Validação de Métodos Bioanalíticos
Curso de Farmacologia Clínica
Universidade Mogi das Cruzes
Abril 2004
Nas últimas décadas, houve um aumento de
métodos bioanalíticos aplicados à cromatografia
para a determinação qualitativa e quantitativa de
fármacos, produtos acabados, matérias primas e
amostras biológicas, em todas as fases do desen-
volvimento do fármaco desde a pesquisa até a rea-
lização de estudos de bioequivalência.
Assim, devido este aumento e a globalização
da economia, a adoção de um sistema de qualida-
de reconhecido universalmente aceito, é requisito
fundamental.
Portanto, o entendimento do que constituí
uma validação de métodos cromatográficos, possi-
bilita a garantia de um nível satisfatório de qualida-
de na validação metodológica (Massart et al., 1998;
Swartz & Krull, 1998).
Desde o final dos anos 80, a importância da
validação de métodos bioanalíticos e suas influên-
cias na avaliação e interpretação dos resultados,
transformou-se em alvo de amplas discussões pre-
sentes em diversas Conferências tanto nos EUA
quanto na Europa e consequentemente fornecer
adequadas diretrizes em relação aos parâmetros
exigidos na validação analítica (Shan et al., 1991 e
1992; Dadgar, 1995; Cartwright et al., 1991 e Arnoux
& Morrison, 1992) .
A correta avaliação dos Estudos Biofarma-
cêuticos só pode ser alcançada se a exatidão dos
dados analíticos forem obtidos (Pachla et al.,1986).
Além disso, essa exatidão depende de crité-
rios fundamentais empregados, não só em relação
à adequada interpretação desses resultados, como
também na aplicação da confiabilidade e na totali-
dade do desempenho do método bioanalitico.
Assim, podemos destacar os principais critérios
fundamentais empregados na validação de métodos
bioanalíticos:
Avaliação da droga e estabilidade do analito .
Seletividade/Especificidade.
Linearidade e modelo de calibração.
Precisão e Exatidão.
Sensibilidade, Limite de Quantificação e Detecção
Recuperação
* Pachla et al., 1986; Buick et al., 1990; MacDouglas e Crummett, 1980; Taylor, 1983;
Brooks e Weinfeld,1985; Dadgar e Smith, 1986; Inman et al., 1987 e Shan et al., 1987.
Modernos métodos bioanalíticos são funda-
mentados em relação a uma variedade de técnicas
físicoquímicas e biológicas á saber:
• Métodos Químicos: Cromatografia (CG, HPLC) e
uma variedade de processos utilizando métodos
de espectrometria de massa (MS) tais como MS-
MS e combinações de técnicas tais como CG-
MS,LC-MS.
• Métodos Biológicos: baseados em procedimen-
tos de imunoensaios; em particular o Radioimu-
noensaio (RIA), imunoensaio de múltiplas enzi-
mas (EMIT) e ensaio de imunoabsorção de enzi-
mas ligadas (ELISA).
• Métodos microbiológicos
Tais métodos analíticos devem ser cuidado-
samente pré- validados na fase de desenvolvimento
e também validados durante o ensaio analítico, para
garantir que os mesmos sejam satisfatoriamente
realizados e que a confirmação das especificações
pré-determinadas seja encontrada; além disso,
gerar confiabilidade nos resultados obtidos (Buick
et al., 1990; Jackson, J. A; 1994; Shan et al., 1992).
Para tanto, os mesmos envolvem
procedimen-
tos de determinação e quantificação de moléculas
orgânicas com amplas propriedades físico- quími-
cas, onde cada composto deve ser avaliado de acor-
do com as suas propriedades individuais e também
levando em consideração a complexidade analítica e
as concentrações almejadas (Jackson, J. A 1994).
Seleção e Desenvolvimento
Pode-se considerar que a etapa crítica no Es-
tudo Biofarmacêutico é o desenvolvimento e valida-
ção de ensaios bio-analíticos, que consistem de
experimentos realizados para encontrar condições
necessárias para a quantificação do analito em
questão.
