UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
RELATÓRIO DE ESTÁGIO
Inês Alexandra Tita Fernandes
ORIENTAÇÃO:
Dra. Joana Gomes
Laboratório do Hospital de Santiago
Grupo General Lab
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
LISBOA 2016
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
2
RESUMO
O presente documento consiste no elemento de avaliação final do Curso de
Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.
Este trabalho é constituído pelo Relatório de Estágio, na qual é apresentado o local de
estágio e a sua caracterização, bem como a descrição de cada uma das valências
abrangidas, com ênfase sobre os ensaios realizados, controlo de qualidade interno e a
avaliação externa da qualidade. Este estágio curricular do Mestrado em Análises
Clínicas decorreu no Laboratório do Hospital de Santiago, o qual pertence ao Grupo
General Lab, no qual foram abrangidas diferentes valências tais como Bioquímica,
Imunologia, Hematologia e Microbiologia. Cada uma das diversas áreas analíticas
Palavras-Chave:
Análises Clínicas; Bioquímica Clínica; Hematologia; Microbiologia; Imunologia
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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ABSTRACT
The present document represents the element of final evaluation of the Master in
Clinical Analysis of the Faculty of Pharmacy, University of Lisbon. This paper work is
the Internship Report, in which it is presented the location and its characterization, as
well as the description of each of the valences covered, with emphasis on the assays
performed, the internal quality control and external evaluation of quality. This curricular
internship was conducted in the Laboratory of the Hospital de Santiago, which belongs
to General Lab group, where the following internship areas were performed:
Biochemistry, Immunology, Hematology and Microbiology.
Keywords:
Clinical Analysis; Clinical Biochemistry; Hematology; Microbiology; Immunology
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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AGRADECIMENTOS
Venho desta forma exprimir os meus mais profundos agradecimentos à minha
orientadora, a Doutora Joana Gomes, que demonstrou o seu apoio e acompanhamento,
os quais foram indispensáveis para que conseguisse atingir o objectivo deste trabalho da
melhor forma. Agradeço também à restante equipa do laboratório, que foram
fundamentais na construção deste relatório.
Aos meus pais e irmã, por sempre terem demonstrado um apoio e carinho
valiosos, por terem dado sempre o melhor de si na minha educação, obrigado por
estarem presentes nos momentos mais importantes.
Aos meus colegas de curso, por todos os minutos dentro e fora da faculdade,
todos os momentos, ideias trocadas, paciência e consolo nas horas difíceis.
E por último, um agradecimento muito especial ao David, pelo grande
companheirismo, amor e compreensão. Obrigado pela motivação e sobretudo pela
eterna paciência que foram fundamentais em cada momento, desde os mais fáceis aos
mais difíceis.
A todos o meu Muito Obrigado!
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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ÍNDICE
INTRODUÇÃO ……………………………………….…………………………….16
1. FASE PRÉ-ANALÍTICA……………………………….……………………….18
1.1. Preparação do doente ……………………………………………………….19
1.2. Colheita de Amostras …………………………………………………….…20
1.2.1. Colheita de Sangue ………………………………………..................20
1.2.2. Colheita de Urina ……………………………………………………21
1.2.3. Colheita de exsudados……………………………………………….22
1.2.4. Colheita de Outros Líquidos Biológicos……………………………..22
2. HEMATOLOGIA……………………………………………………………….25
2.1. Cell-Dyn 3500………………………………………………………………26
2.1.1. Hemograma…………………………………………………………..28
2.1.2. Reticulócitos………………………………………………………….37
2.1.3. Controlo de Qualidade Interno ……………………………………...38
2.1.4. Avaliação Externa da Qualidade……………………………………..38
2.2. ACL 7000……………………………………………………….…………..38
2.2.1. PT, Tempo de Protrombina…………………………………………..39
2.2.2. aPPT, Tempo de Tromboplastina Parcial Activada……………….…42
2.2.3. Fibrinogénio…………………………………………………………..43
2.2.4. Controlo de Qualidade Interno…………………………………….…44
2.2.5. Avaliação Externa da Qualidade…………………………………..….44
2.3. ORTHO BioVue® System………………………………………………..…44
2.3.1. Tipagem AB0…………………………………………………..……..45
2.3.2. Tipagem RhD…………………………………………..……………..46
2.3.3. Teste de Coombs……………………………………………………..46
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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2.4. Métodos Manuais………………………………………………………...……47
2.4.1. Velocidade de Sedimentação………………………………………...…47
2.4.2. Crioaglutininas……………………………………………………...…..49
3. MICROBIOLOGIA …………………………………………………………..…..51
3.1. Urocultura……………………………………………………………………..56
3.2. Exsudado Vaginal e Uretral…………………………………………………..59
3.3. Exsudado Faríngeo……………………………………………………………62
3.4. Exsudado Nasal…………………………………………………………….....63
3.5. Hemocultura……………………………………………………………..……64
3.6. Coprocultura………………………………………………………………..…66
3.7. Expectoração e Secreções Brônquicas……………………………………...…68
3.8. Exsudado Purulento………………………………………………………..…70
3.9. Outras actividades desenvolvidas na área da microbiologia…………….…....71
3.10. Antibiogramas…………………………………………………………..72
3.11. Controlo de Qualidade Interno……………………….……………..…73
3.12. Avaliação Externa da Qualidade……………………………………….74
4. IMUNOLOGIA……………………………………………………………………75
4.1. Vidas…………………………………………………………………………..75
4.1.1. Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)…………………………….76
4.1.2. Controlo de Qualidade Interno…………………………………………77
4.1.3. Avaliação Externa da Qualidade………………………………………..78
4.2. Serologia / Técnicas Manuais………………………………………………….78
4.2.1. Serologia para Treponema pallidum……………………………………79
4.2.2. Serologia para Salmonella………………………………………...……80
4.2.3. Serologia para Mononucleose Infecciosa…………………….……..….81
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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5. BIOQUÍMICA…………………………………………………………………….83
5.1. Dimension Xpand……………………………………………………………..83
5.1.1. Glucose…………………………………………………………………85
5.1.2. Proteínas Totais…………………………………………………………87
5.1.3. Albumina……………………………………………………………….89
5.1.4. Ferritina…………………………………………………………………90
5.1.5. Proteína C reactiva……………………………………………………...92
5.1.6. Ureia…………………………………………………………………….93
5.1.7. Creatinina……………………………………………………………….95
5.1.8. Ácido Úrico…………………………………………………………….97
5.1.9. Bilirrubinas……………………………………………………………..98
5.1.9.1. Bilirrubina Total………………………………………………..99
5.1.9.2. Bilirrubina Directa……………………………………………..100
5.1.10. Triglicéridos…………………………………………………………..102
5.1.11. Colesterol Total……………………………………………………….103
5.1.12. Colesterol HDL……………………………………………………….105
5.1.13. Colesterol LDL……………………………………………………….107
5.1.14. Lactato Desidrogenase (LDH)……………………………………….108
5.1.15. Creatina Cinase (CK)…………………………………………………110
5.1.16. α-Amilase……………………………………………………………..111
5.1.17. Cálcio………………………………………………………………….113
5.1.18. Ferro………………………………………………………………….114
5.1.19. Fósforo……………………………………………………………….116
5.1.20. Magnésio……………………………………………………………..118
5.1.21. Gonadotropina Coriónica Humana (β-HCG)…………………………119
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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5.1.22. Hormona Estimulante da Tiróide (TSH)……………………………..120
5.1.23. Tiroxina Total (T4)…………………………………………………...122
5.1.24. Ionograma……………………………………………………………123
5.1.25. Aspartato Aminotransferase (AST) …………………………………126
5.1.26. Alanina Aminotransferase (ALT) …………………………………...127
5.1.27. Gama Glutamiltransferase (GGT) …………………………………...128
5.1.28. Fosfatase Alcalina (PAL) ……………………………………………130
5.1.29. Controlo de Qualidade Interno………………………………………131
5.1.30. Avaliação Externa da Qualidade……………………………………..132
5.2. Hi-AUTO A1C………………………………………………………………132
5.2.1. Hemoglobina Glicada (HbA1c)………………………………………133
5.2.2. Controlo de Qualidade Interno……………………………………….134
5.2.3. Avaliação Externa da Qualidade……………………………………...134
5.3. Clinitek 500………………………………………………………………….135
5.3.1. Urina Tipo II……………………………………………………….....135
6. CONTROLO DE QUALIDADE……………………………………………….141
6.1. Controlo de Qualidade Interno……………………………………………..141
6.2. Avaliação Externa da Qualidade……………………………………………142
7. VALIDAÇÃO BIOPATOLOGICA ……………………………………………143
BIBLIOGRAFIA ……………………………………………………………….144
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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INDICE DE TABELAS
Tabela 1. Equipamentos, parâmetros e metologias do sector de Hematologia….…….26
Tabela 2. Parâmetros constituintes do eritrograma.……………………………………29
Tabela 3. Importância clínica dos elementos do leucograma……………………….....30
Tabela 4. Alterações na contagem de plaquetas…………………………………….....32
Tabela 5. Alterações passíveis de serem observadas no esfregaço de sangue
periférico…………………………………………………………………………….….35
Tabela 6. Causas de INR aumentado………………………………………………...…41
Tabela 7. Causas de aPTT aumentado…………………………………………………42
Tabela 8. Alterações do fibrinogénio…………………………………………………..43
Tabela 9. Causas da elevação da VS e factores influentes…………………………….48
Tabela 10. Presença de Crioaglutininas………………………………………………..50
Tabela 11. Controlo de Qualidade Interno Microbiologia……………………………..74
Tabela 12. Alterações dos valores de glucose…………………………………………86
Tabela 13. Alterações dos valores das Proteínas totais………………………………..88
Tabela 14. Alterações dos valores da Albumina……………………………………….90
Tabela 15. Alterações dos valores da Ferritina………………………………………...91
Tabela 16. Causas do aumento de PCR………………………………………………..93
Tabela 17. Causas do aumento de ureia………………………………………………..95
Tabela 18. Alterações da creatinina……………………………………………………96
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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Tabela 19. Causas do aumento de ácido úrico…………………………………………98
Tabela 20. Causas do aumento das bilirrubinas………………………………………101
Tabela 21. Causas do aumento de triglicéridos……………………………………….103
Tabela 22. Alterações do colesterol total……………………………………………...105
Tabela 23. Alterações do colesterol HDL…………………………………………….106
Tabela 24. Situações que podem levar ao aumento de LDH…………………………109
Tabela 25. Situações que podem levar ao aumento de CK…………………………..111
Tabela 26. Situações que podem levar ao aumento de α-Amilase……………………112
Tabela 27. Alterações do Cálcio……………………………………………………..114
Tabela 28. Alterações do Ferro………………………………………………………116
Tabela 29. Alterações do Fósforo……………………………………………………117
Tabela 30. Alterações do Magnésio………………………………………………….119
Tabela 31. Alterações da TSH……………………………………………………….121
Tabela 32. Alterações da T4…………………………………………………………123
Tabela 33. Alterações do Ionograma…………………………………………………125
Tabela 34. Relação AST/ALT………………………………………………………..128
Tabela 35. Aumento da GGT………………………………………………………...129
Tabela 36. Aumento da ALP…………………………………………………………131
Tabela 37. Urina II……………………………………………………………………136
Tabela 38. Sedimento urinário………………………………………………………..139
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Cassete do ORTHO BioVue® System……………………………………..45
Figura 2. Como semear uma urocultura………………………………………………57
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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INDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1. Fluxograma Urocultura………………………………………………….58
Esquema 2. Fluxograma Exsudade Vaginal e Uretral………………………………..61
Esquema 3. Fluxograma Exsudado Faríngeo…………………………………………63
Esquema 4. Fluxograma Exsudado Nasal……………………………………………64
Esquema 5. Fluxograma Hemocultura……………………………………………….65
Esquema 6. Fluxograma Coprocultura……………………………………………….67
Esquema 7. Fluxograma Expectoração e Secreções Brônquicas…………………….69
Esquema 8. Fluxograma Exsudado Purulento……………………….……………….70
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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LISTA DE ABREVIATURAS
ADH – Hormona Anti Diurética
ALT – Alanina aminotransferase
aPPT - Tempo de Tromboplastina Parcial Activada
AST – Aspartato aminotransferase
β-HCG - Gonadotropina Coriónica Humana fracção β
BHI – Brain Heart Infusion
BK – Bacilo de Koch
CAM – Gelose Campylosel
CHGM - Concentração de Hemoglobina Globular Média
CK - Creatina Cinase
CLED - Cystine Lactose Electrolyte Deficient
CMV – Citomegalovírus
COS - Gelose Columbia + 5% sangue de carneiro
EDTA – Ácido Etilenodiaminatetracético
EIA - Imunoensaio enzimático
EIC - Empresa Internacional de Certificação
ELFA - Enzyme linked fluorescente assay
GGT – Gama glutamiltransferase
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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GV – Glóbulos Vermelhos
HAEM2 - Gelose Chocolate Haemophilus 2
HbA1c - Hemoglobina Glicada
HDL – High Density Lipoprotein
HEKT - Gelose Hektoen
HGM - Hemoglobina Globular Média
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
HPLC - Cromatografia de alta performance
INR - Razão de Normalização Internacional
ISI - International Sensitivity Index
LDH - Lactato Desidrogenase
LDL – Low Density Protein
MAPSS - Multi-Angle-Polarized-Scatter-Separation
MCK - Gelose Mac Conkey
MSA2 - Gelose Mannitol Salt Agar 2
NEQAS - National External Quality Assessment Schemes
PAL – Fosfatase Alcalina
PCR - Proteína C reactiva
PSA- Antigénio Específico da Próstata
PT – Tempo de Protrombina
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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RDW - Coeficiente de Distribuição Eritrocitária
RIQAS - Randox International Quality Assessment Scheme
RNA – Ácido Ribonucleico
RPR - Rapid Plasma Reagin
SEHH - Sociedade Espanhola de Hematologia e Hemoterapia
SEQC - Sociedade Espanhola de Bioquímica Clínica e Patologia Molecular
SGC2 - Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol 2
SIDA - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
SMS – Slide-Maker-Stainer
STRB - Gelose Strepto B
TPHA - Treponema Pallidum Hemaglutination
TSH - Hormona Estimulante da Tiróide
VCAT3 - Gelose Chocolate + Gelose PolyViteX
VGM – Volume Globular Médio
VLDL – Very Low Density Lipoprotein
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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INTRODUÇÃO
O estágio curricular em Análises Clínicas encontra-se contemplado no plano de
estudos do curso Mestrado em Análises Clínicas e tem por objectivos principais
fomentar a integração no meio profissional e o contacto com os outros profissionais de
saúde, aplicar os conhecimentos adquiridos ao longo do mestrado no contexto real de
trabalho de forma a desenvolver a capacidade de trabalho em equipa, compreender a
estrutura e organização de um laboratório bem como a cadência das actividades diárias,
e também promover o contacto com os doentes, aplicando princípios éticos e
deontológicos.
Este estágio decorreu no período compreendido entre Fevereiro e Agosto de
2015, no laboratório do Hospital de Santiago, em Setúbal, no qual foram englobadas as
valências de bioquímica, imunologia, hematologia e microbiologia. O Hospital de
Santiago disponibiliza uma ampla oferta de especialidades médicas e cirúrgicas, meios
complementares de diagnóstico com recurso a tecnologia recente e todas as condições
necessárias para internamento e realização de procedimentos cirúrgicos, estando
referenciado como a unidade privada de saúde com maior diferenciação na zona sul do
país, nomeadamente para tratamento de doentes oncológicos por radioterapia. Deste
hospital faz parte também o laboratório de análises clínicas que funciona em regime de
outsourcing com o grupo General Lab Portugal desde 2010, que se encontra sediado em
Lisboa. A General Lab Portugal inicia o seu percurso na gestão de laboratórios
hospitalares em 2006, tendo como primeiro parceiro o Grupo Espírito Santo Saúde, o
qual integra o Hospital de Santiago. Devido ao regime de outsourcing implementado,
grande parte das análises e parâmetros realizados são enviados para o laboratório central
através de um serviço de estafetas especializado no transporte deste tipo de produtos.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
17
O laboratório do Hospital de Santiago é composto por diferentes sectores
principais tais como a hematologia, bioquímica e microbiologia, supervisionadas pelo
director técnico. O laboratório recebe todos os dias pedidos de ambulatório,
internamentos e urgências. São executadas cerca de 15000 análises por mês, destas 80%
são requisitadas por doentes em ambulatório, 5% a doentes internados e 15% em
urgência. Actualmente, cerca de 75% das análises estão automatizadas.
O laboratório encontra-se, na sua totalidade, inserido num sistema de
certificação Multisite Labco, certificado pela Empresa Internacional de Certificação
(EIC) de acordo com a NP EN ISO 9001:2008, num processo que ficou concluído a 24
de Março de 2014.
O presente trabalho tem como propósito apresentar o local de estágio, focando as
diferentes fases do processo analítico, desde a fase pré-analítica, passando pelo
processamento dos vários produtos biológicos, à realização dos diferentes ensaios para
os diversos parâmetros efectuados e seu significado clínico, à metodologia utilizada nos
vários equipamentos, validação biopatológica, e ainda o controlo de qualidade interno e
a avaliação externa da qualidade.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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1. FASE PRÉ-ANALÍTICA
Os dados analíticos obtidos num laboratório de análises clínicas têm uma grande
influência relativamente à decisão dos clínicos no diagnóstico dos doentes, o que é
particularmente importante em doentes que se encontrem em condições clínicas graves.
Neste contexto é necessário tem em conta os níveis de qualidade com os quais se
trabalha. A fase pré-analítica está referenciada como a etapa onde se verificam a maioria
dos erros laboratoriais, sendo que engloba a preparação apropriada do indivíduo antes
da colheita da amostra, a obtenção da amostra propriamente dita, tratamento e
conservação da mesma e critérios de rejeição. A dificuldade reside sobretudo no
controlo das variáveis pré-analíticas, nomeadamente na preparação do utente, colheita
da amostra e sua identificação, e transporte e conservação dos diferentes produtos
biológicos. Trata-se de uma fase com maior erro associado ao factor humano pois
grande parte dos processos não é automatizada. De forma a prevenir o erro e garantir
resultados com maior qualidade, estão estabelecidos procedimentos a cumprir.
A Fase Pré-Analítica inicia-se com a chegada da prescrição médica à recepção
do laboratório, passando pelas diferentes etapas até à fase analítica. De seguida são
descritos alguns dos principais pontos e procedimentos da fase pré-analítica.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
19
1.1. PREPARAÇÃO DO DOENTE
Antes da colheita das amostras propriamente ditas, é crucial que o doente seja
preparado e informado de forma adequada. A preparação do doente é importante na
medida em que permite minimizar a interferência que diversos factores biológicos
controláveis bem como factores extrínsecos e comportamento.
O laboratório dispõe de um folheto com instruções gerais de colheita para que o
doente possa estar preparado de forma correcta consoante as análises a realizar, como
exemplo:
Preparação para colheira de sangue – Jejum de 8 horas; evitar a ingestão de
gorduras na véspera e bebidas alcoólicas; jejum de 12 horas em caso de análises
ao perfil lipídico, etc.
Preparação para colheita de urina – Colheita da primeira urina da manhã em
boião esterilizado; Evitar toma de antibiótico na semana antecedente no caso de
uma urocultura, etc.
No caso de um pedido de PSA, evitar ecografias e exames prostáticos na semana
antecedente, entre outros exemplos.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
20
1.2. COLHEITA DE AMOSTRAS
A colheita de amostras é um dos passos mais decisivos num laboratório de análises
clínicas, pois trata-se do momento no qual existe um contacto íntimo e privilegiado
entre o doente e o laboratório afectando a credibilidade e confiança nos resultados.
