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MOEMA CORTIZO BELLINTANI
ESTUDO DA PROPAGAÇÃO IN VITRO E EX VITRO DE
Neoregelia mucugensis LEME, Orthophytum mucugense
WAND. e CONCEIÇÃO e O. albopictum PHILCOX.
ESPÉCIES DE BROMELIACEAE ENDÊMICAS DA BAHIA.
FEIRA DE SANTANA – BAHIA
2006
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA
ESTUDO DA PROPAGAÇÃO IN VITRO E EX VITRO DE
Neoregelia mucugensis LEME, Orthophytum mucugense
WAND. e CONCEIÇÃO e O. albopictum PHILCOX
ESPÉCIES DE BROMELIACEAE ENDÊMICAS DA BAHIA.
MOEMA CORTIZO BELLINTANI
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Botânica da Universidade
Estadual de Feira de Santana como parte
dos requisitos para a obtenção do título de
Doutor em Botânica.
ORIENTADOR: PROFA. DRA. ANA LÚCIA CUNHA DORNELLES
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ RANIERE FERREIRA DE SANTANA
FEIRA DE SANTANA – BA
2006
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Ficha Catalográfica
Bellintani, Moema Cortizo. Estudo da propagação in vitro e ex vitro de Neoregelia mucugensis Leme, Orthophytum mucugense Wand. e Conceição e Orthophytum albopictum Philcox, espécies de Bromeliaceae endêmicas da Bahia / Moema Cortizo Bellintani. – Feira de Santana: Universidade Estadual de Feira de Santana, 2006. 115p.:il. Tese (Doutorado em Botânica) – Departamento de Ciências Biológicas Universidade estadual de feira de Santana, BA, 2006.
4
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Dra. Ana Lúcia Cunha Dornelles (UFRRJ)
_____________________________________________
Dra. Claudinéia Regina Pelacani (UEFS)
_____________________________________________
Dra. Fernanda Vidigal Duarte Souza (EMBRAPA)
_____________________________________________
Dra. Janay Almeida dos Santos-Serejo (EMBRAPA)
_____________________________________________
Dr. Renato Paiva (UFLA)
Feira de Santana – BA
2006
5
A Antonio, meu amor, companheiro para a vida;
Aos meus pais, responsáveis pela fascinação, respeito e admiração que nutro
pela natureza e pela vida acadêmica;
Aos meus irmãos pela cumplicidade, amizade e alegria.
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste
trabalho.
A Ana Lúcia Cunha Dornelles, pela orientação, respeito e confiança, mas
principalmente pelo exemplo de vida;
A José Raniere Ferreira de Santana, pelas sugestões, disponibilidade e
orientação que tiveram grande importância para a conclusão deste trabalho;
A José Geraldo de Aquino Assis, Ana Lúcia Pires Cotias de Oliveira, Ervene
Barreto, João Paulo Loyola e demais membros da equipe do Laboratório de
Citogenética Vegetal da UFBA, pelo auxílio e por disponibilizar a estrutura do
laboratório e os equipamentos para a realização das análises histológicas;
A Claudinéia Pelacani, pelas sugestões e disponibilidade, principalmente durante
a primeira etapa deste trabalho;
Ao Projeto Sempre-Viva e à sua equipe, pelo excelente trabalho que vêm
realizando em Mucugê e pela força e incentivo, essenciais para a realização deste
trabalho;
A FAPESB, por ter apoiado o projeto que resultou neste trabalho;
A Maria das Graças Lapa Wanderley, pela identificação taxonômica das espécies
aqui estudadas;
A equipe de professores, funcionários e estudantes do Laboratório de Cultura de
Tecidos Vegetais e demais laboratórios do Horto Florestal, pela convivência e
colaboração ao longo dos últimos quatro anos. Ana Paula Sampaio, Ana Paula
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Rios, Ana Carolina, Cristina, Janilza, José Roberto, Magnólia, Noeli, Sandra,
Solange, Vânia e Dona Zezé, muito obrigada;
A Alone Brito, pela força, pelas indispensáveis contribuições e principalmente pela
serenidade, convívio e amizade;
A Carolina Cerqueira, pela alegria e pela participação na montagem,
acompanhamento e avaliação de muitos experimentos deste trabalho;
A Sheila Resende, pela amizade e zelo, e também pelas discussões e pela
assistência, essenciais em muitos momentos;
As amigas Lia Miranda e Manuela Rodrigues, pelo companheirismo e carinho;
A Léa Lopes, pelo grande apoio e aprendizado, mas principalmente pela amizade;
A Lázaro Benedito da Silva, pelas boas e acolhedoras conversas;
A Andréa Karla, pela disponibilidade e ajuda com as exsicatas;
A Adriana Estrela, pela dedicação ao curso de Pós-Graduação;
As queridas amigas Ana Maria Almeida e Roberta Damasceno, pela revisão dos
abstracts;
A Leila Cruz, Leonardo Pacheco, Raymundo Sá Neto, Sílvia Passos e Tiana
Baqueiro, porque, próximos ou distantes, são sempre grandes amigos;
Aos meus alunos, que me possibilitam aprender e crescer a cada dia.
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SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS
RESUMO 1
ABSTRACT 3
INTRODUÇÃO GERAL 5
CAPÍTULO 1 19
Germinação e crescimento inicial de Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum
mucugense Wand. e Conceição. Bromélias endêmicas da Bahia – Brasil.
CAPÍTULO 2 38
Estabelecimento in vitro de Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum mucugense
Wand. e Conceição. Bromélias endêmicas da Chapada Diamantina, Bahia - Brasil.
CAPÍTULO 3 57
Resposta regenerativa in vitro de explantes caulinares de Neoregelia mucugensis Leme,
Orthophytum mucugense Wand. e Conceição e Orthophytum albopictum Philcox.
Bromélias endêmicas da Chapada Diamantina - Brasil, submetidas a diferentes
concentrações de BAP e ANA.
CAPÍTULO 4 78
Efeito da ventilação in vitro na aclimatização de plantas micropropagadas de
Orthophytum mucugense Wand. e Conceição, uma bromélia endêmica da Bahia - Brasil.
CONCLUSÕES GERAIS 99
APÊNDICES 105
Quadros de análise de variância
1
RESUMO
Orthophytum albopictum, Orthophytum mucugense e Neoregelia mucugensis são
bromélias endêmicas da Chapada Diamantina, com grande potencial ornamental
e relevante importância ecológica. Têm distribuição restrita, sendo importante a
realização de trabalhos de conservação. O cultivo in vitro de bromélias é muito
utilizado para fins comerciais e na preservação de espécies raras ou ameaçadas
de extinção. Os objetivos desse trabalho foram: (1) avaliar a influência do
substrato na germinação e crescimento ex vitro de O. mucugense e N.
mucugensis; (2) avaliar a influência da composição do meio de cultura na
germinação e no crescimento in vitro de O. mucugense e N. mucugensis; (3)
desenvolver um protocolo eficiente de regeneração in vitro para O. albopictum, O.
mucugense e N. mucugensis utilizando explantes caulinares na presença de
benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA) e (4) avaliar a influência
da forma de fechamento dos tubos e de diferentes concentrações de sacarose na
aclimatização de plantas da espécie O. mucugense propagadas in vitro. Os
percentuais de emergência (%E), foram maiores para N. mucugensis (91,2 –
96,5%) do que para O. mucugense. (58 – 77,5%). Em O. mucugense os maiores
valores para %E foram observados nos substratos terra vegetal (T) (77,5%) e
vermiculita + terra (V+T) (76%). O índice de velocidade de emergência e o tempo
médio de emergência para as duas espécies não diferiram significativamente
entre os três substratos. Aos 120 dias, os substratos T e V+T foram mais efetivos
na incorporação de matéria seca que o substrato V para O. mucugense. Enquanto
para N. mucugensis, o substrato V+T proporcionou um ganho quase duas vezes
maior que o substrato T. Aos 300 dias, a incorporação de matéria seca foi maior
no substrato T para as duas espécies. Nos experimentos in vitro, as sementes de
N. mucugensis germinam bem em ágar e em MS/2, já a espécie O. mucugense
teve uma boa germinação apenas no ágar. Os meios de cultura MS e MS/2
podem ser utilizados para o cultivo in vitro de N. mucugensis e O. mucugense. A
presença de carvão ativado favoreceu o crescimento da parte aérea de O.
mucugense e do sistema radicular de ambas espécies, sendo aconselhável a sua
utilização na fase de pré-aclimatização. Em geral O. albopictum e N. mucugensis
têm maior capacidade para regenerar brotos que O. mucugense. Os brotos de O.
albopictum apresentaram maior ganho de massa que as demais espécies. Quanto
2
à capacidade dos explantes em regenerar brotos, N. mucugensis e O. albopictum
apresentaram percentuais significativamente mais altos que O. mucugense. O
percentual de explantes formando calos foi maior para O. albopictum que para as
outras duas espécies. Para induzir a formação de brotos in vitro recomenda-se a
utilização das combinações de 2,22 ou 4,44µM BAP + 1,3µM de ANA para N.
mucugensis, 2,22µM de BAP + 0,65µM ANA para O. mucugense e 1,11µM de
BAP + 0,65µM ANA para O. albopictum. O selamento dos recipientes de cultura
com algodão reduziu a perda de água em 50% e possibilitou o desenvolvimento
da parede celular lignificada de células da epiderme adaxial e abaxial. A
concentração de sacarose não influenciou de forma significativa à sobrevivência
de plantas procedentes de tubos fechados com algodão. A restrição de sacarose
no meio de cultura prejudicou a sobrevivência de plantas provenientes de tubos
fechados com PVC.
3
ABSTRACT
Neoregelia mucugensis, Orthophytum mucugense and Orthophytum albopictum
are endemic bromeliads from Chapada Diamantina, Bahia, Brazil, and they have
great ornamental potential and ecological relevance. They have restricted
occurrence in Mucugê, Bahia – Brazil, vindicating conservation studies about
them. In vitro culture of bromeliads is widely used for commercial purposes and for
preservation of rare or endangered species. The purposes of the present study
were to: (1) to evaluate the effects of substrates at the ex vitro germination and
initial development of N. mucugensis and O. mucugense; (2) to evaluate the
effects of culture medium composition in the germination and growth of N.
mucugensis and O. mucugense; (3) develop an efficient protocol for in vitro
regeneration from stem explants of Orthophytum albopictum, Orthophytum
mucugense and Neoregelia mucugensis in the presence of benzylaminopurine
(BAP) e naphthaleneacetic acid (NAA) and (4) to evaluate the influence of different
tubes closing forms and the effect of sucrose in the acclimatization of
micropropagated O. mucugense shoots. The emergence percentage (%E) were
higher for N. mucugensis (91.2 – 96.5%) than for O. mucugense. (58 – 77.5%).
For O. mucugense the highest values of %E were observed in the substrates T
(77.5%) and V+T (76%). The emergence velocity index and the average period of
emergence, for both species, did not show significant differences between the
three substrates. At day 120, the substrates T and V+T were more efective
concerning dry weight incorporation than the substrate V for the O. mucugense.
The substrate V+T promoted a gain almost twice times greater than the substrate
T for N. mucugensis. After 300 days, the dry weight incoporation was greater in
the substrate T for both. In the in vitro experiments, seeds of N. mucugensis had a
good germination ratio in agar and in MS/2, but O. mucugense seeds had a better
germination ratio in agar. MS or MS/2 culture media can be used for the N.
mucugensis and O. mucugense in vitro culture. As the presence of activated
charcoal favoured leaf growth of O. mucugense and the root system growth of
both species, thus its use is recommended in the pre-acclimatization phase. In
general, O. albopictum e N. mucugensis had better capacity to regenerate shoots
and more responsive explants than O. mucugense. O. albopictum shoots showed
higher dry weights than other species. N. mucugensis explants were more
4
responsives in the presence of BAP (1.11 e 2.22µM) and in the absence of NAA.
O. albopictum showed the biggest callus formation. We recommend the use of
1.3µM NAA + 2.22 or 4.44µM BAP for N. mucugensis, 2.22µM BA + 0.65µM NAA
for O. mucugense and 1.11µM of BAP + 0.65µM NAA for O. albopictum. The use
of cotton for sealing culture containers reduced the loss of water in 50% and it
made possible the development of the lignified cellular wall of adaxial and abaxial
epidermis. The concentration of sucrose did not show significant influence on the
survival of cotton sealed tube plants. The restriction of sucrose in the culture
medium decreased the PVC sealed tubes plant’s survival.
5
INTRODUÇÃO GERAL
Bromeliaceae, com cerca de 3.000 espécies, forma a maior família de
plantas essencialmente americana, distribuindo-se do sul dos Estados Unidos até
o Chile. A única exceção é Pitcairnia feliciana (A. Chev.) Harms J. Mildbraed,
encontrada no Golfo da Guiné, África. Dados da biogeografia da família sugerem
que as primeiras espécies devem ter se originado e iniciado a sua diversificação
numa época bastante próxima à separação dos continentes, que originou o
Oceano Atlântico, há cerca de 200 milhões de anos (Leme e Marigo 1993). São
conhecidos três grandes centros de origem e dispersão de espécies: os Andes, o
planalto das Guianas e o leste brasileiro. Os representantes mais primitivos
(Pticairnioideae e gêneros mais primitivos de Tillandsioideae) aparecem na região
andina e nas Guianas. As espécies e táxons considerados mais avançados
(Bromelioideae e táxons mais evoluídos de Pitcairnioideae e Tillandsioideae)
encontram-se amplamente difundidos no leste brasileiro (Smith 1934).
No Brasil, encontram-se quase metade das espécies de bromélias
conhecidas, especialmente na região costeira, na Mata Atlântica e na restinga,
podendo aparecer também na Amazônia, na caatinga, no cerrado e nos campos
de altitude (Leme e Marigo 1993). O longo período de estabilidade geológica
ocorrido na região que envolve o território brasileiro proporcionou a sobrevivência
e desenvolvimento de grupos que hoje ocorrem na forma de vários gêneros
endêmicos tais como Canistrum, Cryptanthus, Encholirium, Nidularium,
Orthophytum, Quesnelia e Wittrockia (Leme e Marigo 1993; Leme 1998).
A família Bromeliaceae está dividida em 3 subfamílias: Pitcairnioideae
Harms, Bromelioideae Reichenbach e Tillandsioideae Harms. O número de
gêneros diverge entre os autores. Smith e Downs (1974) na Flora Neotrópica
apresentam 46 gêneros. Entretanto a descrição de novas espécies e o crescente
estudo da família, tem ampliado este número para 51, 50 e 56 (Brummitt 1992;
Leme e Marigo 1993; Leme 1997) (Tabela 1).
6
Tabela 1 – Subdivisões da família Bromeliaceae (Leme 1997).
FAMÍLIA BROMELIACEAE
SUBFAMÍLIA Pitcairnioideae SUBFAMÍLIA Bromelioideae
TRIBO Pitcairnieae GÊNERO Acanthostachys Aechmea GÊNERO Ayensua Ananas
Connelia Androlepis Cottendorfia Araeococcus Fosterella Billbergia Lindmania Bromelia Navia Canistropsis Pepinia Canistrum Pitcairnia Cryptanthus Steyerbromelia Deinacanthon
Disteganthus TRIBO Brocchinieae Edmundoa
Fascicularia GÊNERO Brocchinia Fernseea
Greigia TRIBO Puyeae Hohenbergia
Hohenbergiopsis GÊNERO Brewcaria Lymania
Deuterocohnia Neoglaziovia Dyckia Neoregelia Encholirium Nidularium Hechtia Ochagavia Puya Orthophytum
Portea SUBFAMÍLIA Tillandsioideae Pseudaechmea
Pseudananas GÊNERO Alcantarea Quesnelia
Catopsis Ronnbergia Glomeropitcairnia Streptocalyx Guzmania Ursulaea Mezobromelia Wittrockia Tillandsia Vriesea Werauhia
7
Schultz (1985) descreve as bromélias como uma grande família de
plantas herbáceas, terrestres ou epifíticas, com caule reduzido e, nas epífitas,
raízes restritas à fixação. As folhas lanceoladas se inserem em espiral no caule
ou formam uma roseta basal capaz de acumular grande quantidade de água. A
epiderme das folhas em várias espécies é revestida de escamas capazes de
absorver água e nutrientes necessários para o desenvolvimento da planta.
O desenvolvimento do epifitismo envolveu o surgimento de escamas cada
vez mais especializadas. Paralelamente à especialização das escamas, ocorre a
redução do sistema radicular. Se a espécie absorve água e nutrientes diretamente
do ar ela apresenta tricomas escamiformes altamente especializados, distribuídas
em grande quantidade pela superfície foliar, e as raízes são reduzidas visto que a
função de absorção radicular é restrita (Smith e Downs 1974).
Evolutivamente o ovário tende a se posicionar de forma cada vez mais
protegida, portanto os indivíduos morfologicamente derivados possuem ovário
ínfero. O fruto se desenvolve no sentido de proporcionar uma dispersão cada vez
mais especializada. Assim, o fruto capsular, composto de muitas sementes
pequenas dotadas de apêndices, assume a forma bacácea, onde as sementes
aparecem em maior tamanho e menor número. A relação tamanho-quantidade
apresentada pelas sementes é uma adaptação ao sucesso reprodutivo para o tipo
de dispersão desenvolvida. A dispersão pelo vento envolve uma redução no
tamanho, que resulta em sementes leves, mas ao mesmo tempo com menos
reservas energéticas (Smith e Downs 1974).
A família Bromeliaceae tem grande importância na manutenção da
biodiversidade animal e vegetal, fornecendo água e alimento além de ser utilizada
como abrigo e local de acasalamento para muitas espécies animais. As bromélias
vêm adquirindo importância econômica crescente devido à utilização no mercado
florístico e ornamental, sendo que a maioria das plantas utilizadas para estes fins
são obtidas de forma extrativista, o que vem acarretando uma perda genética
significativa.
O Estado da Bahia, como o Nordeste de uma forma geral, possui uma
flora bastante rica, com espécies, pertencentes a diversas famílias, com grande
potencial para exploração econômica.