Isto requer conhecimentos das propriedades
físico-químicas da droga para que o processo de
desenvolvimento seja racional e individualizado.
Assim, todos os critérios envolvidos no desen-
volvimento analítico deverão ser registrados em
relatórios de acompanhamento analítico (Snyder,
1988; Jackson, J.A 1994).
Padrões
• Análise de Drogas ou seus Metabólitos é invariávelmete feita através de amostras “contaminadas”, curvas de calibração e amostras de controle de qualidade (QC).
• Padrões de Referência autenticados devem ser utilizados no estudo. Preferivelmente o mesmo composto.
• Caso contrário um sal, base, ácido ou éster do composto pode ser usado.
Escolha da Procedência:
• Padrões certificados (U.S.Pharmacopea)
• Padrões disponíveis comercialmente de fontes de conhecida reputação.
• Padrões com pureza documentada, específicamente sintetízados por laboratórios comerciais.
Deflazacort (DFZ) 21-Hydroxy DFZ (21-OH DFZ)
21-Acetate Dexamethazone (21-Ac DXM, I.S.)
O
HO
H H
H O
NO
OH
O
HO
H H
H O
NO
O
O
O
HO
F H
H
OHO
O
O
A realização de uma pesquisa bibliográfica é
a primeira etapa para a busca do método bioanalíti-
co. Uma vez existindo o método, ele deverá ser tes-
tado quanto a sua reprodutibilidade.
Na inexistênciade um método bioanalítico para
um determinado fármaco, o centro analítico deve
desenvolver um método que responda satisfatória-
mente ao estudo desejado..
Para a aplicação deste fato, consideram-se os
seguintes tipos de validação:
Validação Total
Validação total é de importância no desen-
volvimento e implementação de um método quando
aplicado pela primeira vez ou quando for utilizado
para determinar um novo analito nesta mesma
condição analítica.
Validação Parcial
Validações parciais são modificações do
método já validado. Uma validação parcial pode
compreender desde uma pequena determinação de
precisão/exatidão a até quase uma validação total.
No desenvolvimento de um método é nece-
ssário verificar toda a metodologia de preparação
da amostra, a qual envolve os processos de extra-
ção, separação, purificação, identificação e quanti-
ficação do fármaco na matriz biológica.
Para tanto, podemos dizer que nesta fase,
temos duas etapas distintas á saber:
• Pré-Validação
• Objetivo: Avaliar os parâmetros de desempenho do método.
• Deve ser realizado para cada matriz biológica e cada espécie
química estudada.
• Deve ser realizado com pelo menos 3 lotes da matriz biológica,
onde cada lote é coletado de uma fonte diferente.
• Cada lote deve conter:
– Uma curva de calibração utilizando a matriz pura,
matriz + I.S. e 5 a 8 pontos com a faixa de
aplicação do método.
– Amostras de Controle (n 5) de Qualidade de
Baixa concentração (QCA) Média concentração e
(QCB) Alta concentração (QCC) e Limite de
Detecção (LOQ QC).
Nesta fase consiste na realização de alguns
ensaios preliminares visando à determinação dos
seguintes parâmetros:
Exatidão, precisão e recuperação;
Linearidade e limites de quantificação;
Seletividade.
• Validação do Método
É a fase propriamente dita do
desenvolvimen-
to e estabelecimento da metodologia com o objeti-
vo de definir o ensaio bioanalítico.
Neste caso, a padronização de um método
bio-analítico típico inclui a determinação dos se-
guintes parâmetros fundamentais á saber:
Especificidade e Seletividade;
Linearidade;
Precisão e Exatidão;
Sensibilidade, Limite de quantificação e
detecção;
Recuperação;
Estabilidade ;
Protocolo do Ensaio Bioanalítico
Uma vez que o método bioanalítico foi desen-
volvido e totalmente validado, um manual de proce-
dimentos operacionais padronizados (POPs) para o
mesmo deve ser documentado.
Portanto, todas as análises do método em
questão devem ser submetidas conforme procedi-
mentos do respectivo POP.
