-PCR (Reação em cadeia da Polimerase)

GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

Profa. Fabiana K. Seixas

PCR Polymerase Chain Reaction

Amplificação in vitro de uma

seqüência específica de DNA

* replicação in vitro

Kary Mullis (1983)

Prêmio Nobel Química (1993)

Revolucionou genética

pesquisa genética

medicina forense

genética molecular

HISTÓRIA DA PCR

DNA molde

Oligonucleotídeos (primer)

dNTP’s

DNA Polimerase

Magnésio

Tampão

Água

COMPONENTES DA REAÇÃO

Thermus aquaticus -Estável a temperaturas

de 177 graus;

Temperatura Ótima:

72 graus

DNA POLIMERASE

Thomas D. Brock no lago do “Yellowstone National Park”

de onde foi isolado o Thermus aquaticus

TERMOCICLADOR

EQUIPAMENTO

PCR se constitui hoje no método de rotina para isolar

rapidamente sequências específicas a partir de uma mistura

complexa de seqüências genômicas

ou de cDNAs.

PCRReação em Cadeia da Polimerase

Programa

94 0C por 5 min

94 0C por 1 min

55 0C por 1 min

72 0C por 1 min

72 0C por 5 min

4 0C

PCRCICLOS DA PCR

35 ciclos

ET

APA

S Extração de DNA

Desenho dos Primers

Reação de PCR

Análise dos Resultados

EX

TR

AÇ

ÃO

DO

DN

A

DELINEAMENTO DE PRIMERS

Os iniciadores (oligos / primers) são a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR.

-Tamanho dos primers;

- Estabelecimento das temperaturas corretas a

serem utilizadas;

National Center for Biotechnology Information

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

ANELAMENTO E POLIMERIZAÇÃO

ETAPAS D

A P

CR

DESNATURAÇÃO

ANELAMENTO

POLIMERIZAÇÃO

ELETROFORESE

ELETROFORESE

VISUALIZAÇÃO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA

Eletroforese do DNA em gel de agarose 0.8%

RESULTADOS

RESULTADOS

• Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas

• Amplificação de genes para posterior clonagem e

expressão

• Determinação de variabilidade genética

• Deteção de OGMs

• Sexagem de embriões

• Estudo da expressão gênica

APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR

Construção do DNA Recombinante

Molécula de DNA de

um plasmídeo circular

Clivagem com

enzima de

restrição

Molécula de DNA de um plasmídeo

linear com extremidades coesivas

anelamento

Ligação covalente

pela DNA ligase

Molécula de DNA

plasmidial contendo

o inserto

Inserção em

uma célula

hospedeira

APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR

htt

p:/

/ww

w.p

crlin

ks.

com

/

Extração do DNA da amostra é crítica

Alguns compostos podem inibir a polimerase

Condições específicas para cada reação

Falsos resultados positivos devido a contaminação.

Falsos resultados negativos.

Análises conduzidas em laboratórios especializados.

LIMITAÇÕES