O gênero Neoregelia L.B.Sm. é composto por espécies terrestres, epífitas
ou saxícolas. Apresenta tamanho bastante variado, suas folhas são densamente
8
rosuladas e usualmente espinosa-serreadas. A disposição das folhas origina um
“tanque” característico, no qual a inflorescência está localizada (Smith e Downs
1983; Leme 1998). N. mucugensis Leme é uma planta típica dos campos
rupestres. Apresenta grande plasticidade fenotípica, sendo caracterizada por
variações na coloração, forma e conformação da roseta foliar e na coloração das
flores (Leme 1998) (Figura 1A).
Orthophytum Beer é um gênero exclusivamente brasileiro, composto por
espécies terrestres ou saxícolas. As folhas serreadas são completamente
recobertas por escamas, que refletem parte da luz solar que incide nas plantas.
Pode ser dividido em dois grupos: o primeiro reúne maior número de espécies,
apresenta inflorescência provida de escapo e folhas verdes; as espécies do outro
grupo apresentam inflorescência séssil e, durante a floração, tendem a apresentar
folhas coloridas na parte central da roseta foliar (Smith e Downs 1983; Wanderley
1990). Segundo Wanderley e Conceição (2006) as espécies de Orthophytum com
inflorescência séssil, ocorrentes na Chapada Diamantina têm grande valor
ornamental devido à intensa coloração vermelha que suas brácteas e folhas
atingem na antese. Esta característica torna estas espécies também muito
importantes por atrair beija-flores, desempenhando um importante papel
ecológico.
Orthophytum mucugense Wand. e Conceição é a mais nova espécie de
Orthophytum descrita. Os indivíduos deste táxon crescem formando grandes
populações em paredões rochosos localizados nas margens de rios. Os relatos
acerca da sua distribuição geográfica revelam que a sua ocorrência está restrita
ao município de Mucugê – Chapada Diamantina. Apesar de ser encontrada em
uma Unidade de Conservação Municipal e de formar grandes populações, a
ocorrência restrita a uma única localidade leva O. mucugense a categoria
vulnerável, fato que demonstra a importância da realização de trabalhos de
preservação com esta nova espécie (Wanderley e Conceição 2006) (Figura 1B).
9
A
B
C
Figura 1 – Plantas em flor (A) Neoregelia mucugensis; (B) Orthophytum
mucugense e (C) Orthophytum albopictum. As barras representam 1cm.
10
Orthophytum albopictum Philcox apresenta inflorescência séssil e durante
o período de florescimento as folhas centrais da roseta também adquirem
coloração vermelha. As duas espécies de Orthophytum aqui apresentadas têm o
mesmo habitat e distribuição geográfica, mas são facilmente diferenciadas pelo
tamanho; O. mucugense é uma planta de pequeno porte, já O. albopictum é
considerada uma espécie de grande porte (para este gênero), apresentando
folhas ao menos duas vezes mais largas que as de O. mucugense (Smith e
Downs 1983; Stannard 1995; Wanderley 1990; Wanderley e Conceição 2006)
(Figura 1C).
Os problemas ambientais e o intenso extrativismo têm afetado as
populações de bromélias, ressaltando a importância de trabalhos de conservação,
que protejam estes vegetais e, conseqüentemente, toda a fauna e flora
associadas a estas plantas (Fialho 1990, Fialho e Furtado 1993; Leme e Marigo
1993; Oliveira et al. 1994; Oliveira e Rocha 1997). A coleta indiscriminada destas
plantas tem prejudicado a recuperação das populações naturais, tornando as
bromélias cada vez mais escassas na natureza. Sendo assim, tornam-se
imprescindíveis novas medidas, que de um lado mantenham as espécies a salvo
do perigo de extinção, e de outro ajudem a manutenção da fonte de renda
relacionada à utilização ornamental destas plantas. Uma atenção especial deve
ser destinada a espécies com distribuição restrita ou ameaçadas de extinção.
Neoregelia mucugensis, Orthophytum mucugense e Orthophytum
albopictum são espécies endêmicas da Chapada Diamantina – Bahia, ocorrem
em unidades de conservação municipais ou federais, mas não são consideradas
protegidas devido às grandes queimadas que costumam atingir a região no
período de seca (Leme 1998; Wanderley e Conceição 2006). Estes três táxons
apresentam grande potencial ornamental. Portanto o estudo da propagação
destas espécies é importante para a conservação bem como para o
estabelecimento de um sistema de cultivo comercial.
A reprodução assexuada através dos brotamentos laterais da planta
“mãe” é feita com sucesso, mas limita bastante o número de plantas obtidas. A
reprodução por sementes promove a varibilidade genética e a obtenção de maior
número de indivíduos. Já a multiplicação in vitro possibilita a formação de um
grande número de mudas, essencial para a racionalização do cultivo (Mercier e
Kerbauy 1995, 1997). A propagação em larga escala reduz os custos de produção
11
e, conseqüentemente, o preço final das mudas, mas principalmente diminui o
extrativismo, favorecendo a preservação das espécies (Kanashiro 2005).
O cultivo in vitro de bromélias tem obtido espaço na preservação de
espécies raras ou ameaçadas de extinção (Arrabal et al. 2002; Carneiro et al.
1999; Mercier e Kerbauy 1997; Rech Filho et al. 2005). A escassez de estudos
sobre a biologia reprodutiva destas plantas tem elevado a importância da
conservação in vitro da família. A manutenção in vitro assegura a conservação de
germoplasma (Carneiro e Mansur 2004; Villalobos et al. 1991) e é vantajosa
inclusive por proporcionar a produção de plantas saudáveis, e a representação de
grande variedade de genótipos em espaços reduzidos (Engelmann 1991).
A micropropagação visando a preservação de espécies deve assegurar a
manutenção da variabilidade genética. Para tanto, é importante a utilização de
plântulas obtidas a partir da germinação in vitro de sementes oriundas de
diferentes populações (Mercier e Nievola 2003). Neste caso, o cultivo in vitro a
partir de sementes é aconselhado também por gerar um grande número de
plantas-matrizes, evitando a retirada de indivíduos da natureza, o que agravaria o
grau de ameaça sobre estas espécies (Carneiro e Mansur 2004). Outra
importante vantagem da obtenção de explantes a partir da germinação decorre da
maior facilidade na desinfestação de sementes quando comparadas com tecidos
extraídos de plantas nativas (Mercier e Kerbauy 1997).
Para a conservação in vitro as plantas devem manter a sua estabilidade
genética, sendo importante o desenvolvimento de métodos que reduzam a
ocorrência de mutações e a variação somaclonal. A regeneração de brotos a
partir de organogênese direta e a redução da concentração e do tempo de
exposição dos explantes aos reguladores de crescimento diminuem as chances
de ocorrência de alterações genéticas (Mercier e Nievola 2003).
Apesar de algumas espécies de bromélias serem amplamente
propagadas, muitos indivíduos comercializados ainda são obtidos pelo
extrativismo predatório, colocando muitas espécies em risco. A padronização de
protocolos de micropropagação tem possibilitado a produção de grande
quantidade de mudas para o abastecimento agrícola e comercial. No entanto, o
número de espécies micropropagadas ainda é bastante reduzido (Arrabal et al.
2002; Carneiro e Mansur, 2004; Carneiro et al. 1999; Droste et al. 2005; Endres et
12
al. 2002; Guimarães et al. 1999; Malda et al. 1999; Mercier e Kerbauy 1992, 1997,
1998).
Plantas procedentes de propagação in vitro podem apresentar problemas
na adaptação para o ambiente ex vitro, resultando freqüentemente num baixo
percentual de sobrevivência. A incapacidade de controlar a perda de água por
evaporação a partir da superfície foliar bem como o mau funcionamento dos
estômatos de plantas cultivadas in vitro afeta a capacidade de adaptação ao
ambiente externo (Seelye et al. 2003). Estas alterações que acarretam a
inabilidade das plantas em manter a sua umidade interna parecem ser
influenciadas pelo acúmulo de gases como, etileno, mas principalmente pelo
elevado teor de umidade presente no recipiente utilizado para o cultivo in vitro
(Buddendorf-Jooten e Woltering 1996; De Proft et al. 1985; Zobayed et al. 1999).
Assim, um modelo de cultivo que possibilite a ocorrência de trocas gasosas tem
mostrado facilitar a fase de aclimatização das mudas (Jackson 2003; Seelye et al.
2003).
A ventilação dos frascos de cultura obtida através do uso de tampas
permeáveis aumenta as trocas gasosas e, conseqüentemente, as taxas de
transpiração das plantas in vitro (Lai et al. 2005; Zobayed et al. 1999). A aeração
dos frascos estimula o desenvolvimento de adaptações contra a perda de água
ainda no ambiente de laboratório, resultando na produção de plantas com melhor
controle da evaporação (Santamaria et al. 2000). Outros trabalhos demonstraram
efeitos positivos das trocas gasosas sobre a propagação in vitro de mamão (Lai et
al. 1998), eucalipto (Zobayed et al. 2000a), batata doce (Zobayed et al. 2000b),
batata (Zobayed et al. 2001) e maçã (De Klerk 2002). Mills e Tal (2004), avaliando
a tolerância à salinidade em tomate, demonstraram que plantas crescendo sob
condições in vitro em frascos ventilados apresentaram comportamento
semelhante ao das plantas cultivadas em ambiente externo.
O meio de cultura utilizado para a micropropagação em geral contém
açúcar em quantidade suficiente para possibilitar o crescimento heterotrófico dos
brotos. Além disso, o típico ambiente de cultivo in vitro é caracterizado por
apresentar um grande acúmulo de substâncias como o etileno, decorrente da
ausência de trocas gasosas entre o recipiente de cultivo e o meio externo, de
forma que existe uma grande diferença entre estes ambientes (Kozai 1991). A
aproximação entre as condições da cultura in vitro e as condições ambientais tem
13
demonstrado melhorar o desenvolvimento das plantas. Kozai et al. (1991)
destacam a possibilidade de estimular a fotoautotrofia in vitro, reduzindo a
quantidade de carboidrato fornecido e aumentando a intensidade luminosa do
ambiente de cultivo. Alguns sistemas de micropropagação fotoautotróficos que
envolvem a utilização de meios sem açúcar, ventilação forçada e exposição a
altas intensidades luminosas têm mostrado resultados positivos, proporcionando
um melhor desempenho das plantas no que tange ao crescimento, qualidade e
sobrevivência (Zobayed et al. 2000a; Xiao e Kozai 2004).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a germinação e o crescimento em
viveiro e estabelecer um protocolo eficiente para o estabelecimento e a
propagação in vitro bem como para a aclimatização de plantas micropropagadas
pertencentes às espécies Neoregelia mucugensis, Orthophytum mucugense e
Orthophytum albopictum.
14
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARRABAL, R.; AMANCIO, F.; CARNEIRO, L. A.; NEVES, L. J.; MANSUR, E.
2002. Micropropagation of endangered endemic Brazilian bromeliad Cryptanthus
sinuosus (L.B. Smith) for in vitro preservation. Biodiversity and Conservation,
11: 1081-1089.
BRUMMITT, R.K. 1992. Vascular Plant Families and Genera. Royal Botanic Gardens, Kew, 804p.
BUDDENDORF-JOOSTEN, J.M.C.; WOLTERING, E.J. 1996. Controlling the
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19
CAPÍTULO 1
Germinação e crescimento inicial de Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum
mucugense Wand. e Conceição. Bromélias endêmicas da Bahia - Brasil1.
1 Este capítulo será submetido à revista Biodiversity and Conservation
20
RESUMO
As espécies Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense, endêmicas da
Chapada Diamantina - Bahia, têm grande potencial ornamental e importância
ecológica. Como outras bromélias, são obtidas de forma extrativista. O objetivo
desse trabalho foi avaliar a influência do substrato na germinação e
desenvolvimento inicial de N. mucugensis e O. mucugense. Foram utilizados três
substratos para a avaliação da germinação e do crescimento das plantas aos 120
dias: (V) vermiculita, (T) terra vegetal e (V+T) vermiculita + terra vegetal (1:1) e
dois substratos para a avaliação do crescimento aos 300 dias: (T) terra vegetal e
(V+T) vermiculita + terra vegetal. As duas espécies apresentaram altas
porcentagens de emergência (%E), sendo que os valores observados para N.
mucugensis (91,2 – 96,5%) foram maiores do que para O. mucugense (58 –
77,5%). Em O. mucugense os maiores valores para %E foram observados nos
substratos T (77,5%) e V+T (76%). O índice de velocidade de emergência e o
tempo médio de emergência para as duas espécies não diferiram
significativamente entre os três substratos. Aos 120 dias, os substratos T e V+T
foram mais efetivos no ganho de matéria seca que o substrato V para O.
mucugense. Enquanto para N. mucugensis, o substrato V+T proporcionou um
ganho quase duas vezes maior que o substrato T. Aos 300 dias, o ganho de
matéria seca foi maior no substrato T para as duas espécies. A germinação e o
desenvolvimento inicial de N. mucugensis e O. mucugense foram influenciados
pelos substratos utilizados neste experimento.
21
ABSTRACT
(Germination and initial development of Neoregelia mucugensis Leme and
Orthophytum mucugense Wand. e Conceição. Endemic bromeliads from
Bahia – Brazil.) Neoregelia mucugensis and Orthophytum mucugense are
endemic species from Chapada Diamantina, Bahia, Brazil and they have great
ornamental potential and ecological relevance. Like others bromeliads, they are
obtained through extractivism. The purpose of the present study was to evaluate
the effects of substrates at the germination and initial development of N.
mucugensis and O. mucugense. Three substrates were compared to evaluate
germination and plant growth at 120 days: (V) vermiculite, (T) organic soil and
(V+T) vermiculite + organic soil (1:1); and two substrates were used to evaluate
plant growth at 300 days: (T) organic soil and (V+T) vermiculite + organic soil.
Even though both species have presented high emergence percentage (%E), the
values observed for N. mucugensis (91.2 – 96.5%) were higher than the values for
O. mucugense (58 – 77.5%). For O. mucugense the highest values of %E were
observed in the substrates T (77.5%) and V+T (76%). The emergence velocity
index and the average period of emergence, for both species, did not show
significantly differences between the three substrates. At day 120, the substrates T
and V+T were more efective concerning dry weight incorporation than the
substrate V for the O. mucugense. The substrate V+T promoted a gain almost
twice times greater than the substrate T for N. mucugensis. After 300 days, the dry
weight incoporation was greater in the substrate T for both species. The
germination and the initial development of N. mucugensis and O. mucugense were
influenced by the substrates evaluated in this study.
22
INTRODUÇÃO
Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum mucugense Wand. e
Conceição são espécies de Bromeliaceae endêmicas da Chapada Diamantina –
Bahia (Leme 1998; Wanderley e Conceição 2006), têm grande potencial
ornamental e como muitos representantes da família, grande importância
ecológica pelas relações estabelecidas com a fauna local que podem utilizá-las
para forrageamento e como refúgio (Rivero 1989; Oliveira et al. 1994; Oliveira e
Rocha 1997). N. mucugensis apresenta ainda uma característica comum a muitos
representantes da família Bromeliaceae: a capacidade de reter água no “tanque”
(Rocha et al. 1997) que é o micro habitat de muitos organismos, possibilitando a
reprodução de muitas espécies animais (Rivero 1989; Oliveira et al. 1994; Oliveira
e Rocha 1997) e a germinação de sementes de alguns vegetais (Fialho 1990;
Fialho e Furtado 1993).
N. mucugensis ocorre no Parque Nacional da Chapada Diamantina, mas
não é considerada protegida devido às extensas queimadas que atingem o
Parque anualmente (Leme 1998). A espécie recém descrita O. mucugense foi
encontrada exclusivamente no município de Mucugê. A ocorrência restrita leva
essa planta a ser classificada como vulnerável (Wanderley e Conceição 2006). É
importante que se estabeleçam medidas para assegurar a conservação destas
espécies na área de Campos Rupestres, onde se pode observar uma elevada
freqüência de táxons endêmicos que hoje caminham a passos largos para a
extinção (Leme 1998).
Estudos relacionados à propagação podem auxiliar na preservação das
referidas espécies, promovendo a conservação ex situ, gerando indivíduos que
possam ser re-introduzidos na natureza. O estabelecimento de um protocolo de
propagação eficiente viabiliza os cultivos comerciais, reduzindo as atividades
extrativistas.
O entendimento dos principais processos envolvidos na germinação de
sementes de espécies nativas é de grande importância na preservação e
utilização destas em programas de revegetação (Smiderle e Sousa 2003; Cuzzuol
e Lucas 1999). O conhecimento do comportamento germinativo das sementes e
como a plântula se estabelece no ambiente é de grande relevância, porque além
de avaliar a qualidade das sementes, bem como a capacidade de produzir
23
plântulas normais (Garcia 1994), amplia as bases para a compreensão do
sucesso no estabelecimento desses indivíduos e da sua ampla variabilidade
morfológica, além de auxiliar na conservação dessas espécies (Navarro e Guitián
2003; Borghetti 2000).
A composição do substrato é um fator que desempenha papel importante
na germinação e no sucesso do desenvolvimento da planta. Segundo Carvalho
Filho et al. (2002) o substrato exerce influência na arquitetura do sistema radicular
e no estado nutricional das plantas. A depender da estrutura do substrato, da
qualidade de aeração, da capacidade de retenção de água, e do seu grau de
infestação por patógenos, haverá ou não sucesso na germinação das sementes e
no desenvolvimento das plantas (Popinigis 1985). Segundo Marques et al. (1999),
o material usado deve proporcionar a retenção de água ideal à germinação e
garantir a profundidade de semeadura, não dificultando a emergência das
plântulas. Estudos sobre o efeito do substrato são necessários para obtenção de
plântulas de melhor qualidade (Campos e Uchida 2002).
A análise de crescimento é um importante instrumento para a avaliação
dos efeitos ambientais sobre as espécies (Benincasa 2003). O conhecimento a
cerca do crescimento e da incorporação de matéria seca das espécies, é
essencial quando se pretende utilizá-las para fins comerciais ou em programas de
recuperação de ambientes degradados (Vieira et al. 1998).