As amostras são maioritariamente colhidas nas salas de colheita adjacentes ao
laboratório, sendo as restantes colhidas no Serviço de Observação do Atendimento
Médico Permanente, no Internamento ou ainda nos serviços de gastroenterologia e
ginecologia.
1.2.1. Colheita de Sangue
O produto biológico mais requisitado é o sangue, O sangue é o produto
biológico mais utilizado nas análises clínicas, atribuído ao facto de a grande maioria dos
analitos se encontrar disponível neste.
O técnico que executa a colheita chama o utente pelo nome que consta na folha
de colheita, confirmando o nome completo do utente na credencial. Os tubos destinados
à colheita são identificados com etiquetas com código de barras, com o nome do utente,
número do tubo e data. Nesta fase são também recepcionadas outras amostras, como
seja, urina, fezes, etc. Confirma-se a conformidade no que se refere à preparação do
utente. O técnico deve proceder à higienização das mãos com uma solução alcoólica a
70º, ou protecção das mesmas colocando luvas novas. Verifica-se o material de colheita
a utilizar, sendo utilizado geralmente o sistema de tubos com vácuo e agulha com
adaptador. É então colocado o garrote, para melhor detecção das veias e selecionar a
zona de punção, tendo o cuidado de selecionar uma veia que seja facilmente palpável,
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
21
evitar o braço do lado de um peito que tenha sofrido mastectomia, evitar algum local
com hematoma, edema ou contusão visíveis. A zona onde se realiza a punção deve ser
desinfectada com algodão embebido em álcool a 70%, e é pedido ao utente que feche a
mão. Efectua-se a punção e colheita do volume de sangue necessário, de forma suave e
rápida, com a agulha num ângulo de 15 a 45º. Assim que o sangue começar a fluir no
tubo, o garrote é desapertado, deve ser pedido ao doente para abrir a mão e no final
retira-se a agulha colocando-se de imediato um algodão para compressão da picada. A
agulha é descartada em contentor próprio para perfurantes (tipo IV) e procede-se à
homogeneização dos tubos por inversão. É colocado um penso rápido no local da
punção e retirado o garrote. A colheita é terminada depois de se assegurar que o utente
se encontra bem. (1)
Da colheita de sangue total podem resultar outros produtos derivados, sendo
estes o soro, quando o sangue é colhido para tubos secos e posteriormente centrifugado,
e o plasma, quando o tubo tem anticoagulante. Os anticoagulantes mais utilizados são o
EDTA, em hematologia, e o citrato de sódio, especialmente na área do estudo da
coagulação. Deve-se ter em conta a proporção sangue/anticoagulante no que se refere ao
enchimento dos tubos durante a colheita, a qual deverá ser sempre respeitada de forma a
garantir os melhores resultados possíveis. Desta forma, tubos têm geralmente uma
marca que define o limite de enchimento.
1.2.2. Colheita de Urina
A colheita da urina é normalmente efectuada pelo próprio doente, uma vez que
se trata de um procedimento fácil de executar, onde geralmente basta apenas colher uma
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
22
porção de urina para um boião esterilizado. Existem algumas exceções como no caso
dos bebés e crianças, imobilizados ou acamados, em que são usados sacos colectores.
Os diferentes tipos de urina, de acordo com o modo como são colhidos e
dependendo da análise em questão, são os seguintes:
Urina tipo II – colhida geralmente em boião esterilizado
Urina ocasional – colhida geralmente em boião esterilizado
Urina de 24 horas – colhida em recipiente próprio com a capacidade de 2 litros,
por vezes com ácido clorídrico para conservação de analitos específicos
Urocultura – colhida em boião esterilizado
1.2.3. Colheita de exsudados
Os diferentes exsudados são colhidos com o auxílio de zaragatoas, que são
colocadas em meio de transporte apropriados.
1.2.4. Colheita de Outros Líquidos Biológicos
A colheita de outros líquidos biológicos, como o líquido pleural,
cefalorraquidiano, ascítico, entre outros, é um acto médico.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
23
Todas as amostras são identificadas através de um sistema de etiquetas de
código de barras, que posteriormente serão triadas no sistema informático Apollo,
através de um leitor próprio. Associado ao código de barras encontra-se o número de
inscrição, o número interno de hospital, número do tubo, data e sector a que se destina
(bioquímica, imunologia, etc). As amostras são recepcionadas por técnicos e de
seguidas triadas, acompanhadas das respectivas requisições e folhas de colheitas que
serão conferidas posteriormente. De seguida são avaliadas de forma a verificar o
cumprimento dos critérios de aceitação ou rejeição de amostras, ou se exigem condições
especiais de processamento, como centrifugação imediata e separação para congelação.
As amostras recepcionadas são centrifugadas, quando aplicável, e distribuídas pelos
vários sectores. (1)
Relativamente aos critérios de rejeição de amostras, este encontra-se
documentado como uma Instrução de Trabalho, na qual se definem esses mesmos
critérios e acções correctivas em caso das amostras não se encontrarem nas condições
desejadas.
Deverão ser rejeitadas amostras biológicas nas seguintes condições:
Amostras não identificadas (sem código de barras)
Amostras sem prescrição médica/ pedido verbal
Amostras em tubo ou contentor inadequado
Atraso excessivo que comprometa o resultado, entre a colheita e a recepção no
laboratório
Colheitas especiais que não obedeçam às condições referidas no manual de
colheitas
Contentores conspurcados
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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Poderão ainda ter lugar ocorrências que comprometem a disponibilização dos
resultados, entre as mais comuns:
Soro ou plasma muito hemolisado
Presença de coágulos
Tubos com volume incorrecto de amostra (1)
Depois de efectuada toda a verificação necessária as amostras passam à
respectiva área de trabalho. As amostras que se destinam ao laboratório central são
conservadas nas condições aplicáveis até à sua transferência, a qual é assegurada por
uma empresa transportadora e que garante as condições de conservação conforme
aplicável. Daqui segue-se para a fase analítica propriamente dita, referente a cada uma
das diferentes áreas de trabalho.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
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2. HEMATOLOGIA
A actividade nesta secção foi orientada no sentido de efectuar o estudo e
controlo de doenças do foro hematológico, diagnosticar as alterações ao nível da
hemostase e controlo de doentes hipocoagulados, entre outros. Pretende-se não fazer
uma descrição exaustiva de todos os passos do processamento de uma análise neste
sector, mas sim falar das técnicas utilizadas, aspectos fundamentais e relevantes para
uma correcta realização e validação da mesma. A hematologia é o estudo do sangue e
órgãos hematopoiéticos e das suas alterações patológicas.
O sangue é constituído por um conjunto de células dispersas num líquido
complexo, o
plasma. Estas células denominam-se glóbulos vermelhos (eritrócitos), glóbulos brancos
(leucócitos) e plaquetas (trombócitos). Os leucócitos, por sua vez dividem-se em células
mononucleares (mónocitos e linfócitos) e granulócitos ou polimorfonucleares
(neutrófilos, eosinófilos e basófilos).
O sector da Hematologia está organizado de acordo com os equipamentos
utilizados, metodologias e natureza dos parâmetros (Tabela 1.)
Equipamento Parâmetro Metodologia
Cell Dyn Hemograma Citometria de fluxo
MAPSS
Impedância eléctrica
Reticulócitos
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ACL 7000 PT Coagulometria
aPTT Coagulometria
Fibrinogénio Coagulometria
ORTHO BioVue Tipagem AB0
Coombs Directo
Coombs Indirecto
Métodos Manuais
- VS Método de Westergreen
- Crioaglutininas
Tabela 1. – Equipamentos, parâmetros e metologias do sector de Hematologia.
2.1. Cell-Dyn 3500
O Cell-Dyn 3500 é um equipamento da marca Abbott, da gama SMS
(SlideMaker/Stainer), no qual se realizam os hemogramas. Trata-se de um aparelho
completamente automático que conta, mede e classifica as células utilizando a
combinação de várias metodologias, tais como:
Citometria de fluxo MAPSS (Multi-Angle-Polarized-Scatter-Separation) – para
contagem e classificação dos leucócitos e contagem de reticulócitos recorrendo
ao novo azul-de-metileno. É um processo em que células isoladas ou outras
partículas biológicas, envolvidas num fluido, passam alinhadas, uma a uma, em
frente de um sensor, que avalia as suas características físicas e químicas. Este
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
27
sistema recorre à dispersão de luz proveniente de um laser (dispositivo gerador
de um feixe de radiações visíveis monocromático e de elevada intensidade). (2)
Impedância eléctrica – para contagem e medição dos eritrócitos, plaquetas e
leucócitos. Este método baseia-se na passagem constante de corrente eléctrica
entre dois eléctrodos que se encontram em reservatórios diferentes, separados
por uma placa com um orifício micrométrico de dimensões conhecidas e
mergulhados num líquido condutor. Quando uma partícula em suspensão passa
pelo orifício, há um aumento de resistência transitório à passagem de corrente
eléctrica, gerando-se um impulso eléctrico que é quantificado. Cada impulso é
amplificado e comparado com uma referência interna de canais com voltagens
conhecidas. Estes canais estão calibrados de modo a cada um receber um só tipo
de impulsos de determinada amplitude. A cada canal está associado um
determinado tamanho de partículas de acordo com a sua amplitude. (2)
A amostra é aspirada através de uma sonda fraccionada por uma válvula, que a
leva para as diferentes câmaras de diluição onde se dá a mistura da amostra com os
respectivos reagentes, passando em seguida para os locais de leitura. Em termos de
processo óptico da citrometria de fluxo, este contador de hematologia utiliza como fonte
de luz um laser de Hélio-Neon. Este sistema detecta a luz em forma de dispersão
(SCATTER), proveniente de uma superfície celular e de estruturas internas das células
sanguíneas. Por cada célula atravessada pelo laser, gera-se um sinal óptico que se
detecta como sinal eléctrico e se converte posteriormente em sinal digital que é
armazenado numa base de dados. (2)
É também possível fazer a medição da hemoglobina, pelo método
espectrofotométrico. Este é um método físico-químico fundamentado na utilização de
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
28
espectros de absorção. Existe um reagente de lise para leitura dos glóbulos vermelhos,
que forma um complexo estável cuja concentração é proporcional à hemoglobina.
Desta forma, temos um equipamento com sensibilidade e capacidade para
quantificar e diferenciar os elementos figurados do sangue, de maneira a obtermos o
hemograma.
2.1.1. Hemograma
O hemograma consiste essencialmente numa análise quantitativa dos elementos
celulares presentes no sangue periférico e calculo dos índices eritrocitários. Trata-se de
uma das análises mais requisitadas que permite a determinação de vários parâmetros,
sendo constituído pelo eritrograma e pelo leucograma, além da contagem de plaquetas.
Amostra:
Sangue total com EDTA K3
Eritrograma
O estudo da série vermelha consiste na análise dos glóbulos vermelhos,
relativamente ao seu número e características, conjugado com a concentração de
hemoglobina presente no sangue. Na Tabela 2. estão descritos os vários parâmetros
constituintes do eritrograma.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
29
Parâmetro Importância clínica
Hematócrito (%) Volume relativo ocupado
pelos GV, num dado volume
de sangue total, o qual foi
centrifugado em condições
padronizadas
Poliglobulias
Determinação dos índices
eritrocitários.
Hemoglobina
(g/dL)
Anemias
Monitorização da terapêutica no
tratamento da anemia
Nº de eritrócitos Número de eritrócitos
circulantes, presentes num
dado volume de sangue (por
litro)
Índices
Eritrocitários
VGM (fL) Volume médio de um
eritrócito
Diminuído: microcitose
Aumentado: macrocitose
Normal: normocitose
HGM (pg) Quantidade média de
hemoglobina contida num
GV médio
Diminuídos: hipocromia
Normais: normocromia
CHGM aumentada (raro):
situações de esferocitose (não
existem eritrócitos
hipercrómicos)
CHGM (g/dL) Concentração média de
hemoglobina por unidade de
volume de GV
Tabela 2. Parâmetros constituintes do eritrograma (3)
Nota: O coeficiente de dispersão eritrocitária (RDW), o qual indica a variação na
distribuição do volume eritrocitário, é calculado no contador automático a partir do
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
30
histograma de distribuição de volume dos GV, sendo expresso em percentagem. No
entanto o laboratório não inclui este parâmetro nos seus boletins analíticos.
Leucograma
O leucograma consiste na contagem total de glóbulos brancos e respectiva
fórmula leucocitária.
Parâmetro Importância clínica
Nº total de
leucócitos
Na maioria dos casos valores aumentados ocorrem em inflamações,
infecções, stress físico, etc. Também aumentado nas grávidas.
Fórmula leucocitária - Contagem diferencial de leucócitos
Neutrófilos
(%)
Neutrofilia:
Infecções agudas (bactérias, vírus, fungos, parasitas)
Doenças reumáticas e auto-imunes
Doenças neoplasicas
Trauma (Cirurgia, Lesões físicas, hipotermia)
Doenças hematológicas não neoplasicas (Anemias hemolíticas
agudas)
Menstruação, gravidez, stress, esforço físico, etc
Neutropenia:
Infecções (bacterianas – tuberculose; virais – mononucleose)
Fármacos
Doenças hematológicas (Leucemias, anemia aplásica)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
31
Lesão renal grave
Hiperesplenismo.
Linfócitos
(%)
Linfocitose:
Leucemia linfocítica aguda e crónica
Infecções virais
Doenças neoplásicas
Doença inflamatória intestinal, reações a fármacos
Linfocitopénia:
Infecções virais, bacterianas e fúngicas
Doença de Hodgkin, mieloma múltiplo, infecções granulomatosas
disseminadas, anemia aplásica
Hemorragia e insuficiência cardíaca
Quimioterapia citotóxica e radiação
Eosinófilos
(%)
Eosinofilia:
Doenças alérgicas (asma, alergia ao pólen, urticária)
Doenças infecciosas (parasitas, fungos, vírus)
Doenças neoplasicas e hematológicas
Eosinopénia:
Infecções agudas, neoplasias disseminadas, lesões graves
Uso de corticosteroides
Monócitos
(%)
Monocitose:
Infecções (tuberculose, malária)
Doenças neoplasicas (mieloma, leucemia monocitica aguda,
mielodisplasia)
Doença inflamatória intestinal, cirrose hepática, Sarcoidose
Monocitopénia:
Anemia aplásica
Basófilos
(%)
Basofilia:
Infecções (sinusite crónica, infecção viral)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
32
Doenças inflamatórias
Doenças mieloproliferativas (Leucemia mieloide crónica, policitemia
vera)
Doença de Hodgkin, Anemia hemolítica crónica, Leucemia basofílica
Tabela 3. Importância clínica dos elementos do leucograma (3) (4)
Contagem Automática de Plaquetas
A contagem de plaquetas é um parâmetro particularmente útil na medida em que
está relacionado com o risco de hemorragia. As plaquetas são fragmentos do
megacariócito, geralmente de pequenas dimensões, que têm tendência para formar
agregados quando activadas, tornando a sua quantificação mais problemática.
Valores Aumentados: Trombocitose Valores Diminuídos: Trombocitopénia
- Doenças mieloproliferativas (Leucemia
mielocitica crónica, policetimemia vera)
- Hemorragia aguda, deficiência em ferro,
doença maligna, doenças inflamatórias
crónicas, etc.
- Infecções virais agudas
- Insuficiência medular global (quando
acompanhada com outras citopénias)
- Recção imunitária (medicamentosa,
lúpica)
- Pós cirurgia
Tabela 4. Alterações na contagem de plaquetas (3)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
33
Realiza-se ainda uma análise da distribuição volumétrica das plaquetas e
interpretação de possíveis alarmes fornecidos pelo equipamento. Sempre que seja
necessário, nomeadamente para confirmação de baixas contagens de plaquetas, faz-se
uma contagem manual de plaquetas a partir de um esfregaço de sangue periférico.
Esfregaço de Sangue Periférico
O estudo microscópico do esfregaço de sangue corado para análise da
morfologia globular fornece informação de grande relevância. Este consiste numa
preparação de uma fina camada de células sobre uma lâmina de vidro para exame
microscópico. A observação do esfregaço é realizada sempre que seja necessário
complementar ou confirmar os resultados obtidos no hemograma ou mediante
solicitação do médico.
No exame microscópico observa-se a morfologia dos eritrócito e leucócitos,
efectua-se a contagem diferencial dos leucócitos, identificando as diferentes sub-
populações e faz-se a contagem de plaquetas.
Como amostra é utilizado sangue total, geralmente a partir do tubo que foi utilizado
para o hemograma.
Como executar um esfregaço de sangue periférico:
a) Depositar uma gota de sangue perto da extremidade de uma lâmina de vidro
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
34
b) Segurar a lâmina com uma mão, com a outra mão segurar uma lamela que se
apoia na lâmina à esquerda da gota, entre as quais deverá existir um ângulo de
30º a 45º
c) Deslocar a lamela (sempre apoiada na lâmina) até encontrar a gota e deixar que
esta se difunda ao longo da lamela
d) Com um movimento rápido e uniforme, deslizar a lamela no sentido da
extremidade livre até que o sangue se esgote
e) A lâmina é corada pela coloração de May-Grünwald-Giemsa. Este tipo de
coloração combina
os componentes citoplasmáticos básicos (eosinófilos ou acidófilos) de rosa-
alaranjado; o azul-de-metileno (corante básico) que cora o núcleo e componentes
citoplasmáticos ácidos (basófilos), de azul-arroxeado; e o azur de metileno que
cora as granulações azurófilas de vermelho-púrpura. (1)
Segue-se uma tabela com exemplos de alterações passíveis de serem observadas
no esfregaço de sangue periférico quando observado ao microscópio:
Alterações da Série Vermelha
Dimensão Anisocitose
Normócitos
Micrócitos
Macrócitos
Coloração Normocromia
Hipocromia
Forma Poiquilocitose (variadas formas sem
predomínio de nenhuma)
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35
Drepanocitose
Ovalocitose
Esferocitose
Células em alvo
Acantócitos
Esquisócitos
Inclusões eritrocitárias Pontuado basófilo
Anéis de Cabot
Corpos de Heinz
Siderócitos
Corpos de Howell-Jolly
Alteração da estrutura Persistência do núcleo (Eritroblastos)
Persistência de restos nucleares
Propriedades tinturiais Eritrócitos ortocromáticos
Eritrócitos policromatófilos
Eritrócitos basófilos
Recticulócitos
Alterações da Série Branca
Neutrófilos com granulação tóxica
Linfócitos atípicos
Blastos das diferentes linhagens, diversos graus de maturidade
Segmentação dos neutrófilos
Alterações da Série Plaquetária
Agregados plaquetários
Anisocitose plaquetária
Tabela 5. Alterações passíveis de serem observadas no esfregaço de sangue periférico (3) (4)
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36
Valores de Referência:
Homem Mulher Unidades
Eritrograma
Eritrócitos 4.5 – 5.9 3.9 – 5.0 x 102/L
Hemoglobina 13.5 – 17.5 12 – 16 g/dL
Hematócrito 40.6 – 50.4 36 – 46 %
VGM 80 – 100 80 – 100 fL
HGM 26 – 34 26 – 34 pg
CHGM 32 – 36 32 – 36 g/dL
Leucograma
Leucócitos 4 – 10 4 – 10 x 10 9 /L
Neutrofilos 50 – 75 50 – 75 %
Eosinófilos 1 – 5 1 – 5 %
Basófilos 0 – 2 0 – 2 %
Linfócitos 20 – 45 20 – 45 %
Monócitos 1 – 12 1 – 12 %
Plaquetas 150 – 400 150 – 400 x 10 9 /L
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
37
2.1.2. Reticulócitos
Os reticulócitos são os precursores imediatos dos eritrócitos. Consistem em
células anucleadas que contêm restos de RNA no citoplasma. A contagem de
reticulócitos é indicada sobretudo para diagnóstico diferencial das anemias (anemias
regenerativas e não regenerativas).
