Bruno Meirelles Paes
INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DA Kielmeyera
membranacea SOBRE A DISFUNÇÃO VASCULAR
Macaé
2017
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Campus Macaé Professor Aloísio Teixeira
Programa de Pós-graduação em Produtos
Bioativos e Biociência
INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DA Kielmeyera
membranacea SOBRE A DISFUNÇÃO VASCULAR
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Produtos Bioativos e Biociências da Universidade
Federal do Rio de Janeiro como parte das exigências para
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Profª. Drª. Juliana Montani Raimundo
Bruno Meirelles Paes
Macaé, 2017
Bruno Meirelles Paes
INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DA Kielmeyera
membranacea SOBRE A DISFUNÇÃO VASCULAR
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio
de Janeiro para obtenção do grau de mestre em produtos
e bioativos e biociências.
Orientadora: Profª Drª Juliana Montani Raimundo
Aprovada em 07/06/2017
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________
Profa. Dra. Juliana Montani Raimundo (Orientadora)
Campus UFRJ-Macaé
__________________________________________________
Profa. Dra.Cintia Monteiro de Barros
Campus UFRJ-Macaé
____________________________________________________
Prof. Dr. Leandro Louback da Silva
Campus UFRJ-Macaé
_____________________________________________________
Prof. Dr. Thiago da Silveira Álvares
Campus UFRJ-Macaé
Dedico esta conquista a todos os meus
familiares, amigos e a todas as pessoas
que me fazem felizes.
AGRADECIMENTO
Aos meus pais primeiramente, Moacyr e Alba. Sem o apoio, o incentivo ao
estudo e o amor de vocês essa conquista não seria possível.
Às minhas irmãs, Marina e Liana. Irmãos não servem apenas para brigar e
sim, para apoiar, aprender e puxar as orelhas de vez em quando.
Aos meus avós maternos, Wanilton e Alba. Com a calma, mimos, sabedoria,
experiência e o amor de vocês. Aos meus avós paternos, Herval e Maria Francisca,
também tenho mais além de agradecimentos. Apesar de não ter sido muito próximo
do meu avô e minha avó ter falecido antes do meu nascimento, construíram de
maneira perfeita os pilares de suas famílias e, um desses pilares, é o meu pai.
A todos meus familiares que contribuíram de forma significativa para essa
conquista. Destaco em especial aos meus tios, Mário, Luís Antônio, Paulinho e à
minha única e preferida tia, Cida.
Faço um agradecimento em especial à memória do meu tio Teté. Esse nos
deixou no meio dessa jornada. Sempre foi um tio muito presente e incentivador aos
estudos.
À minha namorada Fernanda. Apesar de nos reencontramos no meio dessa
jornada, foi essencial para o término da mesma através do seu amor, paciência e
carinho.
Aos meus amigos, em especial William, Reynaldo, Diego, Bruno Moraes,
Jéssica Ladeira e Cinthya Maciel. Nessa trajetória de mestrado não houve tantas
festas, bebedeiras e ressacas quanto no tempo de graduação, mas o apoio e a
amizade de vocês foram essenciais para esta conquista.
A todos os colegas que passaram e ficaram na minha vida nesse período do
mestrado.
A todos os amigos e colegas que fiz no LIP. Em especial à Cinthya Maciel,
Millena Vidal e Letícia Ferreira. Todas vocês foram essenciais para essa conquista.
Em especial à minha professora orientadora Juliana Montani. Pela calma,
conhecimento, atitudes e paciência, mas muita paciência. E mais um pouco de
paciência. Talvez mais um pouco de paciência. Pode ter certeza que o profissional
que virei hoje, tirei um pouco de você.
Aos professores que contribuíram de forma significativa para meu
crescimento profissional e formação.
À CAPES, pelo apoio financeiro.
RESUMO
Alterações vasculares morfológicas e funcionais, como estresse oxidativo e
disfunção endotelial, são característicos das doenças cardiovasculares e seus
fatores de risco. Sendo assim, há a necessidade de busca por novas substâncias
capazes de atenuar e/ou prevenir a disfunção vascular. Portanto, o objetivo deste
trabalho foi avaliar o potencial farmacológico de produtos bioativos obtidos da
espécie vegetal Kielmeyera membranacea (extrato hidroalcólico das folhas – EKM,
frações e subfrações) na disfunção vascular. A atividade vasodilatadora e os efeitos
na reatividade vascular na ausência e presença de disfunção vascular foram
investigados em aortas isoladas de ratos Wistar preparadas para registro de tensão
isométrica. O EKM provocou vasodilatação dependente do endotélio através da
ativação da produção de óxido nítrico, com participação dos receptores de
bradicinina B2 e de estrogênio ERα. A incubação de anéis de aorta com 25 mM de
glicose por 2 h ou com 10 µM de pirogalol por 15 min resultou em aumento da
contração induzida por fenilefrina e redução da resposta vasodilatadora à
acetilcolina. Quando a disfunção vascular foi induzida por glicose, o pré-tratamento
com 3,5 µg/mL de EKM normalizou a reatividade à fenilefrina e restaurou
parcialmente a vasodilatação em resposta à acetilcolina. No entanto, quando a
disfunção vascular foi induzida por pirogalol, o EKM normalizou apenas a reatividade
à fenilefrina. A fração butanólica do EKM provocou intenso relaxamento vascular e
foi mais potente que as demais frações e o EKM. Entre os flavonoides identificados
na fração butanólica, a orientina parece ser o principal envolvido no efeito
vasodilatador.
Palavras chave: Disfunção vascular, óxido nítrico, vasodilatação.
ABSTRACT
Functional and morphological vascular changes, such as oxidative stress and
endothelial dysfunction, are characteristics of cardiovascular diseases and its risk
factors. Therefore, there discovery of new substances capable of attenuating and/or
preventing vascular dysfunction is needed. The aim of the present work was to
investigate the pharmacological potential of bioactive products from Kielmeyera
membanacea species (hydroalcoholic extract of leaves – EKM, fracions and
subfractions) for vascular dysfunction. The vasodilatory activity and the effects on
vascular reactivity in the absence and presence of vascular dysfunction were
assessed in Wistar rat aortas prepared for isometric tension recording. EKM-induced
vasodilation was endothelium-dependent and mediated through the activation of NO
production, with the involvement of bradykinin B2 and estrogen ERα receptors.
Incubation of aortas with either 25 mM glucose for 2 h or 10 µM pyrogallol for 15
mim, resulted in augmented vasoconstriction to phenylephrine and reduced
vasodilation to acetylcholine. When vascular dysfunction was induced by glucose,
pretreatment with 3.5 µg/mL of EKM normalized vascular reactivity to phenylephrine
and partially restored vascular reactivity to acetylcholine. On the other hand, when
vascular dysfunction was induced by pyrogallol, pretreatment with EKM only restored
vascular response to phenylephrine. Butanol fraction of EKM induced intense
vasodilation and exhibited higher potency when compared with the other fractions
and EKM. Among the flavonoids isolated from butanol fraction, orientin seems to be
the main metabolite involved in the vascular effects of EKM.
Key words: Vascular dysfunction, nitric oxide, vasodilatation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mecanismo de vasodilatação causado pelo óxido nítrico (NO),
prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) 21
Figura 2. Mecanismo potencial pelo qual fatores de risco cardiovascular
levam ao estresse oxidativo e desacoplamento da eNOS 24
Figura 3. Registro representativo do teste para avaliação da integridade
do endotélio 34
Figura 4. Registro típico da resposta contrátil a 10µL de fenilefrina
seguido a exposição a concentrações crescentes e cumulativas do EKM
em anéis de aorta com endotélio 37
Figura 5. Efeito vasodilatador do EKM em anéis de aorta com e sem
endotélio 38
Figura 6. Envolvimento da via NO/GMPc no efeito vasodilatador do EKM 39
Figura 7. Envolvimento dos receptores muscarínicos e de bradicinina no
efeito vasodilatador do EKM 40
Figura 8. Envolvimento da via PI3k/Akt e da ativação dos receptores de
estrogênio no efeito vasodilatador do EKM 41
Figura 9. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina 42
Figura 10. Efeitos do EKM na reatividade vascular à acetilcolina 43
Figura 11. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de
disfunção vascular induzida por glicose 44
Figura 12. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de
disfunção vascular induzida por estresse oxidativo 46
Figura 13. Efeito vasodilatador das frações hexânica, em diclorometano,
em acetato de etila e butanólica do extrato hidroalcoólicos das folhas de K.
membranacea em anéis de aorta com endotélio 48
Figura 14. Efeito vasodilatador das subfrações 1, 2 e 4 da fração
butanólica do extrato hidroalcoólico das folhas de K. membranacea em
anéis de aorta com endotélio 50
Figura 15. Estrutura química das substâncias isoladas da subfração 2 da fração
butanólica: orientina, isoorientina, vitexina e podocarpos flavona A 57
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Fracionamento cromatográfico da fração butanólica. 33
Tabela 2. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de
folhas de K. membranacea (EKM) e frações.
49
Tabela 3. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de
folhas de K. membranacea (EKM), da fração butanólica (Fr. BuOH) e suas
subfrações.
51
Tabela 4. Constituintes majoritários presentes nas subfrações da fração
butanólica de K. membranacea.
