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Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto Departamento de Quiacutemica Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Quiacutemica
lsquolsquoEstudo da associaccedilatildeo de complexos nitrosilos de rutecircnio
liberadores de NO com o agente fotossensibilizador Zinco
ftalocianina ZnPC em sistemas de liberaccedilatildeo utilizados na
Terapia Fotodinacircmicarsquorsquo
Daniela Silva Maranho
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave Faculdade de
Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto da
USP como parte das exigecircncias para a obtenccedilatildeo
do tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias Aacuterea Quiacutemica
RIBEIRAtildeO PRETO -SP
2008
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Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto Departamento de Quiacutemica Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Quiacutemica
lsquolsquoEstudo da associaccedilatildeo de complexos nitrosilos de rutecircnio
liberadores de NO com o agente fotossensibilizador Zinco
ftalocianina ZnPC em sistemas de liberaccedilatildeo utilizados na
Terapia Fotodinacircmicarsquorsquo
Daniela Silva Maranho
Orientador Prof Dr Antonio Claudio Tedesco
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave Faculdade de
Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto da
USP como parte das exigecircncias para a obtenccedilatildeo
do tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias Aacuterea Quiacutemica
RIBEIRAtildeO PRETO -SP
2008
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FICHA CATALOGRAacuteFICA
Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo
de Ribeiratildeo Preto USP
Maranho Daniela Silva
Estudo da associaccedilatildeo de complexos nitrosilos de rutecircnio liberadores de NO com o agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina ZnPC em sistemas de liberaccedilatildeo utilizados na Terapia Fotodinacircmica 96 p il 30cm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo PretoUSP ndash Aacuterea de concentraccedilatildeo Quiacutemica Orientador Tedesco Antocircnio Claacuteudio
1 Terapia Fotodinacircmica 2 oacutexido niacutetrico 3 complexo nitrosilo de rutecircnio 4 neoplasias
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Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto
Folha de Aprovaccedilatildeo
Membros da Comissatildeo Julgadora da Dissertaccedilatildeo de Mestrado de Daniela Silva Maranho
apresentada ao Departamento de Quiacutemica da Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de
Ribeiratildeo Preto ______
Comissatildeo Julgadora
____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo) ____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo) ____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo)
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DEDICATOacuteRIA
Dedico este trabalho agrave minha famiacutelia
Primeiramente agrave Deisy Silva Maranho minha matildee grande mulher que com seu amor e alegria
sempre me motivou Seu apoio incondicional e imensuraacutevel me deu a forccedila necessaacuteria para
encarar todos os desafios para assim conseguir alcanccedilar tudo que desejei
Ao meu pai querido Alcides Maranho com seu carinho e amor sempre me guiou pelo
caminho do bem Homem sereno exemplo de honestidade seu caraacuteter singular foi a base da
minha formaccedilatildeo moral
Aos meus irmatildeos queridos
Dinho uma pessoa muito especial que com toda sua sensibilidade me mostrou que o que
importa nessa vida eacute ser feliz Um cuidado uacutenico comigo meu iacutedolo
Ana Deisy com sua ternura sempre foi a certeza de encontrar em casa o carinho mais sincero
Du atraveacutes de sua escolha me mostrou que natildeo haacute barreiras para alcanccedilarmos nossos sonhos
tudo eacute possiacutevel
Agrave minha querida avoacute Zica com seus 98 anos ainda reza por mim e confia nas minhas
conquistas
Obrigada pela confianccedila e por tanto amor
6
AGRADECIMENTOS
A Deus
por tudo que tenho por ser meu descanso e a certeza da minha felicidade Com a ajuda dos
anjos e santos consigo me manter firme e confiante
ldquoTudo posso naquele que me fortalecerdquo(Fl 413)
7
AGRADECIMENTOS
Principalmente ao Prof Dr Antonio Claudio Tedesco por ter confiado no meu
crescimento na pesquisa Obrigada pela paciecircncia pelo apoio carinho pelos momentos de
descontraccedilatildeo mas principalmente pelos grandes ensinamentos
Ao professor Prof Dr Roberto Santana da Silva pelo faacutermaco cedido pelas
sugestotildees pelo apoio e principalmente pela forma carinhosa que sempre me recebeu
Agrave professora Profa Dra Lusiane Maria Bendhack pelo apoio e pela grande
disponibilidade em todos os momentos em que precisei
Agrave professora Dra Renata Galvatildeo de Lima pela enorme ajuda amizade e pelas horas
de alegria
A Joseacute Honorato Ferreira Neto uma pessoa essencial para minha felicidade Obrigada
por confiar em mim e por resgatar em mim a vontade de conquistar meu espaccedilo Ao seu lado
sou muito feliz porque o amo e por causa do seu amor sou completa Obrigada por tudo Que
o nosso amor sempre contribua para nosso crescimento profissional e para nossa vida juntos
Amo vocecirc
Graccedilas a este trabalho conquistei amigas valiosas e eternas
Agrave minha amiga tatildeo querida Paty a melhor pessoa desse mundo Natildeo tenho palavras
para dizer tudo que jaacute fez por mim serei eternamente grata por tecirc-la como companheira A
certeza de ter seu ombro amigo me ajudou a enfrentar os mais diversos problemas Valeu
doida
Agrave minha amiga Alessandra a alegria em pessoa obrigada por tantos conselhos cafeacutes
terapias e festas Eacute um exemplo de vida para mim
A todo o grupo de Fotoquiacutemica e Fotobiologia por sempre me ajudarem Agrave Dani
Manfrim pelos ensinamentos e pela amizade A Fernando Lucas Primo pela enorme
disponibilidade em me socorrer e nesta uacuteltima etapa do trabalho tive a oportunidade de
reconhececirc-lo como um grande amigo Acircngelo Gilson e Paula obrigada pela amizade e pela
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oacutetima convivecircncia Marcilene Paloma Gisele Andreza Carol Dani Zancanela Nathaacutelia
todos os alunos da iniciaccedilatildeo obrigada pelo apoio e amizade
Agrave minha querida Oliacutempica o socorro imediato Natildeo apenas como teacutecnica do
laboratoacuterio mas uma amiga uacutenica Obrigada pelos conselhos e por sempre estar ao meu lado
Agraves minhas amigonas Nati Tati Carol Carolzinha Ciacutentia Flavitcha e Fernandinha que
sempre estatildeo a postos para o que der e vier adoro vocecircs Ao povo do ldquosaia justardquo aos que
faltaram citar Val os Jotas obrigada por este instante particular do nosso dia
Agraves minhas grandes amigas Ana Luacutecia e Alessandra pelo carinho e amizade desde a
infacircncia
Agrave Djuly (in memorian) pela fidelidade e pelo amor A saudade eacute infinita
Agraves minhas cunhadas e sobrinhos tios e tias principalmente meus padrinhos Neacuteia e
Deacutelio e tambeacutem minha madrinha Mai por sempre torcerem pelas minhas conquistas
Agrave Bernadete e ao Major pelo carinho com que me acolhem em sua casa todos os dias
Ao meu primeiro professor de Quiacutemica Joseacute Dirceu pela consideraccedilatildeo que sempre
demonstrou por mim
Agraves minhas companheiras de casa Jordana e Caacutessia pela ajuda diaacuteria e amizade
Ao pessoal da Secretaria do Departamento da Secretaria de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
especial a Lacircmia pela enorme paciecircncia e cooperaccedilatildeo
Agrave Capes CNPq pelos auxiacutelios financeiros sem os quais o trabalho natildeo seria
realizado
9
SUMAacuteRIO
RESUMO x
ABSTRACT xi
I INTRODUCcedilAtildeO 1
I1 Cacircncer 1
I2 Terapia Fotodinacircmica 2
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD 5
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica 9
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio12
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos15
II OBJETIVOS18
III PARTE EXPERIMENTAL 19
III1 Materiais 19
III2 Preparaccedilotildees 20
III3 Aparelhagem 22
III4 Meacutetodos 25
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo 25
III42 Preparaccedilatildeo da ZnPC do complexo de rutecircnio e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal26
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas 27
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal 28
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal 29
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
10
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 30
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto 31
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
31
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (Φ∆)
32
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 33
III411 Estudos in vitro 37
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10) 37
III4112 Controle da integridade da membrana celular 38
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 40
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto 41
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO42
IV1 Estudos Fotofiacutesicos 43
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal 43
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
48
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal 50
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
11
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal 52
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(Φ∆) 68
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 70
III2 Estudos in vitro 75
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 75
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto 77
V CONCLUSOtildeES 80
VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
17
τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
18
RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
19
ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
20
I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
21
radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
22
No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
23
A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
24
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
25
fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
26
3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
27
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
28
devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
29
fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
30
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
31
patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
32
[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
33
Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
34
pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
40
do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
41
comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
42
Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
43
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
44
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
45
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
46
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
47
obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
48
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
49
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
50
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
51
cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
52
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
53
)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
54
A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
56
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
57
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
69
fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
70
supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
71
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
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72
1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
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73
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
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74
Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
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75
Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
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76
por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
77
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
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78
Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
79
Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
80
ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
81
Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
82
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
83
Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
84
estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
85
Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
86
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
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Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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89
A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
90
De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
91
III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
92
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
93
Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
94
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
96
V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
97
Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
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Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Referecircncias Bibliograacuteficas
2
Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto Departamento de Quiacutemica Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Quiacutemica
lsquolsquoEstudo da associaccedilatildeo de complexos nitrosilos de rutecircnio
liberadores de NO com o agente fotossensibilizador Zinco
ftalocianina ZnPC em sistemas de liberaccedilatildeo utilizados na
Terapia Fotodinacircmicarsquorsquo
Daniela Silva Maranho
Orientador Prof Dr Antonio Claudio Tedesco
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave Faculdade de
Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto da
USP como parte das exigecircncias para a obtenccedilatildeo
do tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias Aacuterea Quiacutemica
RIBEIRAtildeO PRETO -SP
2008
3
FICHA CATALOGRAacuteFICA
Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo
de Ribeiratildeo Preto USP
Maranho Daniela Silva
Estudo da associaccedilatildeo de complexos nitrosilos de rutecircnio liberadores de NO com o agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina ZnPC em sistemas de liberaccedilatildeo utilizados na Terapia Fotodinacircmica 96 p il 30cm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo PretoUSP ndash Aacuterea de concentraccedilatildeo Quiacutemica Orientador Tedesco Antocircnio Claacuteudio
1 Terapia Fotodinacircmica 2 oacutexido niacutetrico 3 complexo nitrosilo de rutecircnio 4 neoplasias
4
Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto
Folha de Aprovaccedilatildeo
Membros da Comissatildeo Julgadora da Dissertaccedilatildeo de Mestrado de Daniela Silva Maranho
apresentada ao Departamento de Quiacutemica da Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de
Ribeiratildeo Preto ______
Comissatildeo Julgadora
____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo) ____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo) ____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo)
5
DEDICATOacuteRIA
Dedico este trabalho agrave minha famiacutelia
Primeiramente agrave Deisy Silva Maranho minha matildee grande mulher que com seu amor e alegria
sempre me motivou Seu apoio incondicional e imensuraacutevel me deu a forccedila necessaacuteria para
encarar todos os desafios para assim conseguir alcanccedilar tudo que desejei
Ao meu pai querido Alcides Maranho com seu carinho e amor sempre me guiou pelo
caminho do bem Homem sereno exemplo de honestidade seu caraacuteter singular foi a base da
minha formaccedilatildeo moral
Aos meus irmatildeos queridos
Dinho uma pessoa muito especial que com toda sua sensibilidade me mostrou que o que
importa nessa vida eacute ser feliz Um cuidado uacutenico comigo meu iacutedolo
Ana Deisy com sua ternura sempre foi a certeza de encontrar em casa o carinho mais sincero
Du atraveacutes de sua escolha me mostrou que natildeo haacute barreiras para alcanccedilarmos nossos sonhos
tudo eacute possiacutevel
Agrave minha querida avoacute Zica com seus 98 anos ainda reza por mim e confia nas minhas
conquistas
Obrigada pela confianccedila e por tanto amor
6
AGRADECIMENTOS
A Deus
por tudo que tenho por ser meu descanso e a certeza da minha felicidade Com a ajuda dos
anjos e santos consigo me manter firme e confiante
ldquoTudo posso naquele que me fortalecerdquo(Fl 413)
7
AGRADECIMENTOS
Principalmente ao Prof Dr Antonio Claudio Tedesco por ter confiado no meu
crescimento na pesquisa Obrigada pela paciecircncia pelo apoio carinho pelos momentos de
descontraccedilatildeo mas principalmente pelos grandes ensinamentos
Ao professor Prof Dr Roberto Santana da Silva pelo faacutermaco cedido pelas
sugestotildees pelo apoio e principalmente pela forma carinhosa que sempre me recebeu
Agrave professora Profa Dra Lusiane Maria Bendhack pelo apoio e pela grande
disponibilidade em todos os momentos em que precisei
Agrave professora Dra Renata Galvatildeo de Lima pela enorme ajuda amizade e pelas horas
de alegria
A Joseacute Honorato Ferreira Neto uma pessoa essencial para minha felicidade Obrigada
por confiar em mim e por resgatar em mim a vontade de conquistar meu espaccedilo Ao seu lado
sou muito feliz porque o amo e por causa do seu amor sou completa Obrigada por tudo Que
o nosso amor sempre contribua para nosso crescimento profissional e para nossa vida juntos
Amo vocecirc
Graccedilas a este trabalho conquistei amigas valiosas e eternas
Agrave minha amiga tatildeo querida Paty a melhor pessoa desse mundo Natildeo tenho palavras
para dizer tudo que jaacute fez por mim serei eternamente grata por tecirc-la como companheira A
certeza de ter seu ombro amigo me ajudou a enfrentar os mais diversos problemas Valeu
doida
Agrave minha amiga Alessandra a alegria em pessoa obrigada por tantos conselhos cafeacutes
terapias e festas Eacute um exemplo de vida para mim
A todo o grupo de Fotoquiacutemica e Fotobiologia por sempre me ajudarem Agrave Dani
Manfrim pelos ensinamentos e pela amizade A Fernando Lucas Primo pela enorme
disponibilidade em me socorrer e nesta uacuteltima etapa do trabalho tive a oportunidade de
reconhececirc-lo como um grande amigo Acircngelo Gilson e Paula obrigada pela amizade e pela
8
oacutetima convivecircncia Marcilene Paloma Gisele Andreza Carol Dani Zancanela Nathaacutelia
todos os alunos da iniciaccedilatildeo obrigada pelo apoio e amizade
Agrave minha querida Oliacutempica o socorro imediato Natildeo apenas como teacutecnica do
laboratoacuterio mas uma amiga uacutenica Obrigada pelos conselhos e por sempre estar ao meu lado
Agraves minhas amigonas Nati Tati Carol Carolzinha Ciacutentia Flavitcha e Fernandinha que
sempre estatildeo a postos para o que der e vier adoro vocecircs Ao povo do ldquosaia justardquo aos que
faltaram citar Val os Jotas obrigada por este instante particular do nosso dia
Agraves minhas grandes amigas Ana Luacutecia e Alessandra pelo carinho e amizade desde a
infacircncia
Agrave Djuly (in memorian) pela fidelidade e pelo amor A saudade eacute infinita
Agraves minhas cunhadas e sobrinhos tios e tias principalmente meus padrinhos Neacuteia e
Deacutelio e tambeacutem minha madrinha Mai por sempre torcerem pelas minhas conquistas
Agrave Bernadete e ao Major pelo carinho com que me acolhem em sua casa todos os dias
Ao meu primeiro professor de Quiacutemica Joseacute Dirceu pela consideraccedilatildeo que sempre
demonstrou por mim
Agraves minhas companheiras de casa Jordana e Caacutessia pela ajuda diaacuteria e amizade
Ao pessoal da Secretaria do Departamento da Secretaria de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
especial a Lacircmia pela enorme paciecircncia e cooperaccedilatildeo
Agrave Capes CNPq pelos auxiacutelios financeiros sem os quais o trabalho natildeo seria
realizado
9
SUMAacuteRIO
RESUMO x
ABSTRACT xi
I INTRODUCcedilAtildeO 1
I1 Cacircncer 1
I2 Terapia Fotodinacircmica 2
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD 5
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica 9
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio12
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos15
II OBJETIVOS18
III PARTE EXPERIMENTAL 19
III1 Materiais 19
III2 Preparaccedilotildees 20
III3 Aparelhagem 22
III4 Meacutetodos 25
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo 25
III42 Preparaccedilatildeo da ZnPC do complexo de rutecircnio e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal26
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas 27
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal 28
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal 29
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
10
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 30
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto 31
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
31
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (Φ∆)
32