Para quantificação dos reticulócitos, o Cell-Dyn utiliza um método que se baseia
na difracção da luz laser nas células previamente coradas com tiazina azul-de-metileno
novo. O RNA das células é corado e posteriormente a amostra diluída.
Amostra:
Sangue total com EDTA K3
Valores de Referência:
0.5 – 1.5 %
A validação dos resultados do hemograma é feita tendo em conta diversos
factores importantes tais como a idade e sexo, contexto clínico do doente, sinais de
alarme emitidos pelo contador, correlação com outros parâmetros laboratoriais (ferro,
ferritina, transferrina, velocidade de sedimentação, etc). No decorrer da validação são
seleccionadas as amostras que necessitam de ser repetidas e/ou execução do esfregaço
de sangue periférico.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
38
2.1.3. Controlo de Qualidade Interno
Para efeitos de controlo de qualidade interno, são utilizados três níveis, baixo,
normal e alto de Cell-Dyn 26 Plus Control. Diariamente são efectuados dois desses
níveis, os quais vão alternando. São passados no aparelho da parte da manhã em modo
automático e ao fim do dia em modo manual. Os critérios de aceitação são os do
programa UNITY (software de controlo de qualidade, que utiliza ≤ 3 sd de acordo com
os critérios definidos pelo comité de da qualidade). Para os reticulócitos, apenas é
efectuado controlo nos dias em que existem pedidos.
2.1.4. Avaliação Externa da Qualidade
O laboratório, na área de hematologia geral, participa mensalmente em ensaios
inter-laboratorias através de um programa da SEHH (Sociedade Espanhola de
Hematologia e Hemoterapia) exceptuando os reticulócitos, para os quais é utilizado um
programa do NEQAS (National External Quality Assessment Schemes) de dois em dois
meses.
2.2. ACL 7000
O ACL 7000 é um equipamento totalmente automatizado, controlado por micro-
computador, utilizado no estudo da hemostase. A hemostase é um processo complexo
que assegura permanentemente o equilíbrio entre a possibilidade de hemorragias
espontâneas e formação de trombos, controlando também hemorragias resultantes de
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
39
qualquer lesão vascular, estando assim dependente da interação de diversos
componentes complexos e equilíbrio entre os processos de coagulação e fibrinólise. (5)
A coagulação sanguínea (hemostase secundária) é um processo dinâmico que
culmina com a formação de trombina em quantidades suficientes para a conversão do
fibrinogénio em fibrina. A cascata da coagulação é classicamente dividida em duas vias,
a via intrínseca e a via extrínseca, as quais conduzem à formação do coágulo de fibrina.
O ACL 7000 consegue a determinação dos diferentes parâmetros relacionados
com a
hemostase através do método por coagulometria (detecção óptica do coágulo). A
formação do coágulo é detectada graças a um fotodíodo que mede a variação da
densidade óptica. Este aparelho requer a utilização duma pool de plasma normal
(plasma de calibração), o qual verifica e monitoriza as condições de ensaio em todo o
sistema durante o decorrer da análise. (5)
O estudo da hemostase é essencial para a detecção de patologias hemorrágicas e
trombóticas bem como para a monitorização da terapêutica anticoagulante.
2.2.1. PT, Tempo de Protrombina
O tempo de protrombina corresponde ao tempo de recalcificação de um plasma
citratado e pobre em plaquetas, na presença de excesso de tromboplastina e iões cálcio.
Este parâmetro explora a via extrínseca da coagulação, reflectindo alterações em alguns
dos diferentes factores de coagulação, nomeadamente dos dependentes da vitamina K. É
uma análise bastante prescrita pois é essencial para monitorização da terapêutica com
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
40
anticoagulantes orais, sendo indicada também no rastreio de distúrbios do sistema da
coagulação ou avaliação da função hepática.
Amostra:
Plasma em Citrato
Fundamento do Método
Adição de tromboplastina tecidular e cloreto de cálcio ao plasma do doente para
a avaliação do tempo de formação do coágulo de fibrina.
Os valores podem ser expressos em:
Tempo de protrombina
Valores de Referência:
Tempo de Protrombina: 11.8 – 15.1 segundos
Percentagem (Taxa de Protrombina): mediante uma curva de calibração
para a protrombina, o tempo é convertido em taxa.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
41
Valores de Referência:
Taxa de Protrombina: 74 – 132 %
INR (Razão de Normalização Internacional): devido às variações das
diversas tromboplastinas e de modo assegurar a uniformidade de
resultados, foi necessário padronizá-las segundo uma referência
internacional, e desde então todas as tromboplastinas são acompanhadas
pelo ISI (International Sensitivity Index - valor fornecido pela marca).
O cálculo do INR efectua-se por elevação de razão de protrombina ao valor de ISI.
Valores de referência:
INR: ≤ 1.18, mas é variável consoante a patologia
Valores de INR Aumentados
- Deficiências em protrombina, factor VII, X, vitamina K
- Terapêutica com anticoagulantes orais, doenças hepáticas, etc.
Tabela 6. Causas de INR aumentado (3)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
42
2.2.2. aPPT, Tempo de Tromboplastina Parcial Activada
O tempo de tromboplastina parcial activada corresponde ao tempo de
recalcificação de um plama citratado e pobre em plaquetas, na presença de uma
substância fosfolipídica. Este parâmetro explora a via intrínseca da cascata da
coagulação. É importante na monitorização da terapêutica com heparina, rastreio de
distúrbios da via intrínseca e comum da coagulação sanguínea e detecção de inibidores
da coagulação.
Amostra:
Plasma em Citrato
Fundamento do Método
É adicionada cefalina (substituto de fosfolípido incapaz de activar a via
extrínseca) e cloreto de cálcio ao plasma do doente, para a avaliação do tempo de
formação do coágulo de fibrina.
Valores de referência:
24.3 – 35 segundos
Valores de aPTT Aumentados
- Deficiências em factores da via intrínseca (hemofilia A e B, factores XI e XII, doença
de Von Willebrand)
- Doenças hepáticas, contaminação com heparina, doença intravascular disseminada
Tabela 7. Causas de aPPT aumentado (3)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
43
2.2.3. Fibrinogénio
O fibrinogénio é uma glicoproteina sintetizada exclusivamente pelos
hepatócitos, sendo clivado pela trombina para formar o coágulo de fibrina. O seu
doseamento é considerado um teste específico para a avaliação da coagulação estando
indicado no estudo de discrasias sanguíneas sem causa aparente.
Amostra:
Plasma em Citrato
Fundamento do Método
Adiciona-se ao plasma diluído do doente excesso de trombina e determina-se o
tempo de formação do coágulo de fibrina. O tempo de formação do coágulo é
inversamente proporcional à concentração de fibrinogénio presente na amostra.
Valores de referência:
169 – 515 mg/dl
Valores de Fibrinogénio Aumentados Valores de Fibrinogénio Diminuídos
- Gravidez, diabetes mellitus, síndrome
nefrótico, mieloma múltiplo, etc
- Processos inflamatórios (proteína de fase
aguda positiva)
- Diminuição da síntese de fibrinogénio
(ex: doença hepática grave)
- Aumento do catabolismo (ex. após
grandes hemorragias, queimaduras)
Tabela 8. Alterações do fibrinogénio (3)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
44
2.2.4. Controlo de Qualidade Interno
Para realizar o controlo de qualidade interno, são utilizados dois níveis
diariamente de HemosIL Control Assayed. São passados no aparelho da parte da
manhã, preferencialmente antes dos doentes. Os critérios de aceitação são os do
programa UNITY (software de controlo de qualidade, que utiliza ≤ 3 sd de acordo com
os critérios definidos pelo comité de da qualidade).
2.2.5. Avaliação Externa da Qualidade
O laboratório participa mensalmente em ensaios inter-laboratorias através de um
programa da SEHH (Sociedade Espanhola de Hematologia e Hemoterapia).
2.3. ORTHO BioVue® System
Este equipamento foi concebido de forma a automatizar a execução de testes
imuno-hematológicos que eram na sua maioria, técnicas manuais. A tecnologia do
aparelho baseia-se na utilização de cassetes com 6 colunas onde cada coluna contém
uma câmara de reacção e um reagente com esferas de vidro. Um resultado é negativo
quando os eritrócitos atravessam a coluna e se depositam no fundo da coluna enquanto
que um resultado é positivo quando se forma uma aglutinação que fica no topo da
coluna.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
45
Figura 1. Cassete do ORTHO BioVue® System (3)
Neste laboratório a tipagem sanguínea é realizada não só no âmbito da
prescrição médica de rotina mas também como pré-operatórios e situações antecedentes
a transfusões sanguíneas, de forma a ser administrado um sangue compatível com o
receptor. Existem vários sistemas de classificação dos grupos sanguíneos, sendo os mais
comuns a tipagem AB0 e a tipagem Rh.
2.3.1. Tipagem AB0
A determinação do grupo sanguíneo de um individuo é possível devido à
expressão antigénica na superfície dos eritrócitos, em que os antigénios presentes se
ligam a anticorpos que circulam no soro. O processo de determinação do grupo
sanguíneo pode ser executado de duas formas, a prova directa e prova reversa. Na
tipagem direta, são pesquisados os antigénios do sistema AB0 existentes na membrana
do eritrócito, através de uma reação dos eritrócitos da amostra com soros comerciais que
contenham anticorpos anti-A, anti-B e anti-AB. Na tipagem reversa, investiga-se a
presença de anticorpos do sistema AB0 presentes no soro do indivíduo, através de uma
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
46
reação desse soro com dois reagentes eritrocitários comerciais. O resultado das duas
provas deverá ser concordante (6).
2.3.2. Tipagem RhD
Além da tipagem AB0, é realizada a tipagem RhD, também com significado
clínico na medicina transfusional e materno-fetal. Os eritrócitos do dador são testadas
com um soro anti-D e com soro controlo RhD. Poderemos ter RhD positivo, negativo
ou fraco. Quando a pesquisa do D fraco for positiva, o concentrado de eritrócitos é
rotulado como RhD positivo. Quando ambas as provas resultarem negativas, o sangue
deve ser rotulado como RhD negativo (6).
2.3.3. Teste de Coombs
Outro dos testes realizados neste equipamento, é o teste de Coombs, muito
utilizado para diagnosticar doenças hemolíticas causadas por autoanticorpos que se
ligam à membrana do eritrócito, como a anemia hemolítica do recém-nascido ou
anemias hemolíticas auto-imunes. Geralmente são pesquisados anticorpos maternos IgG
anti-Rh fetal (anti-D), através da utilização de um soro com anticorpos que reagem com
os anticorpos maternos.
O teste da antiglobulina pode ser realizado de duas formas:
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
47
Directo: Detecção de anticorpos maternos anti-D que já se ligaram aos
eritrócitos fetais, através da utilização de um soro com anti-IgG.
Indireto: Pesquisa de anticorpos anti-D no soro materno, o qual é
incubado com eritrócitos RhD positivos e posteriormente são
adicionados os anticorpos anti-IgG. Permite detectar anticorpos
antieritrocitários irregulares. (6)
2.4. Métodos Manuais
2.4.1. Velocidade de Sedimentação
A velocidade de sedimentação é traduzida como a velocidade de queda espontânea
dos elementos figurados do sangue em suspensão no plasma por acção da força da
gravidade. A velocidade de sedimentação é um processo resultante da combinação de
vários mecanismos:
a) Diferença de gravidade existente entre os eritrócitos (que são mais densos) e
o plasma
b) Atracção electrostática gerada entre as cargas eléctricas negativas da
membrana dos eritrócitose as cargas eléctricas positivas de determinadas
proteínas plasmáticas
c) Contra-corrente plasmática
A velocidade de sedimentação é expressa em unidades de distância (mm), que os
eritrócitos percorrem ao longo de uma hora. Este processo decorre em três fases:
1º - Agregação: formação de pilhas de eritrócitos (rouleaux)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
48
2º - Sedimentação: queda dos rouleaux a velocidade constante
3º - Sedimentação final: empilhamento dos eritrócitos no fundo do tubo
Amostra:
Plasma em Citrato
Método
Método de Westergreen (método de referência). A determinação é efectuada
num sistema da marca Aquisel, que consiste no conjunto do tubo e duma pipeta. Os
tubos têm incorporada uma válvula que permite a introdução manual da pipeta,
pressionando até o sangue subir até à marca ‘’0’’. Este conjunto é colocado num suporte
próprio, que fica em repouso durante uma hora. Ao fim desse tempo é feita a leitura
visual dos resultados, pela escala existente ao longo da pipeta.
Valores de Referência:
Homem: <15 mm
Mulher: <20 mm
Valores de VS Aumentados Factores que influenciam a VS
- Variações fisiológicas (gravidez,
menstruação)
- Infecções agudas e crónicas
- Processos inflamatórios agudos
- Número, forma e tamanho dos eritrócitos
- Viscosidade do sangue
- Aumento do fibrinogénio
- Altura e diâmetro do tubo
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
49
- Doenças reumatismais
- Anemias
- Leucemias, mielomas, neoplasias
- Posição do tubo (vertical);
- Vibrações
- Proporção sangue/anticoagulante
Tabela 9. Causas da elevação da VS e factores influentes (3)
2.4.2. Crioaglutininas
As crioaglutininas são proteínas, autoanticorpos (imunocomplexos) geralmente
da classe IgM, dirigidos contra o antigénio de superfície dos eritrócitos, que precipitam
com o frio e se redissolvem a 37ºC. Podemos suspeitar que estamos na presença destas
crioaglutininas quando obtemos resultados aberrantes dos índices eritrocitários VGM e
CHGM.
Amostra:
Plasma em EDTA
Método
Colheita de sangue para um tubo de vidro a 37ºC. Fazer a retracção de coágulo
na estufa. Retira-se o coágulo, centrifuga-se e retira-se o sobrenadante que é colocado
imediatamente no frio durante 10 dias, nos quais é verificado se ocorreu aglutinação.
Valores de referência:
Presença de precipitado – Resultado positivo
Ausência de precipitado – Resultado negativo
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
50
Presença de Crioaglutininas
- Mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenström, linfoma imunoblastico,
leucemia linfocitica crónica, anemias hemolíticas, doenças autoimunes (lúpus
eritematoso sistémico), diversas infecções
Tabela 10. Presença de Crioaglutininas (3)
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51
3. MICROBIOLOGIA
A microbiologia, tal como o nome indica, estuda as características biológicas
dos microorganismos (bactérias, parasitas, fungos). O estágio neste sector teve como
principal objectivo contactar com todas as actividades aqui desenvolvidas:
acompanhamento desde a entrada dos produtos biológicos a analisar, observação de
exames a fresco e lâminas coradas, observação das culturas e consequente interpretação
dos resultados, valorização ou não dos agentes isolados, entre outros. A identificação
dos agentes isolados com interesse patogénico e a realização de testes de sensibilidade
aos antibióticos não foram efectuados, uma vez que, todas as culturas selecionadas são
enviadas para o laboratório central onde serão então efectuados esses procedimentos. A
identificação é feita num equipamento Maldi-Tof e os testes de sensibilidade aos
antibióticos são executados na sua maioria num Vitek.
O principal objectivo em microbiologia é detectar e identificar o agente causal,
de forma a estabelecer o diagnóstico correcto e o tratamento adequado à doença
infecciosa. Desta maneira, é necessário dar a devida importância a todas as etapas da
análise para que o resultado seja coerente com a situação clínica do doente,
nomeadamente as condições em que a colheita ocorre. Assim sendo, a microbiologia é a
área analítica onde o rigor da colheita, a conservação e manipulação da amostra se
reveste de maior importância, sendo essencial para o resultado final.
Antes de passar à parte do processamento das amostras, segue-se uma breve
descrição dos meios de cultura utilizados neste laboratório bem como em que consiste o
exame bacteriológico na sua generalidade.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
52
Meios de Cultura
Gelose Columbia + 5% sangue de carneiro (COS)
A gelose Columbia é um meio de isolamento seletivo que permite o crescimento
de microrganismos fastidiosos. Complementada com sangue de carneiro, é altamente
nutritiva e portanto adaptada à cultura da maior parte das espécies bacterianas,
independentemente do seu metabolismo. Permite o crescimento da maior parte dos
microorganismos e põe em evidência o tipo de hemólise.
Gelose Mac Conkey (MCK)
A gelose MacConkey é um meio de isolamento seletivo e de diferenciação para
deteção de Enterobacteriaceae em amostras de origem diversa. Destina-se
especialmente a detetar a fermentação da lactose:
- colónias lactose (+): rosa a vermelho
- colónias lactose (-): incolor ou ligeiramente bege
Gelose Hektoen (HEKT)
A gelose Hektoen é um meio seletivo e de diferenciação recomendado para a
deteção das espécies de Salmonella e Shigella. O meio é inoculado a partir de amostras
de fezes, suspensão de fezes ou caldo de enriquecimento.
- As colónias de Salmonella são verdes ou verdes-azuladas, com ou sem centro
negro.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
53
- As colónias de Shigella são verdes ou verdes-azuladas sem centro negro.
A inibição de microrganismos Gram-positivo obtém-se pela mistura de sais biliares e de
corantes.
Gelose CLED
A gelose CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient) é especialmente útil no
isolamento de microrganismos do trato urinário. Permite também diferenciar as
bactérias que fermentam a lactose das que não fermentam (indicador azul de
bromotimol):
- As bactérias lactose (+) produzem colónias amarelas pálidas ou amarelas, por
acidificação do meio
- As bactérias que não fermentam a lactose produzem colónias verdes, azuis ou
incolores.
Gelose Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol 2 (SGC2)
Esta gelose é um meio seletivo recomendado para o isolamento de leveduras e
fungos. A presença de gentamicina inibe muitas bactérias Gram-negativo e Gram-
positivo.
A presença de cloranfenicol melhora a seletividade para certas espécies que
podem ser resistentes à gentamicina. O pH da gelose que é ligeiramente ácido,
favorecendo mais o crescimento dos fungos do que o crescimento das bactérias.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
54
Gelose Campylosel (CAM)
A gelose Campylosel é um meio seletivo para o isolamento
do Campylobacter intestinal (C. jejuni e C. coli principalmente) a partir de amostras de
fezes. As colónias características de Campylobacter são pequenas e acinzentadas, e por
vezes estendem-se ao longo das estrias de inoculação.
Gelose Chocolate + Gelose PolyViteX (VCAT3)
Este meio é seletivo para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae & Neisseria
meningitidis a partir de amostras polimicrobianas (urogenitais, orofaríngeas,
hemoculturas...).
Gelose Chocolate Haemophilus 2 (HAEM2)
Esta gelose é seletiva para o isolamento das diferentes espécies de Haemophilus.
O isolamento das espécies de Haemophilus provenientes das vias respiratórias é muitas
vezes difícil devido à presença de uma flora saprófita.
Gelose Mannitol Salt Agar 2 (MSA2)
O Mannitol Salt Agar é uma formulação concebida para a diferenciação de
estafilococos com resultados positivos para a coagulase (ex: Staphylococcus aureus)
dos estafilococos com resultados negativos para a coagulase.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
55
Gelose Strepto B (STRB)
Meio para rastreio de Streptococcus agalactiae e prevenção das infecções
neonatais por estreptococos do Grupo B. Este microorganismo é o principal agente
responsável por infecções bacterianas invasivas nos recém-nascidos nos países
industrializados.
O meio cromogénicos permite o seu isolamento, apresentando colónias cor-de-rosa
claro a vermelho.
Meios de enriquecimento
Meio Selenito
O caldo de selenito é utilizado no enriquecimento e isolamento de Salmonellas
e Shiguelas, para posteriormente ser inoculado numa gelose de Hektoen. A turvação do
meio indica crescimento de microrganismos.