51
LISTA DE ABRAVIATURAS E SIGLAS
[Ca2+]i – Concentração intracelular de Ca2+
AcOEt – Acetato de etila
AMPc – Adenosina monofosfato cíclico ou monofosfato de adenosina cíclico
AMPK – Proteína quinase ativada pelo AMPc
ATP – Trifosfato de adenosina
BH2 – 6-7-[8H]-H2-biopterina
BH3 – Trihidrobiopterina
BH4– Tetrahidrobiopterina
BuOH – Butanol
CaMKII – Proteína quinase II dependente da calmodulina
CI50 – Concentração inibitória média
CE50 – Concentração eficaz média
DAG –Diacilglicerol
DCNT – Doenças crônicas não transmissíveis
DCVs – Doenças cardiovasculares
DM – Diabetes mellitus
DM-1 – Diabetes mellitus tipo 1
DM-2- Diabetes mellitus tipo 2
DMSO - Dimetilsulfóxido
EDHF –Fator hiperpolarizante derivado do endotélio
EKM – Extrato hidroalcóolico de folhas de Kielmeyera membranacea
eNOS – Óxido nítrico sintase endotelial
ET-1 – Endotelina-1
FAD – Flavina adenina dinucleotídeo
FMN – Flavina mononucleotídeo
GCs– Guanilatociclase solúvel
GMPc –Monofosfato de guanosina cíclico
GTP – Guanosina trifosfato
HAS – Hipertensão arterial sistêmica
Hex – Hexano
IP3 –Inositol 1, 4, 5, trifosfato
iNOS – Óxido nítrico sintase induzível
LDL – Proteína de baixa densidade
L-NAME – L-NG-Nitroarginina metil éster
MeOH –Metanol
MLCK – Quinase de cadeia leve de miosina
NADPH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NO – Óxido nítrico
nNOS – Óxido nítrico sintase neuronal
NOS – Óxido nítrico Sintase
ODQ – 1H-(1,2,4)oxidiazolo(4,3-a)quinoxalin-1-ona
ONOO- - Peroxinitrito
PA – Pressão arterial
pCE50 – log da CE50 em M
PGF2 – Prostaglandina
PGI2 –Prostaciclina
Phe – Fenilefrina
PIP2 – Fosfolipídeos fosfatidilinositolbifosfato
PKA – Proteína quinase dependente de AMPc
PKC – Proteína quinase C
PKG – Proteína quinase dependente de GMPc
PLC – Fosfolipase C
ROS – Espécies reativas de oxigênio
RNS – Espécies reativas de nitrogênio
RS – Retículo sarcoplasmático
SOD – Superóxido dismutase
TXA2 – Tromboxano A2
VEGF – Fator de crescimento endotelial vascular
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 15
1.1. Doenças cardiovasculares 15
1.2. Estrutura e regulação da contratilidade dos vasos
sanguíneos 16
1.2.1. Fatores vasoconstritores endoteliais 18
1.2.2. Fatores vasodilatadores endoteliais 18
1.2.2.1. NO 19
1.2.2.2. PGI2 21
1.2.2.3. EDHF 22
1.3. Disfunção endotelial 22
1.4. Potencial farmacológico cardiovascular de produtos
vegetais 24
1.5. Kielmeyera membranacea 26
2. JUSTIFICATIVA 30
3. OBJETIVOS 31
3.1. Objetivos gerais 31
3.2. Objetivos específicos 31
4. MATERIAIS E MÉTODOS 32
4.1. Material vegetal 32
4.2. Obtenção do extrato hidroalcoólico, frações e subfrações 32
4.3. Preparo dos anéis de aorta para registro de tensão
isométrica 33
4.4. Avaliação do efeito vasodilatador do EKM, frações e
subfrações 34
4.5. Estudo do mecanismo de ação do efeito vasodilatador do
EKM 35
4.6. Efeitos do EKM na reatividade vascular 35
4.7. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de
disfunção vascular induzida por alta concentração de
glicose 36
4.8. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de
disfunção vascular induzida por estresse oxidativo 36
4.9. Análise estatística 36
5. RESULTADOS 37
5.1. Efeito vasodilatador do EKM 37
5.2. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à
acetilcolina 41
5.3. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à
acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas
por glicose 43
5.4. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à
acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas
por estresse oxidativo 45
5.5. Efeitos das frações e subfrações do EKM no músculo liso
vascular 47
6. DISCUSSÃO 52
6.1. Efeito vasodilatador do EKM 52
6.2. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à
acetilcolina 54
6.3. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à
acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas
por glicose 55
6.4. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à
acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas
por estresse oxidativo 56
6.5. Efeitos das frações do EKM no músculo liso vascular 56
7. CONCLUSÕES 60
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 61
9. ANEXO 73
15
1. INTRODUÇÃO
1.1. Doenças cardiovasculares
As doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) são responsáveis por
milhões de óbitos em todo o mundo, sendo as doenças cardiovasculares (DCVs) a
principal causa de morte. A cada ano, cerca de 17,5 milhões de pessoas morrem em
decorrência de DCVs, representando aproximadamente 31% de todas as causas de
morte no mundo. Deste total, mais de 75% foi registrado em países
subdesenvolvidos ou em desenvolvimento (GUIMARÃES et al., 2015). No Brasil, no
ano de 2011, foram registrados 335.213 mil óbitos, sendo 37.019 mil óbitos no
Estado do Rio de Janeiro (DATASUS, 2016; GUIMARÃES et al., 2015). Estima-se
que em 2030 o número de óbitos no mundo devido as DCVs será de 23,6 milhões,
representando assim um grave problema de saúde pública (GUIMARÃES et al.,
2015; WHO, 2016).
As DCVs são caracterizadas por desordens do coração e dos vasos
sanguíneos, como por exemplo, distúrbios coronarianos, doença cerebrovascular,
doença arterial periférica, doença cardíaca reumática, doença cardíaca congênita e
insuficiência cardíaca. Quatro em cada cinco mortes por DCVs estão associadas ao
infarto agudo do miocárdio ou acidente vascular cerebral, sendo o acúmulo de
gordura depositado nas paredes internas dos vasos sanguíneos a causa mais
comum para essas desordens (WHO, 2016).
Similarmente a qualquer doença, há fatores de risco que levam ao
desenvolvimento das DVCs, os quais podem ser divididos em fatores
comportamentais e fatores não comportamentais. Entre os fatores comportamentais
citam-se hábitos alimentares inadequados, sedentarismo, tabagismo e uso
constante e abusivo de bebidas alcoólicas. Os fatores de risco não comportamentais
englobam a hipertensão arterial sistêmica (HAS), diabetes mellitus (DM),
dislipidemia, estresse e obesidade (BRASIL, 2016; STAPLETON et al., 2008; WHO,
2016).
A HAS, além de ser um dos principais fatores de risco para o
desenvolvimento de DCVs, está entre as DCNT mais comuns atualmente. É
caracterizada pela pressão arterial sistêmica cronicamente elevada e sustentada,
estando frequentemente associada a alterações funcionais e estruturais do coração,
16
encéfalo, rins e vasos sanguíneos (GILES et al., 2012; WEISS et al., 2016). Esta
enfermidade é classificada como uma doença multifatorial decorrente da ação
combinada de fatores ambientais, genéticos e comportamentais e é responsável por
aproximadamente 9,4 milhões de mortes por ano no mundo. Estima-se que em
2025, 1,56 bilhões de pessoas no mundo apresentem HAS (BOLÍVAR, 2013).
A obesidade, condição que poderá afetar mais de 1,3 bilhões de indivíduos no
mundo em 2030, está relacionada a desordens metabólicas, como por exemplo,
intolerância à glicose, resistência à insulina e dislipidemia. Além disso, pode afetar a
estrutura e a função cardiovascular, sendo então um fator de risco importante para o
desenvolvimento de DCVs (CHENG et al., 2015). Acredita-se que o desbalanço na
produção e liberação de substâncias anti- e pró-inflamatórias pelos adipócitos possa
ser a ligação entre obesidade, resistência à insulina e DCVs (LACHINE et al., 2016).
Adicionalmente, a obesidade e o sobrepeso são encontrados em outras situações
clínicas, como no caso de pacientes com DM tipo 2 (DM2) (OKOP et al., 2016;
CHENG et al., 2015).
As DCVs são a principal causa de morte em pacientes com DM tipo1 (DM1) e
DM2 (ABDULLAH, 2016). Dados da literatura sugerem que mulheres com DM1
apresentam risco pelo menos quatro vezes maior que mulheres não diabéticas de
desenvolverem DCVs, assim como indivíduos com DM2 têm um risco aumentado
em seis vezes de apresentarem doenças macrovasculares quando comparados a
pessoas não diabéticas (BROWN et al., 2016; LACHINE et al., 2016). A
aterosclerose é considerada o principal mecanismo no desenvolvimento de
complicações macrovasculares em diabéticos, sugerindo que um estado inflamatório
crônico possa desempenhar papel vital no seu desenvolvimento (ABDULLAH, 2016;
LACHINE et al., 2016).
1.2. Estrutura e regulação da contratilidade dos vasos sanguíneos
Em temos histológicos, a parede vascular das artérias e veias é constituída
por três túnicas distintas: a túnica adventícia, a túnica média e a túnica íntima.
A túnica adventícia é a mais externa da parede vascular e em artérias de
grande calibre é possível encontrar vasos sanguíneos denominados vasa vasorum
que fornecem nutrientes e oxigênio para a camada média. Esta, a mais espessa, é
17
composta basicamente por células musculares lisas e elastina, e é responsável pela
constrição e dilatação dos vasos (ORALLO, 1996).
A contração da musculatura lisa vascular ocorre devido ao aumento da
concentração intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i). A formação do complexo
Ca2+/calmodulina resulta na ativação da quinase da cadeia leve de miosina (MLCK)
e consequente fosforilação da cadeia leve de miosina. Isto permite a interação com
os filamentos de actina e a contração do músculo liso vascular. Já a redução da
[Ca2+]i e a desfosforilação da cadeia leve de miosina pela miosina fosfatase resulta
em relaxamento vascular (BROZOVICH et al., 2016).
Há dois mecanismos principais que podem iniciar a contração do músculo
liso: a despolarização do potencial de repouso da membrana (acoplamento
eletromecânico) e a ativação de receptores de membrana por agonistas
(acoplamento fármaco-mecânico) (ORALLO, 1996).
O componente elétrico de excitação das células musculares lisas é
representado por potenciais de ação, onde o aumento da [Ca2+]i ocorre através da
sua entrada do espaço extracelular ou pela liberação das reservas intracelulares
provenientes do retículo sarcoplasmático (RS). A ativação dos canais de Ca2+
dependentes de voltagem do tipo L é a principal fonte do influxo de Ca2+ nas células
da musculatura lisa (BROZOVICH et al., 2016).
O acoplamento fármaco-mecânico resulta da ação de agonistas em
receptores específicos, cujos efeitos são mediados por diferentes quinases. As vias
RhoA e Rhoquinase (ROCK) são as mais importantes moduladoras da sensibilidade
ao Ca2+ na musculatura lisa e, diversos agonistas vasoconstritores agem através
dessas vias. Outra proteína quinase que também medeia o aumento da
sensibilidade ao Ca2+ é a proteína quinase C (PKC). A ativação dos receptores de
membrana acoplados a proteína Gq, como os receptores adrenérgicos α1, promove
ativação da fosfolipase C (PLC), resultando na hidrólise do fosfatidilinositolbifosfato
(PIP2) à diacilglicerol (DAG) e inositol1,4,5- trifosfato (IP3). O DAG ativa a proteína
quinase C (PKC), enquanto o IP3 provoca a liberação de Ca2+ do RS, levando a
contração da musculatura lisa (OGUT e BROZOVICH, 2003; ORALLO, 1996).
Por fim, a camada íntima está diretamente em contato com o sangue e é
composta por uma única camada de células endoteliais (GUYTON e HALL, 2011). O
endotélio constitui uma barreira física entre o sangue e os tecidos, além de regular o
fluxo de moléculas. Além disso, as células endoteliais metabolizam, sintetizam e
18
liberam uma variedade de substâncias que regulam o tônus vascular, a pressão
arterial e o fluxo sanguíneo local, substâncias que participam da coagulação,
fibrinólise e de reações inflamatórias e imunológicas, espécies reativas de oxigênio
(ROS) e de nitrogênio (RNS) envolvidas na oxidação e nitrosilação de proteínas e
lipídios, e fatores de crescimento que promovem o crescimento celular (SU, 2015).
1.2.1. Fatores vasoconstritores endoteliais
As principais substâncias vasoconstritoras produzidas e liberadas pelo
endotélio vascular são derivados do ácido araquidônico, endotelina (ET-1) e
angiotensina II (DIAS et al., 2009).
A prostaglandina F2 (PGF2) e o tromboxano A2 (TXA2) destacam-se como
substâncias vasoconstritoras derivadas do ácido araquidônico (COELHO et al.,
2003). A ET-1 pode agir sobre os receptores acoplados à proteína G presentes na
musculatura lisa (receptor A de endotelina) ou nas células endoteliais (receptor B de
endotelina). A ativação dos receptores A causa uma potente contração da
musculatura lisa, enquanto a ativação dos receptores B provoca vasodilatação
(SAKURAI et al., 1992). A ação vasoconstritora da angiotensina II ocorre através da
ativação dos receptores AT1, localizados no músculo liso vascular. Além disso,
modula a proliferação celular através da ativação da via ERK1/2 (QIN e ZHOU,
2015).
1.2.2. Fatores vasodilatadores endoteliais
Em 1980, Furgchogott e Zawadzki descobriram um fator derivado do endotélio
de extrema importância na regulação do tônus e manutenção da homeostasia
vascular, sendo este um potente vasodilatador identificado posteriormente como
óxido nítrico (NO). Este gás desempenha funções essenciais na regulação da
pressão arterial e na prevenção contra a aterosclerose, na inibição da adesão e
ativação de plaquetas e leucócitos e na inibição da proliferação das células
musculares lisas. Outros importantes vasodilatadores liberados pelo endotélio são a
prostaciclina (PGI2) e o fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) (ZAGO e
ZANESCO, 2006; FURGHOGOTT e VANHOUTTE, 1989).