O objetivo desse trabalho foi avaliar a germinação de sementes de N.
mucugensis e O. mucugense em diferentes substratos e o desenvolvimento inicial
das plântulas.
24
MATERIAL E MÉTODOS
As sementes das espécies Neoregelia mucugensis e Orthophytum
mucugense foram coletadas no Parque Municipal de Mucugê, Rodovia BA 142,
Km 96, município de Mucugê – Bahia em junho de 2003. Os experimentos foram
desenvolvidos na Unidade Experimental Horto Florestal da Universidade Estadual
de Feira de Santana (Feira de Santana – Bahia). As exsicatas das espécies
encontram-se depositadas no Herbário da Universidade Estadual de Feira de
Santana, com número HUEFS 91408 (N. mucugensis) e HUEFS 91407 (O.
mucugense).
Sementes procedentes de frutos maduros foram colocadas para secar
sobre papel filtro a temperatura ambiente durante 4 dias. Sementes secas foram
desinfestadas em álcool 70% durante um minuto e hipoclorito 3% por 15 minutos
e em seguida submetidas a quatro lavagens em água destilada e autoclavada. A
semeadura foi realizada superficialmente em recipientes plásticos de 50ml,
perfurados na base, contendo três diferentes substratos: (V) vermiculita de
granulação média, (T) terra vegetal e (V + T) vermiculita de granulação média +
terra vegetal (1:1). Os substratos foram esterilizados a 121OC durante 15 minutos.
As culturas foram mantidas em laboratório sob condição de 25 ± 2ºC, fotoperíodo
de 16h e densidade de fluxo de fótons fotossínteticamente ativos de 40 µmol.m-
2.s-1. A irrigação foi feita por capilaridade. A terra vegetal utilizada foi adquirida da
Bio Jardim.
A germinação das sementes foi avaliada diariamente durante 40 dias
após a semeadura, considerando-se como germinadas as sementes que emitiram
a primeira folha.
Para a comparação das sementes das duas espécies, a matéria seca
destas foi mensurada após a secagem em estufa com ventilação forçada a 60ºC
por 96 horas. Foram avaliadas cinco repetições de 100 sementes cada.
As variáveis analisadas foram baseadas em Borghetti (2000); Santana e
Ranal (2000) e Maguire (1962) e consistiram de: Porcentagem de emergência
(%E), Índice de Velocidade de Emergência (IVE), Tempo médio (Tm) e freqüência
relativa (Fr).
A primeira etapa da avaliação da resposta fisiológica das plântulas aos
diferentes tratamentos ocorreu 120 dias após semeadura onde foi avaliado o
25
crescimento nos três substratos, através da determinação da matéria seca da
parte aérea e do sistema radicular pelo método de estufa com ventilação forçada
a 60ºC por 96 horas. Considerando os resultados obtidos neste ensaio, o
substrato vermiculita foi excluído da segunda etapa da avaliação de
desenvolvimento. Assim, as plântulas remanescentes foram transferidas para
sacos de polietileno (10x18x5cm) contendo dois diferentes substratos: (T) terra
vegetal ou (V + T) vermiculita de granulação média + terra vegetal (1:1) e
mantidas em viveiro a 70% de luminosidade. Após 180 dias (300 dias após a
semeadura) foi realizada a segunda etapa de avaliação, novamente através da
determinação da matéria seca das plantas.
Para os ensaios de germinação, utilizou-se o delineamento inteiramente
casualizado em esquema fatorial 2 x 3 (espécie x substrato) com cinco repetições,
sendo cada parcela composta por 40 sementes. Os resultados expressos em
porcentagem foram transformados em arco seno (%G /100)0,5 para a realização
da análise estatística, a fim de normalizar a sua distribuição. Para a avaliação do
desenvolvimento das plântulas aos 120 e 300 dias, o delineamento experimental
utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 3 e 2 x 2 (espécie
x substrato) respectivamente, constituindo-se de quatro repetições, compostas
por 10 plântulas cada (120 dias) ou cinco repetições compostas de 15 indivíduos
cada (300 dias). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias
comparadas pelo teste de Tukey.
26
27
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A emergência de N. mucugensis nos três substratos foi iniciada 14 dias
após a inoculação das sementes e se estendeu até o 23o dia em vermiculita e
vermiculita + terra e até o 25o dia em terra. Já as sementes de O. mucugense
apresentaram uma emergência mais lenta, que se estendeu do 17o ao 40o dia no
substrato vermiculita, do 18o ao 40o dia em vermiculita+terra e do 19o ao 40o dia
quando semeadas em terra. Este resultado mostra que a germinação de N.
mucugensis é concentrada em um período de tempo mais restrito que a de O.
mucugense (Figura 1.1).
Na espécie N. mucugensis o percentual de emergência não diferiu
significativamente entre os substratos avaliados. Já as sementes de O.
mucugense, não apresentaram diferenças na emergência quando semeadas em
terra (77,5%) ou vermiculita + terra (76%), mas ambos os substratos foram
melhores para a germinação que a vermiculita (58%). O. mucugense apresentou
taxa de emergência significativamente inferior a N. mucugensis em todos os
substratos analisados (Tabela 1.1).
Tabela 1.1 – Valores médios para porcentagem de eme rgência (%E), tempo médio de
emergência (TmE) e índice de velocidade de emergênc ia (IVE) de sementes de Orthophytum
mucugense e Neoregelia mucugensis em função do tipo de substrato utilizado.
%EZ TmE IVE
Substratos N. mucugensis O. mucugense N. mucugensis O. mucugense N. mucugensis O. mucugense
Vermiculita (V) 94,0 aW AV 58,0 b B 16,47 a B 25,81 a A 2,31 a A 0,93 a B
Terra (T) 91,2 a A 77,5 a B 16,37 a B 26,01 a A 2,17 a A 1,22 a B
V + T 96,5 a A 76,0 a B 16,31 a B 25,00 a A 2,39 a A 1,26 a B
Média 92,8 A 70,5 B 16,38 B 25,61 A 2,29 A 1,14 B
Z – Médias originais. A estatística foi realizada em médias transformadas em arco seno.
W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada variável, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
28
Figura 1.1 – Freqüência relativa (%) da emergência de (A) N. mucugensis e
(B) O. mucugense em vermiculita (�), terra vegetal (�) ou vermiculita + terra
vegetal (�).
A
0
5
10
15
20
25
30
35
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 B
0
5
10
15
20
25
30
35
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39
Fre
qüên
cia
Rel
ativ
a (%
) F
reqü
ênci
a R
elat
iva
(%)
Tempo (dias)
29
N. mucugensis e O. mucugense apresentaram altos percentuais de
emergência mostrando que estas espécies possuem comportamento semelhante
a outros representantes da família (Mercier e Nievola 2003). Outros trabalhos
registraram uma taxa de 100% de germinação para Aechmea beeriana (Nara e
Webber 2002), cerca de 96% para Aechmea nudicaulis e Streptocalyx floribundus
(Pinheiro e Borghetti 2003), 76% para Tillandsia geminiflora (Stringheta et al.
2005), 99% para Vriesea gigantea, 88,9% para Vriesea philippocoburgii (Droste et
al. 2005), 90% para Vriesea hieroglyphica (Mercier e Kerbauy 1994),
aproximadamente 50% para Pitcairnia staminea e cerca de 76% para Pitcairnia
albiflos (Wendt et al. 2001).
Em O. mucugense o menor valor encontrado para a emergência no
substrato vermiculita (58%), cujas propriedades físico-químicas possibilitam uma
alta retenção de água (Andrade et al. 1999, 2000; Araújo et al. 1991), pode estar
relacionado com a inibição da germinação ocasionada pelo excesso de água no
meio. Além disso, quantidades elevadas de água podem interferir na
disponibilidade de O2, afetando a respiração do embrião, o que pode influenciar
negativamente na germinação (Kerbauy 2004). Supostamente a inviabilidade das
sementes de O. mucugense no substrato vermiculita não ocorreu em N.
mucugensis visto que o percentual encontrado para este tratamento (94%) não
difere significativamente dos valores encontrados para terra (91,2%) ou
vermiculita + terra (96,5%) (Tabela 1.1).
Foi observado que sementes de Canistrum aurantiacum germinam na sua
inflorescência (Siqueira Filho 2001). A geminação de sementes na inflorescência
situada no “tanque” da planta pôde ser observada em N. mucugensis durante as
coletas de sementes no seu habitat. Como este é um local de grande acúmulo de
água, o comportamento da espécie no ambiente justificaria a maior capacidade de
N. mucugensis de se desenvolver em locais com muita água, quando comparada
com O. mucugense, uma espécie desprovida de “tanque”.
O tempo médio e o índice de velocidade de germinação foram
significativamente diferentes para as duas espécies, independentemente do
substrato utilizado, confirmando que sementes de N. mucugensis germinam mais
rápido e em um menor intervalo de tempo que sementes de O. mucugense
(Tabela 1.1).
30
A matéria seca encontrada em 100 sementes de N. mucugensis pesou
em média de 57,4mg enquanto a mesma quantidade de sementes da espécie O.
mucugense pesou em média 24,3mg. N. mucugensis apresentou maiores taxas
de germinação, maior velocidade e conseqüentemente menor tempo médio para
a germinação. Este comportamento pode estar relacionado com o tamanho das
suas sementes que chegam a ter mais que o dobro do peso que as sementes de
O. mucugense, apresentando conseqüentemente um maior acúmulo de reservas
energéticas. Smith e Downs (1974) discorreram sobre a relação tamanho-
quantidade de sementes apresentada por integrantes da família Bromeliaceae,
sugerindo que este fator poderia estar relacionado com o sucesso reprodutivo e o
tipo de dispersão desenvolvida por cada espécie. A redução no tamanho é
geralmente acompanhada pelo aumento no número de sementes o que pode
facilitar a sua dispersão, mas resulta no menor acúmulo de reservas energéticas.
Segundo este princípio, ao comparar espécies que apresentam sementes de
tamanhos diferentes, as sementes maiores e com mais reservas energéticas
apresentariam vantagens no processo germinativo, mas precisariam dispor de
mecanismos de dispersão mais complexos.
Aos 120 dias da semeadura a avaliação do crescimento das plantas
através da mensuração da matéria seca demonstrou que para O. mucugense os
substratos terra vegetal e terra vegetal + vermiculita foram mais efetivos na
incorporação de matéria seca que o substrato vermiculita. Enquanto para N.
mucugensis o substrato terra vegetal + vermiculita proporcionou um ganho quase
duas vezes maior que o substrato composto exclusivamente por terra vegetal.
Nesta espécie as plantas cultivadas em vermiculita também apresentaram o
menor acúmulo de matéria seca. Na segunda avaliação do crescimento, aos 300
dias, foi observado que as plantas cultivadas em terra vegetal apresentaram um
ganho de matéria seca superior às plantas cultivadas em terra vegetal +
vermiculita para as duas espécies (Tabela 1.2). O tamanho médio das plantas aos
120 dias foi de 2,5 cm de altura para ambas espécies enquanto aos 300 dias as
plantas de N. mucugensis e O. mucugense tinham em média 6 e 4,5 cm de altura
respectivamente.
31
Tabela 1.2 – Valores médios para matéria seca da pa rte aérea e das raízes de plantas de N. mucugensis e O. mucugense aos 120 e 300 dias de idade em função do tipo de substrato utilizado.
Matéria seca da parte aérea (mg/planta) Matéria seca das raízes (mg/planta)
Substrato N. mucugensis O. mucugense N. mucugensis O. mucugense
120 dias
Vermiculita 8,82 cW AV 1,35 b B 2,65 b A 0,55 b B
Terra 30,65 b A 8,40 a B 13,20 a A 2,45 a B
Vermiculita + Terra 60,95 a A 8,00 a B 13,45 a A 2,75 a B
Média 33,48 A 5,92 B 9,77 A 1,92 B
300 dias
Terra 106,90 a A 42,93 a B 27,14 a A 8,71 a B
Vermiculita + Terra 72,36 b A 33,56 b B 23,99 a A 6,00 b B
Média 89,63 A 38,25 B 25,57 A 7,36 B
W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada variável, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
O menor desenvolvimento dos indivíduos de ambas espécies cultivados
em vermiculita pode ser explicado pela ausência de nutrientes neste substrato, o
que limita o crescimento dos vegetais. O maior ganho de matéria seca observado
em N. mucugensis no substrato vermiculita + terra aos 120 dias pode ser atribuída
à presença de nutrientes provenientes da terra, associados à maior retenção de
umidade proporcionada pela vermiculita (Andrade et al. 1999, 2000; Araújo et al.
1991). A presença de plântulas no “tanque” de indivíduos adultos pode indicar que
N. mucugensis necessita de maior suprimento de água para o seu
desenvolvimento inicial. No entanto, após a floração e frutificação, N. mucugensis
assim como a grande maioria das espécies de bromélias entra em declínio
fisiológico e morre (Leme e Marigo 1993; Smith e Downs 1974), neste momento
as plantas jovens precisam estar estabelecidas na população de forma a não
depender mais de plantas adultas. Neste sentido, Siqueira Filho e Machado
(2001) observaram que plântulas de Canistrum aurantiacum, que se desenvolvem
ainda na inflorescência atingem o solo 7-8 meses após o florescimento, com o
declínio fisiológico da planta adulta. A menor disponibilidade de água e a maior
32
disponibilidade de nutrientes no substrato terra pode ser responsável pelo melhor
desenvolvimento de ambas espécies nesse substrato aos 300 dias.
O maior ganho de matéria seca observada para N. mucugensis em
comparação com O. mucugense pode estar relacionada com as características
genéticas de cada espécie. O indivíduo adulto de N. mucugensis é
consideravelmente maior que plantas adultas da espécie O. mucugense.
A distribuição da matéria seca entre a parte aérea e o sistema radicular
revela baixas porcentagens de matéria seca para o sistema radicular em relação
à parte aérea para as duas espécies em todos os substratos. Em geral o ganho
de matéria seca das raízes foi proporcionalmente maior aos 120 dias (Figura
1.2A) que aos 300 dias (Figura 1.2B). O comportamento do sistema radicular na
família bromeliaceae pode ser correlacionado com o desenvolvimento das
características epífitas e saxícolas presentes em algumas de suas espécies. O
desenvolvimento destas características envolve o surgimento de escamas foliares
cada vez mais especializadas, paralelamente ocorre a redução das raízes, visto
que a função de absorção radicular tende a ser reduzida (Smith e Downs, 1974).
As duas espécies estudadas são saxícolas, portanto apresentam uma tendência à
redução do sistema radicular o que pode explicar o menor desenvolvimento de
raízes em relação à parte aérea. No entanto a função de fixação exercida pelas
raízes é muito importante para as bromélias. A fixação no início do
desenvolvimento bem como a função de absorver água em quantidade adequada
no momento em que o indivíduo está se estabelecendo podem explicar a maior
proporção de raízes observada aos 120 dias. A folha em seus estádios iniciais de
desenvolvimento é considerada um tecido heterotrófico, por isso sugere-se que a
absorção inicial de água e nutrientes em bromélias ocorra predominantemente
através das raízes, e posteriormente, com o desenvolvimento e estabelecimento
funcional das folhas, parte dessas funções venham a ser gradativamente
transferidas para a parte aérea destes vegetais.
Apesar dos percentuais de emergência não diferirem de forma
significativa entre os três substratos avaliados, para a espécie N. mucugensis, é
indicado que as sementes sejam semeadas em vermiculita + terra vegetal já que
neste substrato apresentam alta germinabilidade e melhor crescimento durante os
primeiros três meses, evitando o transplantio. Após esse período recomenda-se a
transferência das mudas para substrato composto exclusivamente por terra
33
vegetal. Para O. mucugense, indicam-se os substratos terra vegetal ou terra
vegetal + vermiculita para semeadura e desenvolvimento nos primeiros 120 dias,
mas decorridos três meses as plantas devem ser transferidas para terra vegetal,
procedimento semelhante ao utilizado para N. mucugensis.
Figura 1.2 – Distribuição da matéria seca em plantas das espécies N. mucugensis
e O. mucugense com 120 (A) ou 300 (B) dias de idade em função do substrato
utilizado. (V) vermiculita, (T) terra ou (V + T) vermiculita + terra.
Dis
trib
uiçã
o da
mat
éria
sec
a (%
do
tota
l)
A
N. mucugensis
0%
20%
40%
60%
80%
100%
T V + T T V + T
p. aérea
raiz
B
O. mucugense
O. mucugense N. mucugensis
0%
20%
40%
60%
80%
100%
V T V + T V T V + T
34
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38
CAPÍTULO 2
Estabelecimento in vitro de Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum
mucugense Wand. e Conceição. Bromélias endêmicas da Chapada Diamantina,
Bahia - Brasil.2
2 Este capítulo será submetido à revista Brazilian Archives of Biology and Technology
39
RESUMO
Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense são bromélias endêmicas da
Chapada Diamantina – Bahia com grande potencial ornamental e relevante
importância ecológica. O cultivo in vitro de bromélias é muito utilizado para fins
comerciais e na preservação de espécies raras ou ameaçadas de extinção. O
objetivo desse trabalho foi avaliar a influência da composição do meio de cultura
na germinação e no crescimento de N. mucugensis e O. mucugense, a fim de
estabelecer in vitro estas espécies. A germinação foi avaliada em ágar e no meio
de cultura MS com metade da concentração salina (MS/2). O crescimento foi
avaliado em MS e MS/2 na presença ou ausência de carvão ativado. As sementes
de N. mucugensis germinaram bem em ágar e em MS/2, já a espécie O.
mucugense teve melhor germinação em ágar. Os meios de cultura MS e MS/2
podem ser utilizados para o cultivo in vitro de N. mucugensis e O. mucugense. A
presença de carvão ativado favoreceu o crescimento da parte aérea de O.
mucugense e do sistema radicular de ambas espécies, sendo aconselhável a sua
utilização na fase de pré-aclimatização.