Meio BHI
Este é um meio de utilização geral, adequado para a cultura de uma grande
variedade de tipos de organismos, incluindo bactérias, leveduras e fungos filamentosos
provenientes das amostras clínicas. Neste caso, é habitualmente utilizado para inocular
amostras como pus provenientes de feridas, para posteriormente ser semeado em MCK,
COS e MSA2.
Meio Todd Hewitt
Caldo que é usado para o cultivo de Streptococcus agalactiae, antes de ser
inoculado no meio de Strepto B.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
56
Exame Bacteriológico
Na pesquisa de agentes patogénicos são utilizadas diversas técnicas como:
Exame directo:
- Macroscópico - Volume, cor, consistência e, em alguns casos, selecção
da porção da amostra mais adequada para a análise
- Exame a fresco (microscópico) – antes ou após centrifugação, com soro
fisiológico ou água destilada
- Exame corado - Colorações de Gram e Ziehl-Neelsen
Exame cultural:
- Selecção de meios adequados atendendo ao tipo de amostras
3.1. Urocultura
O exame bacteriológico da urina é um meio complementar de diagnóstico capaz
de confirmar a presença de infecção urinária. As infecções do aparelho urinário são das
infecções mais frequentes, geralmente causadas por bactérias da flora intestinal
saprófita, que invadem o aparelho urinário por via ascendente através da uretra. Os
agentes etiológicos mais frequentes nas crianças e adultos, sem outras doenças
associadas, são as enterobacteriáceas com grande destaque para a Escherichia coli,
Proteus spp. e Klebsiella spp. Em doentes internados e com factores de risco como
algaliação permanente, cálculos urinários e outras patologias do aparelho urinário, o
leque de agentes etiológicos alarga-se a outros microrganismos, como Pseudomonas
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
57
spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. e fungos (Candida spp.), estes últimos
particularmente em doentes que estão sob terapêutica antibiótica. Em situações clínicas
particulares poderão ser pesquisados outros microrganismos de acordo com a
informação clínica disponível (7). A identificação do agente microbiano na urina baseia-
se na execução da Urina tipo II e exame directo a fresco do sedimento urinário, na
observação microscópica de esfregaços corados pelo método de Gram e de Ziehl-
Neelsen (quando aplicável) da amostra e no exame cultural em meio CLED. Utilizando
uma ansa descartável, com um volume de 10μL, semear a urina pelo método
quantitativo, no meio CLED. A ansa deve fazer uma linha recta atravessando o centro
da placa (a) e seguidamente fazer as chamadas estrias de isolamento (b). (1)
Figura 2. Como semear uma urocultura.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
58
Esquema 1. Fluxograma Urocultura
De um modo geral, deveremos interpretar e relacionar os resultados do exame a
fresco, dos exames microscópicos corados e do exame cultural. No dia a seguir ao envio
para o laboratório central, chega a identificação bacteriológia e o antibiograma, os quais
são interpretados e valorizados de acordo com o contexto clinico. As infecções urinárias
tratadas devem ser seguidas com nova colheita 1 a 2 semanas após a terapêutica
antibiótica.
Frasco de urina estéril
Concentração por centrifugação (10 ml de
urina a 2000 rpm durante 10
minutos). Despreza-se o sobrenadante
fazendo-se a observação do sedimento
Exame directo a fresco:
Quantificação de células, leucócitos, piócitos,
eritrócitos, cilindros, cristais, bactérias, leveduras, parasitas
(Trichomonas), etc
Exame corado (quando aplicável):
- Coloração de Gram (pesquisa de bactérias e leveduras)
- Coloração de Ziehl-Neelsen (para
pesquisa de bacilos álcool-ácido-resistentes), quando requisitada
ou sempre que existe
piúria asséptica
Semear com ansa calibrada (10μl), seguida de uma
incubação a 37ºC, por um período de 16 a 24
horas
Leitura das culturas e contagem das colónias.
Observação das lâminas coradas pelas colorações de
Gram e Ziehl-Neelsen.
Resultado negativo – Saída às 24 horas Resultado positivo:
Cultura mista: repicagem para nova placa e
incubação
Cultura pura: envio para o laboratório
central para identificação e TSA
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
59
3.2. Exsudado Vaginal e Uretral
No aparelho genital feminino podem ocorrer diversas infecções, de etiologia
bacteriana, fúngica, parasitária e viral. Grande parte dessas infecções pode ser
assintomática ou causar sintomas muito discretos podendo passar despercebidos pela
mulher. Devido à grande variedade de agentes possíveis de serem pesquisados, é muito
importante que a suspeita clínica seja bem direccionada para que os exames
laboratoriais mais indicados sejam realizados. A colheita adequada das amostras, o seu
transporte e processamento laboratorial são fundamentais para o diagnóstico preciso.
A flora vaginal normal é complexa e resultante de um equilíbrio dinâmico,
variando consoante o período de vida e a fase do ciclo menstrual. O elemento bacteriano
predominante em condições normais é o lactobacilo (ou bacilo de Doderlein), associado
ao bifidobacterium, ao estafilococo epidermidis, enterococos, bacilos coliformes, etc
(7).
A partir das zaragatoas com meio de transporte é realizado:
Exame a fresco:
- Exame citológico: contagem de células e leucócitos
- Exame parasitológico: pesquisa de Trichomonas vaginalis
- Exame micológico: pesquisa de células leveduriformes
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
60
Exame corado:
- Coloração de Gram: avaliação da flora Gram + (bacilos de Doderlein) e flora
Gram -. Verificar a presença de “clue-cells” sugestiva de Gardnerella vaginalis
Exame Bacteriológico:
Em meio COS, que permite a observação da presença ou não de hemólise e do
tipo de hemólise, em meio VCAT3 para pesquisa de Neisseria gonorrhoeae, e
meio SGC2 para pesquisa de leveduras. (1)
O exsudado uretral é geralmente efectuado nos homens, sendo processado tal
como um exsudado vaginal.
Mais uma vez, o isolamento e posterior valorização de colónias suspeitas será
em função do conjunto de exames e contexto clínico.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
61
Esquema 2. Fluxograma Exsudado Vaginal e Uretral
Quando o meio SGC2 apresenta colónias, é feito o teste da blastese para
identificação da Candida albicans. Em conclusão, esta avaliação permite-nos observar o
equilíbrio da flora saprófita normal para a idade em questão, avaliação do número de
bacilos de Doderlein e flora associada, e pesquisar de bactérias potencialmente
patogénicas.
Zaragatoa em Meio de Stuart
Exame a fresco:
Quantificação de células, leucócitos, bacilos de
Doderlein, “clue-cells”, leveduras, parasitas
Exame corado:
Coloração de Gram: avaliação da flora Gram +
(bacilos de Doderlein) e flora Gram -, “clue-
cells”
Semear em COS e VCAT3 com incubação 24-48
horas a 37˚C em atmosfera de 10% de CO2
+
SGC2 com incubação 48 -72 horas a 30ºC
Leitura das culturas
Observação das lâminas de Gram
Resultado negativo – Saída às 48 horas Colónias suspeitas: repicagem para nova
placa e incubação
Se valorizável: envio para o laboratório
central para identificação e TSA
Zaragatoa em Meio de Carvão
COS VCAT3 SGC2
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
62
3.3. Exsudado Faríngeo
As infecções das vias respiratórias superiores são muito frequentes, sendo a
maior parte de etiologia viral. O diagnóstico bacteriológico dessas situações representa
uma tentativa de identificar, entre uma flora indígena abundante, o agente implicado na
infecção. Existe uma flora mista abundante na garganta, constituída por variados
microorganismos. Vários agentes patogénicos tais como o S. pneumoniae, S. pyogenes,
H. influenzae, N. meningitidis, leveduras e membros das Enterobacteriaceae, podem
constituir uma flora transitória ou estar presente em pequeno número na orofaringe de
indivíduos saudáveis. Na faringite bacteriana a principal causa é o Streptococcus β-
hemolítico do grupo A (Streptococcus pyogenes) (7).
No exame directo, são observados na coloração de Gram cocos Gram positivo,
esféricos, que ocorrem em cadeias de comprimento variável. No exame cultural em
COS, as colónias apresentam-se transparentes ou translúcidas, pouco convexas de
superfície lisa e bordo inteiro com larga zona de hemólise. Para complementar o estudo,
faz-se a prova da catalase, a qual é negativa para o Streptococcus pyogenes, e podemos
também recorrer ao teste de susceptibilidade à bacitracina, que é positivo (identificação
presuntiva). (1)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
63
Esquema 3. Fluxograma Exsudado Faríngeo
3.4. Exsudado Nasal
As infecções das vias respiratórias superiores são muito frequentes, sendo a
maior parte de etiologia viral. O diagnóstico bacteriológico dessas situações representa
uma tentativa de identificar, entre uma flora indígena abundante, o agente implicado na
infecção.
Vários agentes patogénicos tais como o Staphylococcus aureus ou Streptococcus.
Pneumoniae ou leveduras e membros das Enterobacteriaceae, podem constituir uma
Exame corado:
Coloração de Gram: avaliação da flora Gram + e
flora Gram -
Semear em COS com incubação 24-48 horas a 37˚C
em atmosfera de 10% de CO2
Leitura das culturas
Observação das lâminas de Gram
Resultado negativo – Saída às 48 horas Colónias suspeitas: Prova da Catalase e
repicagem se necessário (nova incubação)
Envio para o laboratório central para
identificação e TSA
Zaragatoa em Meio de Stuart
COS
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
64
flora transitória ou estar presente em pequeno número em indivíduos saudáveis.
Normalmente a pesquisa está direcionada para o Staphylococcus aureus (7).
Esquema 4. Fluxograma Exsudado Nasal
3.5. Hemocultura
A grande maioria das doenças infecciosas podem decorrer com bacteriémia
transitória, intermitente, ou persistente (ex. endocardite). Como o sangue é um produto
biológico estéril, o isolamento de um microrganismo a partir duma hemocultura é
geralmente o agente etiológico da infecção. É utilizado um meio de cultura difásico, o
Hemoline. O frasco contém dois meios de cultura que correspondem a fórmulas
Exame corado:
Coloração de Gram: avaliação da flora Gram + e
flora Gram -
Semear em COS com incubação 24-48 horas a 37˚C
em atmosfera de 10% de CO2
+
MSA2 com incubação 24-48 horas a 37ºC
Leitura das culturas
Observação das lâminas de Gram
Resultado negativo – Saída às 48 horas Colónias suspeitas: Prova da Catalase e
Slidex, repicagem se necessário (nova
incubação)
Envio para o laboratório central para
identificação e TSA
Zaragatoa em Meio de Stuart
COS MSA2
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
65
enriquecidas com factores de crescimento que permitem o desenvolvimento das
bactérias anaeróbias estritas e aero-anaeróbias responsáveis por septicémias. É
particularmente aconselhado para um crescimento rápido dos seguintes
microorganismos: enterobactérias, Pseudomonas sp, Staphylococcus, Streptococcus,
Candida sp (7). A incubação é em atmosfera de aerobiose a 37ºC durante 10 dias.
Realiza-se o exame macroscópico diariamente com inversão do frasco para contacto do
meio líquido com a gelose. O aparecimento de turvação, hemólise no caldo, produção
de gás, depósitos na superfície do caldo, desenvolvimento de colónias na gelose são
sinais de positividade da amostra. Obrigatoriamente ao 5º e 10º dias são feitas passagens
para COS e feito uma lâmina para Gram, ou quando houver sinais de positividade. (1)
Esquema 5. Fluxograma Hemocultura
Incubado em estufa a 37ºC durante 10 dias Verificação diária: turbidez, gás, crescimento na fase sólida.
Lâminas de Gram
Colónias suspeitas:
Envio para o laboratório central para
identificação e TSA
Meio Hèmoline
COS
5º e 10º dia
(ou apresentar turbidez
suspeita, gás ou crescimento)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
66
A positividade de uma hemocultura é sempre reportada ao clínico, mesmo
tratando-se de um agente da flora comensal da pele. Os microorganismos patogénicos
mais frequentemente isolados são Escherichia coli, Enterobacter, Staphylococcus
aureus, Pseudomona sp.
3.6. Coprocultura
A identificação de microorganismos patogénicos nas fezes é complicada uma
vez que existe uma abundante microflora fecal normal. Na realidade, a flora fecal no
indivíduo normal contém 10¹¹- 10¹² organismos/g de fezes, sendo cerca de 99%
aeróbios. As infecções do aparelho gastrointestinal têm uma alta incidência na
população em geral, com grande morbilidade em determinados grupos etários (crianças
e idosos). Os microrganismos responsáveis por estas infecções têm vindo a alterar-se
devido a vários factores tais como o aumento dos movimentos migracionais, a maior
frequência de viagens intercontinentais, o aumento do número de doentes
imunodeprimidos e o desenvolvimento de métodos de diagnóstico cada vez mais
sensíveis (7). Os antecedentes epidemiológicos, a existência de factores predisponentes,
a presença de sinais e sintomas clínicos e o tipo de diarreia devem orientar na pesquisa
do agente etiológico.
No laboratório faz-se por rotina o despiste de Salmonella spp,, Shigella spp., e
Campylobacter spp. Após o utente entregar a amostra em recipiente estéril, seco, de
boca larga e tampa de rosca, esta é levada para a área da microbiologia para mais tarde
ser processada. Inicialmente é feita a sementeira das fezes nos meios apropriados:
MCK, CAM e HEKT, sendo também inoculado em meio de enriquecimento de selenito
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
67
para posterior sementeira novamente em HEKT, seguindo para estufa a 37ºC durante
24h (meio CAM mantém-se 5 dias em atmosfera de microaerofilia). (1)
Esquema 6. Fluxograma Coprocultura
O exame micológico das fezes é apenas realizado quando há um pedido
específico do clínico. Quando assim é, as fezes são também semeadas em meio SGC2 e
seguem para a estufa a 30ºC durante 72 horas. (1)
Em meio MCK são consideradas colónias suspeitas todas que as forem lactose
negativas (bege claras a transparentes) e no meio HEKT todas as que foram esverdeadas
ou com centro negro.
Amostra de fezes
Semear em MCK, CAM, HEKT e selenito, incubar a
37ºC durante 24h (meio CAM mantém-se 5 dias em
atmosfera de microaerofilia).
Leitura das culturas
Resultado negativo – Saída às 72 horas Resultado positivo:
Colónias suspeitas: envio para o
laboratório central para identificação
e TSA
CAM HEKT MCK
Meio Selenito
HEKT
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
68
3.7. Expectoração e Secreções Brônquicas
O diagnóstico das infecções respiratórias inferiores é frequentemente dificultado
pela contaminação das amostras por flora comensal da orofaringe durante a colheita.
Geralmente a expectoração consiste num exsudado inflamatório do sistema respiratório
inferior misturado com saliva.
O Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) é o agente mais frequente da
pneumonia. O Haemophilus influenzae é o segundo microrganismo mais prevalente,
verificando-se um aumento da frequência na presença de doença pulmonar crónica. Os
microrganismos atípicos, Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila e a
Chlamydia pneumoniae são responsáveis por menor número de casos. A Pseudomonas
aeruginosa é um agente etiológico pouco frequente, sobretudo na ausência de alterações
estruturais pulmonares, estando geralmente associada a formas graves de pneumonia
(7).
Para pesquisa destes agentes patogénicos, é realizado um exame directo a partir
de lâminas coradas por Gram, bem como o exame cultural em meio COS, MCK e
HAEM. Na lâmina de Gram, além da avaliação da flora existente, também é avaliada a
quantidade de células polimorfonucleares presentes bem como a de células epiteliais (no
caso da presença de muitas células epiteliais, a amostra é rejeitada por contaminação). O
meio COS permite a observação da presença ou não de hemólise e do tipo de hemólise.
É a partir deste meio que se fazem os teste da catalase e coagulase se necessário. O
Streptococcus pneumoniae é um microrganismo anaeróbio facultativo que após 18-24h
de incubação a 37ºC numa atmosfera com 5 % de CO2 apresenta colónias, na gelose
sangue, com cerca de 1 mm de diâmetro, redondas de bordo inteiro e circundadas por
uma zona de a hemólise. O teste da optoquina permite a identificação presuntiva do
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
69
Streptococcus pneumoniae. Este teste baseia-se na susceptibilidade desta bactéria à
optoquina, inibindo o seu crescimento o que origina um halo de inibição da cultura em
placa. A valorização clínica das culturas é efectuada de acordo com a informação clínica
e exame directo. O exame micológico é efectuado pelo exame cultural em meio SGC2
apenas quando é expressamente pedido pelo clínico. (1)
Poderá ser também pedido um exame directo e cultural para a pesquisa de BK (
Bacilo de Koch) para despiste de tuberculose. Neste caso, a expectoração é enviada
assim que possível para o laboratório central para ser processada, sendo que no
laboratório apenas é feita a lâmina para Ziehl (pesquisa de bacilos álcool-ácido-
resistentes).
Esquema 7. Fluxograma Expectoração e Secreções Brônquicas
Semear em COS e HAEM com incubação 24-48 horas
a 37˚C em atmosfera de 10% de CO2
+
MCK 18 – 24 horas a 37ºC
Leitura das culturas
Observação das lâminas de Gram e Ziehl
Resultado negativo – Saída às 48 horas
Expectoração / Secreção Brônquica
COS HAEM MCK
Colónias suspeitas: eventual prova da
Catalase e Slidex, repicagem se necessário
(nova incubação)
Envio para o laboratório central para
identificação e TSA
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
70
3.8. Exsudado Purulento
O exsudado purulento pode variar consoante a zona na qual é recolhido o pus.
Podemos estar na presença de um exsudado auricular, de uma úlcera ou de uma ferida,
entre outros. Os meios utilizados são o COS, MCK e MSA2, além de ser também
incubado em meio de enriquecimento BHI para ser novamente semeado em COS, MCK
e MSA2 após 24 horas (no caso de turvação do meio) ou 48 horas. Juntamente com a
cultura é realizada uma lâmina para coloração de Gram. (1)
Esquema 8. Fluxograma Exsudado Purulento
Zaragatoa em Meio de Stuart
Semear em COS, MCK, MSA2 e BHI, incubar a 37ºC
durante 24 – 48 horas
Leitura das culturas
Resultado negativo – Saída às 72 horas
Resultado positivo:
Colónias suspeitas: envio para o
laboratório central para identificação
e TSA
COS
MSA2 MCK
BHI
MSA2
COS
MCK
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
71
3.9. Outras actividades desenvolvidas na área da microbiologia
Exame parasitológico das fezes
Antes da preparação da amostra é essencial ter em atenção a eventual presença
de estruturas macroscópicas sugestivas de parasitas. A amostra é preparada por
concentração pelo método de Ritchie, o qual se baseia-se no processo de
centrifugação/sedimentação das formas parasitárias num sistema de formol e éter. Neste
laboratório é utilizado o Kit comercial IBERKIT®. Posteriormente faz-se a observação
ao microscópio óptico com ampliação de 10x e 40x, depois de homogeneizar a
suspensão. Apesar de raramente obtermos amostras positivas, os parasitas mais
frequentes são quistos de Giardia lamblia, Entamoeba histolytica e Entamoeba coli,
ovos de Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e de Taenia spp.(1).
Pesquisa de sangue oculto nas fezes
Este teste é usado na deteção nas fases iniciais de problemas gastrointestinais
tais como o cancro do cólon, úlceras, pólipos, colite, diverticulite, que possam não
mostrar quaisquer sintomas visíveis a não ser sangue oculto. É realizado com o
dispositivo CLEARVIEW®FOB, o qual é um imunoensaio cromatográfico rápido para
detecção qualitativa de sangue humano oculto nas fezes. Este dispositivo tem uma
membrana revestida de anticorpos anti-hemoglobina na região da linha de teste. Durante
o teste, a amostra reage, formando uma linha colorida, revelando um resultado positivo.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
72
Deverá sempre aparecer uma segunda banda colorida, como indicador do bom
desempenho e controlo do teste. (1)(8)
Pesquisa de Mycoplasma e Ureaplasma
A pesquisa destes agentes patogénicos é apenas efetuada mediante pedido
específico, sendo efectuada em exsudados vaginais ou uretrais.