Alterações podem afetar significativamente
resultados finais como por exemplo, a substituição
por um outro tipo de coluna, uma mudança signifi-
cativa no comprimento de onda durante as análises
e ou mudança no procedimento de extração, requer,
no mínimo, revalidação parcial do método analítico.
As amostras biológicas dos voluntários a
serem investigadas são processadas preferencial-
mente em duplicata e totalmente “randomizadas” e
podem estar compreendidas em:
• Uma única lista
• Em série de listas analíticas
Importante que a análise de amostra bioló-
gica de um voluntário esteja compreendida em uma
única corrida analítica com a finalidadede minimizar
efeitos da variabilidade do inter-ensaio (Dighe e
Adams, 1991).
Uma Lista analítica é constituída por * :
– Amostras analíticas em duplicata a ser
determinadas.
– Uma curva de calibração em duplicata utilizando
a matriz pura, matriz + I.S. e 5 a 8 pontos
correspondendo faixa de aplicação do método.
* Shan et al., 1992; Jackson, J.A 1994
– Amostras de Controle (n 5) de Qualidade de
Baixa concentração (QCA) Média concentração e
(QCB) Alta concentração (QCC) dispostos em
intervalos para monitorar o desempenho
analítico.
Parâmetros da Validação Bioanalítica
Especificidade - Seletividade
A especificidade de um método é definida
quando o mesmo produz uma única resposta analí-
tica para um único analito.
Já a seletividade é definida como a
habilidade
de uma técnica analítica em distinguir e quantificar,
ou não, uma droga em relação a outras resposta de
diferentes componentes presentes nos fluidos bio-
lógicos.
Assim, uma vez que as técnicas
cromatográ-
ficas produzam respostas que possam ser distin-
guidas das demais resultantes dos diferentes inter-
ferentes presentes na matriz biológica; o termo se-
letivo é usualmente aplicado como parâmetro, na
validação dos métodos bioanalíticos (Karnes et al.,
1991; Dadgar e Brunett, 1995).
Diversos interferentes podem surgir
durante
o desenvolvimento de um método analítico, á saber:
• Endógenos: compreende um amplo número de
compostos orgânicos de alto e baixo peso
molecular (hormônios, lipídeos, proteínas, etc.),
metabólitos de fármacos, precursores, produtos
de degradação do analito, co-administração de
fármacos e vitaminas.
• Exógenos: impurezas presentes nos reagentes
empregados no processamento das amostras
analíticas, componentes utilizados na manufatura
dos recipientes de acondicionamento e ou uma
incompleta lavagem dos mesmos (Buick et al.,
1990; Dadgar et al., 1995).
• Análise da especificidade e seletividade
emprega-sede no mínimo seis fontes de
amostras de matriz biológica branco obtida sob
controladas condições, avaliando-se o horário da
coleta, ingestão de alimentos, e outros fatores
considerados importantes ao método.
• Cada “branco” deve ser avaliado em relação a
interferentes, utilizando-se o método de extração
proposto e as condições analíticas em questão
(HPLC, LC/MS/MS).
• Os resultados são confrontados com os obtidos
de uma solução aquosa do analíto em
concentrações ao Limite de Quantificação (LOQ).
• Qualquer interferência significativa no tempo de
retenção da droga, do metabólitos ou do padrão
interno (I.S.) deve ser rejeitado (Shan et al., 1992;
ISO/DIS 5725-1 - 5725-3, 1994).
• Interferência em mais que 20% em relação a
concentração do LOQ, o método deve ser alterado
para eliminar os interferentes (Causey et al., 1995;
Doing et al., 1990 e Dadgar et al., 1995).
• Nicotina, drogas OTC e seus metabólitos, como
cafeína, aspirina, acetoaminofen e ibuprofeno
devem ser testados.
• Se mais de um analíto é avaliado, cada um deve
ser injetado separadamente.
Blank SampleI.S.
21-OH DFZ
21-OH DFZ (1ng/mL) + I.S. I.S.