19
1.2.2.1. NO
O NO é estruturalmente uma das moléculas biológicas mais simples e
desempenha importantes funções no organismo por atuar nas mais diversas vias de
sinalização. O NO consiste apenas de um átomo de oxigênio ligado à um nitrogênio.
O seu caráter de ser um “radical livre” lhe confere propriedades específicas de
reatividade química e determina sua interação com inúmeros alvos in vivo
(DUDZINSK et al., 2005).
O NO é sintetizado por NO sintases (NOS) a partir do aminoácido L-arginina.
Atualmente são conhecidas três isoformas de NOS em mamíferos: NOS neuronal
(nNOS), encontrada em sua maioria em neurônios; NOS induzível (iNOS), cuja
expressão gênica é regulada por citocinas e mediadores inflamatórios; e NOS
endotelial (eNOS), presente normalmente nas células endoteliais e plaquetas. Tanto
a nNOS quanto a eNOS são definidas como NOS constitutivas e dependentes de
Ca2+ (FÖRSTERMANN e SESSA, 2012; OLIVEIRA-PAULA et al., 2015).
A ativação da eNOS envolve a ligação do complexo Ca2+/calmodulina, aliado
a presença de co-fatores como a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato em sua
forma reduzida (NADPH), O2 molecular, tetrahidrobiopterina (BH4), flavina adenina
dinucleotídeo (FAD) e flavinamononucleotídeo (FMN). A eNOS catalisa a síntese de
NO em dois passos: o primeiro é a hidroxilação da L-arginina à Nw-hidroxi-L-arginina
(permanece em grande parte ligada à enzima), e o segundo consiste na oxidação da
Nw-hidroxi-L-arginina à L-citrulina e NO (FÖSTERMANN e SESSA, 2012).
No endotélio vascular, a eNOS é ativada pelo aumento da [Ca2+]i induzido por
agonistas como a acetilcolina, histamina e ATP. A ligação do complexo
Ca2+/calmodulina à eNOS facilita o fluxo de elétrons da NADPH e demais cofatores
do domínio redutase para o domínio heme oxigenase. Em contraste, a eNOS
também pode ser ativada pela fosforilação do resíduo de Ser1177, o que estimula o
fluxo de elétrons, aumentando a sensibilidade ao Ca2+ e representando um
mecanismo adicional e independente para a ativação da eNOS. O resíduo de Ser1177
nem sempre está na sua forma fosforilada nas células endoteliais, porém pode
rapidamente sofrer esta ação após o estresse de cisalhamento ou ativação de
receptores de estrogênio, de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou de
insulina. As quinases envolvidas nesse processo variam de acordo com o estímulo.
O estrogênio e o VEGF fosforilam a eNOS através da Akt; a insulina ativa a Akt e a
20
proteína quinase ativada pelo AMP (AMPK); a bradicinina ativa a quinase II
dependente de calmodulina (CaMKII); e o estresse de cisalhamento provoca a
fosforilação da eNOS via Akt e proteína quinase A (PKA). Além disso, este processo
pode ser ou não dependente da [Ca2+]i, dependendo da quinase envolvida na
fosforilação da eNOS. Por exemplo, a ativação mediada pela CaMKII é dependente
do aumento da [Ca2+]i, enquanto a ativação mediada pela Akt não é afetada pela
remoção do Ca2+ (FÖSTERMANN e SESSA, 2012; MICHEL e VANHOUTTE, 2010).
Por ser um gás solúvel e ter caráter lipofílico, o NO produzido no endotélio
vascular é difundido para a musculatura lisa e se liga à metade heme da guanilato
ciclase solúvel (GCs), ativando a produção de GMPc. Este nucleotídeo cíclico ativa a
proteína quinase G (PKG), levando a fosforilação de proteínas intracelulares,
diminuição da [Ca2+]i e vasodilatação. A ativação da PKG, assim como o NO
atuando diretamente, também pode provocar a abertura de canais de K+, resultando
em hiperpolarização da membrana plasmática, o que impede o influxo de Ca2+ a
partir dos canais de cálcio tipo L (Figura 1) (ROE e REN, 2012).
21
Figura 1: Mecanismo da vasodilatação causada pelo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF). AA, ácido araquidônico; eNOS, óxido nítrico sintase endotelial; cAMP, monofosfato cíclico de adenosina; AC, adenilatociclase; GCs, guanilatociclase; cGMP, monofosfato cíclico de guanosina;SR, retículo sarcoplasmático; L-Arg, L-arginina; ATP,adenosina trifosfato; GTP, guanosina trifosfato; PKA, proteína quinase A; PKG, proteína quinase G. (Modificado de VANHOUTTE, 2003.)
1.2.2.2. PGI2
A PGI2 também tem papel importante na vasodilatação dependente do
endotélio e na supressão da adesão de células sanguíneas e plaquetas, sendo,
portanto, crucial na prevenção da aterosclerose e na formação de trombos. Esta
molécula promove relaxamento vascular através da ativação de receptores IP
acoplados à proteína Gs presentes nas membranas da musculatura lisa vascular,
tendo como resposta a ativação da adenilato ciclase com consequente aumento na
concentração citosólica de adenosina 3, 5-monofosfato cíclico (AMPc), o qual ativa a
quinase dependente de AMPc (PKA) (Figura 1). Esta quinase promove a redução da
[Ca2+]i através da inibição da liberação de Ca2+ do RS, aumento da captação para o
RS, aumento da extrusão do Ca2+ e inibição da entrada a partir do meio extracelular.
A PGI2 também pode induzir a hiperpolarização da célula muscular lisa através da
ativação dos canais de K+ sensíveis a ATP (PARKINGTON, 2004).
22
1.2.2.3. EDHF
O EDHF promove relaxamento da musculatura lisa vascular através da
ativação dos canais de K+ ativados por Ca2+ de intermediária e baixa condutância
com consequente hiperpolarização da membrana celular, embora outros
mecanismos ainda não conhecidos possam estar envolvidos (FÉLÉTOU, 2009).
Agonistas como acetilcolina e bradicinina também podem estimular a liberação de
fatores envolvidos na hiperpolarização (SU, 2015). A transmissão da
hiperpolarização gerada nas células endoteliais para as células da musculatura lisa
estima-se ocorrer através das junções mioendoteliais (BRYAN et al., 2005;
FÉLÉTOU, 2009). A identidade química desses compostos ainda não está bem
definida, porém os ácidos epoxieicosatrienóicos e moléculas como monóxido de
carbono e peróxido de hidrogênio são possíveis candidatos. Ressalta-se ainda que a
vasodilatação ocasionada pelos EDHF é observada sem o aumento dos níveis dos
nucleotídeos cíclicos (VANHOUTTE, 2004).
1.3. Disfunção endotelial
Em condições fisiológicas há um equilíbrio preciso entre a produção e a
liberação dos fatores vasoconstritores e vasodilatadores derivados do endotélio, e
qualquer perturbação que possa alterar esse balanço pode levar à disfunção
endotelial, contribuindo para o desenvolvimento e progressão das DCVs (SU, 2015).
A atenuação dos efeitos vasodilatadores, como por exemplo, a redução da
biodisponibilidade de NO, aliada ao aumento da produção dos fatores contráteis
derivados do endotélio favorece a ocorrência de vasoespasmos, trombose,
penetração de macrófagos, crescimento celular e reações inflamatórias que levam à
aterosclerose (VANHOUTTE, 2004).
Clinicamente, a disfunção endotelial é caracterizada pela redução da
vasodilatação dependente do endotélio em resposta a agonistas como acetilcolina e
bradicinina, ou ao estresse de cisalhamento (GILES et al., 2012; SU, 2015). A
disfunção endotelial está presente tanto em fatores de risco para DCVs, como
hipercolesterolemia, DM e HAS (SU et al., 2015), como na doença já estabelecida
(GILES et al., 2012).
23
Alguns mecanismos são propostos para explicar a disfunção endotelial, como
a diminuição da liberação e a diminuição da sensibilidade da musculatura lisa aos
fatores relaxantes derivados do endotélio, a disfunção na via de transdução de sinal
dos fatores relaxantes endoteliais e o aumento na produção dos fatores contrateis
derivados do endotélio (CARVALHO et al., 2001). Outro mecanismo, porém, não
menos relevante, é a redução da biodisponibilidade de NO devido ao estresse
oxidativo, o qual tem papel significativo no desenvolvimento da aterosclerose, HAS e
DM (COHEN e TONG, 2010).
O estresse oxidativo é caracterizado quando o processo pró-oxidativo supera
a capacidade dos mecanismos antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, com
consequente aumento na formação das ROS (GILES et al., 2012). Os principais
agentes antioxidantes enzimáticos são a superóxido dismutase (SOD), catalase e
glutationa peroxidase. Os sistemas antioxidantes não enzimáticos podem se
subdividir em endógenos (vitamina E, glutationa) e exógenos (vitamina C,
carotenoides, flavonoides) (COHEN e TONG, 2010).
Há diversas enzimas que podem potencializar a produção de ROS na parede
vascular, como a NADPH oxidase, xantina oxidase, enzimas mitocondriais da cadeia
respiratória e eNOS na sua forma desacoplada. Dessas citadas, a NADPH oxidase é
a principal fonte de ânion superóxido (O2-) (FÖSTERMANN e SESSA, 2012;
RODRIGO et al., 2013).
O sistema renina-angiotensina-aldosterona é o principal ativador da NADPH
oxidase na HAS. A angiotensina II estimula a NADPH oxidase tanto pelo aumento da
expressão de subunidades dessa enzima quanto pelo aumento da produção de
ROS. O bloqueio do receptor AT1 reduz o estresse oxidativo e aumenta a
capacidade antioxidante plasmática, a qual é a capacidade dos agentes
antioxidantes (vitamina C, α-tocoferol) plasmáticos têm de evitar a geração de
radicais OH (COHEN e TONG, 2010).
Em condições de estresse oxidativo é possível observar uma exacerbação na
geração de O2- e uma depleção na geração de NO. Este processo é referido como
desacoplamento da eNOS. A eNOS em sua forma desacoplada ocorre, em geral,
pelo déficit do substrato L-arginina ou de cofatores como o BH4. A redução na
disponibilidade de BH4 ocasiona em um aumento na produção de O2- ao invés de
NO, resultando na formação do peroxinitrito (ONOO-) (GILES et al., 2012).
Adicionalmente, a S-glutationilação também leva ao desacoplamento da eNOS em
24
condições de estresse oxidativo, com prejuízo na vasodilatação dependente do
endotélio (FÖSTERMANN e SESSA, 2012).
O DM e a HAS levam à geração aumentada de ROS através da super
regulação da NADPH oxidase mediada pela PKC. Os produtos da NADPH oxidase e
da eNOS, O2- e NO, rapidamente formam ONOO-, o qual pode oxidar o BH4 a BH3.
O BH3 por sua vez pode gerar o BH2 e, como consequência, o desacoplamento da
eNOS contribui para o estresse oxidativo através da produção de O2- ao invés de
NO (Figura 2) (FÖSTERMANN e SESSA, 2012).
Figura 2: Mecanismo potencial pelo qual fatores de risco cardiovascular levam ao estresse oxidativo e desacoplamento da eNOS. Super-regulação da NADPH oxidase em diversos tipos de doença cardiovascular. PKC, proteína quinase C; SOD, superóxido dismutase; H2O2, peróxido de hidrogênio; ONOO-, peroxinitrito; BH4, tetrahidrobiopterina; BH3, trihidrobiopterina; BH2, 6,7-[8H]-H2-biopterina; NADPH, dinucleotídeo adenina nicotinamida fosfato (Modificado de FÖSTERMANN e SESSA, 2012).
