Cromatografia em Camada Delgada

Discentes: Daniely de Godoy Silva

Germano Blaquez Junior

Gislaine Ap. da Cunha

Docentes: Profº. Drº José Eduardo de Oliveira

Profª Amanda Coelho Danuello

Histórico da Cromatografia em Camada Delgada

BEYERINCK em 1889 usou sólidos em camada delgada sobre vidro, para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgânicos.

Em 1938 IZMAILOV e SCHRAIBER reintroduziram a Cromatografia em Camada Delgada, para análise de produtos farmacêuticos, mas não foi muito usada até o desenvolvimento, por KIRCHNER do método de aderir os sólidos ao suporte.

Em 1956 atingiu grande desenvolvimento, pelo método de preparar as placas com reprodutibilidade por STAHL.

Cromatografia :

Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo.Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela.

Técnicas cromatográficas

Cromatografia planar: Fase estacionária permanece em um plano

Cromatografia em coluna:

Fase estacionária permanece num tubo

Cromatografia

Planar Coluna

Líquido LíquidoGás

Líquido Fase ligada

Sólido Líquido LíquidoSólido Fase ligada

CP CCD CCD CGL CGS CGFL CLL

Sólido

CLS CE

Fase ligada

CLFLCTI CB

Critério de classificação

Técnica

Fase Móvel

Fase Estacionária

Tipo de cromatografia

Outra Classificação

Fase Normal

Polaridade: FE > FM

FE utilizada : Sílica G

Fase Reversa

Polaridade: FE < FM

FE utilizada: Sílica C18

> polaridade

< polaridade

< polaridade

> polaridade

MECANISMO DE AÇÃO

ABSORÇÃO ADSORÇÃO

Mecanismos

Adsorção Partição Exclusão Líquido/gás sólido

Líquido sólido

+

+

+-

-

Líquido/gás líquidoLíquido/gás gel/sólido

Troca Iônica

FORÇAS INTERMOLECULARES

MOLÉCULAS APOLARES

FORÇAS DE DISPERSÃO DE LONDON

Molécula apolar

Molécula apolar

Dipolo instantâneo

Afastadas = Não existe atração

Aproximação = Indução

Atração

Ex: Hidrocarbonetos

Moléculas Polares

Dipolo - Dipolo

Ligação de HidrogênioH ligado a F, ou O, ou N

Molécula polar sem H ligado a F, ou O ou N

Cromatografia em Camada Delgadaem Camada Delgada

Consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana.

Aplicações:

Estudos preliminares da complexidade dos componentes de um extrato orgânico;

Investigação de: Casos de envenenamento; ingestão de estimulantes por atletas;

Estudos de reações : presença de intermediários estáveis;

Análise da pureza de compostos;

Análise da eficiência de: destilação e cristalização

Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada

a. Simplicidade;

b. Baixo custo;

c. Facilidade de raspar a camada, com espátula fina ou com uma lâmina para microscopia, para recuperar, por eluição o conteúdo de uma mancha ou de uma banda;

ADSORVENTES UTILIZADOS EM CCD

Processo de separação varia em função da quantidade de água presente no adsorvente:

Ausência de água = Adsorção

Presença de água = Partição

Exemplos de adsorventes:

Sílica-Gel ou àcido Silícico;

Óxido de alumínio ou alumina;

Celulose;

Kieselgur;

Poliamida;

Sílica gel

Kieselgur Alumina

Sílica gel ou Ácido silícico

Mecanismo de adsorção:-Si-OH: Interações polares por ligação de hidrogênio, como doador ou aceptor de H.-Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo

SiO O Si

O

O O

O

OH

Mais usada na CCD

Substância porosa e amorfa.

Apresenta caráter ácido.

Possui característica polar, devido à presença de grupos hidroxilas denominados silanóis. Deve apresentar número de hidroxilas razoável para ser seletivo na separação de substâncias de diferentes polaridades

Tratamento térmico eliminação de água ( temperatura recomendada para a sua ativação de 105 a 110ºC)

Caracterização do tipo básico de sílica gel :

G: adição de sulfato de cálcio, gipsita, (aglutinante);

H: indica ausência de aglutinante;

F: indica adição de substâncias fluorescentes;

P: indica adsorvente para uso preparativo;

R: indica adsorvente de alto grau de pureza;

Preparação: 30g de sílica com 60-70 mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3 mm

CUIDADO! A aspiração da sílica causa silicose, um tipo de inflamação pulmonar crônica!