É utilizado um kit próprio, o MycoView®, que permite a identificação, a
titulação diferencial e a determinação de sensibilidade aos antibióticos de Ureaplasma
urealiticum e de Mycoplasma hominis, a partir de diferentes amostras urogenitais. Este
teste baseia-se em propriedades metabólicas específicas e resistência natural de cada
espécie de micoplasma. O Ureaplasma urealiticum faz a hidrólise da ureia e é resistente
à lincomicina, enquanto o Mycoplasma hominis hidrolisa a arginina e é resistente à
eritromicina (8). Este teste associa um caldo de cultura seletivo a uma galeria, que é
incubada a 37ºC durante 48 horas, e fornecem um resultado qualitativo/semi-
quantitativo. O crescimento das duas espécies é visualizado por uma mudança de cor do
indicador de pH de amarelo-laranja para vermelho ou rosa. A identificação do
Ureaplasma urealiticum é feita às 24 horas enquanto a do Mycoplasma hominis é feita
às 48 horas (1).
7.1. Antibiogramas
Os antibiogramas não se realizam neste laboratório, sendo que todos são
efectuados no laboratório central. No entanto é importante deixar uma breve nota
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
73
referente a esta questão, uma vez que, quando o resultado do antibiograma
correspondente a qualquer produto enviado fique pronto, é feita uma selecção rigorosa
dos antibióticos que vão efectivamente ser validados e apresentados no boletim de
análises, pelo especialista. Esta selecção é feita tendo em conta a idade, o estado
fisiológico e patologias associadas ou contexto clínico, com base nas guidelines da
Direcção Geral da Saúde.
7.2. Controlo de Qualidade Interno
Como controlo de qualidade interno do sector de microbiologia são utilizadas
estirpes de referência, obtidas a partir de culturas de colecção, as quais são processadas
como estirpes isoladas a partir de amostras clínicas.
As estirpes, a periodicidade e os processamentos utilizados nestes procedimentos
estão indicados na tabela seguinte:
Estirpes Processamento Objectivo Critérios de
Aceitação
Periodicidade
Staphylococcus
aureus ATCC
29213
Teste da
catalase +
Slidex + Gram
Testar
reagentes da
catalase,
Slidex e
coloração de
Gram
Catalase
positiva,
Slidex
positivo, Gram
positivo
Mensal /
Abertura de
novo lote de
reagente
Escherichia coli
ATCC 25922
Gram Testar os
reagentes da
coloração de
Gram
Gram negativo Mensal /
Abertura de
novo lote de
reagente
Streptococcus Teste da Testar os Sensível à Mensal /
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
74
pneumoniae
ATCC 49619
optoquina discos de
optoquina
optoquina Abertura de
novo lote de
reagente
Tabela 11. Controlo de Qualidade Interno Microbiologia
As estirpes são conservadas congeladas a – 20º C em sistema CRYO-BEADS.
É igualmente realizado um controlo de esterilidade da câmara de fluxo laminar
mensalmente. Para tal são colocadas no interior da câmara, durante uma hora, três meios
COS e três meios SCG2 abertos, seguindo depois para a estufa onde ficam a incubar 48
horas, a 37ºC e 30ºC respectivamente.
7.3. Avaliação Externa da Qualidade
Para efeitos de avaliação externa da qualidade, o laboratório participa num
programa específico, o NEQAS – Microbiologia Geral, Micobactérias, Microscopia e
Coloração, mensalmente.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
75
4. IMUNOLOGIA
A Imunologia é uma das valências com pouca expressão técnica neste
laboratório, uma vez que a maior percentagem de análises imunológicas são todas
encaminhadas para o laboratório central. Desta forma, esta área foi pouco explorada.
Apesar disso, o sector de imunologia do laboratório inclui um equipamento onde são
feitos alguns parâmetros imunológicos, o Vidas®, sendo as restantes técnicas, manuais.
A imunologia é uma área de grande complexidade, é necessário estar sempre ciente das
situações fisiológicas dos indivíduos para conseguir discernir possíveis interferências
nos resultados.
4.1. Vidas
O Vidas® é um equipamento com um sistema multiparamétrico de imunoensaio
com cinco secções diferentes, tendo cada uma 6 posições de testes, o que permite que
diversos parâmetros sejam efectuados em simultâneo. É um aparelho rápido e muito
simples de utilizar.
Fundamento do método:
ELFA (Enzyme linked fluorescente assay): O princípio do doseamento associa o método
imunoenzimático sandwich em 2 etapas com uma detecção final em fluorescência. O
cone, de utilização única, serve tanto de fase sólida como de suporte de pipetagem. Os
outros reagentes da reacção imunológica estão prontos a ser usados e pré-repartidos na
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
76
barrete. Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente no aparelho, o que se
traduz numa sucessão de ciclos de aspiração e dispensa do meio reaccional. A amostra é
colocada na barrete e no seu local correspondente, sendo depois diluída e incubada com
o cone. Posteriormente, é aspirada e dispensada no interior do cone durante um tempo
determinado. O interior do cone está revestido com antigénios ou anticorpos
complementares aos anticorpos ou antigénios que se pretende determinar na amostra. Os
anticorpos e os antigénios ligam-se. Os componentes não ligados à amostra são
eliminados por lavagens. Durante a etapa final de revelação, o substrato é aspirado e
dispensado pelo cone; a enzima do conjugado catalisa a reacção de hidrólise deste
substrato no produto cuja fluorescência emitida é medida. O valor do sinal de
fluorescência é proporcional à concentração do anticorpo presente na amostra.
Terminado o teste, os resultados são calculados automaticamente pelo equipamento
relativamente à curva de calibração em memória. Todos os reagentes utilizados no
sistema são pré-calibrados. Cada kit trás uma carta de calibração em formato de código
de barras que tem de ser lida cada vez que se utiliza um novo lote. A cada 14 dias, é
necessário passar o calibrador no equipamento (9).
4.1.1. Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)
O HIV é um retrovírus RNA, transmitido principalmente através do contacto
sexual mas também por infecção pré-natal ou perinatal, ou contacto directo de ferida ou
mucosa com sangue ou produtos contaminados. Este vírus é responsável pela SIDA
(Síndrome da Imunodeficiência Adquirida). Actualmente o HIV é classificado em dois
tipos, o HIV-1 e o HIV-2, sendo estes muito semelhantes na estrutura morfológica,
organização genómica, e tropismo celular, entre outras características. Após uma
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
77
primeira exposição ao vírus, existe uma fase de latência, antes de se manifestar a severa
imunodepressão que caracteriza a SIDA. Pouco tempo depois da infecção pelo HIV,
mas antes da seroconversão, os antigénios do HIV podem ser detectados em amostras
de soro ou plasma. A proteína estrutural do HIV mais frequentemente utilizada como
marcador antigénico é a proteína p24 (10). É utilizado um kit específico, o Vidas® HIV
DUO Quick, tratando-se de um teste automatizado que permite a detecção combinada
das imunoglobulinas totais anti-HIV 1 e anti-HIV 2 e do antigénio p24 do HIV 1, em
soro ou plasma humano, pela técnica de ELFA.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
ELFA
4.1.2. Controlo de Qualidade Interno
O controlo de qualidade interno é feito com base no controlo interno do próprio
kit utilizado. Existem três níveis, controlo nível 1 (patológico), controlo nível 2 (não
patológico) e controlo nível 3 (patológico), com intervalos de referência pré-
estabelecidos que acompanham o kit. Este controlo é efectuado semanalmente ou
sempre que seja realizado o ensaio.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
78
4.1.3. Avaliação Externa da Qualidade
Na avaliação externa da qualidade, o laboratório participa num programa ao
SEQC (Sociedade Espanhola de Bioquímica Clínica e Patologia Molecular)
trimestralmente.
4.2. Serologia / Técnicas Manuais
A serologia compreende diferentes técnicas que nos auxiliam no diagnóstico de
patologias infeciosas. Estas técnicas têm como principal base a detecção sérica de
anticorpos específicos produzidos contra antigénios, como resposta à presença de um
agente infeccioso.
Fundamento do Método:
Aglutinação Directa – Na presença de um agente patogénico ocorre a
formação de anticorpos, nomeadamente aglutininas. Um soro que contenha
estas aglutininas específicas, em presença dos antigénios homólogos e em
condições devidamente controladas, são capazes de causar aglutinação
visível. O grau de aglutinação depende da concentração do antigénio, do
número de anticorpos presentes e da temperatura.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
79
4.2.1. Serologia para Treponema pallidum
O Treponema pallidum é o agente etiológico da sífilis, uma doença sexualmente
transmissível e infecção crónica, que progride através de diferentes fases (sífilis
primária, secundaria, terciária e quaternária), produzindo diferentes sintomas clínicos
que se iniciam com as lesões cancroides típicas, seguidas de rash e, por fim, problemas
cardiovasculares e neurosífilis (7). O diagnóstico da sífilis é feito maioritariamente por
reacções serológicas, através da detecção de anticorpos (métodos não-treponémicos) ou
de antigénios de T. pallidum (métodos treponémicos). Ao nível deste laboratório é
utilizado um método não-treponémico, o RPR (Rapid Plasma Reagin).
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
RPR – Inespecífico, apenas detecta anticorpos da classe IgG e IgM. O antigénio
utilizado é constituído por cardiolipina, lecitina e colesterol. É avaliado o grau de
floculação dos antigénios lipídicos com o soro dos doentes. O RPR utiliza partículas de
carvão activado com os antigénios lipídicos adsorvidos e a reacção é visível a olho nu. É
também utilizado na monitorização da terapêutica com antibióticos. A metodologia é
aglutinação directa em placa. Se houver agregados de partículas de cor negra, estamos
perante um resultado positivo. Neste caso, fazemos diluições do soro com soro
fisiológico, até deixarem de aparecer agregados. A última diluição em que se observa
um resultado positivo, será o resultado da titulação (8).
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
80
Esta análise apresenta várias interferências (pouco específica), podendo ocorrer
resultados falsos-positivos, os quais requerem a confirmação dos resultados por
métodos treponémicos. Tal facto deve-se ao aparecimento de anticorpos antilipídicos,
em resposta a doenças não-treponémicas, agudas e crónicas, em que ocorre destruição
tecidular (ex. doenças autoimunes), nas grávidas e nos idosos. Nenhum título único é,
por si só, diagnóstico. O método treponémico utilizado para confirmação do RPR é o
TPHA (Treponema Pallidum Hemaglutination), realizado a nível do laboratório central.
4.2.2. Serologia para Salmonella
As bactérias do género Salmonella, vulgarmente designadas por salmonelas, são
bacilos Gram-negativos da família Enterobacteriaceae, que provocam infecções
gastrointestinais. A salmonelose é adquirida por contacto fecal-oral através da ingestão
de alimentos e água contaminados. Para melhor compreender a linguagem ao nível das
diferentes espécies de Salmonella, é necessário referenciar que para a sua nomenclatura
usa-se frequentemente o nome do serótipo como sendo o nome da espécie (ex. S.
paratyphi A). A serotipagem baseia-se na caracterização dos antigénios somáticos (O),
antigénios flagelares (H) e antigénios de superfície (Vi). O diagnóstico laboratorial da
febre tifóide (S. typhi) e paratifóide (S. paratyphi A e B) é feito através da reacção de
Widal.
Amostra:
Soro ou plasma
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
81
Método:
Reacção de Widal - Quantificação dos anticorpos anti-O e anti-H, presentes no
soro do doente, por reacções de aglutinação directa em placa com suspensões
antigénicas padronizadas de Salmonella (typhi O e H; paratyphi AO, AH, BO e BH). Os
resultados são expressos em título, dado pela última diluição do soro que ainda
apresenta aglutinação.
Podem existir reacções cruzadas devido a imunização prévia, infecções antigas ou
presença de anticorpos dirigidos a antigénios relacionados (8).
4.2.3. Serologia para Mononucleose Infecciosa
A mononucleose infecciosa é uma infecção herpética aguda causada
maioritariamente pelo vírus Epstein-Barr, transmitida por via oral, a qual afecta
principalmente crianças e adolescentes. É caracterizada por um conjunto de sintomas
que podem incluir linfadenopatia generalizada, hepatoesplenomegália moderada,
faringite acompanhada de febre, mal-estar, astenia, mialgias, entre outros. Os linfócitos
T respondem imunologicamente às células B infectadas, sobretudo através da activação
e proliferação das células T supressoras (CD8), originando uma linfocitose e o
aparecimento (superior a 10 %) de linfócitos atípicos no sangue periférico. Durante a
fase aguda da doença, anticorpos heterófilos (primariamente IgM) aparecem em 80 a
90% dos casos, os quais podem ser detectados por técnicas de aglutinação (3).
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
82
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
MONOSPOT – Kit Clearviem IM: Imunoensaio para a determinação qualitativa
de anticorpos IgM heterófilos por técnica de aglutinação directa. A amostra do doente é
adicionada à placa absorvente na janela de amostra. A placa absorvente contém
microesferas ligadas a uma glicoproteína de eritrócitos bovinos. Quando a amostra é
aplicada, estas microesferas são mobilizadas e a amostra migra ao longo da tira teste. Se
estiverem presentes anticorpos heterófilos, estes conjugam-se com as glicoproteínas,
formando um complexo com as microesferas na linha de teste originando uma linha
com cor. Podem surgir falsos-negativos associados a situações em que o doente
permanece negativo para anticorpos heterófilos, ou eventualmente apresenta uma
resposta tardia a este tipo de anticorpos (8).
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
83
5. BIOQUÍMICA
A valência de bioquímica corresponde a um dos sectores mais importantes das
Análises Clínicas. É dos sectores com maior volume de trabalho e igualmente dos mais
extensos, onde é analisado um elevado número de parâmetros, segundo inúmeras
técnicas e com diferentes fundamentos. Desta forma, houve a possibilidade de percorrer
todas as fases do processo laboratorial (fase pré-analitica, fase analítica e pós-analitica)
e perceber a importância de cada uma delas, nomeadamente a importância de uma boa
colheita e do transporte correcto e rápido da amostra até ao processamento laboratorial
para a obtenção de um resultado correcto. Neste laboratório não existem muitos
equipamentos diferentes, no entanto foram executados desde métodos totalmente
manuais aos totalmente automáticos, passando pelos semi-automáticos, sempre com a
preocupação da maior familiarização possível com os fundamentos de funcionamento
dos equipamentos e da metodologia utilizada, para além de participação na validação de
resultados, sempre com auxílio de profissionais qualificados.
5.1. Dimension Xpand
Este é o equipamento onde são realizadas a maioria das análises em todo o
laboratório. Os sistemas de bioquímica clínica deste equipamento são sistemas de
química integrados, independentes, controlados por microprocessador, que medem
diversos analitos, incluindo enzimas. Os sistemas funcionam com cartuchos de reagente
para testes múltiplos, as flex, cuvetes de reacção descartáveis, tecnologia de
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
84
microssensores integrados (IMT), de forma a fornecer resultados rápidos, exactos e
precisos.
Fundamento do método:
Espectrofotometria - Método definido como uma medida da intensidade da luz
absorvida a um determinado comprimento de onda da radiação que incide na amostra. A
absorvância varia linearmente com a concentração do analito, a qual é determinada por
extrapolação gráfica com base na Lei de Lambert Beer. Neste método, é adicionado um
reagente produzindo uma reação que altera a absorvância. Esta alteração é detectada por
um fotodetector. Dentro da espectrofotometria temos o método colorimétrico, que
quantifica a intensidade da cor formada na reação. Existem também métodos que
envolvem reacções enzimáticas, incluindo a determinação da actividade enzimática a
um tempo fixo (método enzimático) e a determinação contínua da actividade enzimática
(método cinético).
Potenciometria - Baseia-se na medição de potencial de um eléctrodo indicador
em relação a um eléctrodo de referência. Este potencial depende das actividades das
espécies iónicas que entram nas reacções de oxidação-redução correspondentes. Neste
caso é utilizado um sensor que desenvolve um potencial elétrico proporcional à
actividade de casa ião específico na amostra. Os iões estabelecem um equilíbrio com a
superfície do eléctrodo. É gerado um potencial proporcional ao logaritmo da actividade
do analito. Este potencial gerado na amostra é comparado com uma solução standard e
a concentração iónica calculado com base na equação de Nernst.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
85
Turbidimetria – A turbidimetria é uma medida da diminuição da intensidade da
luz incidente causada pela dispersão, reflecção e absorção do feixe de luz incidente
numa solução de partículas. A imunoturbidimetria compreende a formação de
imunocomplexos Ag/Ac in vitro, de forma a aumentar a turbidez, medindo a formação
progressiva de imuncomplexos numa célula fotoeléctrica, na forma de densidade óptica.
Imunoensaio enzimático – Técnica realizada através da fixação de antigénios ou
anticorpos a uma superfície sólida que se vão ligar especificamente aos anticorpos ou
antigénios a pesquisar, durante um período de incubação. O material ligado é
posteriormente detectado por um segundo anticorpo marcado com uma enzima. O
conjugado que não estiver ligado é removido por lavagem. É adicionado um substrato,
que será degradado pela enzima, originando cor ou quimioluminescência. A leitura dos
resultados é feita geralmente utilizando um espectrofotómetro de absorvância (quando o
produto da reacção é corado) ou de emissão (quando o produto da reacção emite
radiação/fluorescência). A absorvância/fluorescência será proporcional à quantidade de
antigénios ou de anticorpos específicos presente na amostra testada.(11)
5.1.1. Glucose
A glucose é um monossacárido presente no sangue que funciona como um
substrato fornecedor de energia. A determinação da glicémia é utilizada como meio de
diagnóstico e monitorização da terapêutica de pacientes com diabetes mellitus,
investigação de hiper e hipoglicémia e rastreio de factores de risco cardiovascular.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
86
Amostra:
Soro ou plasma e urina
Método:
Espectrofotometria (Enzimático)
Hexocinase-glucose-6-fosfato desidrogenase:
A leitura da absorvância é feita a 340 nm e 383 nm e é devida à formação de NADH, a
qual é proporcional à concentração de glucose na amostra.
Valores de Referência:
74 – 106 mg/dl
Valores de Glucose Aumentados Valores de Glucose Diminuídos
-Diabetes mellitus
- Hemocromatose
- Fármacos
- Deficiências nutricionais
Hexocinase
Glucose + ATP Glucose-6-fosfato + ADP
Glucose-6-fosfato desidrogenase
Glucose-6-fosfato + NAD+
Gluconato-6-fosfato + NADH + H+
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
87
- Síndrome de Cushing
- Feocromocitoma
- Stress
- Pancreatite aguda
- Fármacos
- Doenças hepáticas e cardíacas
- Hipotiroidismo
- Doenças pancreáticas (tumores
pancreáticos secretores de insulina)
- Hipoglicémia auto-imune (ex. Ac. Anti
células beta)
Tabela 12. Alterações dos valores de glucose (12)
Para além da determinação única de glicémia, são também realizadas outras
provas com a determinação de glicémia a tempos determinados. As mais comuns são a
Glicémia Pós-Prandial e a Prova de Tolerância Oral à Glucose, que são provas de
sobrecarga de açúcares, com vista a avaliar a capacidade funcional do pâncreas.
5.1.2. Proteínas Totais
O total de proteínas no soro consiste na soma de todas as proteínas em
circulação. O valor das proteínas totais séricas pode sofrer variações devido a alterações
de uma ou mais proteínas específicas ou alteração a nível do volume de água no plasma.