1.4. Potencial farmacológico cardiovascular de produtos vegetais
Há tempos imemoriais os povos primitivos já buscavam na natureza o alívio e
a cura de doenças visando a manutenção da saúde. Com o passar dos anos, aliado
aos avanços do conhecimento científico e tecnológico, descobriu-se que os produtos
naturais representam fontes importantes de substâncias biologicamente ativas,
25
sendo, as principais, as plantas, bactérias, fungos, insetos e organismos marinhos,
as principais fontes de obtenção de fármacos (BARREIRO e BOLZANI, 2009).
A maior parte dos fármacos em uso na clínica é de origem natural ou foi
desenvolvida por síntese química planejada a partir de seus derivados. De 1981 a
2010, 64% das novas substâncias químicas foram obtidas de origem natural e
apenas 34% de origem puramente sintética, indicando assim a importância dos
produtos naturais na descoberta de novos fármacos (CRAGG e NEWMAN, 2013).
Entre os produtos naturais que serviram de fonte para a descoberta de
fármacos utilizados para o tratamento das doenças do sistema cardiovascular pode-
se destacar: digoxina, isolada da espécie vegetal Digitalis purpurea e utilizada
anteriormente para o tratamento da insuficiência cardíaca; captopril, obtido do
veneno de cobra Jathropus jararaca, utilizado para o tratamento da HAS; ácido
acetilsalicílico, obtido a partir da salicina isolada da espécie vegetal Salix alba e
utilizado principalmente como antiagregante plaquetário; e reserpina, isolada da
espécie vegetal Rauwolfia serpentina e já foi usada para o tratamento da HAS
(BUTLER, 2004; JUNIOR et al., 2006).
Segundo KENNEDY e WIGHTMANN (2011) é notório que as plantas vivam
em seus microambientes particulares extremamente ricos em substâncias químicas,
favorecendo, em termos evolutivos, a seleção natural de espécies fitoquímicas, ou
seja, de metabólitos secundários ou especiais, como também são conhecidos. Ao
contrário dos metabólitos primários, responsáveis pelo crescimento e
desenvolvimento das plantas, os metabólitos secundários desempenham uma série
de funções protetoras, de defesa e podem gerenciar o relacionamento interplantas
(BARREIRO e BOLZANI, 2009; TAIZ e ZEIGER, 2002). Além dos metabólitos
secundários estarem associados a inúmeras funções biológicas diretamente
relacionadas à sobrevivência das plantas no meio ambiente, são responsáveis
também pelos efeitos terapêuticos das plantas medicinais, com grande importância
para o desenvolvimento de fármacos.
Entre os metabólitos com destaque para as ações no sistema cardiovascular
estão as substâncias fenólicas, as quais representam um grupo heterogêneo de
metabólitos secundários amplamente encontrados na dieta (CURIN e
ANDRIANTSIOOHAIANA, 2005). Estudos epidemiológicos indicam que uma dieta
rica em vegetais e frutas, bem como o consumo consciente de bebidas como vinho
26
tinto e chás estão associados à redução do risco cardiovascular (KERTH et al.,
2011).
Os flavonoides são os principais constituintes desse grupo de metabólitos,
representando mais de 4 mil dos 8 mil compostos fenólicos. Eles compartilham de
um núcleo comum formado por 15 átomos de carbono dispostos em 3 anéis,
podendo ser divididos em flavanois (catequinas e epicatequinas), flavonois
(quercetina e kaempferol), antocianidinas (cianidinas), flavonas (apigenina) e
flavononas (naringerina). Nos compostos não-flavonoides, no anel aromático há um
ou mais grupos hidroxilas, incluindo os estilenos (resveratrol), ácidos fenólicos (ácido
gálico), saponinas (ginsenosídeo), cumarinas e taninos (CURIN e
ANDRIANTSIOOHAIANA, 2005).
Diversos são os efeitos benéficos dos polifenois nas DCVS, como atividade
antioxidante, redução da hiperlipidemia, do tônus vascular e da aterosclerose, e
atividade anti-inflamatória (STOCLET et al., 2004). Os efeitos antioxidantes dos
polifenois podem ser resultantes de diferentes mecanismos. Essas moléculas podem
sequestrar diretamente ROS, como também podem inibir enzimas geradoras de
ROS, como xantina oxidase e NADPH oxidase (VÁZQUEZ et al., 2013).
Compostos polifenólicos do vinho tinto induzem o relaxamento vascular de
forma dependente do endotélio por distintos mecanismos, como regulação da
expressão da eNOS, regulação da atividade da eNOS pela fosforilação dessa
enzima na Ser1177, regulação da atividade e expressão da GCs (STOCLET et al.,
2004; VÁZQUEZ et al., 2013).
Os compostos polifenólicos do vinho tinto protegem contra a oxidação do LDL
em células endoteliais, promovem efeito antioxidante, antiagregante plaquetário,
tendo papel contra a aterosclerose. Além disso, polifenois encontrados na toranja
reduzem a susceptibilidade de oxidação do LDL em pacientes com doença
coronariana (OU et al., 2005; CURIN e ANDRIANTSIOOHAIANA, 2005; KHALIL e
SULAIMAN, 2010; MIDDLETON et al., 2000).
1.5. Kielmeyera membranacea
A espécie selecionada para este trabalho foi a Kielmeyera membranacea,
pertencente à ordem Malpighiales, família Calophyllaceae, gênero Kielmeyera. Esta
ordem é uma das maiores e mais diversas do clado das rosídeas e inclui o grupo
27
dos clusioides, representado pelas famílias Clusiaceae, Calophyllaceae,
Bonnetiaceae, Hypericaceae e Podostemaceae (RUHFEL et al., 2011).
Os gêneros da família Calophyllaceae são de ampla distribuição sendo
frequentemente encontrados nas América Latina e Central, além da África Central e
Ásia. Já foram identificados 14 gêneros e aproximadamente 476 espécies
pertencentes a essa família no mundo. No Brasil já foram catalogados 8 gêneros –
Calophyllum L., Caraipa Aubl., Clusiella Planch & Triana, Haploclathra Benth.,
Kielmeyera Mart. & Zucc., MahureaAubl., Marila Sw. e Neotatea Maguire – e 81
espécies, sendo 59 endêmicas, inclusive a K. membranacea (MOBOT, 2014;
WURDACK - DAVIS, 2009; REFLORA, 2014).
Entre as atividades biológicas já estudadas para espécies da família
Calophyllaceae encontradas no Brasil citam-se o tratamento de lesões cutâneas
provocadas por leishmaniose (Calophyllum brasiliense) (LEMOS et al., 2012),
antibiótica (Kielmeyera variabilis) (TIUMAN et al., 2012) e anti-inflamatória
(Haploclathra paniculata) (SUFFREDINI et al., 2006). Já foram descritas atividades
protetoras contra a disfunção endotelial de espécies não encontradas no Brasil,
como Mammea neurophyllae e Calophyllum flavoramulum, pelo mecanismo de
inibição da formação dos produtos finais da glicação avançada (DANG et al., 2014;
FERCHICHI et al., 2012).
O gênero Kielmeyera é endêmico da América do Sul, sendo a maior parte das
47 espécies descritas na literatura encontradas exclusivamente no Brasil. Espécies
desse gênero são amplamente encontradas em todas as regiões do país,
principalmente na região sudeste e em diversos domínios fitogeográficos, como na
floresta Amazônica, em cerrados, caatingas e Mata Atlântica (restinga) (SADDI,
1982; REFLORA, 2014).
Na medicina popular, muitas espécies do gênero Kielmeyera são utilizadas no
tratamento de diversas doenças tropicais, como malária, esquistossomose,
leishmaniose e infecções fúngicas e bacterianas. Cita-se também que algumas
espécies desse gênero já foram estudadas quanto à sua atividade biológica,
destacando-se as espécies K. coriacea, K. variabilis, K. aureovinosa, K. neglata e K.
rugosa (ZAGOTO et al., 2006).
A espécie K. coriacea é relatada por ter um potencial efeito antidepressivo,
visto que o extrato hidroalcoólico do caule inibe a recaptação de serotonina,
noradrenalina e dopamina (OBICI et al., 2008). Estudos sugerem que a fração em
28
diclorometano do caule de K. coriacea pode ser uma importante alternativa
terapêutica no tratamento do transtorno da ansiedade e do pânico (BIESDORF et al.,
2012). O extrato etanólico e a fração ciclohexânica desta espécie obtidos a partir da
casca, também apresentaram atividades antioxidante e antifúngica contra T. rubrum
(AQUINO et al., 2013; SILVA et al., 2009). Segundo FIGUEIREDO e colaboladores
(2014), constituintes das folhas da espécie vegetal K. coriacea apresentaram
atividade antitumoral.
O fracionamento cromatográfico das frações mais potentes obtidas das folhas
da espécie K. variabilis conduziu à identificação de 3 flavonoides com atividade
antioxidante (COQUEIRO et al., 2013). Os extratos das folhas das espécies K.
aureovinosae e K. neglecta (extrato etanólico e fração em acetato de etila)
apresentaram atividade antibiótica e citotóxica, respectivamente (CARVALHO et al.,
2012; SOUZA et al., 2012), e a fração diclorometânica obtida do caule da K. rugosa
demonstrou atividade antitumoral sem substancial toxidez (OLIVEIRA et al., 2013).
MELO e colaboradores (2014) demonstraram atividades anti-hiperalgésicas e anti-
inflamatórias a partir do extrato metanólico do caule da K. rugosa.
As espécies do gênero Kielmeyera também têm sido estudadas quanto à sua
composição química, marcada caracteristicamente pela presença de xantonas e
cumarinas, além de antraquinonas, terpenos, esteroides e flavonoides glicosídicos
(COQUEIRO et al., 2016; MARTINS et al., 2015; NOGUEIRA et al., 2009; SOBRAL
et al., 2009).
Algumas substâncias já foram isoladas como por exemplo, 4-alquilcumarinas,
4-fenilcumarinas e 4-n-propilcumarinas, sendo estas duas últimas extraídas de
folhas de K. rugosa. A composição química das espécies do gênero Kielmeyera
também varia de acordo com o ambiente em que se localiza, onde em espécies
encontradas no cerrado a classe das xantonas predomina e, por outro lado, em
espécies de restinga predominam a 4-fenilcumarinas e 4-n-propilcumarinas
(NOGUEIRA et al., 2009; SOBRAL et al., 2009).
As xantonas apresentam efeitos benéficos em algumas DCVs, incluindo
isquemia, aterosclerose, HAS e trombose. Atividades antioxidante, anti-inflamatória,
antitrombótica e vasodilatadora são consideradas efeitos protetores provocados por
essas substancias contra as DCVs. Ressalta-se, em particular, que o antagonismo
dos inibidores endógenos da NOS provocado pelas xantonas pode representar a
base para a melhoria da função endotelial (DE-JIAN et al., 2004).
29
Já foram descritas também atividades farmacológicas das cumarinas, com
ações antioxidante, antiplaquetária, anti-inflamatória e hipotensiva (FARZEI et al.,
2013; SONG et al., 2014). Estudos demonstraram potente atividade inibitória da
formação de produtos finais de glicação avançada pelas 4-fenil e 4-(1-acetoxipropil)
cumarinas. Ressalta-se ainda que uma série de potentes inibidores da enzima
colesterol acetiltransferase, potentes agentes terapêuticos para o tratamento da
aterosclerose, tem em sua base a 4-fenilcumarina (OGINO et al., 2011).
A espécie vegetal K. membranacea, objeto deste estudo, é endêmica do
Brasil, sendo encontrada nos estados de Minas Gerais, Bahia, Espírito Santo e Rio
de Janeiro, sendo seu domínio fitogeográfico a Mata Atlântica, em especial a
restinga (REFLORA, 2013). Apesar de não haver descrição de uso popular ou
atividade farmacológica no sistema no cardiovascular, uma triagem do efeito
vasodilatador de extratos vegetais realizado no Laboratório Integrado de Pesquisa
do Campus UFRJ-Macaé mostrou que a K. membranacea e suas frações
apresentam potente atividade vasodilatadora (PAES, 2014), despertando o interesse
para o estudo mais aprofundado de suas propriedades farmacológicas.