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 33
III411 Estudos in vitro 37
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10) 37
III4112 Controle da integridade da membrana celular 38
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 40
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto 41
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO42
IV1 Estudos Fotofiacutesicos 43
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal 43
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
48
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal 50
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
11
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal 52
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(Φ∆) 68
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 70
III2 Estudos in vitro 75
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 75
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto 77
V CONCLUSOtildeES 80
VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
17
τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
18
RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
19
ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
20
I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
21
radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
22
No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
23
A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
24
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
25
fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
26
3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
27
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
28
devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
29
fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
30
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
32
[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
33
Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
40
do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
41
comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
42
Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
43
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
44
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
45
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
46
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
47
obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
48
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
49
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
50
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
51
cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
52
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
53
)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
54
A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
56
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
57
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
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supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
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Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
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1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
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volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
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Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
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Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
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por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
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Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
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Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
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Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
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ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
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Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
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Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
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Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
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estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
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Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
87
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
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88
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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89
A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
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90
De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
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91
III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
92
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
93
Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
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94
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
96
V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
97
Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
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3
FICHA CATALOGRAacuteFICA
Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo
de Ribeiratildeo Preto USP
Maranho Daniela Silva
Estudo da associaccedilatildeo de complexos nitrosilos de rutecircnio liberadores de NO com o agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina ZnPC em sistemas de liberaccedilatildeo utilizados na Terapia Fotodinacircmica 96 p il 30cm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo PretoUSP ndash Aacuterea de concentraccedilatildeo Quiacutemica Orientador Tedesco Antocircnio Claacuteudio
1 Terapia Fotodinacircmica 2 oacutexido niacutetrico 3 complexo nitrosilo de rutecircnio 4 neoplasias
4
Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto
Folha de Aprovaccedilatildeo
Membros da Comissatildeo Julgadora da Dissertaccedilatildeo de Mestrado de Daniela Silva Maranho
apresentada ao Departamento de Quiacutemica da Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de
Ribeiratildeo Preto ______
Comissatildeo Julgadora
____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo) ____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo) ____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo)
5
DEDICATOacuteRIA
Dedico este trabalho agrave minha famiacutelia
Primeiramente agrave Deisy Silva Maranho minha matildee grande mulher que com seu amor e alegria
sempre me motivou Seu apoio incondicional e imensuraacutevel me deu a forccedila necessaacuteria para
encarar todos os desafios para assim conseguir alcanccedilar tudo que desejei
Ao meu pai querido Alcides Maranho com seu carinho e amor sempre me guiou pelo
caminho do bem Homem sereno exemplo de honestidade seu caraacuteter singular foi a base da
minha formaccedilatildeo moral
Aos meus irmatildeos queridos
Dinho uma pessoa muito especial que com toda sua sensibilidade me mostrou que o que
importa nessa vida eacute ser feliz Um cuidado uacutenico comigo meu iacutedolo
Ana Deisy com sua ternura sempre foi a certeza de encontrar em casa o carinho mais sincero
Du atraveacutes de sua escolha me mostrou que natildeo haacute barreiras para alcanccedilarmos nossos sonhos
tudo eacute possiacutevel
Agrave minha querida avoacute Zica com seus 98 anos ainda reza por mim e confia nas minhas
conquistas
Obrigada pela confianccedila e por tanto amor
6
AGRADECIMENTOS
A Deus
por tudo que tenho por ser meu descanso e a certeza da minha felicidade Com a ajuda dos
anjos e santos consigo me manter firme e confiante
ldquoTudo posso naquele que me fortalecerdquo(Fl 413)
7
AGRADECIMENTOS
Principalmente ao Prof Dr Antonio Claudio Tedesco por ter confiado no meu
crescimento na pesquisa Obrigada pela paciecircncia pelo apoio carinho pelos momentos de
descontraccedilatildeo mas principalmente pelos grandes ensinamentos
Ao professor Prof Dr Roberto Santana da Silva pelo faacutermaco cedido pelas
sugestotildees pelo apoio e principalmente pela forma carinhosa que sempre me recebeu
Agrave professora Profa Dra Lusiane Maria Bendhack pelo apoio e pela grande
disponibilidade em todos os momentos em que precisei
Agrave professora Dra Renata Galvatildeo de Lima pela enorme ajuda amizade e pelas horas
de alegria
A Joseacute Honorato Ferreira Neto uma pessoa essencial para minha felicidade Obrigada
por confiar em mim e por resgatar em mim a vontade de conquistar meu espaccedilo Ao seu lado
sou muito feliz porque o amo e por causa do seu amor sou completa Obrigada por tudo Que
o nosso amor sempre contribua para nosso crescimento profissional e para nossa vida juntos
Amo vocecirc
Graccedilas a este trabalho conquistei amigas valiosas e eternas
Agrave minha amiga tatildeo querida Paty a melhor pessoa desse mundo Natildeo tenho palavras
para dizer tudo que jaacute fez por mim serei eternamente grata por tecirc-la como companheira A
certeza de ter seu ombro amigo me ajudou a enfrentar os mais diversos problemas Valeu
doida
Agrave minha amiga Alessandra a alegria em pessoa obrigada por tantos conselhos cafeacutes
terapias e festas Eacute um exemplo de vida para mim
A todo o grupo de Fotoquiacutemica e Fotobiologia por sempre me ajudarem Agrave Dani
Manfrim pelos ensinamentos e pela amizade A Fernando Lucas Primo pela enorme
disponibilidade em me socorrer e nesta uacuteltima etapa do trabalho tive a oportunidade de
reconhececirc-lo como um grande amigo Acircngelo Gilson e Paula obrigada pela amizade e pela
8
oacutetima convivecircncia Marcilene Paloma Gisele Andreza Carol Dani Zancanela Nathaacutelia
todos os alunos da iniciaccedilatildeo obrigada pelo apoio e amizade
Agrave minha querida Oliacutempica o socorro imediato Natildeo apenas como teacutecnica do
laboratoacuterio mas uma amiga uacutenica Obrigada pelos conselhos e por sempre estar ao meu lado
Agraves minhas amigonas Nati Tati Carol Carolzinha Ciacutentia Flavitcha e Fernandinha que
sempre estatildeo a postos para o que der e vier adoro vocecircs Ao povo do ldquosaia justardquo aos que
faltaram citar Val os Jotas obrigada por este instante particular do nosso dia
Agraves minhas grandes amigas Ana Luacutecia e Alessandra pelo carinho e amizade desde a
infacircncia
Agrave Djuly (in memorian) pela fidelidade e pelo amor A saudade eacute infinita
Agraves minhas cunhadas e sobrinhos tios e tias principalmente meus padrinhos Neacuteia e
Deacutelio e tambeacutem minha madrinha Mai por sempre torcerem pelas minhas conquistas
Agrave Bernadete e ao Major pelo carinho com que me acolhem em sua casa todos os dias
Ao meu primeiro professor de Quiacutemica Joseacute Dirceu pela consideraccedilatildeo que sempre
demonstrou por mim
Agraves minhas companheiras de casa Jordana e Caacutessia pela ajuda diaacuteria e amizade
Ao pessoal da Secretaria do Departamento da Secretaria de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
especial a Lacircmia pela enorme paciecircncia e cooperaccedilatildeo
Agrave Capes CNPq pelos auxiacutelios financeiros sem os quais o trabalho natildeo seria
realizado
9
SUMAacuteRIO
RESUMO x
ABSTRACT xi
I INTRODUCcedilAtildeO 1
I1 Cacircncer 1
I2 Terapia Fotodinacircmica 2
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD 5
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica 9
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio12
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos15
II OBJETIVOS18
III PARTE EXPERIMENTAL 19
III1 Materiais 19
III2 Preparaccedilotildees 20
III3 Aparelhagem 22
III4 Meacutetodos 25
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo 25
III42 Preparaccedilatildeo da ZnPC do complexo de rutecircnio e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal26
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas 27
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal 28
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal 29
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
10
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 30
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto 31
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
31
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (Φ∆)
32
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 33
III411 Estudos in vitro 37
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10) 37
III4112 Controle da integridade da membrana celular 38
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 40
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto 41
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO42
IV1 Estudos Fotofiacutesicos 43
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal 43
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
48
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal 50
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
11
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal 52
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(Φ∆) 68
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 70
III2 Estudos in vitro 75
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 75
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto 77
V CONCLUSOtildeES 80
VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
17
τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
18
RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
19
ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
20
I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
21
radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
22
No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
23
A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
24
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
25
fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
26
3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
27
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
28
devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
29
fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
30
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
31
patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
34
pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
40
do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
41
comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
42
Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
43
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
44
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
45
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
46
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
47
obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
48
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
49
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
50
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
51
cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
52
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
53
)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
54
A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
56
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
57
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
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68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
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69
fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
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70
supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
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71
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
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72
1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
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73
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
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74
Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
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75
Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
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76
por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
77
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
78
Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
79
Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
81
Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
84
estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
85
Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
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IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
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Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
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Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
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De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
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III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
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Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
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Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
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Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
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95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
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Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
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Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto
Folha de Aprovaccedilatildeo
Membros da Comissatildeo Julgadora da Dissertaccedilatildeo de Mestrado de Daniela Silva Maranho
apresentada ao Departamento de Quiacutemica da Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de
Ribeiratildeo Preto ______
Comissatildeo Julgadora
____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo) ____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo) ____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo)
5
DEDICATOacuteRIA
Dedico este trabalho agrave minha famiacutelia
Primeiramente agrave Deisy Silva Maranho minha matildee grande mulher que com seu amor e alegria
sempre me motivou Seu apoio incondicional e imensuraacutevel me deu a forccedila necessaacuteria para
encarar todos os desafios para assim conseguir alcanccedilar tudo que desejei
Ao meu pai querido Alcides Maranho com seu carinho e amor sempre me guiou pelo
caminho do bem Homem sereno exemplo de honestidade seu caraacuteter singular foi a base da
minha formaccedilatildeo moral
Aos meus irmatildeos queridos
Dinho uma pessoa muito especial que com toda sua sensibilidade me mostrou que o que
importa nessa vida eacute ser feliz Um cuidado uacutenico comigo meu iacutedolo
Ana Deisy com sua ternura sempre foi a certeza de encontrar em casa o carinho mais sincero
Du atraveacutes de sua escolha me mostrou que natildeo haacute barreiras para alcanccedilarmos nossos sonhos
tudo eacute possiacutevel
Agrave minha querida avoacute Zica com seus 98 anos ainda reza por mim e confia nas minhas
conquistas
Obrigada pela confianccedila e por tanto amor
6
AGRADECIMENTOS
A Deus
por tudo que tenho por ser meu descanso e a certeza da minha felicidade Com a ajuda dos
anjos e santos consigo me manter firme e confiante
ldquoTudo posso naquele que me fortalecerdquo(Fl 413)
7
AGRADECIMENTOS
Principalmente ao Prof Dr Antonio Claudio Tedesco por ter confiado no meu
crescimento na pesquisa Obrigada pela paciecircncia pelo apoio carinho pelos momentos de
descontraccedilatildeo mas principalmente pelos grandes ensinamentos
Ao professor Prof Dr Roberto Santana da Silva pelo faacutermaco cedido pelas
sugestotildees pelo apoio e principalmente pela forma carinhosa que sempre me recebeu
Agrave professora Profa Dra Lusiane Maria Bendhack pelo apoio e pela grande
disponibilidade em todos os momentos em que precisei
Agrave professora Dra Renata Galvatildeo de Lima pela enorme ajuda amizade e pelas horas
de alegria
A Joseacute Honorato Ferreira Neto uma pessoa essencial para minha felicidade Obrigada
por confiar em mim e por resgatar em mim a vontade de conquistar meu espaccedilo Ao seu lado
sou muito feliz porque o amo e por causa do seu amor sou completa Obrigada por tudo Que
o nosso amor sempre contribua para nosso crescimento profissional e para nossa vida juntos
Amo vocecirc
Graccedilas a este trabalho conquistei amigas valiosas e eternas
Agrave minha amiga tatildeo querida Paty a melhor pessoa desse mundo Natildeo tenho palavras
para dizer tudo que jaacute fez por mim serei eternamente grata por tecirc-la como companheira A
certeza de ter seu ombro amigo me ajudou a enfrentar os mais diversos problemas Valeu
doida
Agrave minha amiga Alessandra a alegria em pessoa obrigada por tantos conselhos cafeacutes
terapias e festas Eacute um exemplo de vida para mim
A todo o grupo de Fotoquiacutemica e Fotobiologia por sempre me ajudarem Agrave Dani
Manfrim pelos ensinamentos e pela amizade A Fernando Lucas Primo pela enorme
disponibilidade em me socorrer e nesta uacuteltima etapa do trabalho tive a oportunidade de
reconhececirc-lo como um grande amigo Acircngelo Gilson e Paula obrigada pela amizade e pela
8
oacutetima convivecircncia Marcilene Paloma Gisele Andreza Carol Dani Zancanela Nathaacutelia