CH3Si

OSi

OSi

OSi

O

CH3

CH3

OH

CH3

OH

O

CH3

CH3

CH3

CH3

Sílica C18

Usada em cromatografia de fase reversa, em que a fase estacionária é menos polar que a fase móvel

Alumina ou Óxido de AlumínioSegundo adsorvente mais empregado em CCD;

Há três grupos deste adsorvente:

A ativação da alumina faz-se,após secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min.

A alumina é caracterizada pelo diâmetro dos poros dos grânulos.

Tipo E: apresenta superfície específica de 120 – 180 m2. g-1.

Tipo T: apresenta superfície específica de 60 – 90 m2. g-1.

Preparação: 5 placas de 20x20 cm e espessura de 0,3 mm, recomenda-se a utilização de uma suspensão de 30 g de alumina em 40 mL de água destilada.

O Al

AlO

ClAlCH3

Cl

CH3

Cl

ÁCIDApH 4,0

O Al

AlO

ONaAlCH3

ONa

CH3

ONa

BÁSICApH 9,0

NEUTRApH 7,0

Mecanismo de adsorção:

Al3+: campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis ( sistemas conjugados)

O2-: sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+

Celulose

Existem dois tipos de celulose empregadas em CCD: a nativa ( celulose fibrosa) e a celulose microcristalina.

Existem ainda as celuloses quimicamente tratadas aplicadas na CCD:

Mecanismo: Partição ou troca iônica.

Kieselgur ou terra de diatomáceasÉ um tipo de ácido silícico oriundo de carapaças de diatomáceas fósseis.

Comparado a sílica e alumina é menos adsorvente e com menor poder de resolução.

Poliamida

Separação de fenóis e ácidos carboxílicos

A separação depende da intesindade das forças decorrentes das ligações de hidrogênio com o analito.

Baixa aderência ao vidro: dificuldade de preparação da placas

Técnica GeralEscolha da fase estacionária;

Preparação das placas cromatográficas;

Ativação das placas cromatográficas;

Seleção da fase móvel;

Aplicação das amostras nas cromatoplacas;

Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do cromatograma;

Revelação dos cromatogramas;

Documentação;

Calculo do fator de retenção Rf;

Escolha da fase estacionária

Liofilicidade e liofobicidade

Interação com os componentes (polaridade)

Necessidade de aditivos Aglutinantes Substâncias fluorescentes

Capacidade adsorvedora

Preparação da placas

As placas devem ser: resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes à temperatura e uniformes.

Dificuldades: Obtenção de camada uniforme.

Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.

Procedimentos para a preparação das placas

Limpeza da placa de vidro detergente e água corrente (eliminação de

gordura);

Secagem em estufa

Preparação das camadas finas dos adsorventes: Utilização de espalhadores ( mais empregada); Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado.

Riscar as placas, determinando a altura

de ínicio e fim da cromatografia

Ativação das placas

Objetivo: retirar substâncias interferentes e eliminar água

Metodologia : Varia de uma adsorvente para outro.

Exemplo : Sílica e alumina estufa 105 – 110 ºC por 30 – 60 min;

Celulose estufa 105ºC por 10 min;

Seleção da fase móvel Depende: natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase móvel.

Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por adsorção: levar em conta a natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto.

Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por partição: constitui um processo de separação que depende das diferenças de solubilidade dos componentes das amostras, nas fases estacionária e móvel e na imiscibilidade dessas fases.

Método de seleção

Aplicação das amostras A amostra é aplicada na forma de solução 0,1 – 1%,dependendo A amostra é aplicada na forma de solução 0,1 – 1%,dependendo da sensibilidade do revelador, usando solventes mais voláteis da sensibilidade do revelador, usando solventes mais voláteis possíveis.possíveis.

Aplica-se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos Aplica-se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos capilares.capilares.

As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte

inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato

direto com o solvente durante o desenvolvimento do direto com o solvente durante o desenvolvimento do

cromatograma.cromatograma.

Alinhamento horizontal uniforme.Alinhamento horizontal uniforme.

