Post on 17-Apr-2015
Avaliação da diversidade microbiana
Amostragem, processamento e técnicas
Dificuldades na avaliação:• Falta de recursos humanos capacitados
• Falta de financiamento
• Amplitude da diversidade
• Erosão da diversidade
• Falta de metodologias
Porquê avaliar?
Assegurar que microrganismos desempenhem processos necessários a produtividade e sustentabilidade.Assegurar que pelo menos alguns microrganismos sejam tolerantes a estresses.
• Amostragem
• Processamento
• Detecção e avaliação – técnicas:
i. Fenotípicas
ii. Moleculares
iii. Imunológicas
• Etapa crítica
• São usados equipamentos especializados
• Devem ser considerados os seguintes fatores:
Representatividade
Não alterar os números e as atividades
Evitar a introdução de contaminantes
Estocar em condições adequadas
• Uso de amostras compostas para minimização do erro
• Determinação do numero de amostras mínimo
• Estatística determinará os limites de confiança
Problema da representatividade
Estratégias de amostragem
Acesso - direto
Número de microrganismos - Baixo
Equipamentos
Processamento - Concentração em filtros
Ar é um meio restritivo
para os microrganism
os (1)
(1) Apesar de restritivo transmite inúmeros agentes patogênicos
Amostragemno
Microbiota do Ar
Morte dos microrganismos no ar
Xt = X0-k.t
K- coeficiente de inativação
Depende do tipo de microrganismo e das condições ambientais
Fatores:Umidade relativa
Temperatura
Radiação (pigmentação, reparo do DNA)
Radicais de O2
Íons, dentre outros
Os microrganismos alcançam o ar através dos aerossóis
Depende do tipo de microrganismo, partículas e fase gasosa
Amostragem do ar
1.Simulação respiratória
(tamanho partícula 0,8 – 15 μm; fluxo de ar e velocidade)
2. Colisão - Captura em liquido. Ex: AG-30
3. Impacto - deposição em superfícies sólidas. Ex: coletor de Anderson
4. Centrifugação
5. Filtração
6. Deposição - Coleta passiva
Coletor de AndersonAG-30
Equipamentos para amostragem do ar:
Amostragem passivaApenas microrganismos que caem nas placas
Amostragem ativaRecuperação forçada usando um volume determinado
Método usado nas estações espaciaisDados NASA
Importância Aeromicrobiologia extramural:
Dispersão de patógenos e toxinas (botulínica, estafilocócica, LPS)
Fitopatógenos (ferrugem)
Doenças pulmonares e gastro-intestinais de animais
Despejo de resíduos (sólidos e líquidos)
Guerra biológica
Aeromicrobiologia intramural:
Edificios (doenças dos Legionários-Legionella
pneumophila, bactéria aquática disseminada
pelos aparelhos de ar condicionado e água potável)
Viagens de avião
Saúde pública - gripes
Acesso - Direto ou remoto
Números - elevados ou baixos
Equipamentos -Recipientes, filtros
Processamento - diluição ou concentração
Amostragemna
Depende nível de matéria orgânica
Equipamentos
• ROV (Veículo operado de forma remota) usados nas águas hidrotermais Yellowstone Park
• Águas termais (difíceis de amostrar convencionalmente)
Mensageiro controlado remotamente abre o recipiente para não ocorrer contaminação com microrganismos de outras profundidades
Acesso - Remoto
Número de microrganismos - elevado
Equipamentos - observatórios, sondas
Processamento - diluição
Amostragemem
Profundezas oceânicas mostrando as conexões entre a crosta e os sedimentos. Ocorrem trocas entre os sedimentos e a crosta.
Um método efetivo de acesso ao sedimento enterrado é através de observatórios.
Microbiota dos sedimentos
Cowen, 2004
Observatórios penetrando 300 m nos sedimentos e crostas
Baixa abundância (biomassa) porém microrganismos sempre presentes
Uso de sondas fluorescentes específicas para rRNA de Archaea e Bacteria e C radioativo para detectar atividade na crosta basáltica oceânica.
Fisk et al., 1998
Ventarolas marinhas
Sedimentos:
• Elevada diversidade de Bacteria e Archaea
• 180 reações metabólicas envolvendo N,S e C inorgânico, metais e minerais assim como compostos orgânicos
• Diversos micro-nichos existentes
Acesso - direto
Números de microrganismos - elevado ou baixo
Equipamentos - trados, pás
Processamento - diluição
Amostragemno
SOLO
Uma simples pá de solo de jardim contem mais espécies de organismos do que pode
ser encontrado em toda a floresta amazônica.
Problemas
solo
Distribuição dos microrganismos em
agrupamentos
Bactérias existem em “hot-spots”
1-5 g solo
Elevada variabilidade entre amostras
Estatística
SOLO
Solo propriamente dito
Elevada população devido a riqueza nutricional da rizosfera.