todos os alunos da iniciaccedilatildeo obrigada pelo apoio e amizade
Agrave minha querida Oliacutempica o socorro imediato Natildeo apenas como teacutecnica do
laboratoacuterio mas uma amiga uacutenica Obrigada pelos conselhos e por sempre estar ao meu lado
Agraves minhas amigonas Nati Tati Carol Carolzinha Ciacutentia Flavitcha e Fernandinha que
sempre estatildeo a postos para o que der e vier adoro vocecircs Ao povo do ldquosaia justardquo aos que
faltaram citar Val os Jotas obrigada por este instante particular do nosso dia
Agraves minhas grandes amigas Ana Luacutecia e Alessandra pelo carinho e amizade desde a
infacircncia
Agrave Djuly (in memorian) pela fidelidade e pelo amor A saudade eacute infinita
Agraves minhas cunhadas e sobrinhos tios e tias principalmente meus padrinhos Neacuteia e
Deacutelio e tambeacutem minha madrinha Mai por sempre torcerem pelas minhas conquistas
Agrave Bernadete e ao Major pelo carinho com que me acolhem em sua casa todos os dias
Ao meu primeiro professor de Quiacutemica Joseacute Dirceu pela consideraccedilatildeo que sempre
demonstrou por mim
Agraves minhas companheiras de casa Jordana e Caacutessia pela ajuda diaacuteria e amizade
Ao pessoal da Secretaria do Departamento da Secretaria de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
especial a Lacircmia pela enorme paciecircncia e cooperaccedilatildeo
Agrave Capes CNPq pelos auxiacutelios financeiros sem os quais o trabalho natildeo seria
realizado
9
SUMAacuteRIO
RESUMO x
ABSTRACT xi
I INTRODUCcedilAtildeO 1
I1 Cacircncer 1
I2 Terapia Fotodinacircmica 2
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD 5
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica 9
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio12
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos15
II OBJETIVOS18
III PARTE EXPERIMENTAL 19
III1 Materiais 19
III2 Preparaccedilotildees 20
III3 Aparelhagem 22
III4 Meacutetodos 25
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo 25
III42 Preparaccedilatildeo da ZnPC do complexo de rutecircnio e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal26
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas 27
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal 28
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal 29
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
10
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 30
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto 31
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
31
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (Φ∆)
32
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 33
III411 Estudos in vitro 37
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10) 37
III4112 Controle da integridade da membrana celular 38
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 40
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto 41
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO42
IV1 Estudos Fotofiacutesicos 43
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal 43
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
48
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal 50
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
11
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal 52
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(Φ∆) 68
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 70
III2 Estudos in vitro 75
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 75
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto 77
V CONCLUSOtildeES 80
VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
17
τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
18
RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
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ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
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I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
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I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
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fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
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3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
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I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
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devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
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fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
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I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
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patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
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[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
33
Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
34
pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
40
do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
41
comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
42
Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
43
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
44
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
45
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
46
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
47
obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
48
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
49
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
50
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
51
cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
52
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
53
)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
54
A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
56
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
57
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
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66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
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67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
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68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
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69
fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
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70
supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
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71
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
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72
1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
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73
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
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74
Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
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75
Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
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76
por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
77
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
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78
Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
79
Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
80
ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
81
Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
82
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
83
Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
84
estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
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85
Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
86
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
87
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
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88
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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89
A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
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90
De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
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91
III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
92
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
93
Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
94
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
96
V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
97
Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
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5
DEDICATOacuteRIA
Dedico este trabalho agrave minha famiacutelia
Primeiramente agrave Deisy Silva Maranho minha matildee grande mulher que com seu amor e alegria
sempre me motivou Seu apoio incondicional e imensuraacutevel me deu a forccedila necessaacuteria para
encarar todos os desafios para assim conseguir alcanccedilar tudo que desejei
Ao meu pai querido Alcides Maranho com seu carinho e amor sempre me guiou pelo
caminho do bem Homem sereno exemplo de honestidade seu caraacuteter singular foi a base da
minha formaccedilatildeo moral
Aos meus irmatildeos queridos
Dinho uma pessoa muito especial que com toda sua sensibilidade me mostrou que o que
importa nessa vida eacute ser feliz Um cuidado uacutenico comigo meu iacutedolo
Ana Deisy com sua ternura sempre foi a certeza de encontrar em casa o carinho mais sincero
Du atraveacutes de sua escolha me mostrou que natildeo haacute barreiras para alcanccedilarmos nossos sonhos
tudo eacute possiacutevel
Agrave minha querida avoacute Zica com seus 98 anos ainda reza por mim e confia nas minhas
conquistas
Obrigada pela confianccedila e por tanto amor
6
AGRADECIMENTOS
A Deus
por tudo que tenho por ser meu descanso e a certeza da minha felicidade Com a ajuda dos
anjos e santos consigo me manter firme e confiante
ldquoTudo posso naquele que me fortalecerdquo(Fl 413)
7
AGRADECIMENTOS
Principalmente ao Prof Dr Antonio Claudio Tedesco por ter confiado no meu
crescimento na pesquisa Obrigada pela paciecircncia pelo apoio carinho pelos momentos de
descontraccedilatildeo mas principalmente pelos grandes ensinamentos
Ao professor Prof Dr Roberto Santana da Silva pelo faacutermaco cedido pelas
sugestotildees pelo apoio e principalmente pela forma carinhosa que sempre me recebeu
Agrave professora Profa Dra Lusiane Maria Bendhack pelo apoio e pela grande
disponibilidade em todos os momentos em que precisei
Agrave professora Dra Renata Galvatildeo de Lima pela enorme ajuda amizade e pelas horas
de alegria
A Joseacute Honorato Ferreira Neto uma pessoa essencial para minha felicidade Obrigada
por confiar em mim e por resgatar em mim a vontade de conquistar meu espaccedilo Ao seu lado
sou muito feliz porque o amo e por causa do seu amor sou completa Obrigada por tudo Que
o nosso amor sempre contribua para nosso crescimento profissional e para nossa vida juntos
Amo vocecirc
Graccedilas a este trabalho conquistei amigas valiosas e eternas
Agrave minha amiga tatildeo querida Paty a melhor pessoa desse mundo Natildeo tenho palavras
para dizer tudo que jaacute fez por mim serei eternamente grata por tecirc-la como companheira A
certeza de ter seu ombro amigo me ajudou a enfrentar os mais diversos problemas Valeu
doida
Agrave minha amiga Alessandra a alegria em pessoa obrigada por tantos conselhos cafeacutes
terapias e festas Eacute um exemplo de vida para mim
A todo o grupo de Fotoquiacutemica e Fotobiologia por sempre me ajudarem Agrave Dani
Manfrim pelos ensinamentos e pela amizade A Fernando Lucas Primo pela enorme
disponibilidade em me socorrer e nesta uacuteltima etapa do trabalho tive a oportunidade de
reconhececirc-lo como um grande amigo Acircngelo Gilson e Paula obrigada pela amizade e pela
8
oacutetima convivecircncia Marcilene Paloma Gisele Andreza Carol Dani Zancanela Nathaacutelia
todos os alunos da iniciaccedilatildeo obrigada pelo apoio e amizade
Agrave minha querida Oliacutempica o socorro imediato Natildeo apenas como teacutecnica do
laboratoacuterio mas uma amiga uacutenica Obrigada pelos conselhos e por sempre estar ao meu lado
Agraves minhas amigonas Nati Tati Carol Carolzinha Ciacutentia Flavitcha e Fernandinha que
sempre estatildeo a postos para o que der e vier adoro vocecircs Ao povo do ldquosaia justardquo aos que
faltaram citar Val os Jotas obrigada por este instante particular do nosso dia
Agraves minhas grandes amigas Ana Luacutecia e Alessandra pelo carinho e amizade desde a
infacircncia
Agrave Djuly (in memorian) pela fidelidade e pelo amor A saudade eacute infinita
Agraves minhas cunhadas e sobrinhos tios e tias principalmente meus padrinhos Neacuteia e
Deacutelio e tambeacutem minha madrinha Mai por sempre torcerem pelas minhas conquistas
Agrave Bernadete e ao Major pelo carinho com que me acolhem em sua casa todos os dias
Ao meu primeiro professor de Quiacutemica Joseacute Dirceu pela consideraccedilatildeo que sempre
demonstrou por mim
Agraves minhas companheiras de casa Jordana e Caacutessia pela ajuda diaacuteria e amizade
Ao pessoal da Secretaria do Departamento da Secretaria de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
especial a Lacircmia pela enorme paciecircncia e cooperaccedilatildeo
Agrave Capes CNPq pelos auxiacutelios financeiros sem os quais o trabalho natildeo seria
realizado
9
SUMAacuteRIO
RESUMO x
ABSTRACT xi
I INTRODUCcedilAtildeO 1
I1 Cacircncer 1
I2 Terapia Fotodinacircmica 2
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD 5
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica 9
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio12
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos15
II OBJETIVOS18
III PARTE EXPERIMENTAL 19
III1 Materiais 19
III2 Preparaccedilotildees 20
III3 Aparelhagem 22
III4 Meacutetodos 25
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo 25
III42 Preparaccedilatildeo da ZnPC do complexo de rutecircnio e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal26
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas 27
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal 28
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal 29
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
10
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 30
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto 31
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
31
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (Φ∆)
32
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 33
III411 Estudos in vitro 37
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10) 37
III4112 Controle da integridade da membrana celular 38
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 40
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto 41
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO42
IV1 Estudos Fotofiacutesicos 43
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal 43
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
48
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal 50
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
11
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal 52
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(Φ∆) 68
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 70
III2 Estudos in vitro 75
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 75
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto 77
V CONCLUSOtildeES 80
VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
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τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
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RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
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ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
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I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
21
radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
22
No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
23
A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
24
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
25
fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
26
3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
27
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
28
devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
29
fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
31
patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
32
[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
33
Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
34
pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
40
do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
41
comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
42
Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
43
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
44
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
45
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
46
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
47
obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
48
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
49
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
50
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
51
cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
52
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
53
)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
54
A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
56
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
57
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
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65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
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66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
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67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
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68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
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69
fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
70
supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
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71
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
72
1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
73
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
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74
Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
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75
Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
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76
por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
77
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
78
Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
79
Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
80
ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
81
Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
82
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
83
Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
84
estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
85
Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
86
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
87
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
88
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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89
A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
90
De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
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91
III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
92
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
93
Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
94
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
96
V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
97
Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
98
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6
AGRADECIMENTOS
A Deus
por tudo que tenho por ser meu descanso e a certeza da minha felicidade Com a ajuda dos
anjos e santos consigo me manter firme e confiante
ldquoTudo posso naquele que me fortalecerdquo(Fl 413)
7
AGRADECIMENTOS
Principalmente ao Prof Dr Antonio Claudio Tedesco por ter confiado no meu
crescimento na pesquisa Obrigada pela paciecircncia pelo apoio carinho pelos momentos de
descontraccedilatildeo mas principalmente pelos grandes ensinamentos
Ao professor Prof Dr Roberto Santana da Silva pelo faacutermaco cedido pelas
sugestotildees pelo apoio e principalmente pela forma carinhosa que sempre me recebeu
Agrave professora Profa Dra Lusiane Maria Bendhack pelo apoio e pela grande
disponibilidade em todos os momentos em que precisei
Agrave professora Dra Renata Galvatildeo de Lima pela enorme ajuda amizade e pelas horas
de alegria
A Joseacute Honorato Ferreira Neto uma pessoa essencial para minha felicidade Obrigada
por confiar em mim e por resgatar em mim a vontade de conquistar meu espaccedilo Ao seu lado
sou muito feliz porque o amo e por causa do seu amor sou completa Obrigada por tudo Que
o nosso amor sempre contribua para nosso crescimento profissional e para nossa vida juntos
Amo vocecirc
Graccedilas a este trabalho conquistei amigas valiosas e eternas
Agrave minha amiga tatildeo querida Paty a melhor pessoa desse mundo Natildeo tenho palavras
para dizer tudo que jaacute fez por mim serei eternamente grata por tecirc-la como companheira A
