das placas é complicada
☺ está a cair em desuso (aquisição de placas preparada s)
� A quantificação é possível mas implica um enorme custo financeiro☺ por isso o TLC é a técnica de separação cromatográfi ca tipicamente qualitativa /
semiquantitativa� Colocação de amostras em quantidades conhecidas e quantificação por comparação
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Resolução = X / 0,5 (d1 + d2); x - distância entre as manchas; d1 e d2 – diâmetros das manchas
R mínimo = 1Rf = distância percorrida pelo soluto / distância percorrida pela frente do solvente
Distância percorrida pelo solvente
Distância percorrida pelo soluto A
Distância percorrida pelo soluto B
Linha de frente do solvente
Linha de colocação das amostras
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