BIOMASSA - 1010 /g
Características:
1. Microcolônias (interação ativa dentro das populações)
2. Estímulo ao crescimento
(populações com elevadas velocidades crescimento)
3. Modificações ambientais
4. Troca genética
Elevada diversidade governada pela Lei do Mínimo de Liebig.
Subsolo
BIOMASSA - 107/g
Distribuição não homogênea
Alguns números sobre a estrutura do solo
Microrganismos no solo
Em cada grama solo tipicamente franco
• 2,8 X 105 m2 - dimensões continentais para microrganismos
• > 1X 1010 células viáveis
• > 4 X103 espécies
• << 0,1% são cultivadas in vitro
• Maioria dos grupos são conhecidos apenas por informações de sequenciamento de DNA
• Apenas 1 ou 2 membros cultivados pertencem a ordens conhecidas
Maioria diversidade é desconhecida!
Números no solo
Números de microrganismos no solo:
Bactérias: 106 a 109 g-1 solo Gram - bacilos 17-29% Gram + bacilos 2-7% Actinomicetos: 11-32% Arthrobacter, etc., 31-46%
Algas: 101 x 106 g-1 Fungos: 104 a 106 g-1 Protozoários : 104 a 105 g-1 Bacteriófagos: ? % Culturabilidade por grupo: 0.8 a 7 %
• Macrofauna e flora são relativamente fáceis de identificar e expressar
usando riqueza especifica e outros índices.
• Mas no solo as estimativas da diversidade da microbiota :
• Envolvem dificuldades: heterogeneidade, grupos dificeis de cultivar em
meio de cultura • Estratégias
•Fame •CHO utilização •Técnicas moleculares usando PCR •Sorologia
Solo
Populações - 107 /g
Importantes patogênicos para
homem
Amostragemno
Cerca de 40 % água consumida pelo homem provem do fontes subterrâneas
Existem gradientes nestas regiões:Forçado - quando água é movimentada em elevadas quantidades produzindo a movimentação dos microrganismos Passivo - natural sem influência artificial
Inúmeros trabalhos mostram a dificuldade de remediação de contaminantes nas águas subterrâneas. Processo dispendioso.
1 litro de petróleo pode contaminar 2.000 m3 de água
Vírus, bactérias e protozoários tem diferentes dimensões, metabolismos, mecanismos de sobrevivência e mecanismos de transporte diferenciados.
Estudo da diversidade da microbiota da sub-superficie é muito complexa.
Doenças causadas aumentou 40 % nos últimos 10 anos
Movimentação da microbiota na sub-superfície
Microbiota da subsolo
Pesquisada na última década (dificuldades de amostragem)
Inúmeros aeróbios
oligotróficos: 103-107/gAnálise comunidades: Archaea e Bacteria (muitas BRS)
Como vivem?
Quimioautotróficos e Quimiolitotróficos
Metanogênicas
(CO2) CH4
Acetogênicas
(HCO3-) acetato
Bactérias redutoras de sulfatos (BRS)
(SO4-2) sulfídrico
H2 é gerado pelo FeO+H2O H2+FeO2
Sedimentos profundos
1. Número de bactérias cultiváveis em sedimentos foi cerca de 3 ou 5
ordens de magnitude (1000 a 100.000 x) MENOR do que em solos
superficiais.
2. Camadas areia-água apresentaram contagens e atividade mais elevadas,
do que as camadas argilosas perto da superfície.
3. Profundidade não é necessariamente limitante ao crescimento e
atividade.
4. Estudo enumerou coliformes, redutores de sulfato e metanogênicas:
- Atividade anaeróbia medida pelo desaparecimento de lactato, formato e
acetato e produção de metano e H2S.
Sedimentos não incluem apenas anaeróbios, sendo inclusive de
100 a 100.000 vezes menos do que os aeróbios.
- Número de coliformes baixou drasticamente com a profundidade, mas
estão presentes nos fluidos dos poços.
Microbiota da subsolo
A 3,4 Km abaixo da superfície
Possibilidades:
1. Foram incorporados nos sedimentos durante a formação das rochas há milhões de anos e sobrevivem em condições nutricionais de “dieta mínima”.
2. Infiltraram as águas subterrâneas a partir de águas de superfície (maioria das bactérias que ocorrem em rochas como basalto e granito)
3. Crescem lentamente a partir de fontes de energia inorgânicas fornecendo carbono orgânico para outros microrganismos na matriz rochosa (SLiME - Subsurface Lithautotrophic Microbial Ecosystems).
A. 1-10 microrganismos /g de rocha (10-9 /g de solo superficial rizosférico)
B. Densidade das comunidades é desconhecida:
- Metabolismo microbiano é lento (dificuldade distinguir viável de
inviável)
- Células inviáveis são fonte nutricional para células viáveis (baixo
movimento de água e nutrientes)
- Difícil reproduzir as condições das profundezas em laboratório
- Recentemente 9000 estirpes do subsolo foram catalogadas.
- Peso dos microrganismos subterrâneos pode ser equivalente aos da superfície.