21-OH DFZ
Linearidade*
É considerada como a habilidade de se obter
resultados diretamente proporcionais à concentra-
ção do analito na amostra.
*International Conference of Harmonization - ICH, Guideline
for Validation of Analytical Procedure Methodology, 1996;
Comissionof European Communities – Comittee for Proprie-
tary Medicinal Products 111/5626/94 final draft, 1994; Buick et
al., 1990.
A avaliação da curva de calibração, recomen-
rdam o uso:
• 5 a 8 determinações que correspondem ao intervalo
entre o valor superior e inferior da substância em exame,
que atendam aos requisitos de precisão, exatidão e
linearidade.
Pennickx et al., 1996; Shan et al., 1992; Hill et al., 1992; Metha, 1898; Massart et al., 1998 e Hartmann et al., 1998.
Quatro fatores devem ser empregados no
desenvolvimento da curva de calibração:
• Precisão e exatidão menor ou igual a 15% nas
determinações nominais da curva de calibração,
exceto para as concentrações do LOQ.
• Precisão e exatidão menor ou igual a 20% nas
determinações nominais do LOQ.
• Pelo menos quatro das seis concentrações
nominais devem estar de acordo com critérios
acima mencionados, incluindo os pontos do LOQ
e os pontos de calibração de menor concentra-
ção.
• Valor de coeficiente de correlação linear ou igual
ou maior que 0.95.
21-OH DFZ
0 100 200 300 4000
100
200
300
400
500
Concentração Teórica (ng/mL)
Co
nce
ntr
açã
o E
xpe
rim
en
tal
(ng
/mL)
r>0.999
21-Hydroxy DFZ (21-OH DFZ)
O
HO
H H
H O
NO
OH
21-Acetate Dexamethazone (21-Ac DXM, I.S.)
O
HO
F H
H
OHO
O
O
100ng/mL
20ng/mL
100L
Razão: 5
O Padrão Interno (I.S.) tem como finalidade corrigir erros e\ou
perdaspor transferências e pipetagem. Uma vez
quesua concentração é conhecida podemos
corrigir a concentração do analito
desassociando o volume.
Voluntário 08 - 1:30h após administração
I.S.
21-OH DFZ
Precisão e Exatidão
Exatidão RuimPrecisão Boa
Exatidão BoaPrecisão Boa
Exatidão RuimPrecisão Ruim
Exatidão BoaPrecisão Ruim
Precisão
É definida como grau de concordância entre
os resultados de análises individuais,quando o pro-
cedimento analítico é aplicado em diversas vezes
em uma mesma amostra analítica, em idênticas
condições experimentais.
Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Causon, R. 1997 e
Brittain, 1998.
Além disso, é expressa como a porcentagem
do coeficiente de variação (C.V) ou o desvio padrão
relativo da média geométrica dos valores das repli-
catas de cada determinação nominal :
Precisão =% CV = (dp/média) x 100
dp = nc2- (c)2 : n (n-1)
Onde:
CV = coeficiente de variação
dp = desvio padrão
n = número de dados
c= concentração calculada
* De acordo com a ICH de 1996 a precisão pode ser medida em dois diferentes níveis :
• Repetibilidade (Precisão intra-ensaio): é definida
como a habilidade de repetições de uma
metodologia empregada nas mesmas condições
laboratoriais, da utilização do mesmo corpo de
analistas, dos mesmos equipamentos e dos
mesmos reagentes analíticos em um curto
intervalo de tempo, considerando a realização do
ensaio analítico em um único dia .
* Relatório final da ISO (International Organization for Standardiza- tion, 1990/1991), Swartz e Kull ,1998; Hartmann et al., 1994; Causon, R. 1997; Shan et al., 1992; Buick et al.,1990
• Reprodutibilidade (Precisão inter-ensaio): é definida
como a habilidade de repetições da mesma
metodologia analítica aplicada sob diferentes
condições laboratoriais como, por exemplo,
mudanças de analistas, reagentes e equipamentos
em subsequentes ocasiões que podem
compreender várias semanas ou até meses.