30
2. JUSTIFICATIVA
As DCVs são uma das principais causas de morte no Brasil e no mundo e são
caracterizadas por alterações funcionais e morfológicas (WHO, 2016). Visto todo
prejuízo que essas doenças causam, é de extrema importância a pesquisa e
descoberta de novas substâncias que possam atenuar e/ou prevenir o seu
desenvolvimento.
Os produtos naturais são uma importante fonte de descoberta de novas
substâncias com atividades biológicas e farmacológicas, inclusive com ações no
tratamento das DCVs (CRAGG e NEWMAN, 2013).
Até o presente momento não há relatos na literatura sobre o uso popular bem
como atividade biológica ou farmacológica da espécie vegetal Kielmeyera
membranacea no que diz respeito ao sistema cardiovascular. Uma triagem do efeito
vasodilatador de extratos vegetais realizada no Laboratório Integrado de Pesquisa
do Campus UFRJ-Macaé mostrou que o extrato hidroalcoólico das folhas de K.
membranacea apresenta uma potente atividade vasodilatadora (PAES, 2014),
despertando assim o interesse para o aprofundamento do conhecimento de suas
propriedades farmacológicas.
31
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos gerais: Identificar subastâncias bioativas obtidas da espécie
vegetal K. membranacea com potencial farmacológico em alterações
vasculares.
3.2. Objetivos específicos:
Investigar o efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico, frações e
subfrações das folhas de K. membranacea;
Investigar o mecanismo de ação do efeito vasodilatador do extrato bruto;
Avaliar os efeitos do extrato bruto na reatividade vascular à fenilefrina e à
acetilcolina;
Avaliar os efeitos do extrato bruto na reatividade vascular à fenilefrina e à
acetilcolina na presença de disfunção vascular induzida por alta concentração
de glicose;
Avaliar os efeitos do extrato bruto na reatividade vascular à fenilefrina e à
acetilcolina na presença de disfunção vascular induzida por estresse
oxidativo.
32
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório Integrado de Pesquisa, Pólo
Universitário do Campus UFRJ-Macaé Professor Aloísio Teixeira. Todos os
protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética com Animais de
Experimentação do Campus UFRJ-Macaé, sob protocolo MAC019. Foram utilizados
ratos Wistar machos (200-280 g), os quais foram mantidos em biotério com
temperatura e umidade controladas, em um ciclo de 12h/12h claro/escuro, com água
e ração disponibilizadas sem restrição.
4.1. Material vegetal
Folhas da espécie Kielmeyera membranacea foram coletadas no PARNA de
Jurubatiba no município de Carapebus – RJ (22°16´S/41°39´W). A coleta e a
identificação botânica foram realizadas pela Profª. Drª. Tatiana Ungaretti Paleo
Konno e, uma exsicata foi depositada no Herbário do Centro de Ciências da Saúde
da UFRJ (RFA38752).
4.2. Obtenção do extrato hidroalcoólico, frações e subfrações
Todos os extratos, frações e subfrações utilizados nos experimentos foram
cedidos pelo Laboratório de Produtos Bioativos do Campus UFRJ-Macaé. Os
resultados farmacológicos guiaram a análise fitoquímica da K. membranacea.
Após a seleção do material, este foi seco em estufa com circulação de ar com
temperatura ajustada para 40 °C. A secagem foi considerada completa quando o
peso da amostra se tornou constante. As folhas de K. membranacea foram trituradas
em moinho de facas.
Para o processo de maceração foi utilizado 50,35 g de folhas de K.
membranacea, previamente secas e pulverizadas, utilizando-se etanol:água (7:3)
como sistema de solvente extrator, em temperatura ambiente. O extrato
hidroalcoólico foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório (IKA®) sob pressão
reduzida resultando no extrato bruto. As frações do extrato bruto foram obtidas
através de partição líquido-líquido utilizando solventes com polaridade crescente:
hexano PA (Hex), diclorometano PA (CH2Cl2), acetato de etila PA (AcOEt) e butanol
33
PA (BuOH). Foram utilizados 6,19 g do EKM ressuspendido em 100 ml de metanol–
água (MeOH:H2O) 9:1. Será feito um fracionamento da fração com maior potência e
perfil vasodilatador.
Considerando os resultados obtidos para as frações nos ensaios de atividade
vasodilatadora, a fração butanólica (Fr. BuOH) foi selecionada como a mais
promissora para o prosseguimento do estudo. Esta foi submetida à fracionamento
cromatográfico em coluna de vidro, tendo como fase estacionária 17 cm de sílica-gel
60 silanizada de fase reversa (tamanho 0,063-0,200 mm). Para o fracionamento,
uma massa de 0,888 g da Fr. BuOH foi solubilizada em água destilada e aplicada na
coluna. O gradiente de eluição utilizado foi iniciado com 100% de água destilada e
finalizado com 100% de metanol e a proporção de solventes seguiu conforme
apresentado na Tabela 1. As subfrações foram recolhidas em frascos de vidro e
reunidas por gradiente totalizando 5 subfrações.
Tabela 1. Fracionamento cromatográfico da fração butanólica
4.3. Preparo dos anéis de aorta para registro de tensão isométrica
Ratos Wistar machos foram eutanasiados para retirada da porção torácica da
aorta, a qual foi transferida imediatamente para uma cuba contendo solução de
Krebs-Henseilet (em mM: NaCl 118; KCl 4,7; KH2PO41,2; MgSO4 1,2; CaCl2 2,5;
NaHCO3 25; glicose 11; pH 7,4) para remoção do tecido conjuntivo adjacente. A
aorta então foi cortada em cilindros de aproximadamente 3 mm de comprimento, que
foram posicionados em cubas verticais de 10 mL preenchidas com a mesma solução
de Krebs-Henseilet, continuamente oxigenada com mistura carbogênica composta
(95% de O2 e 5% de CO2), à uma temperatura constante de 37 °C. Uma das
Subfração Gradiente de eluição
Volume (ml)
Rendimento (g)
1 100% H2O 200 0,353
2 70% H2O e 30% MeOH
200 0,278
3 50% H2O e 50% MeOH
400 0,1031
4 30% H2O e 70% MeOH
600 0,0713
5 100% MeOH 1000 0,0138
34
extremidades do tecido era conectada a um transdutor de tensão isométrica
(MLT0201; ADInstruments), e os sinais gerados eram digitalizados (Power Lab 4/30;
ADInstruments) e armazenados em computador para posterior análise através do
programa LabChart Pro (ADInstruments). Durante o período de estabilização da
preparação, 90 minutos, a solução nutridora era substituída nos tempos de 20, 40 e
60 minutos. Após o período de equilíbrio, a integridade do endotélio vascular era
verificada através da indução da contratura do músculo liso vascular com 10 µM de
fenilefrina, seguida da adição de 10 µM de acetilcolina. O endotélio foi considerado
íntegro quando o relaxamento em resposta à acetilcolina foi igual ou superior a 80%.
Em alguns experimentos foi realizada a remoção mecânica do endotélio utilizando-
se uma cânula, sendo confirmada pela ausência de relaxamento (ou inferior 10%)
frente à acetilcolina (Figura 3).
A
B
Figura 3: Registros representativos do teste para avaliação da integridade do endotélio. Em A, aorta com endotélio e em B, aorta sem endotélio.
4.4. Avaliação do efeito vasodilatador do EKM, frações e subfrações
O EKM e suas frações foram solubilizados em DMSO, em soluções estoques
de 10 e 50 mg/mL. Em estudo controle realizado no Laboratório Integrado de
Fenilefrina 10 µM Acetilcolina 10 µM
5 min
2 g
Fenilefrina 10 µM Acetilcolina 10 µM
5 min
1 g
35
Pesquisa, foi possível observar que este solvente não alterou a atividade vascular na
concentração máxima utilizada (0,65%).
Após o período de equilíbrio da preparação, a contratura do músculo liso
vascular foi induzida com 10 µM de fenilefrina e, estabelecido o platô, foram
adicionadas concentrações crescentes cumulativas do extrato, frações ou
subfrações (1 a 30 µg/mL).
4.5. Estudo do mecanismo de ação do efeito vasodilatador do EKM
Para determinar o mecanismo vasodilatador do EKM, foram utilizados anéis
de aorta com e sem endotélio. A investigação do mecanismo de ação do extrato
seguiu-se em anéis aórticos com endotélio através do pré-tratamento dos mesmos
por 15 minutos (antes da indução da contratura com fenilefrina) com diferentes
inibidores ou antagonistas: L-NG-Nitroarginina metil éster(L-NAME; 100 µM), inibidor
da NO sintase; 1H-[1,2,4]oxadiazol [4,3-a] quinoxalino-1-um (ODQ; 10 µM), inibidor
da GCs; wortmannin (0,3 µM), inibidor da PI3K; atropina (10 µM), antagonista não
seletivo dos receptores muscarínicos; fulvestrant (10 µM), antagonista seletivo dos
receptores de estrogênio ERα; indometacina (10 µM), inibidor da enzima
ciclooxigenase; HOE 140 (10 µM), inibidor dos receptores de bradicinina B2
(RAIMUNDO et al., 2009; PONTES et al., 2012).
4.6. Efeitos do EKM na reatividade vascular
Curvas concentração-resposta para fenilefrina (10-9 – 10-5 M) e para
acetilcolina (10-9 – 10-5 M) foram obtidas em aortas com endotélio na ausência e
presença de EKM (3,5 µg/mL). A concentração do EKM utilizada foi definida por ser
um pouco maio do que a sua CI50. A curva concentração-resposta para fenilefrina
também foi realizada em anéis de aorta sem endotélio e em anéis com endotélio
pré-tratados com L-NAME (100 µM) (RATTMANN et al., 2012).
36
4.7. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção
vascular induzida por alta concentração de glicose
Anéis de aorta com endotélio foram incubados por 2 horas com solução
Krebs-Henseilet contendo 25 mM de glicose. Após este período, curvas
concentração-resposta para fenilefrina (10-9 – 10-5 M) e para acetilcolina (10-9 – 10-5
M) foram obtidas na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL) (DHAR et al., 2010).
4.8. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção
vascular induzida por estresse oxidativo
Anéis de aorta com endotélio foram incubados por 15 min com 10 µM de
pirogalol. Após este período, curvas concentração-resposta para fenilefrina (10-9 –
10-5 M) e para acetilcolina (10-9 – 10-5 M) foram obtidas na ausência e presença de
EKM (3,5 µg/mL) (YEAH-SIANG et al., 2011).
4.9. Análise estatística
Todos os resultados foram apresentados como média ± E.P.M. Os resultados
de relaxamento vascular foram expressos como percentual de relaxamento da
contratura máxima induzida pela fenilefrina. As análises estatísticas foram realizadas
utilizando-se o programa Prism 5.0 (GraphPad Software, USA). A concentração
inibitória média (CI50) do EKM e frações, e a concentração eficaz média (CE50) da
fenilefrina e da acetilcolina, foram calculadas através de regressão não linear. Para
múltiplas comparações foi utilizado o teste análise de variância (One-way - ANOVA)
seguido do pós teste Dunnett ou Newman-Keuls. As diferenças entre os grupos
foram consideradas estatisticamente significativas quando P< 0,05.