40
ABSTRACT
(In vitro establishment of Neoregelia mucugensis Leme and Orthophytum
mucugense Wand. and Conceição. Endemic bromeliads from Chapa da
Diamantina, Bahia - Brazil). Neoregelia mucugensis and Orthophytum
mucugense are endemic bromeliads from Chapada Diamantina, Bahia, Brazil, and
they have great ornamental potential and ecological relevance. In vitro culture of
bromeliads is widely used for commercial purposes and for preservation of rare or
endangered species. The purpose of the present study was to evaluate the effects
of culture medium composition in the germination and growth of N. mucugensis
and O. mucugense, for in vitro establishment. The germination was evaluated in
agar and MS culture medium with half salt concentration (MS/2). The growth was
evaluated in MS and MS/2 in the presence or absence of activated charcoal.
Seeds of N. mucugensis had a good germination ratio in agar and in MS/2, but O.
mucugense seeds had a better germination ratio in agar. MS or MS/2 culture
media can be used for the N. mucugensis and O. mucugense in vitro culture. As
the presence of activated charcoal favoure the leaf growth of O. mucugense and
the root system growth of both species, thus its use is recommended in the pre-
acclimatization phase.
41
INTRODUÇÃO
Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum mucugense Wand. e
Conceição são duas espécies da família Bromeliaceae endêmicas da Chapada
Diamantina, Bahia, Brasil (Leme 1998; Wanderley e Conceição 2006). N.
mucugensis Leme é uma planta típica dos campos rupestres. Apresenta grande
plasticidade fenotípica, sendo caracterizada por variações na coloração, forma e
conformação da roseta foliar e na coloração das flores. Ocorre no Parque
Nacional da Chapada Diamantina, mas não é considerada protegida devido às
extensas queimadas que atingem o Parque anualmente (Leme 1998).
Orthophytum mucugense é a mais nova espécie de Orthophytum descrita.
Os indivíduos deste táxon crescem formando grandes populações em paredões
rochosos localizados nas margens de rios. Os relatos acerca da sua distribuição
geográfica revelam que a sua ocorrência está restrita ao município de Mucugê.
Apesar de ser encontrada em uma Unidade de Conservação Municipal e de
formar grandes populações, a ocorrência restrita a uma única localidade leva O.
mucugense a categoria vulnerável, fato que demonstra a importância da
realização de trabalhos de preservação com esta nova espécie (Wanderley e
Conceição 2006).
A família Bromeliaceae tem grande importância na manutenção da
biodiversidade animal e vegetal, fornecendo água, alimento, condições de
acasalamento e abrigo para muitas espécies. Os problemas ambientais e o
intenso extrativismo têm afetado as populações de bromélias, ressaltando a
importância de trabalhos de conservação, que protejam estes vegetais e,
conseqüentemente, toda a fauna e flora associadas a estas plantas (Leme e
Marigo 1993; Oliveira et al. 1994).
O cultivo in vitro de bromélias é muito utilizado para fins comerciais, e tem
se destacado na preservação de espécies raras ou ameaçadas de extinção
(Arrabal et al. 2002; Carneiro et al. 1999; Mercier e Kerbauy 1997; Rech Filho et
al. 2005). A escassez de estudos sobre a biologia reprodutiva destas plantas tem
elevado a importância da conservação in vitro da família. A manutenção in vitro
assegura o armazenamento de germoplasma (Carneiro e Mansur 2004; Villalobos
et al. 1991) e é vantajosa inclusive por proporcionar a produção de plantas
42
saudáveis, e a representação de grande variedade de genótipos em espaços
reduzidos (Engelmann 1991).
A micropropagação visando a preservação de espécies deve assegurar a
manutenção da variabilidade genética. Para tanto, é importante a utilização de
plântulas obtidas a partir da germinação in vitro de sementes oriundas de
diferentes populações (Mercier e Nievola 2003). Neste caso, o cultivo in vitro a
partir de sementes é aconselhado também por gerar um grande número de
plantas-matrizes, evitando a retirada de indivíduos da natureza, o que agravaria o
grau de ameaça sobre estas espécies (Carneiro e Mansur 2004). Outra
importante vantagem da obtenção de explantes a partir da germinação decorre da
maior facilidade na desinfestação de sementes quando comparadas com tecidos
extraídos de plantas nativas (Mercier e Kerbauy 1997).
Estudos sobre a germinação in vitro de sementes de Bromeliaceae têm
demonstrado altas taxas de germinabilidade utilizando a forma gelificada dos
meios de Knudson (1946) ou Murashige e Skoog (1962), com sacarose e sem
reguladores de crescimento (Droste et al. 2005, Mercier e Kerbauy 1994; Mercier
e Nievola 2003). No entanto, a concentração salina destes meios pode influenciar
o desenvolvimento inicial de algumas espécies de bromélias (Mekers 1977).
As plântulas produzidas a partir da germinação in vitro podem ser
mantidas em meio de crescimento ou utilizadas como fonte de explantes para a
micropropagação. Em ambos os casos, é necessária a transferência para um
meio adequado ao seu desenvolvimento (Mercier e Nievola 2003). O meio
Murashige e Skoog (1962) tem mostrado bons resultados na propagação in vitro
de bromélias (Arrabal et al. 2002; Carneiro et al. 1999; Droste et al. 2005; Rech
Filho et al. 2005).
O carvão ativado favorece a diferenciação dos tecidos vegetais. Apesar
de não ser considerado um fitorregulador, é capaz de modificar a composição do
meio de cultura, influenciando o crescimento in vitro das plantas. A sua atuação
está associada com a retenção de reguladores de crescimento liberados pelos
tecidos vegetais ou presentes no meio de cultura (Fridborg et al. 1978; George
1993). A capacidade de absorção do carvão está relacionada com a sua estrutura
química. A existência de pequenos poros na parte exterior da molécula, somada à
sua grande área interna, propicia o ingresso de substâncias e sua posterior
retenção na superfície interna da molécula (Mohamed-Yasseen 2001).
43
O desenvolvimento de um protocolo eficaz para o estabelecimento in vitro
de bromélias possibilita a manutenção de plantas matrizes in vitro e constitui o
meio básico para a micropropagação de tais plantas. O presente estudo avaliou a
germinação de sementes e o desenvolvimento de plantas de N. mucugensis e O.
mucugense em diferentes concentrações salinas do meio de cultura de Murashige
e Skoog (1962). Foi analisada, ainda, a influência do carvão ativado no
crescimento destas plantas.
44
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal: origem e assepsia
Foram utilizadas sementes de Neoregelia mucugensis e Orthophytum
mucugense coletadas no Parque Municipal de Mucugê, Rodovia BA 142, Km 96,
município de Mucugê - Bahia.
As sementes foram retiradas de frutos maduros e colocadas para secar
sobre papel filtro a temperatura ambiente durante 4 dias. Para a desinfestação, as
sementes foram imersas em álcool 70% durante um minuto e hipoclorito 3% por
15 minutos, e posteriormente submetidas a quatro lavagens em água destilada
autoclavada.
Condições de cultivo
Os experimentos foram conduzidos em laboratório sob condição de
crescimento de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 16h e densidade de fluxo de fótons
fotossínteticamente ativos de 40 µmol.m-2.s-1.
Germinação in vitro
A semeadura foi realizada superficialmente em frascos de 250ml contendo
50ml de meio de cultura. Foram utilizados dois diferentes meios de cultivo: (1)
meio MS (Murashige e Skoog 1962) com metade da concentração salina,
suplementado com sacarose (30g.L-1) e ágar (7g.L-1) ou (2) água destilada
gelificada com ágar (7g.L-1). O pH foi ajustado para 5,8 antes da autoclavagem. A
esterilização foi realizada em autoclave sob temperatura de 120ºC por 15 minutos.
A germinação foi avaliada diariamente durante 78 dias após a semeadura.
A semente foi considerada germinada quando houve a emissão da radícula.
As variáveis analisadas foram baseadas em Borghetti (2000); Santana e
Ranal (2000) e Maguire (1962) e consistiram de: Porcentagem de Germinação
(%G), Índice de Velocidade de Germinação (IVG), Tempo Médio de Germinação
(Tm) e Freqüência Relativa da Germinação (Fr).
O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado em
arranjo fatorial 2x2 (espécies x meio de cultura) com cinco repetições compostas
por 40 sementes cada. Os resultados expressos em porcentagem foram
transformados em arco seno (%G/100)0,5 para a normalização da sua distribuição.
45
Crescimento in vitro
Na avaliação do crescimento de N. mucugensis foram utilizadas plântulas
com 15 a 30 dias, originadas a partir da germinação em ágar (7g.L-1). Cada
plântula foi colocada em um tubo de ensaio (25x200mm) com 15ml de meio de
cultura. Foram utilizados o meio MS ou MS com metade da concentração salina
(MS/2), suplementado com sacarose (30g.L-1) e ágar (7g.L-1) em dois níveis de
carvão ativado (0 e 1,0 g.L-1).
O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado em
arranjo fatorial 2x2 (concentração salina do meio x carvão) com 14 repetições.
Cada repetição foi composta por cinco plantas.
A avaliação do crescimento de O. mucugense foi realizada em duas
etapas. No primeiro experimento, plântulas com 15 a 30 dias (cerca de 1cm de
altura), originadas a partir da germinação em ágar (7g.L-1), foram transferidas para
meio MS ou MS/2, suplementado com sacarose (30g.L-1) e ágar (7g.L-1). Após a
análise dos resultados obtidos neste experimento, foi montado o segundo
experimento. Neste, foram utilizados brotos, medindo entre 1 e 1,5cm de
comprimento, formados in vitro na ausência de fitorreguladores, sendo as
brotações estimuladas pela remoção do ápice de plantas estioladas. Os brotos
foram inoculados em meio MS/2, suplementado com sacarose (30g.L-1) e ágar
(7g.L-1) em dois níveis de carvão ativado (0 e 1,0 g.L-1). Nos dois experimentos o
material vegetal foi inoculado em tubos de ensaio (25x200mm) com 15ml de meio
de cultura.
O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado com 16
repetições. Cada repetição foi composta por cinco plantas.
A avaliação do crescimento das plantas das duas espécies em diferentes
meios foi realizada 90 dias após a inoculação. Foram mensurados o comprimento
da parte aérea e da raiz (mm) com o auxílio de um paquímetro de precisão
(150mm) e a matéria seca (mg) da parte aérea e das raízes, pelo método de
estufa com ventilação forçada a 60oC / 96 horas.
Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias
comparadas pelo teste de Tukey. O programa estatístico utilizado para análise
dos dados foi o software SISVAR (v 4.3, UFLA).
46
47
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Germinação in vitro
A germinação de N. mucugensis em ambos os meios foi iniciada seis dias
após a inoculação das sementes e se estendeu até o 21o (Ágar) ou 22o (MS/2) dia
depois da semeadura. Já as sementes de O. mucugense apresentaram uma
germinação mais lenta, que se estendeu do 18o ao 78o dia no meio MS/2 e do 23o
ao 76o dia no ágar. Este resultado mostra ainda que a germinação de N.
mucugensis é concentrada em um período de tempo mais restrito que a
germinação de O. mucugense (Figura 2.1).
A interação “espécie x meio de cultura” foi altamente significativa para a
porcentagem de germinação. O tempo médio de germinação e o índice de
velocidade de germinação foram influenciados significativamente tanto pela
espécie como pelo tipo de meio utilizado (Tabela 2.1).
N. mucugensis apresentou alta germinabilidade (93 – 95%) não ocorrendo
diferenças significativas em relação ao tipo de meio utilizado. Em estudo ex vitro,
esta espécie alcançou até 96,5% de germinação (capítulo 1), demonstrando que
N. mucugensis apresenta comportamento germinativo semelhante in vitro e ex
vitro (Tabela 2.1).
Tabela 2.1 – Valores médios para porcentagem de ger minação (%G), tempo médio de germinação (TmG) e índice de velocidade de germinaç ão (IVG) de sementes de Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense em função do meio de cultura.
%GZ TmG IVG
Ágar MS/2 Ágar MS/2 Ágar MS/2
N. mucugensis 95,0 aW AV 93,0 a A 9,86 b A 10,89 b A 4,05 a A 3,57 a B
O. mucugense 58,5 b A 14,0 b B 16,35 a B 18,96 a A 0,68 b A 0,13 b B
Z – Médias originais. A estatística foi realizada em médias transformadas em arco seno. W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada variável, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
48
Figura 2.1 – Freqüência relativa (%) da germinação de sementes de (A) N.
mucugensis e (B) O. mucugense em MS/2 (�) e ágar (�).
A
0
5
10
15
20
25
30
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77
B
0
1
2
3
4
5
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77
Fre
qüên
cia
Rel
ativ
a (%
) F
reqü
ênci
a R
elat
iva
(%)
Tempo (dias)
49
Já as sementes de O. mucugense, tiveram melhor desempenho em ágar
(58,5%) que em meio MS/2 (14%), mas em ambos os tratamentos apresentaram
germinabilidade significativamente mais baixa que N. mucugensis (Tabela 2.1).
Em outro experimento (dados não mostrados), foi possível observar a germinação
de 82% das sementes de O. mucugense em ágar, quando a avaliação foi
realizada após 110 dias da semeadura, o que revela que esta espécie também
apresenta alta germinabilidade, no entanto requer um período mais longo para a
germinação in vitro. Em avaliações realizadas ex vitro, 40 dias após semeadura,
sementes de O. mucugense atingiram até 77,5% de germinação (capítulo 1),
demonstrando que esta espécie apresenta comportamento germinativo
diferenciado, necessitando de um período mais prolongado para germinar in vitro
quando em relação à germinação ex vitro.
Estudos realizados com outras espécies de bromélias demonstraram que
a família apresenta alta germinabilidade e que a germinação em geral ocorre após
uma ou duas semanas da semeadura (Mercier e Nievola 2003). Nara e Webber
(2002) observaram 100% de germinação para Aechmea beeriana. Sementes de
Aechmea nudicaulis e Streptocalyx floribundus atingiram 95,7 e 96% de
germinação, respectivamente, sob condições ideais de luminosidade e
temperatura (Pinheiro e Borghetti 2003). A germinabilidade para Tillandsia
geminiflora chegou à taxa dos 76%, 30 dias após a semeadura ex vitro
(Stringheta et al. 2005). Vriesea gigantea e Vriesea philippocoburgii
apresentaram, respectivamente, 99% e 88,9% de germinação in vitro quando
semeadas em meio Knudson (1946) ou em combinações do meio Knudson com
MS, decorridos 45 dias da inoculação (Droste et al. 2005). Mercier e Kerbauy
(1994) obtiveram mais de 90% de germinação para Vriesea hieroglyphica
utilizando meio Knudson com 25 e 50% da concentração salina.
A concentração salina do meio influencia a germinação e o crescimento
inicial de algumas espécies de bromélias. Foi observado um pequeno decréscimo
na germinação de V. gigantea ao utilizar o meio MS com metade da concentração
de macronutrientes e uma taxa ainda menor quando utilizaram o meio MS com
todos os sais (Droste et al. 2005). Mekers (1977) observou que plântulas de
Vriesea splendens morreram algumas semanas após a inoculação em MS, e
sugeriu que esta espécie é sensível às altas concentrações salinas presentes
neste meio de cultura. Desta forma, a reduzida taxa de germinação observada
50
para sementes de O. mucugense inoculadas em MS/2 parece decorrer da
concentração de sais do meio de cultura.
Os cálculos do tempo médio e do índice de velocidade de germinação
apresentaram resultados significativamente diferentes para as duas espécies,
confirmando que sementes de N. mucugensis germinam mais rápido e em um
menor intervalo de tempo que sementes de O. mucugense. Estes dados
possibilitam ainda a observação de que o meio utilizado não influenciou nestas
variáveis para nenhuma das espécies (Tabela 2.1).
Crescimento in vitro
A interação “meio de cultura x carvão” foi altamente significativa para a
matéria seca da raiz, o comprimento da parte aérea e o comprimento das raízes.
A matéria seca da parte aérea foi influenciada pelo carvão ativado na espécie N.
mucugensis (Tabela 2.2).
Tabela 2.2 – Valores médios para matéria seca da pa rte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e comprimento das raízes de plantas de Neoregelia mucugensis em função da concentração de sais do meio de cultu ra e da presença de carvão ativado.
Matéria seca da parte aérea (mg)
Matéria seca da raiz (mg)
Comprimento parte aérea (mm)
Comprimento raiz (mm)
Carvão (g.L-1)
MS MS/2 MS MS/2 MS MS/2 MS MS/2
0,0 8,1 bWAV 7,8 b A 2,2 b B 5,0 b A 25,6 b A 26,4 b A 11,1 b B 24,6 a A
1,0 14,5 a AV 11,2 a A 9,1 a A 7,6 a B 56,5 a A 48,2 a A 35,7 a A 27,6 a B
W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada variável, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
O efeito do carvão ativado adicionado ao meio de cultura foi altamente
significativo para todas as variáveis analisadas, resultando em maior incorporação
de massa na parte aérea e nas raízes, assim como no comprimento da planta e
das raízes (Tabela 2.2).
O carvão proporciona o escurecimento do substrato estimulando o
crescimento de raízes que são fotoblásticas negativas. Além disso, a sua
capacidade de reter parte dos elementos que compõem o meio reduz a
51
concentração de compostos inibidores do enraizamento (Fridborg et al. 1978;
George 1993).
A diferença na concentração de sais do meio de cultura demonstrou
influenciar o comprimento da raiz. As plantas crescendo em meio MS + carvão
apresentaram raízes significativamente maiores e mais pesadas que as plantas
procedentes do meio MS/2 + carvão. No entanto, na ausência de carvão, o melhor
crescimento de raízes foi obtido para as plantas cultivadas em MS/2. As plantas
procedentes de ambos os meios não demonstraram diferir de maneira
significativa quanto ao tamanho e a incorporação de massa pela parte aérea
(Tabela 2.2), indicando que o meio MS/2 fornece os elementos necessários para
o cultivo in vitro de N. mucugensis com um menor gasto de reagentes, se
comparado ao meio MS.