certeza de ter seu ombro amigo me ajudou a enfrentar os mais diversos problemas Valeu
doida
Agrave minha amiga Alessandra a alegria em pessoa obrigada por tantos conselhos cafeacutes
terapias e festas Eacute um exemplo de vida para mim
A todo o grupo de Fotoquiacutemica e Fotobiologia por sempre me ajudarem Agrave Dani
Manfrim pelos ensinamentos e pela amizade A Fernando Lucas Primo pela enorme
disponibilidade em me socorrer e nesta uacuteltima etapa do trabalho tive a oportunidade de
reconhececirc-lo como um grande amigo Acircngelo Gilson e Paula obrigada pela amizade e pela
8
oacutetima convivecircncia Marcilene Paloma Gisele Andreza Carol Dani Zancanela Nathaacutelia
todos os alunos da iniciaccedilatildeo obrigada pelo apoio e amizade
Agrave minha querida Oliacutempica o socorro imediato Natildeo apenas como teacutecnica do
laboratoacuterio mas uma amiga uacutenica Obrigada pelos conselhos e por sempre estar ao meu lado
Agraves minhas amigonas Nati Tati Carol Carolzinha Ciacutentia Flavitcha e Fernandinha que
sempre estatildeo a postos para o que der e vier adoro vocecircs Ao povo do ldquosaia justardquo aos que
faltaram citar Val os Jotas obrigada por este instante particular do nosso dia
Agraves minhas grandes amigas Ana Luacutecia e Alessandra pelo carinho e amizade desde a
infacircncia
Agrave Djuly (in memorian) pela fidelidade e pelo amor A saudade eacute infinita
Agraves minhas cunhadas e sobrinhos tios e tias principalmente meus padrinhos Neacuteia e
Deacutelio e tambeacutem minha madrinha Mai por sempre torcerem pelas minhas conquistas
Agrave Bernadete e ao Major pelo carinho com que me acolhem em sua casa todos os dias
Ao meu primeiro professor de Quiacutemica Joseacute Dirceu pela consideraccedilatildeo que sempre
demonstrou por mim
Agraves minhas companheiras de casa Jordana e Caacutessia pela ajuda diaacuteria e amizade
Ao pessoal da Secretaria do Departamento da Secretaria de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
especial a Lacircmia pela enorme paciecircncia e cooperaccedilatildeo
Agrave Capes CNPq pelos auxiacutelios financeiros sem os quais o trabalho natildeo seria
realizado
9
SUMAacuteRIO
RESUMO x
ABSTRACT xi
I INTRODUCcedilAtildeO 1
I1 Cacircncer 1
I2 Terapia Fotodinacircmica 2
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD 5
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica 9
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio12
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos15
II OBJETIVOS18
III PARTE EXPERIMENTAL 19
III1 Materiais 19
III2 Preparaccedilotildees 20
III3 Aparelhagem 22
III4 Meacutetodos 25
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo 25
III42 Preparaccedilatildeo da ZnPC do complexo de rutecircnio e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal26
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas 27
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal 28
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal 29
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
10
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 30
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto 31
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
31
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (Φ∆)
32
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 33
III411 Estudos in vitro 37
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10) 37
III4112 Controle da integridade da membrana celular 38
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 40
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto 41
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO42
IV1 Estudos Fotofiacutesicos 43
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal 43
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
48
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal 50
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
11
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal 52
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(Φ∆) 68
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 70
III2 Estudos in vitro 75
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 75
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto 77
V CONCLUSOtildeES 80
VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
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τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
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RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
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ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
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I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
21
radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
22
No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
23
A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
24
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
25
fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
26
3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
27
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
28
devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
29
fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
31
patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
32
[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
33
Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
34
pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
40
do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
41
comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
42
Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
43
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
44
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
45
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
46
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
47
obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
48
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
49
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
50
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
51
cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
52
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
53
)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
54
A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
56
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
57
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
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65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
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66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
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67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
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68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
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69
fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
70
supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
71
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
72
1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
73
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
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74
Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
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75
Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
76
por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
77
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
78
Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
79
Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
80
ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
81
Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
82
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
83
Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
84
estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
85
Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
86
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
87
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
88
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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89
A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
90
De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
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91
III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
92
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
93
Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
94
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
96
V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
97
Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
98
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7
AGRADECIMENTOS
Principalmente ao Prof Dr Antonio Claudio Tedesco por ter confiado no meu
crescimento na pesquisa Obrigada pela paciecircncia pelo apoio carinho pelos momentos de
descontraccedilatildeo mas principalmente pelos grandes ensinamentos
Ao professor Prof Dr Roberto Santana da Silva pelo faacutermaco cedido pelas
sugestotildees pelo apoio e principalmente pela forma carinhosa que sempre me recebeu
Agrave professora Profa Dra Lusiane Maria Bendhack pelo apoio e pela grande
disponibilidade em todos os momentos em que precisei
Agrave professora Dra Renata Galvatildeo de Lima pela enorme ajuda amizade e pelas horas
de alegria
A Joseacute Honorato Ferreira Neto uma pessoa essencial para minha felicidade Obrigada
por confiar em mim e por resgatar em mim a vontade de conquistar meu espaccedilo Ao seu lado
sou muito feliz porque o amo e por causa do seu amor sou completa Obrigada por tudo Que
o nosso amor sempre contribua para nosso crescimento profissional e para nossa vida juntos
Amo vocecirc
Graccedilas a este trabalho conquistei amigas valiosas e eternas
Agrave minha amiga tatildeo querida Paty a melhor pessoa desse mundo Natildeo tenho palavras
para dizer tudo que jaacute fez por mim serei eternamente grata por tecirc-la como companheira A
certeza de ter seu ombro amigo me ajudou a enfrentar os mais diversos problemas Valeu
doida
Agrave minha amiga Alessandra a alegria em pessoa obrigada por tantos conselhos cafeacutes
terapias e festas Eacute um exemplo de vida para mim
A todo o grupo de Fotoquiacutemica e Fotobiologia por sempre me ajudarem Agrave Dani
Manfrim pelos ensinamentos e pela amizade A Fernando Lucas Primo pela enorme
disponibilidade em me socorrer e nesta uacuteltima etapa do trabalho tive a oportunidade de
reconhececirc-lo como um grande amigo Acircngelo Gilson e Paula obrigada pela amizade e pela
8
oacutetima convivecircncia Marcilene Paloma Gisele Andreza Carol Dani Zancanela Nathaacutelia
todos os alunos da iniciaccedilatildeo obrigada pelo apoio e amizade
Agrave minha querida Oliacutempica o socorro imediato Natildeo apenas como teacutecnica do
laboratoacuterio mas uma amiga uacutenica Obrigada pelos conselhos e por sempre estar ao meu lado
Agraves minhas amigonas Nati Tati Carol Carolzinha Ciacutentia Flavitcha e Fernandinha que
sempre estatildeo a postos para o que der e vier adoro vocecircs Ao povo do ldquosaia justardquo aos que
faltaram citar Val os Jotas obrigada por este instante particular do nosso dia
Agraves minhas grandes amigas Ana Luacutecia e Alessandra pelo carinho e amizade desde a
infacircncia
Agrave Djuly (in memorian) pela fidelidade e pelo amor A saudade eacute infinita
Agraves minhas cunhadas e sobrinhos tios e tias principalmente meus padrinhos Neacuteia e
Deacutelio e tambeacutem minha madrinha Mai por sempre torcerem pelas minhas conquistas
Agrave Bernadete e ao Major pelo carinho com que me acolhem em sua casa todos os dias
Ao meu primeiro professor de Quiacutemica Joseacute Dirceu pela consideraccedilatildeo que sempre
demonstrou por mim
Agraves minhas companheiras de casa Jordana e Caacutessia pela ajuda diaacuteria e amizade
Ao pessoal da Secretaria do Departamento da Secretaria de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
especial a Lacircmia pela enorme paciecircncia e cooperaccedilatildeo
Agrave Capes CNPq pelos auxiacutelios financeiros sem os quais o trabalho natildeo seria
realizado
9
SUMAacuteRIO
RESUMO x
ABSTRACT xi
I INTRODUCcedilAtildeO 1
I1 Cacircncer 1
I2 Terapia Fotodinacircmica 2
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD 5
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica 9
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio12
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos15
II OBJETIVOS18
III PARTE EXPERIMENTAL 19
III1 Materiais 19
III2 Preparaccedilotildees 20
III3 Aparelhagem 22
III4 Meacutetodos 25
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo 25
III42 Preparaccedilatildeo da ZnPC do complexo de rutecircnio e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal26
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas 27
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal 28
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal 29
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
10
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 30
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto 31
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
31
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (Φ∆)
32
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 33
III411 Estudos in vitro 37
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10) 37
III4112 Controle da integridade da membrana celular 38
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 40
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto 41
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO42
IV1 Estudos Fotofiacutesicos 43
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal 43
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
48
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal 50
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
11
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal 52
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(Φ∆) 68
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 70
III2 Estudos in vitro 75
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 75
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto 77
V CONCLUSOtildeES 80
VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
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τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
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RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
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ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
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I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
21
radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
23
A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
24
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
25
fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
26
3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
27
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
28
devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
29
fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
31
patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
32
[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
33
Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
34
pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
40
do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
41
comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
42
Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
43
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
44
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
45
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
46
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
47
obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
48
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
49
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
50
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
51
cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
52
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
53
)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
54
A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
56
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
57
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
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65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
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66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
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67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
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68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
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69
fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
70
supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
71
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
72
1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
73
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
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74
Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
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75
Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
76
por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
77
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
78
Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
79
Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
80
ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
81
Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
82
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
83
Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
84
estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
85
Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
86
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
87
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
88
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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89
A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
90
De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
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91
III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
92
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
93
Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
94
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
96
V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
97
Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
98
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8
oacutetima convivecircncia Marcilene Paloma Gisele Andreza Carol Dani Zancanela Nathaacutelia
todos os alunos da iniciaccedilatildeo obrigada pelo apoio e amizade
Agrave minha querida Oliacutempica o socorro imediato Natildeo apenas como teacutecnica do
laboratoacuterio mas uma amiga uacutenica Obrigada pelos conselhos e por sempre estar ao meu lado
Agraves minhas amigonas Nati Tati Carol Carolzinha Ciacutentia Flavitcha e Fernandinha que
sempre estatildeo a postos para o que der e vier adoro vocecircs Ao povo do ldquosaia justardquo aos que
faltaram citar Val os Jotas obrigada por este instante particular do nosso dia
Agraves minhas grandes amigas Ana Luacutecia e Alessandra pelo carinho e amizade desde a
infacircncia
Agrave Djuly (in memorian) pela fidelidade e pelo amor A saudade eacute infinita
Agraves minhas cunhadas e sobrinhos tios e tias principalmente meus padrinhos Neacuteia e
Deacutelio e tambeacutem minha madrinha Mai por sempre torcerem pelas minhas conquistas
Agrave Bernadete e ao Major pelo carinho com que me acolhem em sua casa todos os dias
Ao meu primeiro professor de Quiacutemica Joseacute Dirceu pela consideraccedilatildeo que sempre
demonstrou por mim
Agraves minhas companheiras de casa Jordana e Caacutessia pela ajuda diaacuteria e amizade
Ao pessoal da Secretaria do Departamento da Secretaria de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
especial a Lacircmia pela enorme paciecircncia e cooperaccedilatildeo
Agrave Capes CNPq pelos auxiacutelios financeiros sem os quais o trabalho natildeo seria
realizado
9
SUMAacuteRIO
RESUMO x
ABSTRACT xi
I INTRODUCcedilAtildeO 1
I1 Cacircncer 1
I2 Terapia Fotodinacircmica 2
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD 5
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica 9
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio12
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos15
II OBJETIVOS18
III PARTE EXPERIMENTAL 19
III1 Materiais 19
III2 Preparaccedilotildees 20
III3 Aparelhagem 22
III4 Meacutetodos 25
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo 25
III42 Preparaccedilatildeo da ZnPC do complexo de rutecircnio e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal26
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas 27
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal 28
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal 29
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
10
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 30
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto 31
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
31
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (Φ∆)
32
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 33
III411 Estudos in vitro 37
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10) 37
III4112 Controle da integridade da membrana celular 38