Subsolo
Interação
microrganismos - macrorganismos
Plantas - seiva, filosfera
Animais - sangue, dentes
Não destrutivas
Amostras
ProcessamentoObjetivo: recuperação ótima
Concentração - centrifugação e passagem por filtros
Diluição - Diluições seriadas
Problemas:Porosidade dos filtrosComposição quimica
Problemas:Composição do
diluenteTempo de misturaGrau de agitação
Microrganismos encontram-se em números inapropriados (elevados ou baixos) e em comunidades
(diversas espécies)
Enriquecimento
Enriquecimento
Seleção natural aplicada in vitro
Para microrganismos que metabolizam uma determinada substância ou que ocorrem em baixas populações na amostra.
Desenvolvidas por Beijerinck
Cultura de enriquecimento consiste na promoção de condições favoráveis especí.ficas para o crescimento de um tipo particular de microrganismo.
Exemplo 1: para isolar um fixador de nitrogênio o meio de enriquecimento não poderá conter uma fonte de nitrogênio.
Exemplo 2: bactéria que degrada naftaleno deve-se cultivar a amostra em um meio cuja única fonte de C é o naftaleno.
Exemplo 3: coluna de Winogradsky, enriquecimento para quimilitotróficos.
Exemplo 4: Para isolar Bacillus formadores de esporos aquecer a cultura mista e plaquea.
Detecção dos microrganismos
Métodos:Fenotípicos - baseadas no cultivo ou avaliação de certas
propriedades do microrganismos
Moleculares - baseadas na constituição genotípica
Imunológicos - baseadas nas características imunológicas
FenotípicosMétodos baratos e não requerem
treinamento diferenciado
Amplificação de sinal:CULTIVO EM MEIO DE CULTURA
Técnicas morosas
Em alguns sistemas não são precisas
Isolamento cultura pura identificação
Diluição seriada
Plaqueamento
Amplificação sinal fenotípico
colônias
Ex: Geobacter metallireducens:
CH3COO - + 8Fe3+ + 4H2O
2HCO3- + 8Fe 2++ 9H+
Adicionar acetato como única fonte de C no meio de cultura permite a detecção de microrganismos que podem metabolizar acetato e usam oxido de ferro como fonte de energia
Cultivo
Crescer microrganismos em laboratório com base em características fenotípicas.
Detectar grupos que usam determinada substância ou fonte energética e que vivem em determinadas condições físico-químicas.
Corantes vitais e Imunofluorescência
Perfil lipídico
Perfil de FAME (Fatty acids methyl ester analysis)
1. Existe grande variabilidade no perfil da composição e proporção de ácidos graxos (membranas).
Perfil FAME = impressão de uma espécie
2. Usado no estudo da diversidade microbiana em sistemas de tratamento de esgoto, em solos contaminados e biofilmes de sistemas de distribuição de água.
Outras técnicas fenotípicas
MARA - multiple antibiotic resistance activity
ARA - antibiotic resistance analysis
CSU - carbon source utilization
Detecção de hospedeiros de vírus
Avaliação da abundância relativa
Enumeração Biomassa Atividade
Contagem direta
Contagem indireta
Contagem direta
Lâmina Petroff-Hauser ao microscópio
Fluorecência, anticorpos
Vantagens:
Não requerem separação do microrganismo.
Fornecem estimativas elevadas
Desvantagens:
Não distingue entre viáveis e não viáveis.
Não permite análises subsequentes
Lâminas para contagem direta
Contagem indireta
Contagem em placas NMP
Técnica de Diluição e plaqueamento
Diluições seriadas (resultado)
Enumeração NMP
NMP – número mais provável
Contagens indiretas
Vantagens:
-Detecção de viáveis
-Seletividade (uso de meios específicos)
Desvantagens:
- Seletividade
permite a contagem de alguns tipos
- Ausência de não cultiváveis
Avaliação da biomassa
Parâmetro importante porque avalia os recursos energéticos disponíveis para a comunidade.
Expresso em g e pode-se converter em energia: 4,9 Kcal/g peso seco
Baseia-se no fato de existir uma correlação direta entre a abundância de um microrganismo com alguma substância característica.
Proteína
Peptideoglicano
Quitina
LPS
DNA
Dentre outros
Indireta
Direta Filtração
Centrifução
Pesagem
Avaliação da atividade
Fotossíntese – taxa de produção primária
Respiração - consumo de O2 ou produção de CO2
Potencial heterotrófico - taxa de absorção de substâncias marcadas com radioisótopos
Atividade enzimática - lacase, celulase, nitrogenase
Viáveis mas não cultiváveis (VNC)
< 1% dos microrganismos podem ser cultivados no laboratório usando técnicas convencionais de cultivo. Os microrganismos que não são cultiváveis, mas são viáveis, se denominam VNC e requerem técnicas apropriadas para sua detecção.
Ex: Fungos micorrízicos vesículo-arbusculares.