Durante o crescimento in vitro a grande disponibilidade de nutrientes e
vitaminas possibilita a fácil nutrição da planta, que se desenvolve com raízes
pequenas ou ausentes. Na fase que antecede a transferência para o campo, a
formação de raízes se torna importante, pois a planta precisa estar apta a
desenvolver o seu sistema radicular para captar água e nutrientes do solo durante
a aclimatização. As raízes curtas são vantajosas na aclimatização, pois facilitam o
manuseio e como estão em fase de crescimento intenso, favorecem o
desenvolvimento do sistema radicular no ambiente externo. Raízes longas, por
sua vez, precisam ser podadas durante a transferência. No processo de poda
muitas regiões meristemáticas são removidas, dificultando o crescimento radicular
e o estabelecimento ex vitro das plantas (Grattapaglia e Machado 1988).
A análise de plantas da espécie O. mucugense desenvolvidas em MS e
MS/2 demonstrou que a concentração de sais no meio de cultura não interferiu no
seu crescimento. Plantas procedentes de MS ou MS/2 não apresentaram
diferenças significativas em nenhuma das variáveis analisadas. Diante desse
resultado, optou-se por utilizar a menor concentração salina (MS/2), pois ela
promoveu crescimento semelhante com menor gasto de reagentes (Tabela 2.3).
A análise do efeito do carvão ativado no crescimento das plantas de O.
mucugense demonstrou que a presença de carvão influenciou de forma
significativa, em todas as variáveis analisadas. A presença de carvão
proporcionou um aumento de quase 88% na matéria seca da parte aérea e de
mais de 66% na matéria seca da raiz. O comprimento da parte aérea de plantas
52
desenvolvidas na presença de carvão apresentou um aumento de 77% e um
aumento no comprimento da raiz de 57% (Tabela 2.4).
Tabela 2.3 – Valores médios para matéria seca da pa rte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e comprimento das raízes de plantas de Orthophytum mucugense, em função do meio de cultura.
Meio de cultura Matéria seca da parte aérea (mg)
Matéria seca da raiz (mg)
Comprimento parte aérea (mm)
Comprimento raiz (mm)
MS 6,57 aW 1,34 a 17,46 a 23,81 a
MS/2 5,44 a 1,01 a 15,71 a 21,16 a
W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
Tabela 2.4 – Valores médios para matéria seca da pa rte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e comprimento das raízes de plantas de Orthophytum mucugense, em função de diferentes níveis de carvão ativado no meio de cultura.
Carvão (g.L-1) Matéria seca da parte aérea (mg)
Matéria seca da raiz (mg)
Comprimento parte aérea (mm)
Comprimento raiz (mm)
0,0 19,92 bW 3,68 b 28,64 b 30,47 b
1,0 37,43 a 9,81 a 50,70 a 47,93 a
W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
A presença de carvão ativado no meio de cultura tem favorecido a
morfogênese, a rizogênese e o crescimento do vegetal. O estímulo à
diferenciação de tecidos está relacionado com a sua capacidade de absorver
substâncias inibidoras, mas a forma exata pela qual o carvão estimula o
crescimento ainda não está esclarecida (Fridborg et al. 1978; George 1993;
Mohamed-Yasseen, 2001).
Apesar do carvão ativado atuar na redução da oxidação e na inativação
de resíduos de fitorreguladores, deve-se considerar que a retenção de elementos
do meio pode ocasionar deficiências na planta tornando indisponíveis
componentes essenciais para o desenvolvimento dos vegetais como os
macronutrientes e os micronutrientes (Grattapaglia e Machado 1988).
A presença de carvão favoreceu o crescimento da parte aérea e do
sistema radicular de ambas espécies. Considerando os resultados benéficos
53
decorrentes da utilização de carvão é recomendável a sua utilização em uma fase
rápida, que anteceda a aclimatização, já que o desenvolvimento de raízes muito
grandes pode afetar a transferência. É preciso considerar também que a
utilização excessiva do carvão pode interferir no crescimento vegetal, por
indisponibilizar elementos essenciais para o seu desenvolvimento.
As sementes de N. mucugensis podem ser semeadas em ágar ou MS/2,
originando plântulas já na segunda semana após a inoculação, enquanto as
sementes de O. mucugense devem ser semeadas no ágar com ao menos quatro
ou cinco semanas de antecedência à utilização das plântulas.
Foi possível verificar que plantas de ambas espécies não apresentaram
diferenças significativas no crescimento quando foram cultivadas em MS ou MS/2.
Portanto, os dois meios podem ser utilizados para o cultivo in vitro de N.
mucugensis e O. mucugense.
54
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57
CAPÍTULO 3 Resposta regenerativa in vitro de explantes caulinares de Neoregelia mucugensis Leme, Orthophytum mucugense Wand. e Conceição e Orthophytum albopictum Philcox. Bromélias endêmicas da Chapada Diamantina - Brasil, submetidas a diferentes concentrações de BAP e ANA.3
3 Este capítulo será submetido à revista Plant Cell Tissue and Organ Culture
58
RESUMO
Este trabalho teve por objetivo o desenvolvimento de protocolos eficientes de
regeneração in vitro para N. mucugensis, O. mucugense e O. albopictum
utilizando explantes caulinares na presença de benzilaminopurina (BAP) e ácido
naftalenoacético (ANA). Segmentos nodais de plantas com seis meses de idade,
procedentes da germinação in vitro foram inoculados em meio MS/2
suplementado com sacarose, ágar, e combinações de BAP e ANA. Em geral N.
mucugensis e O. albopictum tiveram maior capacidade para regenerar brotos e
mais explantes responsivos que O. mucugense. Os brotos de O. albopictum
apresentaram maior ganho de massa que as demais espécies. Na presença de
1,11 e 2,22µM de BAP e ausência de ANA, N. mucugensis apresentou maior
número de explantes responsivos. O percentual de explantes formando calos foi
maior para O. albopictum que para as outras duas espécies. Os resultados
apresentados neste trabalho revelaram que a micropropagação pode ser
empregada com sucesso para a propagação em larga escala destas espécies de
bromélias. Para induzir a formação de brotos in vitro recomenda-se a utilização
das combinações de 2,22 ou 4,44µM BAP + 1,3µM de ANA para N. mucugensis,
2,22µM de BAP + 0,65µM ANA para O. mucugense e 1,11µM de BAP + 0,65µM
ANA para O. albopictum.
59
ABSTRACT
In vitro regenerative response from stem explants of Neoregelia mucugensis
Leme , Orthophytum mucugense Wand. and Conceição and Orthophytum
albopictum Philcox, endemic bromeliads from Chapada Diamantin a - Brazil,
treated with different concentration of BAP and ANA . This study aimed to
develop an efficient protocol for in vitro regeneration from stem explants of
Neoregelia mucugensis, Orthophytum mucugense and Orthophytum albopictum in
the presence of benzylaminopurine (BAP) e naphthaleneacetic acid (NAA). Stem
segments of six-month-old plants, originated by in vitro germination, were
cultivated in MS/2 medium supplemented with sucrose, BAP and NAA
combinations and agar. In general, N. mucugensis e O. albopictum had better
capacity to regenerate shoots and more responsive explants than O. mucugense.
O. albopictum shoots showed higher dry weights than other species. N.
mucugensis explants were more responsives in the presence of BAP (1.11 e
2.22µM) and in the absence of NAA. O. albopictum showed the biggest callus
formation. The results presented in this study show that micropropagation can be
successfully for conservation purposes and on large scale propagation of these
bromeliads species. We recommend the use of 1.3µM NAA + 2.22 or 4.44µM BAP
for N. mucugensis, 2.22µM BA + 0.65µM NAA for O. mucugense and 1.11µM of
BAP + 0.65µM NAA for O. albopictum.
60
INTRODUÇÃO
As espécies Neoregelia mucugensis Leme, Orthophytum mucugense
Wand. e Conceição e Orthophytum albopictum Philcox, pertencentes à família
Bromeliaceae, são endêmicas da Chapada Diamantina, sendo encontradas no
Parque Nacional da Chapada Diamantina (N. mucugensis) e no Parque Municipal
Sempre-viva (N. mucugensis, O. mucugense e O. albopictum). Apesar de
ocorrerem em unidades de conservação, não são consideradas protegidas devido
às grandes queimadas que costumam atingir a região no período de seca (Leme
1998; Wanderley e Conceição 2006). Além disso, a espécie recém descrita O.
mucugense, assim como O. albopictum, são classificadas como vulneráveis
devido à ocorrência restrita ao município de Mucugê (Wanderley e Conceição
2006). Os três táxons estudados apresentam grande potencial ornamental devido
à coloração de suas folhas, principalmente na fase de floração. Portanto, a
propagação destas espécies é importante para a conservação bem como para o
cultivo comercial.
A propagação natural de bromélias produz um número reduzido de
plantas. Já a multiplicação in vitro possibilita a formação de um grande número de
mudas, característica essencial para a agricultura (Mercier e Kerbauy 1995,
1997). Inicialmente métodos de conservação e propagação in vitro de plantas
tiveram como alvo espécies com interesse econômico. No entanto, estas técnicas
ganharam espaço também na conservação de espécies com ocorrência restrita
ou sob risco de extinção (Arrabal et al. 2002; Carneiro et al. 1999; Malda et al.
1999; Mercier e Kerbauy 1997; Rech Filho et al. 2005). O desenvolvimento de
sistemas de micropropagação geralmente é necessário para o estabelecimento
de programas de conservação. Para a conservação in vitro de bromélias
recomenda-se a utilização de plântulas obtidas a partir de germinação in vitro,
assegurando a variabilidade genética das populações naturais (Carneiro e Mansur
2004).
Para a conservação in vitro as plantas devem manter a sua estabilidade
genética, sendo importante o desenvolvimento de métodos que reduzam a
ocorrência de mutações e a variação somaclonal. A obtenção de plantas a partir
de organogênese direta e a redução da concentração e do tempo de exposição
61
dos explantes aos reguladores de crescimento diminuem as chances de
ocorrência de alterações genéticas (Mercier e Nievola 2003).
O meio MS (Murashige e Skoog 1962) suplementado com os reguladores
benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA) é muito utilizado para a
micropropagação de bromélias, proporcionando a formação de brotos adventícios
em várias espécies (Arrabal et al. 2002; Carneiro et al. 1999; Droste et al. 2005;
Koh e Davies Jr 2001; Rech Filho et al. 2005).
O presente estudo avaliou o efeito de diferentes concentrações dos
reguladores de crescimento vegetal BAP e ANA na micropropagação de N.
mucugensis, O. mucugense e O. albopictum.
62
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal
Sementes de N. mucugensis, O. mucugense e O. albopictum foram
desinfestadas com álcool 70% (1 minuto) e hipoclorito 3% (15 minutos), lavadas
em água destilada autoclavada (4x) e semeadas em frascos de 250ml contendo
50ml de ágar (7g. L-1). Após a germinação as plântulas foram mantidas em meio
MS/2, sendo transferidas para novos meios a cada 90 dias.
Plantas com seis meses de idade, procedentes de germinação in vitro
foram utilizadas como fonte de explantes. Os segmentos nodais foram obtidos
após a remoção das folhas e do ápice caulinar. Cada planta forneceu em média
três explantes a partir da divisão do caule em cilindros com aproximadamente
5mm de comprimento.
Condições de cultivo, pH e esterilização do meio de cultura.
Os experimentos foram conduzidos em laboratório sob condição de
crescimento de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 16h e densidade de fluxo de fótons
fotossínteticamente ativos de 40 µmol.m-2.s-1.
Os meios utilizados tiveram o pH ajustado para 5,8 antes da
autoclavagem, que foi realizada sob temperatura de 120ºC por 15 minutos.
Estudos prévios mostraram que o crescimento de N. mucugensis e O.
mucugense não diferiu entre plantas cultivadas em MS (Murashige e Skoog 1962)
e MS com metade da concentração de sais (MS/2) (capítulo 2). Além disso, a
utilização de meio com concentração salina reduzida tem beneficiado a
multiplicação in vitro de bromélias (Mekers 1977; Mercier e Kerbauy 1992). Por
isso, neste trabalho o meio MS/2 foi utilizado como base para todos os
tratamentos.
Cultura de explantes
Segmentos nodais foram inoculados em tubos de ensaio (25x200mm)
contendo 15ml de meio MS/2, gelificado com ágar (7g.L-1), suplementado com
sacarose (30g.L-1) e diferentes combinações de BAP (0,00; 1,11; 2,22 e 4,44µM)
e ANA (0,00; 0,33; 0,65 e 1,30µM). Os tubos foram fechados com película de
polivinilcloreto (PVC).
63
Decorridos seis meses da inoculação, sem a transferência para
subculturas, foram avaliados: o número de brotações por explante; a incorporação
de matéria seca pelos brotos (mg); o percentual de explantes que produziram
brotos e o percentual de explantes que formaram calos.
Para a avaliação da média de número de brotos produzidos por explante,
foram estabelecidas quatro classes de mensuração: (1) menos de um broto por
explante, (2) 1 a 3 brotos, (3) 4 a 6 brotos, (4) 7 a 12 brotos e (5) a formação de
mais de 12 brotos por explante.
O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado em
arranjo fatorial 3x4x4 (espécies x concentrações de ANA x concentrações de
BAP) utilizando cinco repetições, sendo cada uma delas formada por ao menos
quatro tubos com um explante cada. Os resultados expressos em porcentagem
foram transformados em arco seno para a normalização da sua distribuição. Os
dados foram submetidos à análise de variância e regressão e as médias
comparadas pelo teste de Tukey. Utilizou-se o software SISVAR (v 4.3, UFLA)
para análise dos dados.
64
65
RESULTADOS
A formação de brotos adventícios foi iniciada entre a segunda e a quarta
semana após a inoculação dos explantes. De modo geral os brotos foram
originados diretamente do segmento nodal utilizado como explante e a formação
de calos, quando ocorreu, foi observada somente após quatro meses de cultura.
A formação direta de brotos a partir do caule já foi descrita para outras espécies
de Bromeliaceae como Cryptanthus sinuosus, Vriesea gigantea e V.
philippocoburgii (Arrabal et al. 2002; Carneiro et al. 1998; Droste et al. 2005).
A regeneração de brotos pela espécie N. mucugensis foi observada em
todas as combinações de reguladores de crescimento testadas. O. mucugense
formou em média menos de um broto por explante em 31% dos tratamentos
utilizados. Já O. albopictum apresentou em média menos de um broto por
explante quando utilizados 4,44µM de BAP na ausência de ANA. As melhores
taxas de regeneração ocorreram nas combinações de 2,22 ou 4,44µM de BAP
associado com 1,30µM de ANA para N. mucugensis (7 a 12 brotos) e 2,22µM de
BAP com 0,65µM de ANA para O. mucugense (7 a 12 brotos). Explantes de O.
albopictum regeneraram maior número de brotos em meios suplementados com
1,11µM de BAP associado a 0,33; 0,65 ou 1,30 µM de ANA (Tabela 3.1).
A avaliação comparativa demonstrou que em geral N. mucugensis (4 a 6
brotos por explante) e O. albopictum (4 a 6 brotos por explante) regeneram brotos
que O. mucugense (1 a 3 brotos por explante). Os brotos de N. mucugensis
(1,95mg) e de O. mucugense (1,11mg) apresentaram em geral menor ganho em
matéria seca que os brotos de O. albopictum (2,91mg). A comparação das três
espécies quanto à capacidade dos explantes em regenerar brotos mostra que N.
mucugensis (54,6%) e O. albopictum (50,8%) não diferem entre si, mas ambos
apresentaram percentuais significativamente mais altos que O. mucugense
(39,0%). O percentual de explantes formando calos em média foi menor para N.
mucugensis (10,2%) e O. mucugense (8,4%) que para O. albopictum (20,7%)
(Tabela 3.2).
66
TABELA 3.1 – Valores médios para número de brotos p or explante de O. albopictum, O. mucugense e N. mucugensis em função das espécies e das concentrações de BAP e ANA (µM).
Número de brotosZ
BAP (µM) ANA (µM) N. mucugensis O. mucugense O. albopictum
0,00 2 bW 1 c 2 cdW
0,00 0,33 3 b 2 bc 2 cd
0,65 2 b 1 c 2 cd
1,30 3 b 1 c 2 cd
0,00 3 b 1 c 2 cd
1,11 0,33 3 b 2 bc 4 ab
0,65 3 b 2 bc 5 a
1,30 3 b 3 b 4 ab
0,00 3 b 1 c 2 cd
2,22 0,33 3 b 2 bc 3 bc
0,65 2 b 4 a 3 bc
1,30 4 a 3 b 3 bc
0,00 2 b 2 bc 1 d
4,44 0,33 3 b 2 bc 3 bc
0,65 3 b 3 b 3 bc
1,30 4 a 2 bc 2 cd
Z – O número de brotos está apresentado em classes de mensuração. (1) menos de um broto por explante, (2) 1 a 3 brotos, (3) 4 a 6 brotos, (4) 7 a 12 brotos e (5) a formação de mais de 12 brotos por explante. W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
TABELA 3.2 – Valores médios por espécie para número de brotos, matéria seca dos brotos regenerados por explante, porcentagem de explantes que formaram brotos e porcentagem de explantes que formaram calos.
Número de brotosZ Matéria seca dos
brotos (mg/explante) Explantes com
brotos (%) Explantes com
calos (%)
N. mucugensis 3 aW 1,95 b 54,6 a
10,2 b
O. mucugense 2 b 1,11 c 39,0 b 8,4 b
O. albopictum 3 a 2,91 a 50,8 a 20,7 a
Z – O número de brotos está apresentado em classes de mensuração. (2) 1 a 3 brotos e (3) 4 a 6 brotos por explante. W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
67
A avaliação da incorporação de matéria seca por brotos de N. mucugensis
obteve variações insignificantes para os diferentes tratamentos utilizados (Figura
3.1A). A associação de 2,22µM de BAP com 0,65µM de ANA promoveu o maior
ganho de matéria seca por brotos de O. mucugense. A linha de tendência revela
que nesta concentração de BAP, menores ou maiores taxas de ANA promovem
uma menor incorporação de matéria seca (Figura 3.1B). Ainda com relação à
incorporação de massa pelos brotos de O. mucugense, na ausência de BAP, o
aumento da concentração de ANA favoreceu o acúmulo de matéria seca. A
análise de regressão deste tratamento mostrou uma tendência linear, sugerindo
que concentrações de ANA maiores que as avaliadas neste trabalho podem
resultar em um ganho de matéria seca maior do que o observado para a
associação de 2,22µM de BAP com 0,65µM de ANA (Figura 3.1B). Os brotos de
O. albopictum adquiriram mais matéria seca em meio suplementado com 1,11µM
de BAP. A análise de regressão para este tratamento mostrou uma curva
quadrática que aumenta até aproximadamente 0,65µM de ANA e depois começa
a decrescer (Figura 3.1C).