37
5. RESULTADOS
5.1. Efeito vasodilatador do EKM
Para a avaliação do efeito vasodilatador do EKM, foram utilizados anéis de
aorta com endotélio preparados para registro de tensão isométrica. A contração do
músculo liso vascular foi induzida através da adição de 10 µM de fenilefrina e, após
a observação do platô de contração, foram adicionadas concentrações cumulativas
do EKM (Figura 4). O EKM provocou relaxamento da musculatura lisa vascular de
forma dependente da concentração, sendo de 88,3 ± 3,8 % na concentração de 30
µg/mL (P<0,05; Figura 5). A concentração necessária para reduzir a contratura
induzida por fenilefrina em 50% (CI50) foi de 3,2 ± 0,1 µg/mL.
Para avaliar a importância da participação dos fatores endoteliais no
relaxamento provocado pelo EKM, foram realizados experimentos com anéis de
aorta sem endotélio. A remoção do endotélio inibiu completamente a atividade
vasodilatadora do EKM, como mostrado na figura 5.
Figura 4: Registro típico da resposta contrátil a 10 μM de fenilefrina seguido da exposição a concentrações crescentes e cumulativas do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea em um anel aorta com endotélio.
38
1 10 100
0
20
40
60
80
100
* **
Com endotélio
Sem endotélio
EKM (g/mL)
% R
ela
xam
en
to
Figura 5: Efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) em anéis de aorta com (n= 12) e sem endotélio (n= 6). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado a com endotélio.
Sabendo que o efeito vasodilatador provocado pelo EKM é totalmente
dependente do endotélio e o principal fator vasodilatador produzido e liberado pelo
endotélio é o NO, foram realizados experimentos para investigar a participação da
via do NO/GMPc no seu efeito vasodilatador. O relaxamento provocado pelo EKM foi
completamente inibido após o pré-tratamento com L-NAME, inibidor da NOS, e com
ODQ, inibidor da GCs, confirmado a participação da via NO/GMPc no efeito
vasodilatador do extrato (Figura 6).
39
A B
Figura 6: Envolvimento da via NO/GMPc no efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM). Curvas concentração-resposta para EKM em aortas com endotélio na ausência (n= 12) e presença de L-NAME (A; n= 6) ou ODQ (B; n= 6). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado a com endotélio.
A fim de identificar como o EKM ativa a produção endotelial de NO, foram
utilizados antagonistas dos receptores muscarínicos e de bradicinina: atropina e
HOE140, respectivamente. Na presença de atropina não houve alteração
significativa na curva concentração-resposta do EKM (Figura 7A). Porém, ao pré-
tratar os anéis aórticos com HOE140, houve um efeito inibitório significativo da
vasodilatação provocada pelo EKM na concentração de 30 µg/mL, indicando que os
receptores de bradicinina B2 estão envolvidos no efeito do EKM (Figura 7B).
1 10 100
0
20
40
60
80
100
*
Com endotélio
+ L- NAME 100 M
**
EKM (g/mL)
% R
ela
xam
en
to
1 10 100
0
20
40
60
80
100
*
Com endotélio
+ ODQ 10 M
**
EKM (g/mL)
% R
ela
xam
en
to
40
A B
Figura 7: Envolvimento dos receptores muscarínicos e de bradicinina no efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM). Curvas concentração-resposta para EKM, em aortas com endotélio, na ausência (n= 12) e presença de atropina (A; n= 6) ou HOE140 (B; n= 8). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado a com endotélio.
Com o intuito de avaliar a participação da via PI3K/Akt na ativação da eNOS
foi utilizado o bloqueador wortmaninn, inibidor da PI3K, o qual inibiu completamente
o relaxamento provocado pelo EKM (Figura 8). Em seguida, foi avaliada a
participação dos receptores de estrogênio no efeito do EKM, já que estes receptores
provocam a ativação da eNOS através da via PI3K/Akt. Na presença de fulvestrant,
o relaxamento provocado pelo EKM foi significativamente reduzido (Figura 8B),
sugerindo a participação desses receptores no mecanismo de ação do EKM.
1 10 100
0
20
40
60
80
100
Com endotélio
+ HOE 140
*
EKM (g/mL)
% R
ela
xam
en
to
1 10 100
0
20
40
60
80
100Com endotélio+ Atropina
EKM (g/mL)
% R
ela
xam
en
to
41
A B
Figura 8: Envolvimento da via PI3K/Akt e dos receptores de estrogênio no efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM). Curvas concentração-resposta para EKM na ausência (n=12) e presença de wortmannin (A; n= 5) ou fulvestrant (B; n= 8). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado ao controle.
5.2. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina
Para avaliar os efeitos do EKM na reatividade vascular, foram realizadas
curvas concentração-resposta para fenilefrina e para acetilcolina em aortas com
endotélio na ausência e presença do EKM.
O pré tratamento com o EKM (3,5 µg/mL) reduziu a contração induzida pela
fenilefrina em até 58,83% na concentração de 10 µM (Figura 9A), com alteração da
pCE50 de 7,1 ± 0,1 para 6,2 ± 0,1 (P< 0,05). Como o efeito vasodiltador do extrato é
dependente do endotélio e da liberação de NO, conforme mostrado anteriormente, o
mesmo experimento foi realizado em aortas sem endotélio. Como apresentado na
figura 9B, o EKM não provocou qualquer alteração significativa da curva
concentração-resposta para fenilefrina em aortas sem endotélio (pCE50 7,5 ± 0,1 e
7,4 ± 0,1), indicando que o efeito do extrato em atenuar a vasoconstrição induzida
pela fenilefrina é dependente do endotélio. Resultados semelhantes foram obtidos
em aortas com endotélio pré-tradas com L-NAME (Figura 9C), indicando que o EKM
reduz a contração induzida pela fenilefrina através da ativação da produção de NO
(pCE50 7,7 ± 0,2 e 7,7 ± 0,1).
1 10 100
0
20
40
60
80
100Com endotélio
+ Fulvestrant
*
EKM (g/mL)%
Rela
xa
me
nto
1 10 100
0
20
40
60
80
100
*
Com endotélio
+ Wortmannin
* *
EKM (g/mL)
% R
ela
xam
en
to
42
Figura 9: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular à fenilefrina. Em A e B, curvas concentração-resposta para fenilefrina na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL), em aortas com e sem endotélio, respectivamente. Em C, curvas concentração-resposta para fenilefrina na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL), em aortas com endotélio pré-tradas com L-NAME (100 µM). Os dados representam a média ± E.P.M. de 7-21 experimentos. *P<0,05 comparado a com endotélio.
B
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 Com endotélio
+ EKM 3,5 g/mL
**
*
** *
Log [Fenilefrina], M
Co
ntr
ação
(g
)
A
B
C
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 Sem endotélio
+ EKM 3,5 g/mL
Log [Fenilefrina], M
Co
ntr
ação
(g
)
C
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0Com endotélio + L-NAME
+ EKM 3,5 g/mL
Log [Fenilefrina], M
Co
ntr
ação
(g
)
43
Em relação à reatividade à acetilcolina, o EKM provocou um deslocamento
para esquerda da curva concentração-resposta para acetilcolina com alteração da
pCE50 de 7,3 ± 0,1 para 7,9 ± 0,3 (P> 0,05), sem alterar o relaxamento máximo
(Figura 10).
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
20
40
60
80
100
120 Controle
+ EKM 3,5 g/mL
*
**
Log [Acetilcolina], M
% R
ela
xam
en
to
Figura 10: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular à acetilcolina. Curvas concentração-resposta para acetilcolina em aortas com endotélio na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Os dados representam a média ± E.P.M. de 7-21 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle.
5.3. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na
presença de alterações vasculares induzidas por glicose
A incubação das aortas com 25 mM de glicose por 2 horas resultou em
aumento da contração máxima induzida por fenilefrina de 1,5 ± 0,1 g para 2,2 ± 0,2 g
(P< 0,05) e pCE50 de 6,6 ± 0,1 (Figura 11 A). O relaxamento máximo provocado pela
acetilcolina foi reduzido de 98,4 ± 0,4 % para 25,9 ± 4,5 % (P< 0,05), com pCE50 de
3,3 ± 0,7 (Figura 11 B).
Na presença de 3,5 µg/mL de EKM, a reatividade à fenilefrina foi normalizada
e a vasodilatação em resposta à acetilcolina (10 µM) foi parcialmente restaurada
para 75,5 ± 2,9 %, com pCE50 de 6,3 ± 0,1 (P< 0,05; Figura 11 A e B).
44
A
B
Figura 11: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por glicose. Em A, curvas concentração-resposta para fenilefrina em aortas com endotélio na ausência e presença de glicose 25 mM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Em B, curvas concentração-resposta para acetilcolina em aortas com endotélio na ausência e presença de glicose 25 mM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Os dados representam a média ± E.P.M. de 6-21 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle; #P<0,05 comparado a + 25 mM glicose.
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Controle
+ 25 mM glicose
+ 25 mM glicose + 3,5 g/mL EKM
**
*
Log [Fenilefrina], M
Co
ntr
ação
(g
)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
20
40
60
80
100
120
Controle+ 25 mM glicose
+ 25 mM glicose + 3,5 g/mL EKM
* * * ***
*
###
#
Log [Acetilcolina], M
% R
ela
xam
en
to
45
5.4. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na
presença de alterações vasculares induzidas por estresse oxidativo
O pré-tratamento com pirogalol provocou um deslocamento para esquerda da
curva concentração-resposta da fenilefrina, com aumento da contração máxima de
1,5 ± 0,1 g para 1,9 ± 0,1 g e alteração da pCE50 para 7,6 ± 0,1 (Figura 12 A). Na
presença de 3,5 µg/mL de EKM, a reatividade à fenilefrina foi normalizada (Figura 12
A). O relaxamento vascular induzido pela acetilcolina foi significativamente reduzido
com o pré-tratamento com pirogalol de 98,4 ± 0,4 % para 23,6 ± 0,4 %, e alteração
da pCE50 para 3,5 ± 0,1. O pré-tratamento com EKM (3,5 µg/mL) não foi capaz de
restaurar a disfunção endotelial provocada pelo pirogalol (Figura 12 B).
46
A
B
B
Figura 12: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por estresse oxidativo. Em A, curvas concentração-resposta para fenilefrina em aortas com endotélio na ausência e presença de pirogalol 10 µM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Em B, curvas concentração-resposta para acetilcolina em aortas com endotélio na ausência e presença de pirogalol 10 µM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Os dados representam a média ± E.P.M. de 6-21 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle.
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5Controle
+ Pirogalol
*
*
**
*
*
*+ EKM 3,5 g/mL
Log [Fenilefrina], M
% C
on
tração
-9 -8 -7 -6 -5 -4
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
Controle
+ Pirogalol
+ EKM 3,5 ug/mL
* *
** *
**
* *
*
* *
*
*
Log [Acetilcolina], M
% R
ela
xam
en
to
47
5.5. Efeitos das frações e subfrações do EKM no músculo liso vascular
As frações do EKM foram testadas com a finalidade de sugerir as possíveis
classes de metabólitos secundários responsáveis pela atividade vasodilatadora do
extrato, além de direcionar as etapas posteriores de fracionamento. A partição
líquido-líquido do extrato bruto originou quatro frações (hexânica, em diclorometano,
em acetato de etila e butanólica) que foram testadas em aortas com endotélio.
A fração hexânica (Fr. Hex) não alterou significativamente o tônus vascular. A
fração em diclorometano (Fr. CH2Cl2) provocou um intenso e significativo
relaxamento de 77,7 ± 0,9 % na concentração de 100 µg/mL. De forma semelhante,
a fração em acetato de etila (Fr. AcOEt) provocou intenso relaxamento dos anéis
aórticos a partir da concentração de 10 μg/mL. Com 30 μg/mL foi observado
relaxamento de 79,1 ± 5,0 %. A fração butanólica (Fr. BuOH) também provocou
relaxamento vascular, sendo este significativo a partir da concentração de 3 μg/mL.