* Shan et al., 1992; USPXX 1990; Brooks, 1985; Hartmann et al, 1994 e Buick et al., 1990.
A avaliação da precisão intra e inter ensaio,
recomendam o uso:
• 5 á 10 determinações em replicata para cada
nível de concentrações nominais pré-
estabelecidas das amostras de controle de
qualidade.
• Emprega-se três níveis de concentração: baixo,
que pode ser o LOQ; médio e alto, que estejam
compreendidos dentro do intervalo de limite
especificado do procedimento analítico.
Exatidão
É definida como o grau de concordância
entre os valores individuais encontrados em rela-
ção aos valores reais ou nominais
* Causon, R. 1997; Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Brittain,
1998 e Mehta, 1989.
Além disso, é expressa como a porcentagem
do erro padrão relativo da média geométrica dos
valores das replicatas de cada determinação nomi-
nal :
% E.R = (V. exp - V. t) / V. t x 100
Onde,
V. exp: Valores Experimentais
V. t: Valores teóricos
Normalmente os ensaios para a exatidão
poderão se realizados:
• Um único dia “ Exatidão Intra-ensaio”
• Dias diferentes “Exatidão Inter-ensaio”
• Emprega-se três níveis de concentração: baixo, que pode ser o LOQ; médio e alto, que estejam compreendidos dentro do intervalo de limite especificado do procedimento analítico.
• 5 á 10 determinações em replicata para cada nível de concentrações nominais pré-estabelecidas das amostras de controle de qualidade.
* Buick et al., 1990 e Shan et al,. 1992 e 2000.
Sensibilidade, Limite de Detecção (LOD), Limitede Quantificação (LOQ)
A metodologia analítica é dito sensível quan-
do pequenas mudanças nos padrões de calibração
podem gerar grandes variações na resposta do ins-
trumento analítico. Portanto, ela está relacionada
com inclinação (“slope”) da curva de calibração.
* IUPAC, 1976;Causon, 1997 e Mehta, 1989
Limite de Detecção representa a mais baixa
concentração do composto de investigação que
pode ser detectada em relação à amostra biológica
branco com certo limite de confiabilidade.
• É estabelecido através de análises de soluções
com concentrações conhecidas e decrescentes do
analito até que o nível detectável seja 2 a 3 vezes
superior ao ruído da linha de base cromatográfica
* Swartz e Krull, 1998; Metha, 1989; Mehta, A.C 1987; Mehta A.C 1989;
Brittain, 1998 e BuicK et al.,1990.
O Limite de Quantificação representa a mais
baixa concentração de um composto de investiga-
ção que atende os requisitos para precisão e exati-
dão do ensaio analítico.
• É estabelecido através da a razão 5:1 entre o sinal
e o ruído da linha de base cromatográfica no
tempo de retenção do analito.
• de 5 a 6 determinações em replicata para cada
nível de concentração pré-estabelecida das
amostras de controle de qualidade do LOQ.
* Swartz e Krull, 1998; Causon, R. 1997 e Buick et al., 1990.
Recuperação
Recuperação de um analíto em um estudo é a
resposta obtida de uma quantidade do analito adi-
cionada e recuperada da matrixbiológica e compa-
rada a resposta obtida do padrão puro.
A recuperação avalia a eficiência da extração
e sua variabilidade. Embora recuperações próximas
de 100% sejam desejáveis, baixas recuperações po-
dem ser utilizadas (50-60%) se forem precisas, exa-
tas e reprodutíveis.
Os experimentos de recuperação devem
ser
realizados comparando-se os resuldatos de amos-
tras extraidas a três concentrações diferentes ( alta,
média e baixa ) com padrões não extraidos que
representam 100%.
Para o estudo da recuperação:
• Emprega-se três níveis de concentração: baixo, que pode ser o LOQ; médio e alto, que estejam compreendidos dentro do intervalo de limite especificado do procedimento analítico.
• 5 á 10 determinações em replicata para cada nível de concentrações nominais pré-estabelecidas das amostras de controle de qualidade.