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 40
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto 41
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO42
IV1 Estudos Fotofiacutesicos 43
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal 43
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
48
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal 50
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
11
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal 52
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(Φ∆) 68
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 70
III2 Estudos in vitro 75
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 75
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto 77
V CONCLUSOtildeES 80
VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
17
τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
18
RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
19
ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
20
I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
21
radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
22
No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
23
A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
24
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
25
fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
26
3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
27
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
28
devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
29
fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
30
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
32
[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
33
Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
34
pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
40
do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
41
comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
42
Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
43
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
44
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
45
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
46
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
47
obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
48
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
49
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
50
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
51
cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
52
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
53
)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
54
A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
56
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
57
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
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66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
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67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
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68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
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69
fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
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70
supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
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71
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
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72
1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
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73
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
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74
Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
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75
Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
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76
por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
77
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
78
Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
79
Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
80
ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
81
Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
82
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
83
Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
84
estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
85
Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
86
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
87
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
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88
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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89
A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
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90
De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
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91
III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
92
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
93
Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
94
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
96
V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
97
Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
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9
SUMAacuteRIO
RESUMO x
ABSTRACT xi
I INTRODUCcedilAtildeO 1
I1 Cacircncer 1
I2 Terapia Fotodinacircmica 2
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD 5
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica 9
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio12
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos15
II OBJETIVOS18
III PARTE EXPERIMENTAL 19
III1 Materiais 19
III2 Preparaccedilotildees 20
III3 Aparelhagem 22
III4 Meacutetodos 25
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo 25
III42 Preparaccedilatildeo da ZnPC do complexo de rutecircnio e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal26
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas 27
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal 28
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal 29
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
10
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 30
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto 31
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
31
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (Φ∆)
32
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 33
III411 Estudos in vitro 37
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10) 37
III4112 Controle da integridade da membrana celular 38
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 40
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto 41
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO42
IV1 Estudos Fotofiacutesicos 43
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal 43
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
48
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal 50
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
11
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal 52
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(Φ∆) 68
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 70
III2 Estudos in vitro 75
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 75
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto 77
V CONCLUSOtildeES 80
VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
17
τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
18
RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
19
ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
20
I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
21
radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
22
No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
23
A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
25
fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
26
3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
27
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
28
devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
29
fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
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pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
40
do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
41
comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
42
Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
43
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
44
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
45
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
46
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
47
obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
48
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
49
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
50
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
51
cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
52
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
53
)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
54
A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
56
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
57
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
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68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
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69
fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
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70
supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
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71
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
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72
1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
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73
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
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74
Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
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Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
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76
por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
77
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
78
Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
79
Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
81
Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
84
estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
85
Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
86
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
87
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
88
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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89
A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
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90
De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
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91
III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
92
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
93
Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
94
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
96
V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
97
Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
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10
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 30
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto 31
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
31
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (Φ∆)
32
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 33
III411 Estudos in vitro 37
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10) 37
III4112 Controle da integridade da membrana celular 38
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 40
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto 41
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO42
IV1 Estudos Fotofiacutesicos 43
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal 43
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
48
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal 50
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
11
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal 52
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(Φ∆) 68
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 70
III2 Estudos in vitro 75
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 75
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto 77
V CONCLUSOtildeES 80
VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
17
τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
18
RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
19
ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
20
I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
21
radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
22
No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
23
A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
24
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
25
fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
26
3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
27
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
28
devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
29
fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
30
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
31
patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
32
[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
33
Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
34
pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
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38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
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39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
40
do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
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41
comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
42
Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
43
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
44
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
45
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
46
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
47
obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
48
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
49
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
50
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
51
cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
52
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
53
)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
54
A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
56
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
57
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
69
fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
70
supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
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71
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
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72
1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
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73
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
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74
Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
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75
Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
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76
por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
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77
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
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78
Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
79
Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
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80
ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
81
Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
83
Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
84
estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
86
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
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Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
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Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
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90
De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
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91
III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
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92
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
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93
Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
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94
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
96
V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
97
Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
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Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Referecircncias Bibliograacuteficas
11
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal 52
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(Φ∆) 68
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em
675 nm 70
III2 Estudos in vitro 75
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz 75
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto 77
V CONCLUSOtildeES 80
VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
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16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
17
τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
18
RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
19
ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
20
I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
21
radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
22
No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
23
A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
24
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
25
fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
26
3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
27
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
28
devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
29
fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
30
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
31
patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
32
[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
33
Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
34
pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
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do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
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comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
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Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
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Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
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As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
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III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
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Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
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obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
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III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
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III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
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Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
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cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
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Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
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)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
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A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
56
III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
57
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
69
fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
70
supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
71
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
72
1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
73
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
74
Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
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75
Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
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76
por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
77
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
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78
Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
79
Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
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80
ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
81
Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
