Qualitativo: + ou – Semi-quantitativo: amostra testada foi

diluída – a maior diluição que apresentar reação é o seu título (ex. + ate a diluição 1:320)

Quantitativo: informa quantidade absoluta do material detectado.

IMPORTANTE : Finalidade do teste - 1.Triagem 2.Diagnóstico

?

• Afinidade• Avidez• Taxas Ag-Ac• Reações

Cruzadas

Anticorpos:• Monoclonais• Policlonais

AfinidadeAfinidadeForça de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário

Avidez:Avidez: força total de ligação, em dois ou mais sítios.

Todos os testes baseados nas reações Ag\ Ac,deverão depender da formação de malha ou terão que utilizar formas de detectar complexos imunes pequenos.

Todos os testes baseados nas reações Ag\Ac podem ser utilizados para detectar tanto Ag quanto Ac.

Técnicas sem uso de marcadores◦ Reações de Precipitação◦ Reações de Aglutinação◦ Dependem de formação de malhas

Técnicas com uso de marcadores◦ ELISA◦ Citometria de fluxo◦ Imunofluorescência◦ Radioimunoensaio◦ Não dependem da formação do latex

• PRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese

• AGLUTINAÇÃO- Aglutinação direta e indireta- Inibição da aglutinação- Teste de Coombs

• IMUNOENSAIOS- Radioimunoensaio- ELISA - Imunofluorescência - Citometria de Fluxo

PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO

ZONA DE EQUIVALÊNCIA

EFEITO PRÓ - ZONA

EFEITO PÓS - ZONA

IMUNODIFUSÃO DUPLA

Possui baixa sensibilidade ; demorado (18-24 hrs)

Utiliza uma matriz de ágar

Ag + Ac = linha de precipitação visível

Ac

Ag Ag

Ac

Ag Ag

Ac

Ag Ag

• As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação

• Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante

Utilização da técnica : caracterizar antigenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenças auto-imunes

• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac

• Interpretação– Diâmetro do anel é

proporcional à concentração do Ag

• Método de Mancini– Anticorpo no gel– Antígeno no poço–Vice-versa

Ag Concentração

Dia

met

er2

AgAgAgAg

Ac no gel

Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas

Fácil, baixo custoUtiliza uma matriz de ágarÉ quantitativa

+ -

Ag

Ag

1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna

canaleta

2- Anti-soro na canaleta

canaleta

3- Difusão e precipitação

• Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.

• As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.

• Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. • Ag e Ac formam arcos de precipitação.• É qualitativo• Utiliza lâminas recobertas com ágar

Útil para detectar gamopatias monoclonais, como mieloma múltiplo e a macroglobulinemia

• Pode ser direta ou indireta• + sensíveis qtidade de Ac 500 vezes menorpartículas

amplificam a reação• Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-

quantitativo)

Agregação visível de partículas

EritrócitosBactériasFungoslátex

USO: Tipagem ABOTestes confirmatórios para sífilis, FR

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA

1) Amostra de sangue na placa teste:

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

Partículas que apresentamdeterminantes antigênicosnaturais na sua superfície

+ Ac = Aglutinação

3) Controle negativo:

4) Mistura-se:

HemáciasBactériasProtozoários

AGLUTINAÇÃO DIRETA5) Leitura do resultado:

negativo positivo

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste);

AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas:

• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa.• O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço.

Aglut +

Aglut -

Ags solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias)

TESTE DE COOMBS (Antiglobulina)

DIRETO : Detecta Ac ligados a eritrócitos

• INDIRETO: Detecta Ac anti-eritrócitos no soro

1.Permite detectar incompatibilidade Rh - DHRN (mãe produz IgGantiRh).

2.R. medicamentosa3.R. transfusional

Teste baseado na inibição da aglutinação devido a competição com antígeno solúvel.

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO

Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.

Resultado negativo:(ausência de hCG na urina): ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.

Princípio da técnica:

• Anticorpos ou antígenos são conjugados a um fluorocromo, que, quando excitado por radiações UV, emite luz no espectro visível.

• A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um microscópio de fluorescência

• Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT).

IFA direta:• Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes

de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais, e doenças imunológicas renais e de pele.

IFA indireta: • pesquisa de antígenos ( plasmódio em hemácia) e de anticorpos ( sífilis,

toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, doença de chagas, malária, etc)

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Treponema pallidumTreponema pallidum

Pneumocystis cariniiPneumocystis carinii

Tripanosoma cruziTripanosoma cruzi

Giardia lambliaGiardia lamblia

• Separação de células marcadas por fluorescência;• Anticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou

Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD)• Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo

diferente.• É um teste qualitativo e quantitativo. • Ferramenta que detecta e quantifica células individuais

passando em uma corrente através de um feixe de Laser.

CD 4

CD 18

CD 125

CD 147

• SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO

• SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ.• SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS

ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.

CD4

CD8

CD20

USO

Determinar o tipo e no de céls. sanguíneas brancas Isolar populações celularesQuantidade, tamanho, granulosidade; Distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ags Tamanho celular.

APLICAÇÕES CLÍNICAS DA CITOMETRIA DE FLUXO

- Análise da subpopulação linfocítica- Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas, HIV- Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo- Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas- Análise de reticulócitos- Detecção de anticorpos antiplaquetários

- Quantificação de células progenitoras (Stem cells)

- Avaliação imunológica de paciente transplantado

• O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.

• O produto final ação da enzima sobre o substrato = COR• Produto final corado leitura em fotocolorímetro. • Principais tipos de ELISA: indireto, direto e competitivo.

Vantagens do ELISA:-Utiliza reagentes estáveis-Teste de alta sensibilidade-Seguros e de baixo custo-Não trabalha com radioisótopos-pode ser adaptado tanto a testes simples quanto à automação-Não depende de formação de precipitado, aglutinado, etc.

Direto = Ag Indireto = Ac

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA

substrato

Qualitativos Quantitativos

Ac marcados com Enzimas

+ +Ag

Fosfatase alcalinaPeroxidaseB-galactosidase

DIRETO OU SANDUÍCHEINDIRETO

= COR

Ponte de corte (“ cut-off”) : é o limiar de reatividade; define o limite entre um teste negativo e um teste positivo

Moléculas marcadas com isótopo ( I 125 ,I 131 ) Marcações:

I125: emite raios gama H3: raios beta

Desvantagem manipulação de isótopo radioativo.

• Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas (urina ou soro de atletas), etc.

• Vantagens:– Alta sensibilidade– Permite medidas rápidas e precisas– Limiar de detecção em nanogramas e picogramas.

• Desvantagens:– Custo– Vida média dos reagentes– Risco operacional (radiação)

RADIOIMUNOENSAIO

FIM