As alterações nos níveis de proteínas totais apresentam uma correlação clínica variada e
a sua determinação é, essencialmente, utilizada no diagnóstico e tratamento de diversas
patologias que envolvem o fígado, os rins ou a medula óssea bem como outras
perturbações metabólicas e nutricionais.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
88
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (colorimetria)
Biureto:
A leitura da absorvância é feita a 540 nm e 700 nm e é devida à formação do complexo
azul-violeta que é proporcional à concentração de proteínas na amostra.
Valores de Referência:
6.4 – 8.2 g/dl
Proteínas Totais Aumentados Proteínas Totais Diminuídas
- Desidratação
- Mieloma múltiplo
- Hemorragias
- Síndrome nefrótico
- Queimaduras graves
- Défice na absorção de proteínas
- Síndrome de retenção de sal
Tabela 13. Alterações dos valores das Proteínas totais (12)
OH-
Proteínas + Cu2+
Complexo
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
89
5.1.3. Albumina
A albumina é a proteína mais abundante no soro humano (55-65% das proteínas
plasmáticas totais), sendo a principal responsável pela manutenção da pressão oncótica,
transporte e armazenamento de uma grande variedade de ligandos. Os níveis séricos de
albumina poderão indicar deficiências nutricionais ou serem utilizados como marcador
de desordens do metabolismo proteico (redução da síntese ou perda acentuada de
proteínas).
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (colorimetria)
A leitura da absorvância é feita a 600 nm, nos quais o complexo formado absorve. A
quantidade de complexo formado é proporcional à quantidade de albumina presente na
amostra.
Valores de Referência:
3.4 – 4.8 g/dl
Albumina + Roxo de Bromocresol Complexo
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
90
Albumina Aumentada Albumina Diminuída
- Desidratação
- Estase venosa excessiva
- Deficiência de síntese (doença hepática)
- Ingestão alimentar inadequada
- Absorção diminuída
- Gravidez, hipertiroidismo
- Destruição aumentada (infecções,
neoplasias, traumas)
- Perda excessiva (queimadura,
hemorragia, síndrome nefrótico,
enteropatia)
Tabela 14. Alterações dos valores da Albumina (12)
5.1.4. Ferritina
A ferritina é uma molécula constituída por um invólucro proteico e um núcleo de
ferro. Está presente em quantidades elevadas nas células do fígado e medula óssea.
Constitui a reserva principal de ferro, mantendo o organismo protegido aquando de
excesso de ferro em circulação (até saturação). Encontra-se também em circulação no
plasma, onde a sua concentração reflecte em que condições que se encontram as
reservas. O doseamento de ferritina é útil na detecção e monitorização de deficiência de
ferro, diagnóstico diferencial entre anemia ferropénica e anemia da doença crónica.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
91
Amostra:
Soro ou plasma heparinizado
Método:
Imunoensaio enzimático
Este método consiste num só passo baseado no princípio de sandwich. A
amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos
monoclonais específicos para a ferritina e com um reagente conjugado (anticorpos
monoclonais específicos para um segundo local na molécula de ferritina), formando um
complexo sandwich partícula-ferritina-conjugado. O conjugado não ligado e o analito
são separados magneticamente e por lavagem, correspondentemente. Posteriormente, a
sandwich é combinada com um substrato cromogénico que é catalisado de forma a
originar a cor vermelha. A concentração de ferritina presente é directamente
proporcional intensidade da cor formada. A leitura é bicromática a 577 e 700 nm.
Valores de Referência:
10 – 291 µg/dL
Ferritina Aumentada Ferritina Diminuída
- Sobrecargas de ferro (transfusões)
- Processos inflamatórios (Fase aguda
positiva)
- Depleção das reservas de ferro (Anemia
ferropénica, gravidez, insuficiência renal)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
92
- Hemocromatose
- Doenças hepáticas
- Tumores malignos
Tabela 15. Alterações dos valores da Ferritina (12)
5.1.5. Proteína C reactiva
A proteína C reactiva (PCR) é uma proteína de fase aguda positiva não
específica, que normalmente aumenta precocemente durante a resposta imunitária
generalizada inespecífica a processos inflamatórios não infecciosos e infecciosos, como
por exemplo artrite reumatoide ou doenças cardiovasculares. A PCR é sintetizada no
fígado e tem como principal função a fixação e desintoxicação das substâncias tóxicas
endógenas produzidas em resultado de lesões tecidulares. A sua determinação é
relevante no screening de inflamação aguda e avaliação da terapêutica anti-inflamatória.
Trata-se de um parâmetro muito sensível, no entanto é pouco específico.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Turbidimetria
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
93
Partículas sintéticas coberta de anticorpos para a PCR complexam na presença
desta. A formação de complexos vai aumentar a turbidez, a qual é proporcional à
concentração de PCR na amostra.
PCR Aumentada
- Doenças inflamatórias (ex: artrite reumatoide, doença inflamatória intestinal)
- Infecções bacterianas ou virais
- Danos tecidulares (neoplasias, enfarte do miocárdio)
- Complicações pós-operatórias
Tabela 16. Causas do aumento de PCR (12)
Valores de Referência:
<0,6 mg/dl
5.1.6. Ureia
A ureia é um composto azotado sintetizado no fígado como produto final do
metabolismo das proteínas e dos aminoácidos. Na sua degradação, as proteínas são
hidrolisadas em aminoácidos e estes desaminados. A amónia que resulta desse processo
é convertida em ureia no fígado, lançada na circulação sanguínea e excretada pela urina.
Mais de 90% da ureia é filtrada pelo rim, não sendo reabsorvida nem secretada
PCR + Ac Anti-PCR Complexo
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
94
activamente. Esta constitui a principal via de desintoxicação do organismo humano para
o excesso de amoníaco.
A determinação da ureia é um dos testes mais utilizados para a avaliação da
função renal e da nutrição proteica e também no diagnóstico de determinadas doenças
metabólicas. Esta análise é frequentemente prescrita em conjunto com a creatinina para
o diagnóstico diferencial da hiperurémia pré-renal, renal e pós-renal.
Amostra:
Soro ou plasma e urina
Método:
Espectrofotometria (cinético)
Ensaio de UV cinético
A mudança da absorvância a 340 nm devido ao consumo de NADH é directamente
proporcional à concentração de ureia. A leitura é bicromática a 340 e 383 nm.
Valores de Referência:
Homem: 18 – 55 mg/dl
Mulher: 21 – 43 mg/dl
Glutamato desidrogenase
Urease
Ureia + H2O 2 NH3 + CO2
NH3 + α-cetoglutarato + NADH L-glutamato + NAD
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
95
Ureia Aumentada
Pré-renal - Insuficiência cardíaca
- Catabolismo proteico elevado
- Depleção hídrica
Renal - Nefropatias
Pós-renal - Obstrução das vias urinárias
Tabela 17. Causas do aumento de ureia (12)
5.1.7. Creatinina
A creatinina é sintetizada endogenamente a partir de creatina e de fosfato de
creatina no metabolismo muscular. Em condições de função renal normal, é excretada
por filtração glomerular. O valor da creatinina está dependente da massa muscular,
filtração glomerular e nutrição. As determinações de creatinina são realizadas para o
diagnóstico e a monitorização da insuficiência renal aguda e crónica e monitorização da
diálise renal.
A análise da creatinina na urina é utilizada para calcular a clearance da
creatinina.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
96
Cálculo da clearance da creatinina e expressão dos resultados:
Amostra:
Soro ou plasma e urina
Método:
Espectrofotometria (colorimetria, cinético)
Método de Jaffé
A taxa de alteração na absorvância a 510 nm é proporcional à concentração de
creatinina na amostra. Leitura bicromática a 510 e 600 nm.
Valores de Referência:
Homem: 0.80 – 1.30 mg/dl
Mulher: 0.60 – 1.00 mg/dl
Creatinina Aumentada Creatinina Diminuída
- Insuficiência renal - Gravidez
NaOH
Creatinina + Picrato Cromoforo vermelho
Clcr = Crurina x Volume(urina 24 horas)
Crsérica
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
97
- Doenças musculares
- Dieta rica em creatina (carne vermelha)
- Tratamento de diálise prolongado
- Hepatopatia crónica (a creatinina é
sintetizada a nível hepático)
Tabela 18. Alterações da creatinina (12)
5.1.8. Ácido Úrico
O ácido úrico resulta do metabolismo das purinas e ácidos nucleicos. É
excretado pelos rins, mas em situações de disfunção renal pode acumular-se. O aumento
dos níveis de ácido úrico pode levar à formação de depósitos de cristais de urato nas
articulações (gota) ou nos rins (cálculos renais). A determinação do ácido úrico permite
avaliar se a inflamação nas articulações está relacionada com a gota e é útil para
monitorizar a produção de ácido úrico, em doentes sujeitos a quimioterapia.
Amostra:
Soro ou plasma e urina
Método:
Espectrofotometria (colorimetria, enzimático)
Uricase
Ácido Úrico + 2 H2O + O2 Alantoína + H2O2 + CO2
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
98
O ácido úrico, que absorve a 293 nm, é convertido em alantoína pela uricase, a
qual não absorve a esse comprimento de onda. Esta alteração na absorvância é
directamente proporcional à concentração de ácido úrico na amostra. Leitura
bicromática a 293 e 700 nm.
Valores de Referência:
2.5 – 6.0 mg/dl
Ácido Úrico Aumentado
- Insuficiência renal
- Gota
- Leucemia
- Psoríase
- Transtornos nutricionais
- Terapêutica citostática
Tabela 19. Causas do aumento de ácido úrico (12)
5.1.9. Bilirrubinas
Cerca de 80-85% da bilirrubina produzida diariamente tem origem na
hemoglobina libertada pela decomposição de eritrócitos através do sistema
reticuloendotelial do fígado, baço e medula óssea, no qual o grupo heme, assim que
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
99
perde o ferro, é convertido em bilirrubina. Os restantes 15-20% resultam da ruptura de
proteínas que possuem hemoglobina tais como mioglobina, citocromos e catalase. A
bilirrubina, por ser insolúvel em água, liga-se à albumina. A esta fracção chamamos
bilirrubina indirecta ou não-conjugada. No fígado, a bilirrubina é conjugada com o
ácido glucorónico para formar a bilirrubina conjugada, ou bilirrubina directa, que é
excretada através do sistema biliar para o intestino. A eliminação é quase completa e os
níveis séricos são normalmente insignificantes. A bilirrubina total é a soma das fracções
não-conjugadas e conjugadas. A diferenciação entre a bilirrubina directa e indirecta é
importante para o diagnóstico diferencial das formas de icterícia. Se a bilirrubina directa
constituir menos de 20% da bilirrubina total, é indicativo de icterícia pré-hepática. Se
for superior a 50% pode sugerir a existência de uma icterícia hepática ou pós hepática.
5.1.9.1. Bilirrubina Total
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (colorimetria)
A bilirrubina não-conjugada é solubilizada, à qual é adicionado ácido sulfanílico
diazotado, convertendo-a em diazo-bilirrubina, um cromóforo de cor vermelha que
Bilirrubina solubilizada + ácido sulfanílico diazotado Cromóforo vermelho
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
100
representa a bilirrubina total, absorvendo a 540 nm. Leitura bicromática a 540 e 700 nm.
É realizada uma amostra de ‘’branco’’ para reduzir a interferência do soro endógeno.
Valores de Referência:
< 1.1 mg/dl
5.1.9.2. Bilirrubina Directa
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (colorimetria)
A bilirrubina conjugada é diluída em HCl, à qual é adicionado ácido sulfanílico
diazotado, convertendo-a em diazo-bilirrubina, um cromóforo de cor vermelha que
absorve a 540 nm. Leitura bicromática a 540 e 700 nm. É realizada uma amostra de
‘’branco’’ para reduzir a interferência do soro endógeno.
Valores de Referência:
< 0.2 mg/dl
Bilirrubina conjugada + ácido sulfanílico diazotado Cromóforo vermelho
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
101
No estado fisiológico, a bilirrubina plasmática está quase exclusivamente sob a
forma não conjugada. Nas afecções hepáticas agudas, a bilirrubina total é um bom
indicador da gravidade da afecção. O doseamento da bilirrubina plasmática, livre e
conjugada, permite confirmar a icterícia clínica e determinar a origem.
Aumento das Bilirrubinas
- Icterícias por excesso de bilirrubina (icterícias hemolíticas): Exclusivas da bilirrubina
não-conjugada (origem extrahepática)
- Icterícias ligadas a um defeito do metabolismo da bilirrubina (doença de Gilbert,
síndroma de Crigler-Najar, icterícia do recém-nascido): Exclusivas da bilirrubina não-
conjugada
- Icterícias por obstrução biliar intra ou extra-hepática (icterícias colestáticas):
Maioritariamente da bilirrubina conjugada quase exclusiva. As concentrações séricas
das enzimas da colestase são muito elevadas
- Icterícias ligadas a um defeito de excreção celular biliar (síndroma de Dubin-Johnson):
Bilirrubina não-conjugada um pouco elevada e bilirrubina conjugada predominante
- Icterícias hepato-celulares: associação de um defeito de conjugação e de excreção
celular biliar (hepatites virais, tóxicas ou medicamentosas, cirroses, carcinoma
hepatocelular): Aumento das duas formas de bilirrubina
Tabela 20. Causas do aumento das bilirrubinas (12)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
102
5.1.10. Triglicéridos
Os triglicéridos são lípidos compostos pela esterificação do glicerol. A
esterificação pode produzir mono, di ou triglicéridos. Os triglicéridos constituem a
gordura armazenada no tecido adiposo, sendo a principal reserva energética do
organismo em caso de ausência de ingestão ou incapacidade de metabolização dos
hidratos de carbono. Os triglicéridos de origem exógena (alimentação) são transportados
no plasma em partículas lipoproteicas designadas de quilomicras, que são rapidamente
catabolizadas pelas lipoproteínas lipase expressas no endotélio capilar, tecido adiposo e
músculo-esquelético sob controlo da insulina. Os triglicéridos de origem endógena
(hepática) são transportados no plasma em VLDL, sintetizadas no fígado, com a função
de suprir os tecidos de ácidos gordos na ausência das quilomicras. A avaliação dos
triglicéridos é utilizada no diagnóstico e tratamento de doentes com pancreatite aguda e
crónica, diabetes mellitus, nefrose, obstrução biliar extra-hepática e outras doenças que
envolvem o metabolismo dos lípidos (hiperlipidémias) ou várias perturbações
endócrinas.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (enzimático)
Lipoproteína Lipase
Triglicéridos Glicerol + Ácidos Gordos
Glicerol cinase
Glicerol + ATP Glicerol-3-fosfato + ADP
Glicerolfosfato oxidase
Glicerol-3-fosfato + O2 Dihidroacetona fosfato + H2O2
Peroxidase
2 H2O2 + Aminoantipirina Quinoneimina + HCl + 4 H2O + 4-Clorofenol
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
103
A leitura da absorvância é feita a 510 e 700 nm e é devida à formação de quinoneimina,
sendo proporcional ao teor de triglicéridos na amostra.
Valores de Referência:
40 – 150 mg/dl
Triglicérido Aumentados
- Pancreatite
- Diabetes mellitus
- Doenças genéticas
- Hipercolesterolémias
- Gravidez
Tabela 21. Causas do aumento de triglicéridos (12)
5.1.11. Colesterol Total
O colesterol é sintetizado no fígado e intestinos, embora todas as células o
possam sintetizar a partir de acetil-CoA. Trata-se de um componente essencial das
membranas das células e lipoproteínas e é igualmente um percursor para a síntese das
hormonas esteroides e ácidos biliares. O colesterol é sobretudo transportado pelo LDL e
HDL. Estas duas lipoproteínas desempenham diferentes papéis na patogénese das
perturbações lipídicas (as LDL levam o colesterol para as células e o HDL retira o
colesterol das células). Por conseguinte, a concentração de colesterol total proporciona
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
104
apenas um valor de base que tem de ser analisado conjuntamente com o LDH, HDL e
triglicéridos.
A determinação de colesterol é utilizada no screening do risco aterosclerótico e
no diagnóstico e tratamento de desordens que envolvem elevados níveis de colesterol e
metabólicas dos lípidos e lipoproteínas.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (colorimetria)
A leitura da absorvância é policromática a 452, 550 e 700 nm e é devida à formação de
um cromóforo, o qual é directamente proporcional à concentração de colesterol total na
amostra.
Valores de Referência:
< 190 mg/dl
Colestrol esterase
Ésteres do Colesterol Colesterol + Ácidos Gordos
Colesterol oxidase
Colesterol + O2 Colest-4-ene-3-ona + H2O2
Peroxidase
2 H2O2 + DEA-HCl/AAP 4 H2O + DEA-HCl/AAP oxidado (cromóforo)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
105
Colesterol Total Aumentado Colesterol Total Diminuído
- Hiperlipoproteinémias
- Obstrução biliar
- Hipotiroidismo
- Nefrose
- Doenças pancreáticas
- Gravidez
- Fármacos (contraceptivos orais,
corticosteróides)
- Doenças que provoquem dano hepático
- Hipertiroidismo
- Infecção e inflamação aguda
Tabela 22. Alterações do colesterol total (12)
5.1.12. Colesterol HDL
Lipoproteina de alta densidade responsável pelo transporte reverso do colesterol
das células periféricas para o fígado. No fígado, o colesterol é transformado em ácidos
biliares, os quais são excretados para o intestino através do tracto biliar. A
monitorização do colesterol-HDL no soro tem importância clínica na medida em que
existe correlação inversa entre o valor deste parâmetro e o risco de doença
aterosclerótica. A redução na concentração plasmática de Colesterol-HDL em
conjugação com a elevação dos triglicéridos aumenta o risco cardiovascular.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
106
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (colorimetria)
A leitura da absorvância é feita a 600 e 700 nm. A intensidade da cor é directamte
proporcional à concentração de colesterol HDL na amostra.
Valores de Referência:
Homem: > 40 mg/dl
Mulher: > 45 mg/dl
Colesterol HDL Aumentado Colesterol HDL Diminuído
- Exercício vigoroso - Stress
Sulfato dextrano + Sulfato de Mg
HDL, LDL, VLDL, Quilomicras LDL, VLDL e Quilomicras não reactivos +
Ésteres de Colesterol HDL
PEG-Colesterol esterase
Ésteres de Colesterol HDL + H2O Colesterol HDL + RCOOH
PEG-Colesterol oxidase
Colesterol HDL + O2 Δ Colestenona + H2O2
Peroxidase
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + HSDA + H+ + H2O Desenvolvimento de Cor + 5
H2O
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
107
- Consumo moderado de álcool
- Tratamento com insulina
- Estrogénios orais
- Obesidade
- Diabetes mellitus
- Doença hepática
- Doenças genéticas (Tangier,
Hipoalfalipoproteinémia)
- Urémia
- Nefrose
- Doenças mieloproliferativas
- Tabagismo
- Hipo ou Hipertiroidismo
Tabela 23. Alterações do colesterol HDL (12)
5.1.13. Colesterol LDL
Estas lipoproteínas de baixa densidade são as principais transportadoras
plasmáticas de colesterol com consequente desenvolvimento de aterosclerose. Ainda
que estejamos dentro do intervalo de referência de concentrações de colesterol total,
pode ocorrer um aumento do colesterol LDL com um elevado risco associado de
doenças cardiovasculares, nomeadamente doença coronária.