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82
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
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83
Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
84
estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
85
Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
86
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
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87
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
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88
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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89
A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
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90
De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
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91
III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
92
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
93
Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
94
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
96
V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
97
Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-
tpy) --
15
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar
mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------
16
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em
tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------
45
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610
nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------
46
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do
complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----
47
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada
ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC
(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500
micromolL-1) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da
ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy
(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------
53
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em
10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o
comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de
liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02
V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
13
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo
Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------
61
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo
de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada
ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes
excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo
maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento
dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em
lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-
tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo
do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de
incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=
lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =
ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50
micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------
76
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas
B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-
tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =
ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -
----------------------------------------------------------------------------
78
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14
LISTA DE TABELAS
Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50
Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59
Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do
oxigecircnio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas
com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
15
LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio
EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio
NO Oacutexido niacutetrico
TFD Terapia fotodinacircmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1O2 Oxigecircnio singlete
bullOH Radical hidroxila
bullO2minus Acircnion radical superoacutexido
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
S0 Estado fundamental
Sn Estado excitado singlete superior
S1 Estado excitado singlete
T1 Estado excitado triplete
0F Fotossensibilizador no estado fundamental
1F Fotossensibilizador no estado singlete
3F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato bioloacutegico
3O2 Oxigecircnio molecular
S-OOH Peroacutexidos
NO+ Iacuteon nitrosocircnio
NO- Acircnion nitroacutexido
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
16
O2 Gaacutes oxigecircnio
CO Monoacutexido de carbono
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio
DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retiacuteculo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfoacutexido
ε Coeficiente de absortividade molar
If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor
If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor
kq Constante de supressatildeo
τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor
[Q] Concentraccedilatildeo do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia
Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete
ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO
MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium
τs Tempo de vida de fluorescecircncia
A Amplitude relativa
T1 Estado triplete excitado
17
τt Tempo de vida dos estados tripletes
1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental
3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho
18
RESUMO
Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente
pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica
Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto
ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido
no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil
fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo
Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o
complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)
Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio
lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies
reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo
19
ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the
neoplastic cell line
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO)
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light
Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo
presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract
20
I INTRODUCcedilAtildeO
I1 Cacircncer
ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma
doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees
geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para
outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material
geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes
como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos
viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o
alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros
A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas
por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217
correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer
para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil
casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na
populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e
o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino
Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam
a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes
Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia
radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos
necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais
apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente
resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
21
radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van
Lier 1999)
Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos
colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o
cacircncer
I2 Terapia Fotodinacircmica
A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos
vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC
quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)
No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo
de protozoaacuterios e parameacutecios
Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek
que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
22
No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)
investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)
em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz
proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com
luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio
Maionchi e Hioka 2002)
Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)
demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a
purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi
aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD
No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo
de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e
Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme
Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-
SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo
tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser
Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo
Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a
participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et
al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
23
A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de
certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de
oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex
espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas
(Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)
O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o
organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte
das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
24
I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser
absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo
ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como
ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta
irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da
luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)
Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco
fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de
maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios
processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por
induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2
minus bullOH H2O2) definidas como
EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)
No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e
fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel
O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de
luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por
processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e
Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A
substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
25
fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de
oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies
citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko
2002 Gorman et al 2004)
Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo
Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois
mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)
- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de
transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos
materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π
e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular
presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido
etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo
- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc
0F rarr 1F rarr 3F
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
26
3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)
Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com
formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que
oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios
insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel
pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo
- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica
0F rarr 1F rarr 3F
3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)
1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)
Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o
substrato
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do
oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar
Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura
por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras
espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como
por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et
al 2007 de Lima R G 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
27
I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular
gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas
caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade
no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos
tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou
seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica
permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular
O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e
Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a
luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da
ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e
retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido
muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda
geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As
ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
28
devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et
al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas
ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas
porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas
ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro
unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm
Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas
A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+
Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado
excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)
Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
29
fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M
1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)
Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente
citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi
Rotta e Tedesco 2003)
O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores
ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na
TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)
ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes
mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)
Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo
induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao
quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas
associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+
K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular
(Pelegrino et al 2005)
Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de
faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de
ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
30
I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio
O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as
propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente
citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas
atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992
Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et
al 1993)
A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios
processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem
de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em
meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e
Stuehr 1993)
Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou
seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado
no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao
orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute
isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros
nucleoacutefilos (Wink et al 1993)
Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo
concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese
progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares
morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
31
patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da
homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada
por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em
algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al 2001)
Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos
fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de
proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002
Ignarro 2000)
Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de
se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas
Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave
semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da
produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson 2001)
O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute
apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da
Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
32
[Ru(terpy)(L)NO+]3+
HN
HN
COOH
NHNHq
RuIIL
N
NN
NO+
L
L=
Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)
I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se
uma tarefa difiacutecil
Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos
fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008
Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos
fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de
sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff
et al 2005)
Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos
resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e
polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo
Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
33
Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por
exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com
diferentes substacircncias
Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de
outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o
tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados
ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da
administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias
hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)
Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados
via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do
sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este
processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
34
pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e
promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago
(Woodle e Lasic 1992)
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de
liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os
chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais
recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco
2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e
permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim
a outros siacutetios no organismo
Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar
diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo
campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo
35
II OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico
fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de
modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos
36
III PARTE EXPERIMENTAL
III1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar
Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboraccedilatildeo
Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de
filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo
em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ
As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees
lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio
001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura
Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)
isopropanol (Merck)
Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose
(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo
Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)
corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
37
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16
F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula
neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma
(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A
remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo
para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas
A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas
Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro
bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores
indispensaacuteveis ao crescimento celular
Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem
como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio
III2 Preparaccedilotildees
As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10
mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura
As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF
(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74
as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na
ausecircncia de luz a - 20 oC
As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os
coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
38
Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de
injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a
temperatura ambiente por ateacute 10 dias
As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de
filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm
A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes
da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos
como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana
de poro de 022 microm e em seguida aliquotada
A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74
O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas
neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e
adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo
Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o
pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de
022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril
Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro
bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo
III3 Aparelhagem
Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam
uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
39
Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de
absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de
emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon
Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho oacuteptico
Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem
simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No
iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com
24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e
o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm
bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com
frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda
estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal
detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura
total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de
Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito
A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de
absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o
terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30
mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
40
do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica
(Hellmam CUV-O-Stir)
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter
Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V
Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de
300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm
apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma
meacutedia de 10 pulsos de laser
O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo
nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de
fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A
Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de
emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este
sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente
curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto
Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
41
comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter
opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2
nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O
equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise
Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de
ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e
crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix
banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device
Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL
200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg
50 da Fisher Scientific)
III4 Meacutetodos
III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo
A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia
Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em
meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
42
Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de
caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os
espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm
Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o
espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de
fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa
em 610 nm
III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois
faacutermacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo
meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco
2004)
Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)
027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com
velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo
fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A
soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo
foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de
57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360
microLh)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
43
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo
nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo
Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos
associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a
ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de
rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar
Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas
III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partiacuteculas
Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas
formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC
colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas
Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para
determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de
fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
44
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em
meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada
III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do
complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-
tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de
absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia
fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm
em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
45
III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal
A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor
O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo
Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1
A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm
Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados
20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de
intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida
foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1
Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a
constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
46
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina
e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada
atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente
Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no
comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da
ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro
interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada
ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm
III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos
lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
47
obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de
emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de
decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de
fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento
com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-
quadrado (χ2)
III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por
pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas
descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC
e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy
Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do
transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm
O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de
100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos
ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do
laser em 355 nm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
48
III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco
ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de
absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio
por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees
que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al
1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da
intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema
resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um
detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A
potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A
intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo
com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)
∆
∆
∆∆ Φ=Φτ
τRef
Ref
RefI
I
(Equaccedilatildeo 2)
na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto
padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute
o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida
do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
49
III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico
amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo
de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se
argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado
por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico
(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de
KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi
construiacutedo em uma capela (Figura 7)
3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3
-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+
(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
50
Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso
O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a
soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21
times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso
calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo
deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no
momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de
anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns
segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se
uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado
Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
51
cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no
mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do
eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio
Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo
espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo
de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata
Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da
irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais
variaccedilatildeo no espectro da amostra
A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
52
Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)
O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo
de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela
Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em
um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi
admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de
irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado
passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
53
)101(tI
nabs
s
Lt minusminustimestimes
=φ (Equaccedilatildeo 4)
nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica
Is = intensidade da luz incidente
t = tempo de fotoacutelise (s)
1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da
absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo
III411 Estudos in vitro
III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios
cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas
As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio
liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de
75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas
Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas
crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina
005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60
segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas
foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
54
A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada
dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova
subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas
No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro
fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41
III4112 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi
feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para
avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o
corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan
Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem
estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)
Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180
microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi
agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular
Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do
corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do
MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total
de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
55
O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de
fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o
anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em
soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto
obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo
no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan
formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)
O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido
para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas
sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve
exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausecircncia do faacutermaco em estudo
Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave
capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas
ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora
por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol
O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no
comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm
(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
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III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com
meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado
e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do
tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico
contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo
das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com
a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas
foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida
transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio
completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de
tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram
incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilizaccedilatildeo do formazan
II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de
rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do
complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
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foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri
A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675
nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia
Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as
placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de
24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo
da viabilidade celular
Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism
30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste
Newman-Keuls
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental
58
IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies
reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de
ceacutelulas neoplaacutesicas
Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem
lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na
seccedilatildeo III42
Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada
a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
59
IV1 Estudos Fotofiacutesicos
IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal
A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas
micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo
importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos
mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais
Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram
realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de
emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em
tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal
Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de
absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato
(500 micromolL-1)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
60
Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol
O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de
absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela
terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a
ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T
2003 Oliveira D M 2006)
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61
Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=
74
Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda
de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004
de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)
Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das
propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)
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62
Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50
micromolL-1) em etanol
O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de
fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e
Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)
No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este
comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)
Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir
Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na
concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =
polietileno glicol)
A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da
associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal
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63
10
08
06
04
02
00
Abs
orbacirc
ncia
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e
dos dois compostos associados (minus)
Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo
houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos
faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais
A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem
natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees
estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com
bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em
soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos
mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo
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64
IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas
Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas
determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da
distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos
em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da
FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte
A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos
lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas
As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas
de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num
acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12
determinaccedilotildees para cada anaacutelise
O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas
medidas para cada amostra analisada
A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de
partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de
partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial
conforme descrito pela equaccedilatildeo 5
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65
(Equaccedilatildeo 5)
Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo
ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o
iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz
espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo
O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se
vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho
esperado
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras
analisadas
( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG
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66
Tabela I - Tamanho das partiacuteculas
Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPCRu-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas
Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este
efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo
sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo
IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se
somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua
associaccedilatildeo ao complexo
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67
20x106
15
10
05
00
Inte
nsid
ade
de fl
uore
scecircn
cia
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-
tpy (minus) em meio lipossomal
Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do
complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do
rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)
A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a
associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida
pelo complexo de rutecircnio
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com
o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do
tempo de vida da mesma
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
68
IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em
funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a
500 micromolL-1) (Figura 14)
Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)
conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo
crescente (0 a 500 micromolL-1)
Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados
inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer
If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)
Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor
respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
69
fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute
a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)
Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de
fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram
obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1
Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme
adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo
kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima
O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo
da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o
kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
70
supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente
(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1
Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-
confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que
sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o
complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10
mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito
suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs
AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem
comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado
sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO
livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute
apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
71
Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de
tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o
cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em
-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy
Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV
Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de
oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial
para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs
AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
72
1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0
(Equaccedilatildeo 6)
Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel
pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio
singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre
3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2
IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua
associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de
fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)
satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado
excitado singlete
A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove
seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A
razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um
paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)
O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz
1999)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
73
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f
(Equaccedilatildeo 7)
Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que
efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram
eletronicamente excitadas (Nexc)
exc
F
fN
n=Φ (Equaccedilatildeo 8)
O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons
incidentes e absorvidos
Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do
espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades
semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)
Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente
definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte
experimental (seccedilatildeo III46)
Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o
Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere
diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo
pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete
excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf
encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a
produccedilatildeo o 1O2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
74
Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme
descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)
O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b
Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a
um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9
padratildeo
amostra
padratildeo
amostra
padratildeo
padratildeo
amostraamostra x
n
nx
aAbsorbacircnci
aAbsorbacircncix
Area
Areaφφ =
(Equaccedilatildeo 9)
em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de
refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)
As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em
aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um
filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees
experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc
A Tabela II a seguir demonstra os resultados
Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)
Amostra
ΦΦΦΦf
ZnPC em etanol a 028
ZnPC em lipossoma a 013
ZnPCRu-tpy em
lipossoma
005
a (Oliveira et al 2006)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
75
Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador
ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com
meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior
quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma
diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor
sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente
Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior
rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os
processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas
No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico
IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta
moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza
precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do
fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos
Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos
complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutecircnio
Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos
mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
76
por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17
O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida
de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens
O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas
curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a
remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
77
Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50
micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da
figura representa o resiacuteduo meacutedio
Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
78
Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy
Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2
ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -
ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528
ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280
a (Oliveira et al 2006)
Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC
apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al
2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam
e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo
provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal
apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do
tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute
de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a
adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogecircneo (etanol)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
79
Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do
comportamento do estado excitado triplete
IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser
A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo
da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie
excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio
singlete (Spikes 1986)
Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave
produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de
eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de
eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de
radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas
de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC
estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion
radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo
acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical
hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)
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80
ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)
3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)
ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2
bull minus Equaccedilatildeo (12)
O2 bull minus + O2
bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2
Equaccedilatildeo (13)
ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)
Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo
ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de
laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al
2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes oriundos de estados eletronicamente excitados
Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade
Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)
A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia
mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao
estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em
soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo
dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o
oxigecircnio molecular solubilizado no meio
O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece
um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o
precursor e o transiente formado
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81
Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do
precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de
absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade
menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no
estado estacionaacuterio
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito
na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a
ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados
atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho
como mostrado na figura 18
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
82
Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso
de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio
lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos
transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto
Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
83
Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy
Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )
ZnPC em lipossoma 083
ZnPCRu-tpy 027
Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado
singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os
resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito
Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular
presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in
vitro
IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)
A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a
produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula
tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares
promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
84
estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinacircmico
Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento
quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da
intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆
determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser
determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)
Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)
onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e
o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo
Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado
como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio
singlete (Φ∆= 059)
Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no
meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi
determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy
estatildeo apresentados na Tabela V
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
85
Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete
Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆
Feoforbide-a 059
ZnPC em etanola 065
ZnPC em lipossomaa 023
ZnPCRu-tpy 016
a (Oliveira et al 2006)
De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de
oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a
distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica
pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si
levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma
outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e
gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)
Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou
uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento
quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com
os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto
(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No
entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
86
IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm
Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas
dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de
estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do
espectro eletromagneacutetico
Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410
A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20
Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo
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Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s
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Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)
incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos
novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML
(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO
gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta
em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO
gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda
TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da
fotoacutelise
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89
A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e
10J de potecircncia
Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm
A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma
apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO
liberado de 027 micromolL-1
Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J
de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a
excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO
e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinacircmica
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90
De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o
possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a
transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo
Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio
molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)
Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de
rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo
nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso
considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a
potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e
1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)
ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)
1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr
0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)
1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)
S = solvente ISC= cruzamento inter sistema
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III2 Estudos in vitro
III21 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausecircncia de luz
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para
linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados
O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois
eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais
fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a
descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22
Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo
apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em
funccedilatildeo dos sistemas utilizados
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
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Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as
formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em
lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e
4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica
das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido
do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005
plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3
com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da
ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
93
Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular ()
ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1
Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2
ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy
(05 mmolL-
77plusmn1
Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1
Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do
sistema sineacutergico mostrada anteriormente
IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para
o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e
50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes
estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose
de 05 Jcm2
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
94
Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10
1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema
lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia
estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way
ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005
plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3
Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-
1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica
Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto
(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
95
Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo
da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das
espeacutecies produzidas induz a morte celular
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor
accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma
consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo
(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo
96
V CONCLUSOtildeES
Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees
Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio
Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes
serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil
espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em
lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC
Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a
um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar
que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram
uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da
literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas
pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma
Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu
processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo
foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do
complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso
registrado no NOmeter
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
97
Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a
incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-
1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas
mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo
bem significativa na viabilidade celular
Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas
neoplaacutesicas
Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees
98
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