O maior número de explantes de N. mucugensis responsivos à formação
de brotos foi obtido para a estimulação com 1,11 ou 2,22µM de BAP na ausência
de ANA. No entanto, a análise de regressão mostra que na presença de BAP
(1,11; 2,22 ou 4,44µM) existe uma tendência à elevação do percentual de
explantes responsivos com a utilização de concentrações de ANA maiores que
1,30µM (Figura 3.2A). O percentual de explantes que regeneraram brotos de O.
mucugense foi maior na concentração de 2,22µM de BAP. A curva quadrática
atinge maiores taxas de explantes responsivos entre as concentrações de 0,65 e
1,30µM de ANA. No entanto, a presença de 1,11µM de BAP mostra uma
tendência ao aumento do percentual de explantes formadores de brotos,
sugerindo que a utilização de ANA em concentrações maiores que 1,30µM
associadas a 1,11µM de BAP podem resultar no aumento da proporção de
explantes responsivos (Figura 3.2B). Os melhores percentuais de explantes
responsivos à formação de brotos para O. albopictum foram obtidos ao utilizar
BAP na concentração de 1,11µM. A análise de regressão obteve uma curva
quadrática que atinge o seu pico em uma concentração próxima a 0,65µM de
ANA (Figura 3.2C).
68
Figura 3.1 – Valores médios estimados para matéria seca dos brotos obtidos a
partir de explantes caulinares de N. mucugensis (A), O. mucugense (B) e O.
albopictum (C) em função de diferentes concentrações de ANA e BAP. Linhas de
tendência com coeficiente de correlação inferior a 70% não foram mostradas nos
gráficos. **significativo ao nível de 1% de probabilidade, *significativo ao nível de
5% de probabilidade, nsnão significativo ao nível de 5% de probabilidade.
Mat
éria
sec
a do
s br
otos
(m
g)
ANA (µM)
Y (�) = 2,087x + 0,368 R2 = 85%*
Y (�) = -1,1748x2 + 1,9018x + 0,2398 R2= 70%ns
B O. mucugense
Y (�) = -4,8585x2 + 7,899x - 0,0484 R2 = 85%ns
Y (�) = 0,4448x + 0,202 R2= 89%ns
B
0
2
4
6
8
10
0 0,325 0,65 0,975 1,3
C
0
2
4
6
8
10
0 0,325 0,65 0,975 1,3
Y (�) = -7,7483x2 + 10,527x + 1,2892 R2 = 96%**
Y (�) = -15,346x2 + 22,864x + 0,3582 R2= 100%**
Y (�) = -6,582x2 + 9,8961x + 0,5415 R2 = 98%*
C O. albopictum
A N. mucugensis
Y (�) = 1,738x + 0,474 R2= 83%ns
A
0
2
4
6
8
10
0 0,325 0,65 0,975 1,3
BAP 0 BAP 1,11
BAP 2,22 BAP 4,44
69
Figura 3.2 – Valores médios estimados para o percentual de explantes de N.
mucugensis (A), O. mucugense (B) e O. albopictum (C) que regeneraram brotos
em função de diferentes concentrações de ANA e BAP. Linhas de tendência com
coeficiente de correlação inferior a 70% não foram mostradas nos gráficos.
**significativo ao nível de 1% de probabilidade, *significativo ao nível de 5% de
probabilidade, nsnão significativo ao nível de 5% de probabilidade.
% e
xpla
ntes
com
bro
tos
Y (�) = 24,316x + 28,12 R2= 76%*
B O. mucugense
Y (�) = -41,399x2 + 88,655x + 22,135 R2 = 100%*
ANA (µM)
B
0
20
40
60
80
0 0,325 0,65 0,975 1,3
Y (�) = 37,439x2 - 63,86x + 79,309 R2= 95%ns
A N. mucugensis
Y (�) = 74,233x2 - 111,82x + 81,682 R2 = 84,5%**
Y (�) = 18,989x + 43,2 R2= 88%*
A
0
20
40
60
80
0 0,325 0,65 0,975 1,3
BAP 0 BAP 1,11
BAP 2,22 BAP 4,44
Y (�) = -38,515x2 + 47,287x + 34,464 R2 = 74%ns
Y (�) = -57,881x2 + 107,73x + 30,573 R2= 100%**
C O. albopictum
Y (�) = -32,06x2 + 51,958x + 40,227 R2 = 92%ns
Y (�) = -75,74x2 + 124,92x + 22,2 R2= 86%**
C
0
20
40
60
80
0 0,325 0,65 0,975 1,3
70
N. mucugensis apresentou baixos percentuais de formação de calos,
sendo observada uma tendência para maiores percentuais utilizando 1,11 e
4,44µM de BAP associado à concentrações de ANA superiores à 1,30µM (Figura
3.3A). O. mucugense assim como N. mucugensis, apresentou baixos percentuais
de explantes formadores de calos, mas a análise de regressão mostra que nas
concentrações de 1,11 e 4,44µM de BAP existe uma tendência de crescimento
destes percentuais, podendo atingir taxas mais elevadas em concentrações de
ANA superiores a 1,30µM (Figura 3.3B). O maior percentual de explantes com
calos na espécie O. albopictum foi obtido ao utilizar 1,11µM de BAP. Sob este
estímulo, a linha de tendência tem comportamento quadrático, crescendo até uma
concentração de ANA próxima a 1µM (Figura 3.3C).
71
Figura 3.3 – Valores médios estimados para percentual de explantes de N.
mucugensis (A), O. mucugense (B) e O. albopictum (C) que originaram calos em
função de diferentes concentrações de ANA e BAP. Linhas de tendência com
coeficiente de correlação inferior a 70% não foram mostradas nos gráficos.
**significativo ao nível de 1% de probabilidade, *significativo ao nível de 5% de
probabilidade, ns não significativo ao nível de 5% de probabilidade.
ANA (µM)
% e
xpla
ntes
com
cal
os
Y (�) = 19,042x + 2,32 R2= 95%**
B O. mucugense
Y (�) = -60,032x2 + 80,618x + 0,6382 R2 = 99%**
Y (�) = 18,356x - 3,24 R2= 75%*
B
0
20
40
60
0 0,325 0,65 0,975 1,3
Y (�) = 0,7378x2 - 2,9451x + 24,098 R2 = 80%ns
Y (�) = -3,9917x2 + 13,476x + 36,244 R2= 100%*
A N. mucugensis
Y (�) = -4,8587x2 + 28,51x + 20,947 R2 = 98,5%*
Y (�) = -5,4194x2 + 26,25x + 35,365 R2= 100%**
A
0
20
40
60
0 0,325 0,65 0,975 1,3
BAP 0 BAP 1,11
BAP 2,22 BAP 4,44
Y (�) = 0,022x - 1,2 R2 = 94%*
Y (�) = -75,783x2 + 141,12x - 0,2891 R2= 100%**
C O. albopictum
Y (�) = -35,46x2 + 77,248x + 5,6291 R2 = 72%**
C
0
20
40
60
0 0,325 0,65 0,975 1,3
72
DISCUSSÃO
Este trabalho descreve um protocolo eficiente de regeneração in vitro para
N. mucugensis, O. mucugense e O. albopictum utilizando explantes nodais na
presença de BAP e ANA.
Os resultados obtidos a partir da estimulação com BAP e ANA estão de
acordo com sistemas de micropropagação estabelecidos para outras espécies
(Mercier e Kerbauy 1997). Os dados apresentados possibilitam estabelecer que a
associação de 2,22 ou 4,44µM de BAP com 1,30µM de ANA tem a capacidade de
promover a regeneração de 7 a 12 brotos por explante de N. mucugensis. Em O.
mucugense a interação de 2,22µM de BAP com 0,65µM de ANA também induz a
formação de 7 a 12 brotos por explante, enquanto que para O. albopictum 1,11µM
de BAP associado com 0,65µM de ANA promove a formação de mais 12 novos
brotos por explante (Tabela 3.1). Estas mesmas associações entre BAP e ANA
demonstraram bons resultados para o aumento da biomassa dos brotos (Figura
3.1) bem como para o percentual de explantes responsivos à formação de brotos
para cada uma das espécies (Figura 3.2).
Ocorre que o percentual de explantes que originaram calos também foi
alto (60%) para o tratamento de O. albopictum com 1,11µM de BAP associado
com 0,65µM de ANA (Figura 3.3). A formação de calos é muito importante para
alguns procedimentos da cultura in vitro de plantas como a embriogênese indireta
(George 1993). No entanto, para a conservação de germoplasma, o uso de
sistemas de regeneração não associados com a formação de calos é
recomendado por minimizar o risco de alterações genéticas (Villalobos et al.
1991). A ocorrência de calos para as três espécies estudadas só foi observada
após quatro meses de cultura, período no qual mais de 85% dos brotos já haviam
sido formados. Desta forma é possível controlar a calogênese manipulando o
tempo de cultura.
Em relação ao número de brotos, os valores obtidos neste trabalho foram
iguais ou superiores aos encontrados para outras espécies de bromélias. Droste
et al. (2005) obtiveram 40 a 68% de explantes de Vriesea gigantea responsivos à
formação de brotos, sendo observados até 3,14 brotos por explante. Já a V.
philippocoburgii apresentou 100% de explantes responsivos e em média 4,3
brotos por explante. Mercier e Kerbauy (1994) estimularam a formação de 7,0
73
brotos por plântula de V. hieroglyphica. Brotos de Vriesea reitzii geraram em
média 4,0 a 4,5 brotos adventícios por explante após três meses de cultura (Rech
Filho et al. 2005).
Alguns estudos apresentaram taxas de regeneração superiores às
encontradas para O. albopictum, O. mucugense e N. mucugensis. Mercier e
Kerbauy (1992) induziram a formação de 22 brotos por plântula de V. fosteriana.
Explantes de Cryptanthus sinuosus regeneraram em média 30 brotos (Carneiro et
al. 1998). Em estudos realizados com a espécie Neoregelia cruenta Carneiro et al.
(1999) não obtiveram sucesso na indução da formação de brotos a partir de
segmentos do caule. No entanto, uma alta taxa de formação de brotos foi
observada estimulando folhas de Cryptanthus sinuosus (50 brotos/explante) e
Neoregelia cruenta (60 brotos/explante) com BAP (Carneiro et al. 1998, 1999).
Apesar das altas taxas de regeneração observadas nestes sistemas de
micropropagação, é importante considerar que o BAP foi utilizado em altas
concentrações, aumentando a possibilidade de variação somaclonal e outras
instabilidades genéticas que podem comprometer a conservação in vitro (Mercier
e Nievola 2003).
Neste sentido, Arrabal et al. (2002) avaliaram a micropropagação de
Cryptanthus sinuosus na ausência ou em baixas concentrações de BAP e ANA.
O número de brotos regenerados foi maior na ausência de reguladores e na
combinação de 2,2µM de BAP com 0,05µM de ANA (cerca de 22 a 25 brotos por
explante). Estes resultados foram obtidos após seis meses de cultura em meio
líquido, sendo realizadas subculturas a cada dois meses. A utilização de meio
semi-sólido, sem a transferência para subculturas, condição semelhante à
avaliada para O. albopictum, O. mucugense e N. mucugensis, promove uma
redução de 66% no número de brotos formados após seis meses de cultura.
Portanto, a transferência para subculturas a cada um ou dois meses deve otimizar
a regeneração de brotos nas espécies aqui estudadas, o que seria adequado para
a propagação em escala comercial.
No entanto, o aumento do tempo das subculturas é importante para
projetos de conservação in vitro a curto e médio prazo, que são beneficiados pelo
retardamento do crescimento das plantas, pois assim são reduzidos também o
risco de contaminação e as despesas com manutenção (Villalobos et al. 1991).
Por isso neste trabalho as avaliações foram encerradas após seis meses de
74
cultivo e não foram realizadas transferências para subculturas neste intervalo de
tempo.
Os resultados aqui apresentados revelam que a micropropagação pode
ser empregada com sucesso para a propagação em larga escala destas espécies
de bromélias. Recomenda-se a utilização das combinações de 2,22 ou 4,44µM
BAP + 1,3µM de ANA para N. mucugensis, 2,22µM de BAP + 0,65µM ANA para
O. mucugense e 1,11µM de BAP + 0,65µM ANA para O. albopictum.
A produção de mudas através de organogênese direta deve utilizar as
combinações de reguladores supra citadas em culturas mantidas por um período
máximo de quatro meses, visto que após esse tempo foi observado o início da
formação de calos, principalmente para O. albopictum.
A utilização dos calos formados após quatro meses de cultura pode
favorecer a produção de mudas para comercialização, otimizando a produção de
mudas por organogênese indireta. Neste caso será necessária a realização de
novos trabalhos que estabeleçam protocolos adequados à regeneração de brotos
a partir dos calos bem como que avaliem o potencial ornamental e a produtividade
das plantas obtidas.
75
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78
CAPÍTULO 4
Efeito da ventilação in vitro na aclimatização de plantas micropropagadas de Orthophytum mucugense Wand. e Conceição, uma bromélia endêmica da Bahia - Brasil.4
4 Este capítulo será submetido à revista Plant Cell Tissue and Organ Culture
79
RESUMO Orthophytum mucugense é a mais nova espécie de Orthophytum descrita. Com
distribuição restrita ao município de Mucugê – Chapada Diamantina é classificada
na categoria vulnerável, o que justifica a realização de trabalhos que dêem
suporte à preservação da espécie. Este estudo avalia a influência da forma de
fechamento dos tubos e de diferentes concentrações de sacarose na
aclimatização de plantas da espécie O. mucugense propagadas in vitro. Brotos
micropropagados foram transferidos para MS/2 acrescido de ágar (7g.L-1), carvão
ativado (1g.L-1) e diferentes concentrações de sacarose (0, 15 e 30g.L-1). Após 30
dias as plantas foram submetidas a dois tipos de fechamento de tubos: película
PVC e algodão. Na ocasião da transferência para o viveiro as plantas foram
avaliadas quanto à perda de água e foram coletados os tecidos para a realização
das análises histológicas. No viveiro, as plantas foram transferidas para substrato
(vermiculita + terra) e cobertas com garrafas ¨PET¨, as quais foram destampadas
após 30 dias e retiradas após 40 dias. O selamento dos recipientes de cultura
com algodão reduziu a perda de água em 50% e possibilitou o desenvolvimento
da parede celular lignificada de células da epiderme adaxial e abaxial. A
concentração de sacarose não influenciou de forma significativa à sobrevivência
de plantas procedentes de tubos fechados com algodão. A restrição de sacarose
no meio de cultura prejudicou a sobrevivência de plantas provenientes de tubos
fechados com PVC.
80
ABSTRACT Effect of in vitro ventilation in the acclimatization of micropropaga ted plants
of Orthophytum mucugense, an endemic bromeliad from Bahia – Brazil.
Orthophytum mucugense is the newest described species of Orthophytum. They
have restricted occurrence in Mucugê, Bahia – Brazil, vindicating conservation
studies about them. The purpose of the present study was to evaluate the
influence of different tubes closing forms and the effect of sucrose in the
acclimatization of micropropagated O. mucugense shoots. Micropropagated
shoots were transferred to MS/2 supplemented with agar (7g.L-1), activated
charcoal (1g.L-1) and different concentrations of sucrose (0, 15 e 30g.L-1). After 30
days, the shoots were submitted to two types of tubes closing: PVC film and
cotton. When transferred to the nursery, water plant loss was evaluted and plant
tissues were collected for leaf anatomy analyses. In the nursery, plants were
transferred to substrates (vermiculite + organic soil) and covered with “PET”
bottles, which were opened after 30 days and were removed after 40 days. The
use of cotton for sealing culture containers reduced the loss of water in 50% and it
made possible the development of the lignified cellular wall of adaxial and abaxial
epidermis. The concentration of sucrose did not show significant influence on the
survival of cotton sealed tube plants. The restriction of sucrose in the culture
medium decreased the PVC sealed tubes plant’s survival.
81
INTRODUÇÃO
O Brasil abriga quase metade das espécies de bromélias conhecidas. O
Leste do país é considerado um centro de desenvolvimento e dispersão da família
contendo um grande número de espécies endêmicas (Leme e Marigo 1993; Leme
1998).
Orthophytum Beer é um gênero exclusivamente brasileiro, composto por
espécies com inflorescências sésseis ou providas de escapo (Smith e Downs
1983; Wanderley 1990). Segundo Wanderley e Conceição (2006) as espécies de
Orthophytum com inflorescência séssil, ocorrentes na Chapada Diamantina são
muito valorizadas como plantas ornamentais devido à coloração de suas brácteas
e folhas, geralmente vermelhas na antese. Esta característica confere às espécies
importante papel ecológico pela capacidade de atrair beija-flores.
Orthophytum mucugense Wand. e Conceição é a mais nova espécie de
Orthophytum descrita. Os indivíduos deste táxon crescem formando grandes
populações em paredões rochosos localizados nas margens de rios, constituindo
uma espécie típica de locais sombreados e úmidos. Os relatos acerca da sua
distribuição geográfica revelam que a sua ocorrência está restrita ao município de
Mucugê – Chapada Diamantina. Apesar de ser encontrada em uma Unidade de
Conservação Municipal e de formar grandes populações, a ocorrência restrita a
uma única localidade leva O. mucugense a categoria vulnerável, fato que
demonstra a importância da realização de trabalhos de preservação com esta
nova espécie (Wanderley e Conceição 2006).
Técnicas de cultura de tecidos têm sido aplicadas na conservação e
multiplicação de genótipos específicos de bromélias. A micropropagação é muito
importante para biofábricas por proporcionar a rápida propagação,
disponibilizando uma grande quantidade de mudas, com características
homogêneas, independentemente da estação do ano (Arrabal et al. 2002;
Carneiro et al. 1999; Carneiro e Mansur, 2004; Droste et al. 2005; Endres et al.