O colesterol LDL é obtido indirectamente através de um determinado cálculo:
LDL = Colesterol Total – Colesterol HDL – Triglicéridos/5
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
108
Valores de Referência:
< 130 mg/dl
5.1.14. Lactato Desidrogenase (LDH)
A LDH é uma enzima que podemos encontrar na maioria dos tecidos, como o
coração, pulmão, fígado, rim ou músculo-esquelético. Apresentam-se cinco diferentes
isoenzimas, consoante o tecido onde predomina. Em termos clínicos, a LDH é útil na
detecção de pequenas lesões nos tecidos. Níveis aumentados de LDH poderão ocorrer
numa diversidade de condições patológicas, uma vez que a sua distribuição é bastante
alargada, como por exemplo enfartes do miocárdio, hemólise, doenças hepáticas,
pulmonares e musculares.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectofotometria (cinético)
Em aerobiose, esta enzima transforma o lactato em piruvato que será de seguida
utilizado na glicogénese. Em anaerobiose, intervém no final da degradação da glicose
em lactato libertando energia sob a forma de ATP.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
109
A leitura da absorvância é feita a 340 nm e é devido à formação de NADH, o qual é
proporcional à actividade da enzima na amostra.
Valores de Referência:
85 – 227 UI/L
LDH Aumentada
- Enfarte do miocárdio
- Embolia pulmonar
- Doenças musculares
- Hepatites
- Anemias hemolíticas
- Linfomas
- Choque séptico
- Alguns Tumores
Tabela 24. Situações que podem levar ao aumento de LDH (12)
Lactato Desidrogenase
Lactato + NAD+ Piruvato + H
+ + NADH
pH 9.4
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
110
Creatina Cinase
Creatina Fosfato + ADP Creatina + ATP
Mg2+
, NAC, EDTA
Hexocinase
ATP + Glucose ADP + Glucose-6-fosfato
Mg2+
Glucose-6-fosfato Desidrogenase
Glucose-6-fosfato + NADP+ 6-fosfogluconolactona + NADPH + (H
+)
5.1.15. Creatina Cinase (CK)
A CK é uma enzima que catalisa a transferência de um grupo fosfato para o
ADP, permitindo a reconstituição das reservas de ATP. Encontra-se em abundância no
miocárdio, músculo-esquelético e cérebro, a cada tecido correspondendo uma
isoenzima: CK-MB (miocárdio), CK-MM (músculo esquelético) e CK-BB (cérebro). A
determinação da CK trata-se de um indicador importante de dano muscular ou cardíaco.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (cinético)
A leitura da absorvância é bicromática a 340 e 540 nm e é devida ao consumo de
NADH, o qual é directamente proporcional à actividade da CK.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
111
Valores de Referência:
Homem: 39 – 308 UI/L
Mulher: 26 – 192 UI/L
- Enfarte do miocárdio
- Distrofia muscular
- Exercício físico intenso
- Danos no sistema nervoso
Tabela 25. Situações que podem levar ao aumento de CK (12)
5.1.16. α-Amilase
A α-amilase trata-se de uma enzima que é produzida ao nível do pâncreas e das
nossas glândulas salivares. A determinação da actividade desta enzima tem interesse no
diagnóstico da pancreatite ou outras perturbações pancreáticas. Ao obtermos elevados
níveis de α-amilase no sangue, poderemos estar perante uma situação de pancreatite
aguda, ou na pancreatite crónica recidivante. Estão também associados a síndromes
abdominais dolorosos sem lesão pancreática, pelo que a amilase, apesar de sensível, não
é um teste específico de doença pancreática.
Amostra:
Soro, plasma ou urina
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
112
Método:
Espectrofotometria (cinético)
O CNPG3 funciona como substrato da α-Amilase, produzindo o CNP e o
resultante aumento da absorvância é directamente proporcional à actividade da α-
Amilase na amostra.
A leitura da absorvância é bicromática a 405 e 577 nm e é devida ao aumento da
absorvância, a qual é directamente proporcional à actividade da enzima.
Valores de Referência:
Homem: 20 – 160 UI/L
Mulher: 25 – 115 UI/L
α-Amilase Aumentada
- Pancreatite
- Diversos tipos de tumores malignos (pulmão, ovário, mama e cólon)
- Insuficiência renal
- Queimaduras
- Doença hepática crónica
- Gravidez
- Cetoacidose diabética
Tabela 26. Situações que podem levar ao aumento de α-Amilase (12)
α-Amilase
CNPG3 (Substrato) CNP + CNPG2 + G3 + glucose
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
113
5.1.17. Cálcio
O cálcio é um oligoelemento que se encontra no nosso organismo, na sua
maioria no osso sob a forma de hidroxiapatite. No entanto, uma pequena fracção
encontra-se presente no soro, tendo diversas funções. Esta fracção, por sua vez, é
composta por três: uma fracção livre ou ionizada (cerca de 50% do total de cálcio
sérico), correspondente à fracção fisiologicamente activa; outra fracção ligada às
proteínas (cerca de 45% do total de cálcio sérico), na sua maioria à albumina; e outra
fracção ligada a aniões (cerca de 5% do total de cálcio sérico). Dentro das diversas
funções temos a participação na transmissão dos impulsos nervosos, na preservação da
contractilidade muscular, no processo da coagulação e mineralização óssea. A calcémia
é regulada pela acção conjugada da hormona paratiróide, da vitamina D e da
calcitonina. A determinação do cálcio é utilizada no diagnóstico de hipo e
hipercalcémias bem como no diagnóstico diferencial de nefrolitiase.
Amostra:
Soro, plasma ou urina
Método:
Espectrofotometria (colorimetria)
Ca2+
+ OCPC Ca-OCPC (Complexo roxo)
pH 9.7
Mg2+
+ 8-quinolinol Quinolinato de magnésio
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
114
A leitura da absorvância é bicromática a 577 e 540 nm e é devida á formação do
complexo roxo que é directamente proporcional à concentração de cálcio.
Valores de Referência:
8.5 – 10.1 mg/dL
Hipercalcémia Hipocalcémia Hipercalciúria Hipocalciúria
-Hiperparatireoidismo
primário ou
secundário
- Tumores malignos
- Excesso de vitamina
D
- Hipoparatiroidismo
- Deficiência de
vitamina D
- Remoção cirúrgica
total da tireoide
- Doença renal
crónica
-Hiperparatiroidismo
- Metástases ósseas
- Sarcoidose
- Hipoparatireoidismo
- Metástases de
carcinoma da próstata
- Insuficiência renal
crónica
- Osteomalácia
- Fármacos
(diuréticos tiazidicos).
Tabela 27. Alterações do Cálcio (12)
5.1.18. Ferro
O ferro plasmático resulta de um equilíbrio entre as reservas do nosso
organismo, a absorção através da alimentação e a hemólise fisiológica. Na sua maioria,
o ferro provém da dieta sob a forma férrica (Fe3+
), posteriormente convertida na forma
ferrosa (Fe2+
). No sangue, encontra-se em circulação ligado à transferrina (proteína
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
115
transportadora). Por outro lado, na medula óssea os precursores da série vermelha
utilizam parte do ferro disponível, deixando o restante armazenado sob a forma de
ferritina e hemossiderina nas células do sistema reticuloendotelial do fígado, baço e
medula óssea.
O doseamento do ferro sérico está indicado no diagnóstico diferencial de anemia
e de hemocromatose.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (colorimetria)
Sob condições acídicas, o ferro (Fe3+
) deixa de estar ligado à transferrina, sendo
de seguida reduzido e complexa-se com um sal, formando um complexo azul.
A leitura da absorvância é bicromática a 600 e 700 nm e é devida á formação do
complexo azul, cuja intensidade é directamente proporcional à concentração de ferro na
amostra.
Fe3+
-Tranferrina Fe3+
+ Tranferrina
2 Fe3+ + Ácido Ascórbico 2 Fe2+
+ Ácido Dehidroascórbico + 2 H+
Fe2+
+ 3-Fereno® Fe2+
-Fereno® (Complexo)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
116
Valores de Referência:
50 – 170 µg/dL
Ferro Aumentado Ferro Diminuído
- Hemocromatose
- Hemossiderose (transfusões ou
terapêutica)
- Talassemias
- Anemias hemolíticas
- Doença hepática
- Anemia ferropénica
- Anemias normocrómicas das infecções e
doenças crónicas
- Glomerulopatias (perda proteica)
- Hemorragias (Menstruação)
Tabela 28. Alterações do Ferro (12)
5.1.19. Fósforo
No nosso organismo, o fósforo encontra-se presente na matriz óssea e na
circulação sob a forma de fosfato inorgânico. O fósforo sérico está intimamente
relacionado com o cálcio, sendo que um aumento ou decréscimo dos seus níveis
condicionam directa e inversamente os do cálcio. O doseamento do fósforo é
geralmente utilizada, em conjunto com outros parâmetros, no diagnóstico de alterações
relacionadas com o metabolismo do cálcio, monitorização dos níveis séricos de fósforo
em doentes renais, diagnóstico e monitorização da síndrome de lise tumoral.
Amostra:
Soro, plasma ou urina
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
117
Método:
Espectofotometria
A leitura da absorvância a 340 nm é marcada pela formação do fosfomolibdato
reduzido, a qual é proporcional à concentração do analito.
Valores de Referência:
2.5 – 4.9 mg/dL
Fósforo Aumentado Fósforo Diminuído
- Insuficiência renal, hipoparatireoidismo,
Hipertiroidismo ( ↓ excreção renal)
- Anemia hemolítica, terapêutica
citotoxica, doença de Paget, mieloma
múltiplo (estados catabolicos, lise celular,
dano tecidular)
- Absorção intestinal de fósforo aumentada
( ↑ Ingestão de vitamina D)
- Hiperparatiroidismo ( ↓ Reabsorção
tubular)
- Deficiência em vitamina D ( ↓ absorção
intestinal)
- Síndrome de Cushing
Tabela 29. Alterações do Fósforo (12)
NaMoO4 + PO4-3
Fosfomolibdato
Fosfomolibdato + PMAPS + NaHSO3 Fosfomolibdato Reduzido
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
118
5.1.20. Magnésio
O magnésio é um mineral essencial que se encontra envolvido em diversas
funções bioquímicas. Tratando-se de um catião intracelular presente nos ossos e
músculos, é um factor essencial nas mais variadas reacções enzimáticas (e reacções
dependentes de ATP, fosforilação oxidativa, etc). Grande parte do magnésio encontra-se
complexada com o cálcio e o fosfato no osso. A determinação de magnésio sérico é
utilizada para verificar situações de hipomagnesémia e hipermagnesémia.
Amostra:
Soro, plasma ou urina
Método:
Espectrofotometria (colorimetria)
O magnésio forma um complexo de cor azul. O cálcio é complexado de forma a
evitar a sua interferência na reacção.
A leitura da absorvância é bicromática a 600 e 510 nm e é devida á formação do
complexo azul, cuja quantidade é proporcional à concentração de magnésio na amostra.
Valores de Referência:
1.8 – 2.4 mg/dL
Mg2+
+ MTB Mg-MTB (Complexo) (Absorve a 600nm)
Ca2+
+ Ba-EGTA Complexo (Não absorve a 600nm)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
119
Magnésio Aumentado Magnésio Diminuído
- Insuficiência renal
- Desidratação
- Acidose severa
- Doença de Addison
- Terapêutica com antiácidos contendo
magnésio
- Má-absorção
- Diabetes mellitus
- Alcoolismo crónico
- Diurese forçada
- Hipertiroidismo
- Pancreatite aguda
- Hipocalcemia
- Hipoparatiroidismo
Tabela 30. Alterações do Magnésio (12)
5.1.21. Gonadotropina Coriónica Humana (β-HCG)
A β-HCG é a fracção beta de uma glicoproteína hormonal produzida pelas
células trofoblásticas da placenta pouco tempo depois da implantação do óvulo
fecundado na parede uterina. Esta hormona é composta por duas subunidades (α e β)
ligadas não covalentemente. A sua determinação é geralmente pedida no âmbito do
diagnóstico da gravidez, rastreio pré-natal da síndrome de Down e tumores
germinativos dos testículos e dos ovários.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
120
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Imunoensaio enzimático
Este método consiste num imunoensaio enzimático com dois passos. Durante o
primeiro passo, a amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas
com anticorpos monoclonais específicos para a subunidade α, formando então um
complexo partícula-HCG. As partículas são separadas magneticamente e o sobrenadante
removido. No segundo passo, o complexo partícula-HCG é incubado com um reagente
conjugado (anticorpos monoclonais específicos para a subunidade β) formando uma
sandwich partícula-HCG-conjugado. O conjugado que não se liga é removido
magneticamente. A sandwich é combinada com um substrato cromogénico que é
catalisado de forma a originar a cor vermelha. A concentração de β-HCG é directamente
proporcional intensidade da cor formada. A leitura é bicromática a 577 e 700 nm.
Valores de Referência:
Mulher não grávida: < 2.0 UI/L
5.1.22. Hormona Estimulante da Tiróide (TSH)
Esta hormona consiste numa glicoproteína secretada pela hipófise (lóbulo
anterior), que se vai ligar a receptores na tiróide, permitindo estimular e regular a
produção de tiroxina (T4) e triiodotironina (T3). O seu doseamento é realizado no
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
121
âmbito do diagnóstico diferencial do hipotiroidismo e a monitorização da terapêutica de
substituição das hormonas da tiróide.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Imunoensaio enzimático
Este método consiste num só passo baseado no princípio de sandwich. A
amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos
monoclonais específicos para a TSH e com um reagente conjugado, formando um
complexo sandwich partícula-TSH-conjugado. O conjugado não ligado e o analito são
separados magneticamente e por lavagem, correspondentemente. Posteriormente, a
sandwich é combinada com um substrato cromogénico que é catalisado de forma a
originar uma mudança de cor. A concentração de TSH presente é directamente
proporcional alteração da cor formada.
Valores de Referência:
0.4 – 4.82 mUI/L
TSH Aumentada TSH Diminuída
- Hipertiroidismo secundário (↑produção) - Hipertiroidismo primário
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
122
- Hipotiroidismo
- Tiroidite de Hashimoto
- Doença de Graves
-
Tabela 31. Alterações da TSH (12)
5.1.23. Tiroxina Total (T4)
A T4 é a principal hormona produzida pela tiróide, encontrando-se na sua
maioria ligada a proteínas transportadoras plasmáticas. A determinação desta hormonas
é importante na medida em que reflecte o estado funcional da tiróide, em conjunto com
outros marcadores.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Imunoensaio enzimático
Este método detecta a quantidade total de T4 (ligada e livre). É utilizada uma
solução para libertar as T4 das proteínas ligantes. A T4 liga-se então a anticorpos anti-
T4, competindo com um conjugado na ligação a esses anticorpos, reduzindo a
quantidade de conjugado ligado. O conjugado que fica livre catalisa a oxidação de
glucose-6-fosfato com formação de NADH, o qual absorve a 340 nm. A formação de
NADH é proporcional à quantidade de T4 presente na amostra.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
123
Valores de Referência:
60 – 171 nmol/L
T4 Aumentada T4 Diminuída
Tabela 32. Alterações da T4 (12)
5.1.24. Ionograma
O ionograma consiste na determinação da concentração dos iões sódio (Na+),
potássio (K+) e cloro (Cl
−), o que permite avaliar, de uma forma global, o equilíbrio
electrolítico do organismo. Estes electrólitos intervêm num grande número de processos
metabólicos, nomeadamente, manter a pressão osmótica e a hidratação de vários
compartimentos de fluidos corporais, pH adequado do organismo e regulação das
funções cardíacas e musculares apropriadas, reacções de oxidação-redução e reacções
enzimáticas.
Sódio (Na)
Catião maioritário no fluido extracelular. É responsável pela
osmolalidade plasmática, manutenção da distribuição normal de água e
da pressão osmótica no compartimento extracelular. Os seus níveis
sanguíneos são regulados pela excreção e reabsorção nos rins.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
124
Potássio (K)
Catião maioritário no fluido intracelular. Os níveis deste catião são
mantidos a nível intracelular pela bomba sódio/potássio. É importante na
contracção muscular e manutenção do ritmo cardíaco normal
Cloro (Cl)
Anião principal no meio extracelular. Encontra-se envolvido na
manutenção da distribuição normal de água, pressão osmótica e balanço
iónico do compartimento extracelular.
Amostra:
Soro, plasma ou urina
Método:
Potenciometria
Este método utiliza um sistema específico com sensor, o QuikLYTE Integrated
Multisensor Technology, o qual desenvolve um potencial eléctrico proporcional à
actividade de cada ião na amostra. Os iões estabelecem um equilíbrio com a superfície
do eléctrodo, gerando um potencial proporcional ao logaritmo do analito. Esse potencial
é comparado com o potencial eléctrico de uma solução standard e a concentração do ião
é calculada com base na equação de Nernst.
Valores de Referência:
Na: 136 – 145 mmol/L
K: 3.5 – 5.1 mmol/L
Cl: 98 – 107 mmol/L
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
125
Na K Cl
Diminuído
- Hiponatrémia (diluição):
Aporte excessivo de água
Retenção excessiva de
água (insuficiência renal
ou cardíaca)
- Hiponatrémia (perda):
Aporte insuficiente
Perdas digestivas (vómitos,
diarreias) ou renais
(Nefropatias)
Aumentado
A hipernatrémia:
- Aporte excessivo de
sódio
- Aporte hídrico deficiente
- Perdas renais (deficiente
produção de ADH
hipofisária) ou
extra-renais de água
Diminuído
- Hipocaliémia:
- Aporte deficiente
- Perdas urinárias
(diuréticos,
hiperaldosteronismo)
- Perdas digestivas
(diarreias, vómitos)
Aumentado
- Hipercaliémia:
- Aporte excessivo
- Eliminação renal
deficiente (insuficiência
renal grave, doença de
Addison,
hipoaldosteronismo.
Diminuído
- Hipoclorémia (diluição):
hiperhidratação hipotonica
- Perdas digestivas
(vómitos)
- Perdas renais (alcaloses
metabólicas)
Aumentado
- Hiperclorémias:
- Perdas de líquidos
(desidratação hipertonica)
- Aporte excessivo (excesso
de soro fisiológico)
- Eliminação deficiente
(Acidose tubular por falta de
HCO3)
Tabela 33. Alterações do Ionograma (12)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
126
5.1.25. Aspartato aminotransferase (AST)
Esta enzima pertence a um grupo de enzimas que catalisam a transferência do
grupo amina de um aminoácido para um ácido alfa-cetónico. A AST ocorre numa vasta
variedade de tecidos, entre os quais o tecido hepático, tecido muscular e cardíaco, sendo
constituída por duas isoenzimas, uma citoplasmática e outra mitocondrial. A AST
aparece no soro em caso de hemólise hepática ou muscular. Faz parte das provas de
avaliação das funções hepáticas e cardíacas.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (cinético)
A leitura da absorvância é feita a 340 e 700 nm e é devida ao consumo de NADH, que é
proporcional à actividade da AST.
Valores de Referência:
15 – 37 UI/L
AST (pH 7.8)
L-aspartato + α-cetoglutarato L-glutamato + Oxalacetato
Malato desidrogenase
Oxalacetato + NADH Malato + NAD
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
127
5.1.26. Alanina aminotransferase (ALT)
Esta enzima pertence a um grupo de enzimas que catalisam a transferência do
grupo amina de um aminoácido para um ácido alfa-cetónico. Encontra-se sobretudo no
fígado, pelo que é considerada um marcador mais específico, do que a AST, para
doenças hepáticas. No entanto, esta especificidade não é absoluta, pois a ALT também
se encontra em tecidos como o rim, coração e músculo-esquelético, mas em
concentrações mais baixas. É exclusivamente citoplasmática.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (cinético)
A leitura da absorvância é feita a 340 e 700 nm e é devida ao consumo de NADH, que é
proporcional à actividade da ALT.