Na concentração de 30 μg/mL, foi observado relaxamento de até 85,2 ± 1,3 %
(Figura 13).
48
Figura 13: Efeito vasodilatador das frações hexânica (FrHex), em diclorometano (Fr
CH2Cl2), em acetato de etila (Fr AcOEt) e butanólica (Fr BuOH) do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea em anéis de aorta com endotélio em A, B, C e D, respectivamente. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5-7 experimentos. *P<0,05 comparado com controle.
A tabela 2 mostra as CI50 do extrato bruto e suas frações, onde observa-se
que as frações em diclorometano e em acetato de etila foram menos potentes que o
extrato, enquanto a fração butanólica foi a mais potente entre as frações e também
mais potente que o extrato. Sendo assim, a fração butanólica foi selecionada para os
demais experimentos, com o objetivo identificar as prováveis substâncias
responsáveis pelo efeito vasodilatador do EKM.
1 10 100
0
20
40
60
80
100
*
*
Fr. AcOEt (g/mL)
% R
ela
xam
en
to
1 10 100
0
20
40
60
80
100
** *
*
Fr. CH2Cl2 (g/mL)
% R
ela
xam
en
to
A B
C D
1 10 100
0
20
40
60
80
100
Fr hex (g/ml)
% R
ela
xam
en
to
1 10 100
0
20
40
60
80
100
* ** *
Fr BuOH (g/ml)
% R
ela
xam
en
to
49
Tabela 2. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) e frações
Amostra CI50 (µg/mL)
EKM 3,2 ± 0,5*
Fr. Hex -
Fr. CH2Cl2 67,3 ± 0,7*
Fr. AcOEt 11,3 ± 2,3*
Fr. BuOH 1,7 ± 0,4
*P<0,05, comparado a Fr BuOH
Considerando os resultados obtidos para as frações nos ensaios de atividade
vasodilatadora, a fração butanólica (Fr. BuOH) foi selecionada como a mais
promissora para o prosseguimento do estudo.
O fracionamento da fração butanólica resultou na obtenção de 5 subfrações,
sendo que 3 delas foram avaliadas. As subfrações 3 e 5 não foram testadas por
dificuldades de solubilização. Na concentração de 30 µg/mL, as subfrações 1, 2 e 4
provocaram relaxamento de 85,6 ± 0,7 %, 98,2 ± 1,8 % e 36,5 ± 6,0 %,
respectivamente (Figura 14).
50
C Figura 14: Efeito vasodilatador das subfrações (Subfr.) 1, 2 e 4 da fração butanólica (Fr. BuOH) do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea em anéis de aorta com endotélio em A, B e C, respectivamente. Os dados representam a média ± E.P.M. de 2-6 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle.
As CI50 das subfrações foram obtidas e foi possível observar a equivalência
de potências entre a Fr BuOH e a subfração 2 (Tabela 3).
1 10 100
0
20
40
60
80
100 Subfr. 1
Fr. BuOH
g/mL
% R
ela
xa
me
nto
1 10 100
0
20
40
60
80
100 Subfr. 2
Fr. BuOH
g/mL
% R
ela
xam
en
to
1 10 100
0
20
40
60
80
100 Subfr. 4
*
*
*
Fr. BuOH
g/mL
% R
ela
xa
me
nto
A B
51
Tabela 3. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de folhas de K.
membranacea (EKM), da fração butanólica (Fr. BuOH) e suas subfrações.
Amostra CI50 (µg/mL)
EKM 3,2 ± 0,5*
Fr. BuOH 1,7 ±0,4
Subfraçao 1 6,3 ± 1,7*
Subfração 2 1,9 ± 0,3
Subfração 4 -
*P<0,05, comparado a Subfração 2
A análise por métodos espectrométricos da subfração 2 da fração butanólica
resultou na obtenção e identificação de 4 constituintes majoritários, a orientina,
isoorientina, isovitexina e podocarpusflavona A, todos eles pertencendo a classe dos
flavonoides (Tabela 4; Anexo 1).
Tabela 4. Constituintes majoritários presentes nas subfrações da fração butanólica de K. membranacea
Subfração Constituintes Majoritários
1 isoorientinaa, orientinaa, isovitexinaa, luteolina-O-glicuronídeob, metoxi
luteolina-C-glicuronídeoc
2 isoorientinaa, orientinaa, isovitexinaa, podocarpusflavona Ab
3 amentoflavonab, podocarpusflavona Ab
4 amentoflavonab, podocarpusflavona Ab
5 podocarpusflavona Ab aProposta estrutural com base no espectro de massas modo full ms e pelo espectro ms2 do ion molecular. bProposta estrutural com base no espectro de massas modo full ms. cflavonoide não identificado completamente.
52
6. DISCUSSÂO
A disfunção endotelial está envolvida tanto no desenvolvimento como na
progressão das DCVs (GILES et al., 2012; SU et al., 2015). Baseado nessas
evidências, a descoberta de novos produtos bioativos que possam atenuar e/ou
prevenir as alterações vasculares relacionadas às DCVs torna-se de extrema
importância. Neste trabalho foram investigados os efeitos vasculares de produtos
bioativos obtidos da espécie K. membranacea, uma espécie endêmica no Brasil.
6.1. Efeito vasodilatador do EKM
Diversos estudos relatam a atividade vasodilatadora provocada por produtos
naturais, incluindo diversas espécies vegetais, podendo ser este efeito, dependente
ou não de fatores derivados do endotélio vascular.
O efeito vasodilatador provocado pelo EKM é dependente da liberação dos
fatores vasodilatadores endoteliais, tendo em vista que a resposta vasodilatadora foi
observada em anéis de aorta com endotélio e inexistente em anéis de aorta sem
endotélio. Em experimentos realizados com L-NAME e ODQ (inibidores da eNOS e
GCs, respectivamente), o efeito do EKM foi completamente inibido, indicando que a
ação vasodilatadora se deve a liberação de NO, principal fator vasodilatador liberado
pelo endotélio.
A maior parte dos produtos bioativos vegetais com atividade vasodilatadora
dependente do endotélio exerce seu efeito vasorelaxante através da via NO/GMPc
(LUNA-VÁZQUEZ et al., 2013; McNEILL e JURGENS, 2006). Assim como o EKM, a
brasilina, um homoisoflavonoide obtido da Caesalpina sappan, induz a ativação da
eNOS, sendo seu efeito inibido com o pré tratamento com L-NAME (HU et al., 2003).
PARK e colaboradores (2015) mostraram o efeito vasodilatador dependente do
endotélio provocado pelo extrato etanólico de Camellia japonica, com aumento da
concentração de GMPc em aortas intactas e redução do efeito e da concentração de
GMPc em aortas onde a eNOS foi inibida. Resultados semelhantes foram obtidos
para o extrato das folhas de Apocynum venetum (LAU et al., 2015).
O NO promove vasodilatação através da ativação da GCs, que por sua vez
aumenta os níveis de GMPc com posterior ativação da PKG, proteína responsável
pela diminuição da [Ca2+]i, além de poder também ativar os canais de K+, o que gera
53
hiperpolarização da membrana celular levando a vasodilatação (VANHOUTTE,
2001; CARVALHO et al., 2001).
A ativação da eNOS ocorre principalmente devido ao aumento da [Ca2+]i e
ligação do complexo Ca2+/calmodulina à enzima, como ocorre após a ativação de
receptores muscarínicos, de bradicinina e de histamina. No entanto, a fosforilação
da eNOS em determinados resíduos de aminoácidos também pode levar a ativação
da enzima, como devido à ativação de receptores de insulina e de estrogênio
(FÖSTERMANN e SESSA, 2012).
Com o intuito de identificar os receptores envolvidos na ativação da produção
endotelial de NO, anéis de aorta com endotélios foram pré-tratados com
antagonistas de diversos receptores endoteliais. Na presença da atropina não houve
alteração significativa na curva concentração-resposta do EKM, sugerindo assim a
ausência da participação dos receptores M3 para o efeito vasodilatador do extrato.
Por outro lado, ao pré-tratar os anéis aórticos com HOE140, houve uma pequena
inibição da vasodilatação provocada pelo EKM, sugerindo um envolvimento parcial
dos receptores de bradicinina B2 no mecanismo de ação do EKM. A bradicinina é um
dos agonistas da eNOS melhores caracterizados e os receptores B2 são
amplamente distribuídos no endotélio vascular de mamíferos (DUDZINSKI et al.,
2006). Estes receptores são acoplados a proteína Gq e medeiam a ativação da
eNOS principalmente através do aumento da [Ca2+]i, porém também podem induzir a
fosforilação da eNOS no resíduo Ser1177 mediada pela CAMKII (FÖSTERMANN e
SESSA, 2012).
Na presença de wortmannin, o efeito do EKM foi completamente inibido,
indicando que a via PI3K/Akt tem um papel crucial na ativação da eNOS provocada
pelo extrato. A via PI3K/Akt é uma importante via de sinalização envolvida no
controle do tônus vascular que tem sido proposta para a ação de substâncias
oriundas de produtos naturais (LUNA-VÁSQUEZ et al., 2003; LAU et al., 2015).
Como exemplo, o efeito vasodilatador provovado pela epigalocatequina-3-galato, a
catequina mais abundante encontrada em Camellia sinensis, foi significativamente
reduzido quando utilizado o bloqueador wortmannin, sugerindo assim que esta
substância ativa a via NO/GMPc pela indução da fosforilação da eNOS (ROMANO e
LOGRANO, 2009).
Há um papel especial dos receptores de estrogênio no efeito vasodilatador de
substâncias fenólicas, onde a ativação desses receptores leva a produção de NO
54
através da via PI3K/Akt (TANG et al., 2015). O tratamento das células endoteliais
com concentrações nanomolares de resveratrol leva a uma rápida fosforilação do
resíduo Ser1177, aumentando a atividade enzimática da eNOS e, este efeito é
observado nas células endoteliais humanas através da ativação do receptor ERα (LI
e FÖSTERMANN, 2009). Em adição, a delfinidina, um polifenol encontrado no vinho
tinto, e a isoflavona, são também substâncias que ativam o receptor ERα e
promovem o aumento da expressão e da atividade da eNOS (CHAPOLIN et al.,
2010; RÄTHEL et al., 2009). O receptor ERα também está envolvido na atividade
vasodilatadora do EKM, uma vez que na presença de fulvestrant o efeito do extrato
foi significativamente inibido.
Desta forma, até o momento é possível dizer que o efeito vasodilatador do
EKM é mediado pela ativação de receptores B2 e de receptores ERα. No entanto,
como o wortimannin inibiu completamente o efeito do EKM, pode ser que outro
receptor que ative a via PI3K/Akt esteja envolvido na ação vascular do extrato.
6.2. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina
O pré-tratamento de anéis de aorta com EKM modificou a reatividade vascular
à fenilefrina e à acetilcolina. A resposta vasoconstritora foi reduzida na presença de
EKM somente em aortas com endotélio, indicando que o efeito do extrato é
dependente do endotélio. Ainda, em aortas com endotélio pré-tratadas com L-
NAME, o efeito do EKM foi inibido, indicando que a resposta vasoconstritora à
fenilefrina é reduzida devido a ativação da produção endotelial de NO induzida pelo
extrato. Estes resultados corroboram os demais experimentos que mostraram que o
efeito vasodilatador do EKM ocorre através da ativação da via NO/GMPc.
Em relação à reatividade à acetilcolina, o EKM provocou um discreto
deslocamento para esquerda da curva concentração-resposta para acetilcolina, sem
alterar o relaxamento máximo. Este efeito pode ser decorrente do aumento da
produção de NO induzido pelo extrato ou também estar relacionado a um aumento
da biodisponibilidade do NO, uma vez que DUTRA e colaboradores (2012)
mostraram que o EKM apresenta atividade antioxidante utilizando-se o método de
DPPH. AMEER e colaboradores (2010) demonstraram que extratos derivados de
plantas podem provocar o deslocamento da curva concentração-resposta da
55
acetilcolina para a esquerda como resultado do aumento da meia-vida do NO devido
a redução da sua inativação.