2002; Guimarães et al. 1999; Malda et al. 1999; Mercier e Kerbauy 1992, 1997,
1998).
Plantas procedentes de propagação in vitro podem apresentar problemas
na adaptação para o ambiente ex vitro, resultando freqüentemente num baixo
82
percentual de sobrevivência. A incapacidade de controlar a perda de água por
transpiração a partir da superfície foliar, bem como o mau funcionamento dos
estômatos de plantas cultivadas in vitro, afetam a capacidade de adaptação ao
ambiente externo (Seelye et al. 2003). Estas alterações que acarretam a
inabilidade das plantas em manter o seu conteúdo de água parecem ser
influenciadas pelo acúmulo de gases, como etileno, mas principalmente pelo
elevado teor de umidade presente no recipiente utilizado para o cultivo in vitro
(Buddendorf-Jooten e Woltering 1996; De Proft et al. 1985; Zobayed et al. 1999).
Assim, um modelo de cultivo que possibilite o aumento das trocas gasosas tem
facilitado a fase de aclimatização das mudas (Jackson 2003; Seelye et al. 2003).
A ventilação dos frascos de cultura obtida através do uso de tampas
permeáveis aumenta as trocas gasosas e, conseqüentemente, as taxas de
transpiração in vitro das plantas (Lai et al. 2005; Zobayed et al. 1999). A aeração
dos frascos estimula o desenvolvimento de adaptações contra a perda de água
ainda no ambiente de laboratório, resultando na produção de plantas com melhor
controle da transpiração (Santamaria et al. 2000). Usando essa estratégia
Trevisan e Mendes (2005) obtiveram um aumento na alongação de brotos de
maracujá. Outros trabalhos demonstraram efeitos positivos das trocas gasosas
sobre a propagação in vitro de mamão (Lai et al. 1998), eucalipto (Zobayed et al.
2000a), batata doce (Zobayed et al. 2000b), batata (Zobayed et al. 2001) e maçã
(De Klerk 2002). Mills e Tal (2004), avaliando a tolerância à salinidade em tomate,
demonstraram que plantas crescendo sob condições in vitro em frascos
ventilados apresentaram comportamento semelhante ao das plantas cultivadas
em ambiente externo.
O meio de cultura utilizado para a micropropagação costuma conter
açúcar em quantidade suficiente para possibilitar o crescimento heterotrófico dos
brotos. Além disso, o típico ambiente de cultivo in vitro é caracterizado por
apresentar um grande acúmulo de substâncias, decorrente da ocorrência
reduzida de trocas gasosas entre o recipiente de cultivo e o meio externo, de
forma que existe uma grande diferença entre estes ambientes (Kozai 1991). A
aproximação entre as características de cultura in vitro e as características
ambientais têm demonstrado melhorar o desenvolvimento das plantas. Kozai et
al. (1991) destacam a possibilidade de estimular a fotoautotrofia in vitro, reduzindo
a quantidade de carboidrato fornecido e aumentando a intensidade luminosa do
83
ambiente de cultivo. Alguns sistemas de micropropagação fotoautotróficos que
envolvem a utilização de meios sem açúcar, ventilação forçada e exposição a
altas intensidades luminosas têm mostrado resultados positivos, proporcionando
um melhor desempenho das mudas no que tange ao crescimento, à qualidade e à
sobrevivência (Zobayed et al. 2000a; Xiao e Kozai 2004).
O presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da forma de
fechamento dos tubos e de diferentes concentrações de sacarose sobre a
aclimatização de plantas da espécie O. mucugense propagadas in vitro.
84
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram inicialmente conduzidos em laboratório sob
condição de crescimento de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 16h e densidade de fluxo de
fótons fotossínteticamente ativos de 40 µmol.m-2.s-1 e posteriormente transferidos
para viveiro com 70% de luminosidade, obtida mediante o uso de tela sombrite de
30%.
Multiplicação in vitro
A multiplicação in vitro do material foi realizada em meio MS (Murashige e
Skoog 1962) com metade da concentração salina (MS/2), suplementado com
sacarose (30g.L-1), BAP (2,2 µM), ANA (0,65 µM) e gelificado com ágar (7g.L-1). O
pH foi ajustado para 5,8 antes da autoclavagem. A esterilização foi realizada em
autoclave sob temperatura de 120ºC por 15 minutos. Como explantes foram
utilizados segmentos de caule de Orthophytum mucugense procedentes de
plantas germinadas in vitro com seis meses de idade. Cada explante foi inoculado
em um tubo de ensaio (25x200mm) com 15 ml de meio de cultura (capítulo 3).
Enraizamento
Os brotos produzidos in vitro com parte aérea medindo entre 1 e 2cm de
comprimento foram transferidos para meio de cultura MS/2, suplementado com
diferentes concentrações de sacarose (0, 15 ou 30g.L-1) e carvão ativado (1,0 g.L-
1) e gelificado com agar (7g.L-1). O pH foi ajustado para 5,8 antes da
autoclavagem (120ºC por 15 minutos). Foi utilizada uma brotação para cada tubo
de ensaio (25x200mm) com 15 ml de meio de cultura. Os tubos foram fechados
com película de polivinilcloreto (PVC) e mantidos em sala de crescimento durante
30 dias.
Pré-aclimatização
A pré-aclimatização foi realizada na sala de crescimento, consistindo na
substituição da película de PVC por um tampão de algodão (autoclavado à 120ºC
por 15 minutos) ou por uma nova película de PVC. Para cada uma das
concentrações de sacarose utilizadas, 50% dos tubos foram novamente vedados
85
com PVC e os outros 50% com algodão. Os tubos foram mantidos em sala de
crescimento por 30 dias.
Para a determinação da água perdida por evaporação foram realizadas
análises nas plantas após a pré-aclimatização. As plantas retiradas dos tubos de
ensaio foram pesadas no momento da retirada e após 30 e 60 minutos de
exposição às condições ambientais. Foi calculado o percentual de redução de
peso relacionando o peso obtido após 30 e 60 minutos com o peso inicial de cada
indivíduo por metodologia baseada em Mills e Tal (2004).
Aclimatização
A aclimatização foi realizada em viveiro com 70% de luminosidade. As
plantas foram transferidas para substrato composto de vermiculita + terra (1:1) e
cobertas com garrafas “PET” (2L) as quais foram destampadas após 30 dias e
retiradas, após 40 dias (Figura 4.1).
A porcentagem de sobrevivência foi determinada pela contagem do
número de plantas vivas em relação ao total de plantas submetidas à
aclimatização. Essa avaliação foi realizada 100 dias após a transferência para o
viveiro.
Figura 4.1 – Aclimatização de Orthophytum mucugense. A) Plantas cobertas com
garrafas “PET” tampadas - 15 dias após transferência para viveiro; B) Plantas
cobertas com garrafas “PET” sem tampas - 30 dias após transferência para
viveiro.
A B
86
Análise histológica
Amostras de tecido foliar foram coletadas no dia da transferência das
plantas para o viveiro (1o dia) e 40 dias depois, quando as garrafas “PET” foram
removidas (40o dia). Em cada folha foram tomadas as medidas da espessura da
parede celular lignificada das células da epiderme adaxial e abaxial. As medidas
foram tomadas da célula da epiderme localizada imediatamente acima (adaxial)
ou imediatamente abaixo (abaxial) da nervura central da folha, bem como das
quatro células mais próximas à célula central, duas à direita e duas à esquerda.
As amostras foram retiradas da porção mediana, entre o bordo e a região
central do limbo da primeira folha jovem recém-expandida do ápice da planta. O
material fixado em álcool 70% foi seccionado transversalmente com auxílio de
lâmina de barbear. Os cortes foram clarificados com hipoclorito de sódio a 20%,
lavados em água destilada, corados com Azul de Astra 1% - Safranina 1%, 9:1
(Bukatsch 1972 modificado por Kraus e Arduin 1997) e montados em glicerina
50%. As imagens foram capturadas e avaliadas com o auxílio do software Axion
Vision (v 3.0, Zeiss). A presença de lignina foi confirmada com floroglucina
clorídrica (Jensen 1962).
Delineamento e análise estatística
O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado em
arranjo fatorial 3x2 (sacarose x selamento) com cinco repetições. Nos
experimentos in vitro cada repetição foi formada por cinco tubos. Para avaliar a
sobrevivência, cada repetição agrupou 10 plantas enquanto nos estudos
histológicos, cada repetição consiste nas medidas de espessura da parede celular
de cinco células de cada folha.
Todos os experimentos descritos foram repetidos pelo menos duas vezes.
Os resultados avaliados representam a média dos dois experimentos e foram
submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey
através do uso do software SISVAR (v 4.3, UFLA).
87
88
RESULTADOS
A interação “tipo de selamento x concentração de sacarose” influenciou
significativamente a redução de peso fresco das plantas após 30 minutos de
exposição às condições ambientais. A maior redução ocorreu na concentração de
15g.L-1 de sacarose com tubos vedados com PVC (14,7%), contrastando com a
menor redução de peso fresco observada para as plantas que cresceram em
tubos vedados com algodão (7,1 a 8,0%). A redução de peso obtida quando os
tubos foram fechados com PVC não diferiu significativamente em meio sem
sacarose (11,5%) ou com 30g.L-1 de sacarose (12,9%), sendo que estes dois
tratamentos demonstraram menor redução de peso do que o tratamento com 15
g.L-1 de sacarose (14,7%), em tubos também vedados com PVC, após 30 minutos
de exposição ao ambiente. Para tubos fechados com algodão, não foram
observadas diferenças significativas em relação à concentração de sacarose,
sendo que os três tratamentos demonstraram uma redução de peso (7,6%)
bastante inferior aos tratamentos que utilizaram o PVC para vedar os tubos
(13,0%), após 30 minutos de exposição ao ambiente. A redução de peso fresco
em todos os tratamentos foi maior nos primeiros 30 minutos de exposição às
condições ambientais (Tabela 4.1).
Tabela 4.1 – Valores médios para redução de peso fr esco (%) após 30 minutos, entre 30 e 60 minutos, e redução total 60 minutos depois da ex posição às condições ambientais, em função do tipo de selamento e da concentração de sa carose utilizada.
Até 30 minutosZ entre 30 e 60 minZ TotalZ Concentração de Sacarose (g.L-1)
PVC algodão PVC algodão PVC algodão
0 11,5 bW AV 7,7 a B 7,4 a A 2,9 b B 18,9 b A 10,7 a B
15 14,7 a A 7,1 a B 7,8 a A 4,1 a B 22,5 a A 11,2 a B
30 12,9 b A 8,0 a B 6,3 b A 3,0 b B 19,1 b A 11,0 a B
média 13,0 A 7,6 B 7,2 A 3,4 B 20,2 A 10,9 B
Z – Médias originais. A estatística foi realizada em médias transformadas em arco seno. W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada variável, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
89
Entre 30 e 60 minutos de exposição às condições ambientais foi
observada em média uma redução de mais 7,2% em relação ao peso inicial para
as plantas provenientes de tubos vedados com PVC enquanto que para a
vedação com algodão essa redução foi de apenas 3,4% em relação ao peso
inicial. A redução total de peso fresco após 60 minutos de exposição ao ambiente
demonstra que as plantas provenientes de tubos vedados com algodão (10,9%)
tiveram uma redução de peso fresco aproximadamente 50% menor que as
plantas oriundas dos tubos fechados com PVC (20,2%) (Tabela 4.1).
A combinação de concentração de sacarose e tipo de selamento produziu
efeitos positivos na redução de peso por transpiração. Tubos tampados com
algodão em qualquer uma das concentrações de sacarose utilizadas mostram
uma redução de peso significativamente inferior que as plantas procedentes de
tubos fechados com PVC em todos os momentos de avaliação. A redução de
peso observada entre 30 e 60 minutos para plantas provenientes de tubos
selados com algodão demonstrou ser maior na concentração intermediária de
sacarose (15g.L-1). Já os tratamentos vedados com PVC apresentaram maior
redução de peso fresco tanto após 30 minutos como na avaliação total quando
utilizada a concentração de 15 g.L-1 de sacarose. Ainda considerando os tubos
fechados com PVC, entre 30 e 60 minutos as concentrações de 0 e 15 g.L-1 de
sacarose promoveram a maior redução de peso fresco (Tabela 4.1).
As análises histológicas realizadas em folhas coletadas no 40o dia após a
transferência das plantas para o ambiente mostraram que a interação “tipo de
selamento x concentração de sacarose” foi significativa no que se refere a
espessura da parede lignificada das células da epiderme adaxial e abaxial. As
maiores espessuras foram observadas para as células da epiderme adaxial
(9,95µm) e abaxial (8,53µm) de folhas procedentes de tubos vedados com
algodão. Nestas situações, a concentração de sacarose não influenciou de forma
significativa na espessura da parede celular. As folhas de plantas procedentes de
tubos tampados com PVC apresentaram a parede lignificada de células da
epiderme adaxial e abaxial menos espessas (7,39 e 6,81µm respectivamente) que
as procedentes de tubos fechados com algodão. As células da epiderme adaxial e
abaxial apresentaram tendência semelhante, sendo observado um aumento na
espessura da parede celular nas concentrações de 15 (8,82 e 8,27µm) e 30g.L-1
90
(8,82 e 7,10µm) de sacarose, quando comparados com o tratamento sem
sacarose (4,54 e 5,07µm) (Tabela 4.2 e Figura 4.2).
Tabela 4.2 – Valores médios para espessura da pared e lignificada ( µµµµm) de células da epiderme adaxial e abaxial de folhas de Orthophytum mucugense no dia da remoção do laboratório (1 o dia) e no 40 o dia após a transferência para o ambiente em função do tipo de selamento e da concentração de sacarose utilizada.
1o dia 40o dia Concentração de Sacarose (g.L-1)
Algodão PVC Algodão PVC
Adaxial
0 0,00 cW AV 0,00 A 9,68 a A 4,54 b B
15 1,04 b A 0,00 B 9,76 a A 8,82 a A
30 4,22 a A 0,00 B 10,41 a A 8,82 a B
Média 1,75 A 0,00 B 9,95 A 7,39 B
Abaxial
0 0,00 c A 0,00 A 8,01 a A 5,07 b B
15 2,35 b A 0,00 B 8,06 a A 8,27 a A
30 5,79 a A 0,00 B 9,51 a A 7,10 a B
Média 2,71 A 0,00 B 8,53 A 6,81 B
W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada dia, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
Já as análises realizadas em folhas coletadas no dia da transferência das
plantas para o ambiente (1o dia) mostraram que as células da epiderme foliar
adaxial e abaxial de plantas crescidas em tubos vedados com PVC não
apresentaram parede celular lignificada em nenhuma das concentrações de
sacarose avaliadas. Foi observada uma correlação positiva entre a concentração
de sacarose e a espessura da parede celular lignificada em plantas procedentes
de tubos fechados com algodão: na ausência de sacarose não foi observado o
espessamento da parede celular, no tratamento com 15g.L-1 de sacarose foi
observado um pequeno espessamento da parede de células da epiderme adaxial
e abaxial (1,04 e 2,35µm) e na concentração mais alta de sacarose (30g.L-1)
foram encontradas as paredes celulares mais espessas (4,22 e 5,78µm) para
folhas formadas ainda no ambiente de laboratório (Tabela 4.2 e Figura 4.2).
91
92
A avaliação da sobrevivência das plantas aclimatizadas, após 100 dias de
transferência para o viveiro mostrou que houve interação significativa entre
selamento e sacarose (Tabela 4.3). Plantas provenientes de tubos fechados com
algodão apresentaram percentual de sobrevivência maior (95%) do que as
provenientes de tubos vedados com PVC (80%). Relacionando a sobrevivência
com a concentração de sacarose utilizada ainda na fase in vitro, os resultados
mostram que a presença de sacarose favorece a sobrevivência quando as plantas
são provenientes de tubos selados com PVC. Já as plantas procedentes de tubos
fechados com algodão não apresentaram diferenças significativas na
sobrevivência quando comparadas quanto à concentração de sacarose (Tabela
4.3).
Tabela 4.3 – Valores médios para sobrevivência de Orthophytum mucugense 100 dias após a transferência para o viveiro, em função do tipo d e selamento e da concentração de sacarose utilizada no experimento in vitro.
% sobrevivênciaZ Concentração de Sacarose (g.L-1)
PVC algodão
0 54 bW BV 92 a A
15 92 a A 96 a A
30 94 a A 100 a A
média 80 B 95 A
Z – Médias originais. A estatística foi realizada em médias transformadas em arco seno. W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada dia, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
93
DISCUSSÃO
A vedação do recipiente de cultura com tampas ou filmes plásticos pode
dificultar a troca gasosa entre a cultura e o ambiente, promovendo um acúmulo de
gases liberados pelo tecido vegetal em crescimento, entre eles, etileno e vapor de
água. A retenção de vapor de água promove a formação de uma microatmosfera
com alta umidade relativa, que pode interferir no desenvolvimento do vegetal de
forma a dificultar o processo de aclimatização. O fechamento dos frascos de
cultura com tampas permeáveis possibilita as trocas gasosas, proporcionando a
redução da umidade relativa das culturas (Seelye et al. 2003). A redução da
umidade antecedendo a transferência das plantas para o ambiente externo tem
favorecido a aclimatização e aumentado a sobrevivência de mudas produzidas
através de micropropagação (De Klerk 2002; Xiao e Kozai 2004; Zobayed et
al.2000a).
A transferência da condição in vitro para o ambiente externo é uma etapa
crítica podendo ser um fator limitante para a micropropagação, pois acarreta uma
grande mudança no ambiente de desenvolvimento do vegetal. No laboratório, a
planta cresce sob baixa luminosidade e alta umidade relativa, condições que
resultam num fluxo transpiratório bastante reduzido. Por outro lado, o ambiente
externo apresenta características climáticas que promovem o aumento da
transpiração, sendo importante à atuação de estruturas vegetais, que ajudem a
reduzir a susceptibilidade ao estresse hídrico. Entre estas adaptações podem ser
citadas o espessamento da cutícula ou da parede de células da epiderme e a
presença de estômatos plenamente funcionais. Culturas mantidas em frascos
com trocas gasosas reduzidas com freqüência não apresentam tais adaptações
plenamente desenvolvidas, já que a alta umidade observada in vitro reduz a sua
importância para a sobrevivência e o desenvolvimento do vegetal no laboratório
(Grattapaglia e Machado 1998; Seelye et al. 2003).