Preparação da cuba A cuba deve estar saturada com vapor de fase móvel, para isso, A cuba deve estar saturada com vapor de fase móvel, para isso, coloca-se papel de filtro na cuba, que indica o nível de saturação. coloca-se papel de filtro na cuba, que indica o nível de saturação. A cuba deve ser dotada tampa esmerilhadas de forma a vedá-la A cuba deve ser dotada tampa esmerilhadas de forma a vedá-la hermeticamente, garantindo uma boa saturação da atmosfera hermeticamente, garantindo uma boa saturação da atmosfera interna.interna.

Desenvolvimento de um cromatograma numa cuba

A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar evaporação) e A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar evaporação) e verticalmente, após aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a fase verticalmente, após aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a fase móvel desejadamóvel desejada

A- Procedimentos FísicosA- Procedimentos Físicos: Luz ultravioleta (aromáticos ou dupla ligação conjugada).

B- Procedimentos Biológicos e EnzimáticosB- Procedimentos Biológicos e Enzimáticos: Antibióticos, Enzimas e Substratos.

C- Procedimentos QuímicosC- Procedimentos Químicos: Aplicação de um reativo químico para formar um derivado colorido ou fluorescente.

Revelação dos cromatogramas

Reveladores Físicos

Radiação ultravioleta para compostos fluorescentes.Radiação ultravioleta para compostos fluorescentes.

Ex: clorofila.Ex: clorofila.

Reveladores QuímicosConsiste em utilizar reveladores químicos que, em contato com Consiste em utilizar reveladores químicos que, em contato com as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visíveis.as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visíveis.

Tipos de reveladores químicos Tipos de reveladores químicos Alcalóides:Alcalóides: Dragendorff, iodoplatinato Dragendorff, iodoplatinatoFlavonóides:Flavonóides: NP-PEG NP-PEGAnti-oxidantes: ββ-caroteno-carotenoSaponinas, terpenos e esteróides:Saponinas, terpenos e esteróides: anisaldeído sulfúrico anisaldeído sulfúricoAntraquinonas e cumarinas:Antraquinonas e cumarinas: vapor de amônia vapor de amôniaFenólicos, saponinas e terpenóides:Fenólicos, saponinas e terpenóides: vapor de iodo e solução de CeSO vapor de iodo e solução de CeSO44

Compostos fenólicos:Compostos fenólicos: FeCl FeCl33

Ani

sald

eído

Iodo

Ác.

fos

fom

olib

dico

Reveladores Biológicos

Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para tornar a mancha visível.tornar a mancha visível.Ex.: para testar se uma amostra contém substância anti-Ex.: para testar se uma amostra contém substância anti-fúngica, revela-se o cromatograma com esporos de fúngica, revela-se o cromatograma com esporos de fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas substâncias.substâncias.

Fator de Retenção Rf (Relation front ou Rate factor)

Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase móvel.

Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a vírgula.

dr1

dm

dr2

Ws1

Linha de chegada da FM

Profundidade da FMPonto de partida da amostra

Ws2

• Fartor de Retenção (RFartor de Retenção (Rff):):

• Rf = dr / dm

• Resolução (RResolução (Rss):):

• Rs = 2(dr1 – dr2) / (Ws1 + Ws2)

• Eficiência:Eficiência:

• n = 16 (dr – Ws)2

Parâmetros Utilizados na Cromatografia PlanarParâmetros Utilizados na Cromatografia Planar

Desvantagens da CCDDifícil reprodutibilidade:Difícil reprodutibilidade:

quantidade de amostra aplicada quantidade de amostra aplicada obtenção de cromatoplacas com características idênticas.obtenção de cromatoplacas com características idênticas.

Dificuldade de detecção devido à difusão da amostraDificuldade de detecção devido à difusão da amostra

Difícil determinação exata do Rf.Difícil determinação exata do Rf.

Constantes Físicas

Bibliografia

•COLLINS, Carol H. et al, introdução a métodos cromatográficos, 6ª ed, ed. COLLINS, Carol H. et al, introdução a métodos cromatográficos, 6ª ed, ed. Unicamp,Campinas,1995.Unicamp,Campinas,1995.

•NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, Funep, Jaboticabal, 2005 NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, Funep, Jaboticabal, 2005

•THE MERCK INDEX, 13th, ed. Merck & CO., Inc., Usa, 2001.THE MERCK INDEX, 13th, ed. Merck & CO., Inc., Usa, 2001.

•Labjeduardo.iq.unesp.brLabjeduardo.iq.unesp.br

Agradecimentos

• Marquinho

• Alberto Camilo Alécio

• Amanda Coelho Danuello