Valores de Referência:
12 – 78 UI/L
ALT (pH 7.4)
L-alanina + α-cetoglutarato L-glutamato + Piruvato
Lactato desidrogenase
Piruvato + NADH (H+) Lactato + NAD
+
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
128
Relação AST/ALT – Diagnóstico Diferencial de Lesões Hepáticas
- Normal: 0.7 – 1.4
- Relação AST/ALT<1: Hepatite viral aguda, Colestase extra-hepática, outras lesões
hepáticas agudas
- Relação AST/ALT> 1: Hepatopatia secundária a isquémia, hepatite crónica, cirrose,
neoplasias hepáticas, colestase intra-hepática
- Relação AST/ALT> 2: Álcool, Doença de Wilson, Hepatotoxicidade por fármacos
Tabela 34. Relação AST/ALT (12)
5.1.27. Gama Glutamiltransferase (GGT)
A GGT é uma enzima que catalisa a transferência de resíduos gama-glutamil do
glutatião para receptores peptídicos. Encontra-se nos rins, pâncreas, baço, intestino e em
menor quantidade no fígado, cérebro e no coração. Embora o rim apresente o nível mais
elevado de GGT, a enzima presente no soro parece ter origem, sobretudo no sistema
hepatobiliar, apresentando-se elevada em muitas formas de doença hepática. O aumento
dos níveis de GGT é identificado mais precocemente e é mais acentuado relativamente a
outras enzimas hepáticas em casos de obstrução hepatobiliar. Por este motivo a GGT é
considerada um indicador sensível para estas doenças. O álcool estimula a síntese de
GGT e por isso o seu doseamento é útil para detectar casos de alcoolismo.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
129
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (cinético)
A leitura da absorvância é feita a 405 e 600 nm e é devida à formação do 5- amino-2-
nitrobenzoato, que é proporcional à actividade da GGT na amostra.
Valores de Referência:
Homem: 15 – 85 UI/L
Mulher: 5 – 55 UI/L
GGT Aumentada
- Colestase
- Carcinomas hepatocelulares e metástases hepáticas
- Hepatite viral e na cirrose hepática
- Álcool
- Fármacos
Tabela 35. Aumento da GGT (12)
Nota: Existe uma tendência de correlacionar a GGT com a fosfatase alcalina
(PAL) na interpretação das alterações do fígado e das vias biliares. A GGT e a PAL
GGT
Gama-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilido + glicilglicina L-gamaglutamilglicilglicina + 5-amino-2-nitrobenzoato
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
130
aumentadas significam que estamos provavelmente na presença de um problema de
origem hepática. A GGT normal e a PAL aumentadas significam que possivelmente o
problema é de origem óssea. O aumento isolado da GGT resulta geralmente do
consumo de álcool ou de medicamentos.
5.1.28. Fosfatase Alcalina (PAL)
A ALP ma enzima composta por um grupo de pelo menos cinco isoenzimas que
catalisam a hidrólise de ésteres fosfóricos a pH alcalino. Estão presentes no fígado, nos
ossos, no intestino, nos pulmões, nos eritrócitos e na placenta. Contudo encontram-se
em maior quantidade no fígado e nos ossos, daí serem doseadas para reconhecer as
afecções hepáticas ou ósseas. Uma variedade de processos patológicos pode resultar na
libertação de quantidades elevadas de ALP no sangue.
Amostra:
Soro ou plasma
Método:
Espectrofotometria (cinético)
A actividade da fosfatase alcalina é determinada através da medição da taxa de
conversão de p-nitro-fenilfosfato (pNPP) em p-nitrofenol (pNP) na presença de iões de
magnésio e de zinco e de 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP) como aceitador de
fosfato.
ALP (pH 10.25; Mg/Zn)
pNPP + AMP pNP + AMP-PO4
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
131
A leitura da absorvância é feita a 404 e 510 nm e é devida a formação do pNP que é
proporcional à actividade de ALP na amostra.
Valores de Referência:
46 – 116 UI/L
ALP Aumentada
- Aumentos fisiológicos: crescimento ósseo na infância, gravidez
- Elevação de origem hepática: Colestase intra ou extra-hepática (cálculos, tumores ou
inflamação)
- Elevação de origem óssea:
Na criança – raquitismo
No adulto – Doença de Paget, Osteomalacias, hiperparatiroidismo com lesões ósseas,
nas metástases ósseas relacionadas com o cancro da próstata
Tabela 36. Aumento da ALP (12)
5.1.29. Controlo de Qualidade Interno
Para efeitos de controlo de qualidade interno, para todos os analitos,
exceptuando os que são doseados na urina, β-HCG e PCR, são realizados diariamente
dois níveis (de três possíveis: baixo, normal e alto) alternados de Liquid Assayed
Multiqual Bio-Rad. Para os analitos que são doseados na urina e β-HCG, os controlos
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
132
são executados apenas nos dias em que existem pedidos, dois níveis apenas para os
analitos urinários e dois níveis alternados para a β-HCG. Para a PCR existem apenas
dois níveis que são realizados todos os dias. São passados no aparelho da parte da
manhã antes dos soros dos doentes preferencialmente. Os critérios de aceitação são os
do programa UNITY (software de controlo de qualidade, que utiliza ≤ 3 sd de acordo
com os critérios definidos pelo comité de da qualidade).
5.1.30. Avaliação Externa da Qualidade
Para realização da avaliação externa da qualidade da bioquímica geral, o
laboratório participa num programa da SEQC, mensalmente.
5.2. Hi-AUTO A1C
Este é um equipamento de cromatografia de alta performance (HPLC) com
leitura bi-cromática (415 – 500 nm) para determinação das fracções da hemoglobina. É
semi-automático, constituído essencialmente pela unidade analítica (onde se procede à
análise das amostras) ao qual está acoplada uma unidade de “auto-sampler” (onde se
colocam as amostras). O equipamento é muito simples de manusear, bastando apenas
colocar as amostras e proceder ao start. Após a análise, os resultados são impressos e
introduzidos manualmente no sistema informático.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
133
Fundamento do método:
HPLC - Trata-se de uma cromatografia de troca iónica de fase reversa. As
fracções de hemoglobina são separadas através de interacções electrostáticas com o gel
da coluna, cuja superfície contem grupos hidrófobos e grupos de troca iónica. Assim, a
mistura é separada nos seus diferentes componentes individuais, mediante processos de
adsorção e desadsorção dos diversos componentes na superfície da coluna (fase
estacionária). Daqui resulta que os diversos componentes da mistura sejam eluídos a
tempos diferentes. As fracções eluídas são examinadas através de um colorímetro e os
resultados são analisados por um microprocessador. Este equipamento faz o ajuste
automático do factor de diluição das amostras para compensar as anemias. Os resultados
da HbA1c obtidos deste equipamento não sofrem interferência da hemoglobina
carbamilada ou acetilada, ou da HbA1c lábil, que é removida pelo hemolisante H.
Permite determinar várias fracções da hemoglobina e detectar variantes da
hemoglobina. Neste equipamento apenas é realizada uma análise paramétrica, a
determinação da hemoglogina glicada (HbA1c).
5.2.1. Hemoglobina Glicada (HbA1c)
A HbA1c é uma molécula de hemoglobina ligada covalentemente a uma
molécula de glucose. Geralmente é determinada para meio auxiliar na monitorização
dos doentes diabéticos ou seu diagnóstico. A HbA1c é tanto mais elevada quanto mais
frequentes tenham sido os períodos de hiperglicemia durante os últimos três meses. Os
indivíduos aos quais foi diagnosticada diabetes mellitus apresentam, geralmente, uma
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
134
percentagem elevada de HbA1c. O ensaio para a determinação de HbA1c mede a
concentração desta relativamente à concentração de hemoglobina total.
Amostra:
Sangue total em EDTA
Método:
HPLC
Valores de Referência:
3,4 – 6,0 %
5.2.2. Controlo de Qualidade Interno
Como controlo de qualidade interno são feitos diariamente dois níveis de Glyco
Hb Control.
5.2.3. Avaliação Externa da Qualidade
Em termos de avaliação externa da qualidade, o laboratório participa no
programa RIQAS (Randox International Quality Assessment Scheme) mensalmente.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
135
5.3. Clinitek 500
O Clinitek 500 é um analisador semi-automático específico para a leitura de tiras
teste que avaliam diversos parâmetros bioquímicos urinários. Este equipamento tem
como metodologia a reflectofotometria: a luz emitida por uma lâmpada incandescente,
com comprimento de onda e ângulo definidos, incide na superfície das tiras teste,
constituídas por pequenos quadrados de celulose absorventes impregnados com
reagente. Quando a tira de teste entra em contacto com a urina, ocorre uma reacção
química que produz uma mudança de cor. A luz proveniente das tiras, captada pelo
fotodetector, é reflectida e diminui proporcionalmente à intensidade da cor produzida. A
luz detectada é convertida para valores de reflectância, originando resultados
semiquantitativos.
5.3.1. Urina Tipo II
A análise da urina tipo II é formada por duas partes: determinação das
características físicas e químicas da urina e o sedimento urinário.
Esta análise é importante na medida em que nos fornece várias informações
clínicas úteis no que diz respeito a patologias renais e do tracto urinário inferior.
Amostra:
Urina
Método:
Reflectância (acima descrito) e microscopia
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
136
Exame Físico e Químico da Urina
Determinação qualitativa ou semiquantitativa, de pH, leucócitos, nitritos,
proteínas, glucose, corpos cetónicos, hemoglobina, urobilinogénio, bilirrubina,
densidade e cor. Esta determinação é feita através do uso de tiras de teste pelo
método da reflectofotometria. Na tabela seguinte são indicados todos os parâmetros
avaliados bem como a sua relevância clínica.
Parâmetro
Cor Normal: amarelo claro a âmbar
A cor deve-se à presença de urocromo (pigmento), podendo variar
desde a quase ausência de cor até ao negro. Estas variações podem
ser de natureza patológica, ou não, existindo variações de cor com
importância clínica. Exemplo: incolor - poliúria típica da diabetes
insipidus; vermelho - presença de eritrócitos
Densidade Representa a concentração iónica da urina.
Os limites fisiológicos variam de 1.005 a 1.040, sendo uma
densidade de 1.018 correspondente a uma capacidade de
concentração renal preservada.
Densidade aumentada – cetoacidose (poderá ser resultado também de
presença de muco ou células na urina)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
137
Densidade diminuída - ingestão elevada de água ou diminuição da
capacidade de concentração da urina a nível renal
pH Pode variar desde 4,5 a 8,5.
Detecção de possíveis distúrbios electrolíticos de origem metabólica
ou respiratória.
Importante na identificação de cristais observados no exame
microscópico do sedimento urinário, bem como na verificação do
estado de conservação da amostra (o pH da urina recém-eliminada
não atinge valores superiores a 8,5, tanto em condições normais ou
patológicas, pH superiores revelam má conservação da amostra)
Proteínas Valores normais: 40 - 100 mg/dia
Útil na detecção de patologia renal.
Aumento - Alterações da permeabilidade glomerular
- Diminuição da reabsorção tubular ou aumento das
proteínas plasmáticas a filtrar
Glucose Em circunstâncias normais, a urina contém quantidades mínimas de
glucose, pois quase toda a glucose filtrada pelos glomérulos é
reabsorvida no túbulo proximal. O limiar de reabsorção renal no caso
da glucose é de 160 a 180 mg/dL.
Aumentada – Diabetes mellitus, Síndroma de Cushing,
feocromocitoma, hipertireoidismo, acromegalia
Corpos Usualmente não são detectados na urina.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
138
Cetónicos A cetonúria ocorre em situações de jejum, febre ou diabéticos
descompensados com acidose metabólica
Bilirrubina Quando positiva deve ser feita comparação com os valores de
bilirrubina no soro do doente.
A presença de bilirrubina na urina pode indicar a existência de
doença a nível hepato-biliar
Urobilinogénio Pigmento biliar que resulta da redução da bilirrubina pelas bactérias
intestinais. Pode aumentar em patologias hepáticas e distúrbios
hemolíticos
Nitritos Detectar possíveis infecções do tracto urinário, devido à capacidade
de determinadas bactérias reduzirem nitratos a nitritos
Hemoglobina A presença de hematúria (eritrócitos íntegros) ou de hemoglobinúria
(hemoglobina livre) podem ter diversas origens.
Hematúria - mais relacionada com distúrbios de origem renal ou
urogenital.
Hemoglobinúria - lise dos eritrócitos no tracto urinário; hemólise
intravascular com consequente filtração de hemoglobina através dos
glomérulos.
Leucócitos Possível infecção no sistema urogenital.
Tabela 37. Urina II (12)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
139
Exame Microscópico do Sedimento Urinário
O exame microscópico do sedimento urinário tem como objectivo detectar e
identificar os diversos elementos presentes na urina. O sedimento urinário normal pode
conter vários elementos figurados, sendo a presença de um pequeno número de
elementos como os eritrócitos, leucócitos e cilindros, normal. Grande parte das urinas
contêm apenas raras células epiteliais ou filamentos de muco.
A amostra de urina, após ter sido analisada no equipamento, é centrifugada a
1500 rotações por minuto (rpm) durante 10 minutos. Posteriormente é colocada uma
gota do sedimento entre lâmina e lamela, e realiza-se uma avaliação quantitativa e
qualitativa dos elementos presentes no sedimento. Na tabela seguinte temos os
elementos que podemos observar numa análise microscópica do sedimento urinário:
Elementos a observar:
Células
epiteliais
Encontram-se normalmente no sedimento urinário.
Representam descamação celular normal do epitélio.
Três tipos: Células epiteliais escamosas (sem significado clínico),
células do epitélio de transição (geralmente sem significado clínico),
células do epitélio tubular renal (sugestivas de necrose tubular,
pielonefrite, etc)
Eritrócitos Distúrbios de origem renal ou urogenital.
Leucócitos Possível infecção no sistema urogenital.
Leveduras As leveduras, geralmente da espécie Candida albicans, podem ser
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
140
Parasitas observadas na urina de doentes com diabetes mellitus, contaminação
vaginal.
Podemos encontrar Tichomonas vaginalis devido a contaminação
vaginal.
Cilindros Constituídos essencialmente por proteína de Tamm-Horsfall a qual é
excretada pelas células dos túbulos renais. Não detectável nas tiras
teste.
Diversos elementos presentes nos túbulos renais, tais como células,
bactérias ou grânulos, podem prender-se à matriz do cilindro e estão
na base da sua classificação (cilindros hialinos, leucocitários,
eritrocitários, etc).
Cristais Raramente têm significado clínico. Formam-se por precipitação de
sais na urina submetidos a alterações de pH, de temperatura ou de
concentração. Os sais precipitados aparecem na urina na forma de
cristais verdadeiros ou de material amorfo. O pH da urina é
importante pois vai determinar o tipo de substâncias químicas
precipitadas. Os cristais são geralmente classificados de acordo com
o pH da urina em que estão presentes, ácido ou alcalino. Cristais mais
frequentementes: ácido úrico, uratos amorfos, cristais de oxalato de
cálcio, fosfato amónio magnesiano, fosfatos amorfos.
Tabela 38. Sedimento urinário (12)
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
141
6. CONTROLO DE QUALIDADE
O controlo da qualidade consiste num conjunto de medidas e técnicas utilizadas
para obter os melhores resultados possíveis com a máxima qualidade. Para que isto
aconteça, o laboratório propõe-se a cumprir determinados requisitos de qualidade,
participando num programa de gestão da qualidade. De forma a garantir que o
desempenho dos métodos utilizados é capaz de medir os parâmetros com exactidão e
precisão, o laboratório realiza o Controlo de Qualidade Interno e participa em
programas de Avaliação Externa da Qualidade.
6.1. Controlo de Qualidade Interno
O laboratório deverá ter amostras de controlo adequadas para todos os
parâmetros que executa e deve usá-las sempre que os efectua, de modo a controlar a
precisão dos seus sistemas analíticos. O objectivo do controlo de qualidade interno é
manter as condições de validação no laboratório ao longo do tempo, garantindo a
reprodutibilidade dos resultados. Caso não se verifique, poderá haver a necessidade de
proceder a acções correctivas para que os resultados obtidos possam cumprir os
requisitos de qualidade exigidos.
Para realização do controlo de qualidade interno, recorremos à utilização de
controlos, isto é, são amostras cujos valores relativos ao analito em questão são
perfeitamente conhecidos, com os quais verificamos o desempenho das técnicas,
reagentes e equipamentos usados para o diagnóstico analítico. Salvo raras excepções, o
controlo de qualidade interno é executado diariamente, de preferência antes do
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
142
processamento das amostras dos doentes, e idealmente também ao fim do dia. Para
podermos interpretar os resultados, estes são registados em forma de gráfico e
comparados com os limites aceitáveis (geralmente a média ± 2 desvios padrões),
denominadas Cartas de Controlo de Levey-Jennings.
Quando um determinado parâmetro analítico se apresenta fora dos limites de
aceitação, são investigadas quais as suas causas, e de uma forma geral recorre-se a uma
calibração do equipamento, com posterior processamento dos controlos. A calibração
consiste num conjunto de operações que estabelecem, em condições especificadas, a
relação entre valores de grandeza indicados por um instrumento de medição ou um
material de referência e os correspondentes valores obtidos através de padrões. Para tal
recorre-se a um calibrador - um material de referência de composição qualitativa ou
quantitativa bem definidas, adequado para o analito em questão, adaptado ao método
utilizado e aferido por padrões de referência. A calibração também é efectuada sempre
os lotes de reagente se alteram ou de acordo com os critérios do fornecedor.
Para todos as secções do laboratório, encontram-se descritos no ponto
correspondente, quais os níveis de controlos utilizados.
6.2. Avaliação Externa da Qualidade
Por outro lado, a avaliação externa da qualidade é importante porque permite ao
laboratório verificar e aferir a exactidão dos resultados obtidos. É realizada através da
participação em programas/ensaios inter-laboratoriais, de forma a comparar-se com os
restantes laboratórios.
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
143
Os programas geralmente enviam ao laboratório diversas amostras das diferentes
áreas analíticas, as quais têm que ser processadas exactamente da mesma forma como as
amostras normais dos doentes, cujos resultados são posteriormente enviados e
avaliados. Mais tarde o laboratório receberá um resultado com a classificação que
obteve consoante a exactidão dos resultados que enviou.
Para todos as secções do laboratório, encontram-se descritos no ponto
correspondente, quais os programas de avaliação externa da qualidade em que o
laboratório se encontra inscrito.
7. VALIDAÇÃO BIOPATOLOGICA
Após a conclusão da fase analítica, temos os resultados dos parâmetros
analisados que necessitam de ser validados no seu conjunto para posterior emissão do
boletim de análises. A esta validação chamamos de validação biopatológica, cujo
objectivo é verificar a concordância de todos os parâmetros analíticos e contextualiza-
los com o perfil e historial clínico do utente, condições fisiológicas presentes,
terapêutica, etc. A validação biopatológica é efectuada apenas por especialistas em
análises clínicas. Nesta fase, poderá haver necessidade de entrar em contacto com o
clínico ou com o utente, para confirmação de alguma informação adicional ou de algum
resultado
Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio
144
BIBLIOGRAFIA
1. Instruções de Trabalho do Laboratório do Hospital de Santiago (General Lab).
2. Manual do Equipamento Cell-Dyn 3500.
3. Apontamentos e Slides de Hematologia II do Mestrado em Análises Clínicas
2014.
4. Theml H, Diem H, Haferlach T. Color Atlas of Hematology. Second. Thieme;
2004.
5. Manual Do Equipamento ACL-7000.
6. Dean L. Blood Groups and Red Cell Antigens. ABO blood Gr. 2005;
7. Ferreira W, Sousa J. Microbiologia Volume 2. LIDEL; 2000.
8. Bula do Reagente em vigor.
9. Manual do Equipamento Vidas.
10. Kindt TJ, Goldsby R a, Osborne B a. Kuby Immunology. Sixth. Kuby
Immunology. W. H. Freeman & Company; 2006. 574 p.
11. Manual do Equipamento Dimension Xpand.
12. Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE. Clinical Chemistry - Techniques, Principles,
Correlations. Sixth. Wolters Kluer - Lippincott Williams & Wilkins; 2010.
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