+ - +

Meio (polímero): Agarose ou poliacrilamida Papel (celulose)

-

+

Solução tamponante

Solução tamponante

Amostra (proteínas, peptídeos e

ácidos nucleicos)

CH2=CH-CO-NH2 CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH

CO NH2

CO NH2

CO NH2

acrilamida poliacrilamida

CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2

Bis-acrilamida

CH2=CH-CO-NH2 CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2

S2O8-2 à 2 SO4

-

polimerização

CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2

CH2 NH2 CO CH-CH2- CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH

CO NH2

CO NH2

CO NH2

CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH---

CO NH2

CO NH2

CO NH2

CO NH2

-CH2-CH-

CO NH2

CH2 NH2 CO CH-CH2- CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH

CO NH2

CO NH2

CO NH2

CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH---

CO NH2

CO NH2

CO NH2

CO NH2

-CH2-CH-

CO NH2

A concentração de monômeros e sua

proporção relativa determina a

porosidade do gel

-

+

amostra

-

logv = logv0 - kC

Migração na ausência de gel

Depende do peso molecular (diretamente proporcional)

Velocidade de migração

Concentração do polímero de

poliacrilamida (gel)

Diferentes proteínas têm o mesmo v0?

A

B

- - - -3

-1 - - +

v0 = ZeE/f

h R Carga líquida Campo elétrico

(V. cm-1)

Coeficiente friccional

Velocidade de migração

Viscosidade

Resistência tamanho e forma;

eletroforese

Não-desnaturante (proteínas na forma nativa)

Desnaturante

Separação por carga e peso molecular

Separação por peso molecular

Proteínas reduzidas e desnaturadas por SDS podem ter o mesmo v0

- - + - - - + - - - - - -

- - - - - -

Calor, agente redutor, detergente

(SDS; dodecil-sulfato de sódio)

1 SDS/2 resíduos de aa (“capa” de cargas negativas)

A - - - - - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - - - - +

- - - - - -

- - - - - -

B

Ze f -24 2 -12 1 v0A = v0B

v0 = ZeE/f

Proteínas reduzidas e desnaturadas com SDS apresentam a mesma velocidade de migração quando em eletroforese livre (sem gel, somente tampão). Assim, quando em um gel de poliacrilamida, estas proteínas podem ser separadas por peso molecular. logv = logv0 – kC, sendo que k depende diretamente do peso molecular

SDS - PAGE

Gel de empilhamento baixa [acrilamida]

Gel de separação alta [acrilamida]

+

-

Tampão com SDS

- - + -

-CH2-S S-CH2-

- -

- - - - - - - -

- - - - - -

- - - - - - - -

- - - - - -

- - - - - -

- - - - - -

100°C b-mercaptoetanol SDS

DTT

HS-CH2-CH2-OH (b-mercaptoetanol)

1 cadeia ou 2 cadeias polipeptídicas idênticas?

Gel de empilhamento

Contém SDS Alta porosidade (pouca poliacrilamida) Permite as proteínas migrarem livremente A amostra forma uma pequena “pilha”

Gel de emplilhamento Tris-HCl

Tampão Tris-Glicina pH 8,3

pHgel < pHtampão

6,7 8,3

Gly-

Cl_ Gly-

Cl_ Gly-

Fronteira proteínas

Gel separação pH = 8,9

Cl-

Gly- e Cl-

t1 t2 t3 t4

Gel de separação

Contém SDS Porosidade controlada pela concentração de poliacrilamida. O gel separa proteínas por peso molecular (peneiramento). (logv = logv0 – kC)

maior peso molecular

menor peso molecular

Azul de bromofenol

Início final

Visualização das proteínas

Fixação – metanol, ácido acético e formaldeído Comassie Blue R Coloração com AgNO3 íons Ag+ formam complexos com a proteína. A adição de Na2CO3 leva a formação de AgCO3 que em meio alcalino origina Ag2O (insolúvel e marrom)

Gel de SDS-PAGE corado com AgNO3

Proteínas padrão de peso molecular

Amostras experimentais

Cálculo do peso molecular

Mobilidade relativa = migração individual/migração total

Migração total (cm)

Migração 1

Migração 2

Azul de bromofenol

97,4

66,2

45,0

31,0

21,5

14,4

kD

Mobilidade relativa