6.3. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na
presença de alterações vasculares induzidas por glicose
Há uma clara relação entre o DM e doenças micro e macrovasculares, sendo
o estado hiperglicêmico sustentado um fator de risco importante para a disfunção
endotelial (SHI e VANHOUTTE, 2017; ZHOU et al., 2011). A incubação dos anéis de
aorta em meio com alta concentração de glicose resultou em um aumento da
contração máxima induzida pela fenilefrina e redução do relaxamento máximo
induzido pela acetilcolina.
A literatura mostra resultados divergentes sobre os efeitos da glicose na
contração vascular induzida pela fenilefrina. Já foi mostrado que em vasos isolados
de animais com diabetes induzida por estreptozotocina a reatividade à fenilefrina
estava aumentada (TOPAL et al., 2013), em aortas incubadas por 3 h com 44 mM
de glicose foi observada redução da resposta contrátil a fenilefrina (EL-AWADY et
al., 2014), e em aortas incubadas por 6 h com 55 mM de glicose não foi observada
alteração da resposta à fenilefrina (WU et al., 2015).
De forma similar ao observado neste trabalho, já foi mostrado que a
exposição a altas concentrações de glicose leva a redução da resposta
vasodilatadora à acetilcolina devido a disfunção endotelial. Esta disfunção está
associada a alterações morfológicas dos vasos, redução dos níveis de SOD e GSH,
aumento da atividade da NADPH oxidase, peroxidação lipídica e redução da
atividade da eNOS (WU et al., 2015; EL-AWADY et al., 2014; DHAR et al., 2010).
O EKM normalizou a reatividade à fenilefrina e restaurou parcialmente a
reatividade à acetilcolina. Uma vez que a disfunção endotelial no DM está
relacionada ao estado de estresse oxidativo (SHI e VANHOUTTE, 2017), o efeito
restaurador do EKM pode ser devido à sua propriedade antioxidante (DUTRA et al.,
2012). Resultados semelhantes já foram observados com outros produtos naturais
como o própolis (EL-AWADY et al., 2014) e o estilbeno glicosilado polidatina, uma
das principais substâncias ativas extraídas da Polygonum cuspidatum (WU et al.,
2015).
56
6.4. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na
presença de alterações vasculares induzidas por estresse oxidativo
A literatura mostra que o estresse oxidativo está envolvido na fisiopatologia
das DCVs e do DM e desempenha um papel importante na disfunção endotelial (SHI
e VANHOUTTE, 2017; BARADARAN et al., 2014; COHEN & TONG, 2010; HIGASHI
et al., 2009).
Foram realizados experimentos onde o dano vascular foi induzido com
pirogalol, o qual rapidamente se auto-oxida em meio aquoso contendo O2 formando
O2-. Este radical rapidamente reage com o NO para formar ONOO-, que por sua vez
causa o desacoplamento da eNOS através da oxidação do seu cofator BH4, levando
a produção de O2- ao invés de NO (QIAN et al., 2012). Na presença de pirogalol, a
resposta contrátil à fenilefrina foi aumentada e a resposta vasodilatadora à
acetilcolina foi reduzida, como mostrado em outros trabalhos (ALI & WOODMAN,
2015; QIAN et al., 2012; DHAR et al., 2010).
O pré-tratamento com EKM normalizou a reatividade à fenilefrina, o que pode
estar relacionado à atividade antioxidante do EKM, assim como à ativação da
produção de NO induzida pelo EKM. No entanto, o extrato não foi capaz de restaurar
a vasodilatação dependente do endotélio induzida pela acetilcolina, o que indica que
o EKM, provavelmente, não é capaz sequestrar o O2- produzido pela oxidação do
pirogalol.
6.5. Efeitos das frações e subfrações do EKM no músculo liso vascular
Os resultados obtidos com a avaliação do efeito vasodilatador das frações do
EKM mostraram que substâncias presentes principalmente nas frações butanólica e
em acetato de etila são responsáveis pelo efeito vasodilatador do EKM. Ainda, a
fração butanólica foi a mais potente entre as frações e também mais potente que o
extrato.
Os solventes utilizados na partição líquido-líquido do EKM extraem diversas
substâncias e esta extração baseia-se na polaridade das mesmas. As substâncias
preferencialmente extraídas pelo solvente butanol são flavonoides glicosilados,
saponinas e taninos, enquanto o solvente acetato de etila extrai, preferencialmente,
57
flavonoides, taninos, xantonas, ácidos triterpênicos, saponinas e cumarinas simples
(FILHO e YUNES, 1997; SIMÕES et al., 2010).
As subfrações 1 e 2 da fração butanólica provocaram relaxamento vascular
semelhante ao obtido com o EKM e com a fração butanólica, enquanto o
relaxamento provocado pela subfração 4 foi significativamente menor e seu efeito
vasodilatador máximo não ultrapassou 50%.
A avaliação fitoquímica da subfração 2 da fração butanólica resultou na
identificação dos flavonoides orientina, isoorientina, isovitexina e podocarpusflavona
A (Figura 15). Estes flavonoides também foram identificados na subfração 1.
A B
C D
Figura 15: Estrutura química das substâncias isoladas da subfração 2 da fração butanólica: orientina, isoorientina, vitexina e podocarposflavona A em A, B, C e D, respectivamente.
O potencial farmacológico dos flavonoides para prevenção e tratamento das
DCVs é bastante descrito na literatura. Atividade antioxidante, ativação das vias
NO/GMPc e PGI2/AMPc, ativação dos canais de K+ e bloqueio dos canais de Ca+2
tipo L são mecanismos de ação descritos na literatura para os efeitos vasculares dos
flavonoides (AHMAD et al., 2013; VÁZQUEZ et al., 2013). Além disso, os flavonoides
são um dos únicos constituintes químicos que podem ser extraídos de hastes, folhas
58
e flores de diversas espécies de vegetais, os quais apresentam um grande espectro
de atividades biológicas, apresentando uma baixa toxidez (AN et al., 2016).
A orientina é um flavonóide C-glicosilado solúvel em água, podendo ser
extraída de diversas espécies vegetais. Entre as suas principais atividades
biológicas destacam-se as atividades antioxidante, vasodilatadora e cardioprotetora
(LAM et al., 2016). Os níveis de catalase, glutationa peroxidase e SOD estão
aumentados quando camundongos são tratados com orientina (LAM et al., 2016).
Além disso, em um estudo realizado por FU e colaboradores (2005), foi
demonstrado que a resposta vasodilatadora à orientina em aortas isoladas de
coelhos envolve a ativação da via NO/GMPc. A orientina apresenta efeito
cardioprotetor através do aumento da atividade antioxidante endógena e da redução
da agregação plaquetária induzida por ácido araquidônico em coelhos (FU et al.,
2007). Acredita-se que esses efeitos cardioprotetores da orientina estejam, em
parte, associados à via de sinalização da via PI3K/Akt (LAM et al., 2016).
A isoorientina, por sua vez, destaca-se por suas atividades antimicrobiana e
hepatoprotetora (CHELYN et al., 2014) e sua ação no sistema cardiovascular ainda
permanece pouco estudada. ALMEIDA e colaboradores (2006) demonstraram um
discreto relaxamento vascular em aortas isoladas de ratos, enquanto em aortas
isoladas de coelhos não foi observado efeito significativo (FU et al., 2005).
A isovitexina apresenta efeito antioxidante, mediado principalmente através
do aumento da concentração de glutationa e de SOD (LV et al., 2016; MÜLLER et
al., 2016). Em concentrações entre 0,1 e 30 µM, a isovitexina não provocou
relaxamento em aortas de coelhos (FU et al., 2005). A vitexina, isômero da
isovitexina, apresenta efeito vasodilatador em aortas isoladas de ratos de forma
dependente do vasoconstritor utilizado. Em anéis de aorta pré-contraídos com
fenilefrina a vitexina não apresentou atividade vasodilatadora (KIM et al., 2000),
enquanto em aortas pré-contraídas com forbol, um ativador da quinase ativadora da
proteína quinase ativada por mitógeno (MEK), a vitexina provocou relaxamento
vascular independente do endotélio (JE et al., 2014). No entanto, em aortas isoladas
de coelhos, a vitexina não apresentou efeito vasodilatador (FU et al., 2005).
Por fim, a podocarpusflavona A já foi identificada na espécie vegetal
Kielmeyera variabilis e possui atividade antioxidante (COQUEIRO et al., 2013).
Assim como na K. membranacea, essa substância pode ser encontrada na fração
59
butanólica das folhas da K. variabilis, justificando a atividade antioxidante exibida
pelo EKM.
Tendo em vista a presença apenas de amentoflavona e podocarpusflavona A
como constituintes majoritários nas subfrações 3 e 4, espera-se um efeito
vasodilatador para subfração 3 semelhante ao observado para subfração 4.
Diferente da podocarpusflavona A, que ainda não possui efeito vasodilatador
descrito na literatura, a amentoflavona apresenta atividade vasodilatadora
dependente da via NO/GMPc em aortas isoladas de ratos (KANG et al., 2004). A
subfração 5, por sua vez, possui como constituinte majoritário apenas a
podocarpusflavona A, a qual ainda precisa ser estudada.
Portanto, para determinar todos os metabólitos secundários envolvidos no
efeito vasodilatador do EKM novos estudos ainda precisam ser realizados, como a
avaliação dos efeitos vasculares das substâncias isoladas.
60
7. CONCLUSÕES
O EKM provoca intensa vasodilatação dependente do endotélio em anéis de
aorta pré-contraídos com fenilefrina;
O mecanismo de ação do EKM envolve a ativação da eNOS a partir da
ativação da via PI3K/Akt;
A ativação dos receptores endoteliais de bradicinina B2 e de estrogênio ERα
está envolvida no mecanismo de ação do EKM;
O EKM normalizou a reatividade à fenilefrina e reverteu parcialmente a
disfunção endotelial em aortas com disfunção vascular induzida por alta
concentração de glicose;
O EKM normalizou somente a reatividade à fenilefrina em aortas com disfunção
vascular induzida por estresse oxidativo;
A fração butanólica foi a mais potente vasodilatadora entre as frações obtidas
do EKM;
Entre os flavonoides já identificados na fração butanólica, a orientina parece
ser a principal responsável pelo efeito vasodilatador;
Novos estudos ainda são necessários para determinar os metabólitos
secundários responsáveis pelas atividades vasodilatadora e restauradora da
disfunção vascular exibidas pelo EKM.
61
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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73
ANEXO
Figura 1. Cromatograma da subfração 2 da fração butanólica de K. membranacea
Tabela 1. Perfil de fragmentação dos flavonoides presentes na subfração 2 da fração butanólica de K. membranacea. Análise por Cromatografia líquida de alta eficiência-espectroscopia de massa (CLAE-EM).
Flavonoides Tempo de
retenção (min)
Peso
Molecular
m/z
[M+H]
Luteolina 6-C-glicosídeo
(isoorientina) 5,67 448 449
Luteolina 8-C-glicosídeo
(orientina) 6,07 448 449
Apigenina 6-C-
glicosídeo (isovitexina) 7,01 432 433
Podocarpusflavona A 12,76 552 553
RT: 0,00 - 35,00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time (min)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
uA
U
5,67
7,01
6,0731,37
12,760,73 8,708,81 11,310,88 30,1913,02 20,39 21,5319,2213,91 22,5318,76 23,7415,195,36 25,06 26,644,603,842,68
NL:1,30E4
UV_VIS_3 UV 3 FR2_FRBUOH
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