* Mehta, 1989; Causon, R. 1997 e FDA – Guideline for Industry / Bio-analytical Method Validation final draft ,1998 e 2001
Estabilidade
A Resolução RDC Nº 84 de 19 de março de
2002 e FDA, 1997 , estabelecem que que o estudo
da estabilidade deve ser considerada durante a fase
de desenvolmento analítico.
Neste sentido, os estudos de estabilidade
foram classificados em:
• Curta duração:
– Congelamento e descongelamento: - 70 ou - 20°C
por 3 ciclos; recongelamento de 12- 24hs;
– Condições de Análise: 20 - 25°C, tempo máximo
de análise do lote;
– Condições de Auto Sampler: 25°C; tempo
máximo de análise do lote;
• Média duração:
– temperatura - 20 °C;
– Avaliar no tempo zero, um, dois quatro, oito e
dezesseis dias de armazenamento.
• Longa duração;
– deve compreender no tempo entre a data da primeira coleta das amostras e a data da análise da última amostra
– 03 temperaturas de estocagem,4, - 20 e - 70ºC
• Soluções-padrão;
– Deve ser avaliada à temperatura ambiente por
no mínimo 6 horas.
– Se a solução estoque e padrão interno são
refrigeradas ou congeladas por um período de
quatorze dias,
Considerações
• Preparar três á cinco determinações das concentrações de controle de qualidade (baixa, média, e alta) juntamente com o padrão interno nas amostras biológicas e comparar nas condições determinadas com as mesmas amostras recém preparadas.
• Um composto é considerado estável se sua decomposição não ultrapassar 20% da sua concentração inicial ou não ultrapassar o limite estabelecido no protocolo de validação . O prazo de validade é estabelecido com base neste parâmetro
Critérios de Aceitabilidade
• Precisão: Os CV% do inter-day para os QCs é
15%, e 20% para o LOQ QC, avaliados em um
mínimo de 3 lotes.
• Exatidão: A média dos valores do inter-day devem
ser menores que 15% do valor nominal dos
QCs, e não desviar mais que 20% para LOQ QC.
• Sensibilidade: O menor ponto da curva de
calibração aceitável como limite de quantificação
(LOQ) do método é aquele com CV% 20% (inter-
day).
• Especificidade:
– Respostas de picos interferentes no mesmo
tempo de retenção do analíto devem ser menores
que 20% da resposta de um LOQ.
– Respostas de picos interferentes no mesmo
tempo de retenção do padrão interno (I.S.) devem
ser menores que 5% da resposta de um I.S.
utilizado nos estudos.
• Estabilidade: Teste de Longo-Prazo, Curto-Prazo,
Freezer and Thaw, Soluções de Estoque e Auto-
Sampler são propostos no SOP e variam de
estudo para estudo
Guia da Validação
Obtenção do Material Biológico Obtenção do Método Analítico
Referência Bibliográfica
AdequaçãoDesenvolvimento
do Método
Não disponívelDisponível
Pré - Validação
Estabilidade Método Validado
Obtenção do Plasma
Congelamento
Recebimento
Armazenamento
Pré - Validação
Condição Analítica Definida
Seletividade
Recuperação
Limite de Quantificação
Linearidade
Precisão
Exatidão
Parâmetros de Aceitabilidade
Estabilidade
InterferênciaSem Interferência
< 60%> 60%
> 20%< 20%
< 15%
> 15%
> 15%
> 15%< 15% O.K
< 15%
Restrições
Estabilidade
Curta duração
Média duração
Longa duraçãoIniciar o Estudo
Compatível tempo
Compatível tempo
Não compatível tempo
Não compatível tempo
Não compatível tempo
Redefinir tempo de Estudo de Estocagem
Voluntários
Obtenção do Material Biológico
Obtenção do Plasma
Congelamento
Recebimento
Armazenamento Estabilidade
O.K Inicio do Estudo
Aplicação do Método Validado
Corrida do Lote
APROVADO
O.K O.K O.K
Curvas C.QsAmostras
RELATÓRIO
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