Neste trabalho foi observada uma vantagem do selamento com algodão
em relação ao fechamento com PVC, que dificulta as trocas gasosas entre a
cultura e o ambiente. Estes resultados demonstram que a ocorrência de trocas
gasosas entre o microambiente in vitro e o ambiente externo, favoreceu o
desenvolvimento de adaptações contra a perda de água por evaporação e
94
transpiração e conseqüentemente reduziu o deficit hídrico durante a fase de
aclimatização.
Foi observado o aumento da sobrevivência e a atuação de estômatos em
mudas de macieira submetidas a um decréscimo da umidade relativa pela
abertura das tampas 4 a 5 dias antes da transferência (Brainerd e Fuchigami
1981). Já Wardle et al. (1983), ao reduzirem a umidade relativa do frasco de
cultura, conseguiram estimular a produção de cera, promover o desenvolvimento
da cutícula foliar e reduzir a perda de água durante a transferência de plantas
para o ambiente externo.
A presença de espessamento das paredes das células epidérmicas é uma
característica marcante de vários membros da família Bromeliaceae (Tomlinson
1969; Sajo et al. 1998). Esse espessamento parece estar relacionado com a
redução da evaporação de água dos tecidos, evitando o estresse hídrico e
assegurando a sobrevivência das espécies em condições extremas (Tomlinson
1969; Esaú 1977).
Gilly et al. (1997) avaliaram a formação da cutícula em folhas de hera
produzidas in vitro e ex vitro. Os autores observaram que nas condições de
cultura, com a umidade relativa acima de 95%, as folhas não apresentavam as
deposições de cera que formam a cutícula, enquanto as folhas formadas no
ambiente externo apresentaram o desenvolvimento normal desta estrutura. Neste
mesmo sentido, Zaid e Hughes (1995) mostraram que folhas de palmeiras não
aclimatizadas contém apenas 15% dos depósitos de cera encontrados nas
plantas desenvolvidas em viveiros. No entanto, durante o processo de
aclimatização, ocorre um aumento na biossíntese da cutícula e, ao fim deste
período as folhas estarão adaptadas às novas condições de crescimento (Gilly et
al. 1997).
O estudo histológico de plantas micropropagadas de abacaxi mostrou que
as folhas originadas in vitro não apresentavam espessamento da parede de
células da epiderme, mas decorridos seis meses da aclimatização, as novas
folhas mostravam intenso espessamento destas paredes (Barboza et al. 2006).
Withner et al. (1974) correlacionaram o espessamento da parede de células
epidérmicas de orquídeas com o nível de exposição ao sol, sendo esta
característica típica de folhas expostas a sol intenso.
95
No presente trabalho a avaliação da espessura da parede lignificada de
células da epiderme foliar mostrou que no momento de transferência das mudas
para o viveiro, as plantas procedentes de tubos vedados com PVC não
apresentaram presença de lignina nem espessamento nas paredes das células da
epiderme foliar abaxial ou adaxial em nenhuma das concentrações de sacarose.
Como a parede espessa e lignificada está associada com a proteção contra perda
de água por evaporação (Tomlinson 1969), é natural que tenha sido observada
uma grande redução de peso fresco em decorrência da elevada evaporação
presente nestas plantas. As folhas provenientes de plantas desenvolvidas em
tubos fechados com algodão, apesar de não desenvolverem paredes espessas na
ausência de sacarose, apresentaram paredes lignificadas em desenvolvimento,
nas concentrações de 1,5 e 3% de sacarose, onde um maior espessamento foi
observado com o aumento da concentração de sacarose.
Estes resultados sugerem que o espessamento da parede de células
epidérmicas não está diretamente relacionado com a exposição solar intensa
como sugerido por Withner et al. (1974) mas sim, com a redução da umidade do
ambiente. Como a umidade pode ser influenciada pela exposição ao sol, algumas
correlações indiretas acabam por ser erroneamente atribuídas à irradiação solar.
Quando comparadas com mudas procedentes de culturas vedadas com
PVC, as plantas oriundas de tubos tampados com algodão apresentaram uma
menor perda de água, demonstrando possuir um maior controle da evaporação.
Ocorre que as plantas cultivadas na ausência de sacarose, apesar de não
apresentarem células da epiderme abaxial ou adaxial com paredes espessas e
lignificadas, ainda assim mostraram comportamento semelhante às plantas
procedentes de meio de cultura acrescido de 1,5 ou 3% de sacarose, em relação
à redução de peso fresco. Estes resultados indicam que nesta situação, outros
fatores, como o controle estomático, podem estar associados à redução da perda
de água.
A análise histológica das plantas no 40o dia após a transferência para o
viveiro revelou que existe uma tendência das plantas, submetidas aos diferentes
tratamentos, se igualarem quanto ao espessamento da parede celular lignificada
de células da epiderme, apesar de ainda terem sido observadas diferenças entre
as plantas provenientes de meio com 0 e 3% de sacarose, quando comparadas
em relação ao tipo de fechamento dos tubos.
96
A planta tem um comportamento heterotrófico no laboratório, utilizando a
sacarose presente no meio de cultura como fonte de energia. A transferência para
o ambiente externo requer o desenvolvimento de capacidade autotrófica já que a
sacarose deixará de ser fornecida para o vegetal. É necessária também a
otimização da capacidade de captar nutrientes, já que no substrato utilizado em
viveiro, a dificuldade na absorção de nutrientes poderá ser maior. Além disso,
alguns estudos relatam que o excesso de sacarose no meio de cultura pode
regular negativamente a fotossíntese, isso ocorre por que a maior quantidade de
soluto no meio reduz a disponibilidade de água (Farrar et al. 2000; Guimarães et
al. 1999). O estímulo à autotrofia in vitro, através do decréscimo nas taxas de
açúcar do meio bem como pelo aumento da intensidade luminosa e da
concentração de CO2, pode favorecer o processo de adaptação, pois estará
facilitando a realização da fotossíntese (Grattapaglia e Machado 1988; Kozai et al.
1991). Zobayed et al. (2000b) submeteram brotos de batata doce a condições
fotoautotróficas, conseguindo aumentar a sobrevivência e o crescimento das
mudas além de estimular a formação de estômatos funcionais e o
desenvolvimento de cutícula de cera nas folhas. No entanto, outros estudos
mostraram que maiores concentrações de sacarose desempenharam um efeito
favorável na qualidade das mudas (Gollagunta et al. 2004), apesar de
estimularem a manutenção das plantas em condições heterotróficas.
O tampão de algodão forneceu um sistema permeável às trocas gasosas,
que reduziu a umidade relativa da cultura, favorecendo o desenvolvimento de
adaptações contra a perda de água pelas mudas, além de ter possibilitado a
realização da fotossíntese, estimulando o início do crescimento autotrófico.
Estimava-se que plantas procedentes de cultura em tubos fechados com algodão
e meio sem sacarose seriam mais estimuladas ao crescimento autotrófico tendo
em vista a ausência de sacarose e, conseqüentemente, a necessidade de
produzir açúcar para o seu metabolismo. No entanto, não foi observado o melhor
desempenho por parte destas plantas. Estas observações sugerem que o
comportamento fotoautotrófico não foi induzido com sucesso, possivelmente em
decorrência de uma densidade de fluxo de fótons fotossínteticamente ativos
(40µmol.m-2.s-1) inferior que a necessária para estimular a fotossíntese nesta
espécie. Zobayed et al. (2000a) utilizou 120µmol.m-2.s-1 para eucalipto e Xiao e
97
Kozai (2004) entre 50 e 100µmol.m-2.s-1 para Zantedeschia elliottiana e
Cunninghamia lanceolata. Entretanto, deve-se ressaltar que plantas de O.
mucugense obtiveram vantagens proporcionadas pelas trocas gasosas já que
apresentaram desempenho bastante superior àquelas cultivadas na ausência de
sacarose em frascos nos quais a ventilação não foi possibilitada.
O emprego de estratégias que possibilitem o aumento da umidade
relativa, durante o início do desenvolvimento do vegetal no ambiente externo, é
muito importante para assegurar a sobrevivência das mudas transplantadas. Um
período de transição de 15 a 20 dias no qual a umidade relativa do ar seja
reduzida aos poucos tem sido recomendado por favorecer a sobrevivência e a
adaptação das plantas ao ambiente externo (Grattapaglia e Machado 1988). No
presente estudo, após a transferência das mudas para o viveiro, as plantas
passaram por um período de 30 dias em ambiente de alta umidade relativa,
seguidos de 10 dias de transição para somente depois destes 40 dias estarem
submetidas à umidade relativa do ambiente. O grande período de transição pode
ter favorecido os altos percentuais de sobrevivência observados mesmo para
mudas procedentes de tubos vedados com PVC nos tratamentos com 1,5 e 3%
de sacarose.
O decréscimo da umidade relativa na atmosfera de cultura associado ao
ambiente de alta umidade relativa promovido durante o início do desenvolvimento
das mudas no viveiro contribuiu para o sucesso do processo de aclimatização das
mudas micropropagadas de Orthophytum mucugense, devendo-se destacar a
sobrevivência de todas as mudas procedentes de tubos fechados com algodão e
meio com 3% de sacarose, decorridos 100 dias da transferência. A baixa taxa de
sobrevivência (54%) observada apenas para o tratamento PVC na ausência de
sacarose demonstrou a importância desta fonte de carbono em ambientes onde
as trocas gasosas são restritas.
Este trabalho mostrou que a manipulação do ambiente in vitro possibilita a
formação de plantas mais adaptadas à evaporação, favorecendo o processo de
aclimatização, além de apresentar um método acessível e altamente eficaz, que
garante o sucesso na aclimatização de mudas micropropagadas de Orthophytum
mucugense, uma espécie recém descrita de bromélia, com grande valor
ornamental. Pôde ser observado também que as modificações anatômicas
ocorridas nas folhas de Orthophytum mucugense decorreram de plasticidade
98
fenotípica uma vez que a mudança no ambiente de crescimento promoveu as
alterações no espessamento da parede da epiderme.
99
CONCLUSÕES • O selamento dos recipientes de cultura com algodão na fase de pré-
aclimatização foi eficiente na redução de perda de água na ocasião do
transplante para o viveiro.
• O selamento dos recipientes de cultura com algodão possibilitou o
desenvolvimento da parede celular lignificada de células da epiderme adaxial
e abaxial, favorecendo o processo de aclimatização.
• A presença de sacarose não influenciou a sobrevivência de plantas
procedentes de tubos fechados com algodão.
• A restrição de sacarose no meio de cultura prejudica a sobrevivência de
plantas provenientes de tubos fechados com PVC.
100
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106
CONCLUSÕES GERAIS
1 – A germinação de sementes de Neoregelia mucugensis não diferiu
significativamente entre os três substratos avaliados.
2 – O substrato terra vegetal + vermiculita foi o mais indicado para o
desenvolvimento de Neoregelia mucugensis até o 120o dia após a semeadura.
Posteriormente o substrato composto exclusivamente por terra vegetal
proporcionou o melhor desenvolvimento das plantas.
3 – Os substratos terra vegetal e terra vegetal + vermiculita tiveram melhor
desempenho na germinação e no desenvolvimento de Orthophytum mucugense
até o 120o dia após a semeadura. Posteriormente o substrato composto
exclusivamente por terra vegetal proporcionou o melhor desenvolvimento das
plantas.
4 – A grande quantidade de água retida pela vermiculita pode estar relacionada
com a redução da capacidade germinativa de sementes de O. mucugense.
5 – O sistema radicular de O. mucugense e N. mucugensis teve baixa
representatividade na matéria seca total.
6 - N. mucugensis apresentou maiores taxas de germinação, maior velocidade e
menor tempo médio para a germinação que sementes de O. mucugense.
7 – A germinação in vitro de O. mucugense deve ser realizada em ágar.
8 – A semeadura in vitro de N. mucugensis pode ser realizada em ágar ou MS/2.
9 – Sugere-se a utilização de MS/2 para o crescimento in vitro de O. mucugense e
N. mucugensis.
10 – O carvão ativado favoreceu o crescimento da parte aérea de O. mucugense
e do sistema radicular de ambas espécies, sendo indicada a sua utilização
durante a pré-aclimatização.
11 – Para induzir a formação de brotos in vitro recomenda-se a utilização de MS/2
associado a 2,22 ou 4,44µM BAP + 1,3µM de ANA para N. mucugensis, 2,22µM
107
de BAP + 0,65µM ANA para O. mucugense e 1,11µM de BAP + 0,65µM ANA para
O. albopictum.
12 – A transferência dos brotos produzidos por micropropagação para meio sem
reguladores de crescimento deve ser realizada até o 4o mês de cultura.
13 - O selamento dos recipientes de cultura com algodão na fase de pré-
aclimatização reduziu a perda de água em 50% por ocasião do transplante para o
viveiro.
14 - O selamento dos recipientes de cultura com algodão possibilitou o
desenvolvimento da parede celular lignificada de células da epiderme adaxial e
abaxial.
15 - A concentração de sacarose não influenciou a sobrevivência de plantas
procedentes de tubos fechados com algodão.
16 - A restrição de sacarose no meio de cultura prejudicou a sobrevivência de
plantas provenientes de tubos fechados com PVC.
108
APÊNDICES
Quadros de análise de variância
109
QUADROS DE ANÁLISE DE VARIÂNCIA REFERENTES AO CAPÍTULO 1
Quadro 1.1 - Resumo das análises de variância para porcentagem de emergência (%E), tempo médio de emergência (TmE) e índice de velocid ade de emergência (IVE) de sementes de Orthophytum mucugense e Neoregelia mucugensis em função do tipo de substrato utilizado.
Quadrados médios
Causas de variação GL % Ez TmE IVE
Espécie 1 2789,62** 637,86** 9,95**
Substrato 2 151,21* 0,87ns 0,11*
Espécie x Substrato 2 160,5* 0,59ns 0,11*
resíduo 24 38,70 0,87 0,02
CV (%) 9,22 4,44 8,71
** - significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F * - significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ns – não significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F z – dados transformados em arco seno
Quadro 1.2 – Resumo das análises de variância para matéria seca da parte aérea e matéria seca das raízes de plantas de Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense aos 120 dias de idade, em função do tipo de substrato utili zado.
Quadrados médios
Causa de variação GL Parte aérea Raízes
Espécie 1 4556,78** 369,74**
Substrato 2 127,43** 108,10**
Espécie x Substrato 2 1076,26** 49,60**
Resíduo 18 28,37 1,47
CV 27,04 20,73
** - significativo ao nível de 1% de probabilidade, pelo teste F
110
Quadro 1.3 – Resumo das análises de variância para matéria seca da parte aérea e matéria secao das raízes de plantas de Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense aos 300 dias de idade, em função do tipo de substrato utili zado.
Quadrados médios
Causa de variação GL Parte aérea Raízes
Espécie 1 2,16** 1,47**
Substrato 1 8,87** 0,23**
Espécie x Substrato 1 0,78** 0,02ns
Resíduo 16 0,02 0,02
CV 3,63 14,35
** - significativo ao nível de 1% de probabilidade, pelo teste F ns – não significativo ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste F
111
QUADROS DE ANÁLISE DE VARIÂNCIA REFERENTES AO CAPÍTULO 2
Quadro 2.1 - Resumo das análises de variância para porcentagem de germinação (%G), tempo médio de germinação (TmG) e índice de velocid ade de germinação (IVG) de sementes de Orthophytum mucugense e Neoregelia mucugensis em função do meio de cultura.
Quadrados médios
Causas de variação GL % Gz TmG IVG
Espécie 1 8140,17** 264,90** 58,14**
Meio 1 1155,61** 16,67* 1,32**
Espécie x Meio 1 811,60** 3,13ns 0,01ns
resíduo 16 8,39 3,44 0,03
CV (%) 5,16 13,24 8,74
** - significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F * - significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ns – não significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F z – dados transformados em arco seno
Quadro 2.2 – Resumo das análises de variância para matéria seca da parte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e compr imento das raízes de plantas de Neoregelia mucugensis em função do meio de cultura e do carvão ativado.
Quadrados médios
Causa de variação GL Matéria seca da parte aérea
Matéria seca da raiz
Comprimento parte aérea
Comprimento raiz
Meio de cultura (M) 1 46,87* 5,84ns 199,51** 97,26ns
Carvão ativado (C) 1 335,89** 325,40** 9738,97** 2660,64**
M x C 1 33,93ns 65,38** 289,38** 1635,12**
Resíduo 52 9,84 3,46 25,75 34,92
CV 30,16 31,13 12,95 23,87
** - significativo ao nível de 1% de probabilidade, pelo teste F * - significativo ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste F ns – não significativo ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste F
112
Quadro 2.3 – Resumo das análises de variância para matéria seca da parte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e compr imento das raízes de plantas de Orthophytum mucugense, em função do meio de cultura.
Quadrados médios
Causa de variação
GL Matéria seca da parte aérea
Matéria seca da raiz Comprimento parte aérea
Comprimento raiz
Meio de cultura 1 10,25ns 0,88ns 24,50ns 56,18ns
Resíduo 30 4,18 0,27 10,38 29,93
CV 34,05 44,52 19,42 24,33
ns – não significativo ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey
Quadro 2.4 – Resumo das análises de variância para matéria seca da parte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e compr imento das raízes de plantas de Orthophytum mucugense, em de diferentes níveis de carvão ativado no meio de cultura.
Quadrados médios
Causa de variação
GL Matéria seca da parte aérea
Matéria seca da raiz Comprimento parte aérea
Comprimento raiz
Carvão ativado 1 2452,28** 300,33** 3894,03** 2439,51**
Resíduo 30 117,73 23,03 34,67 147,94
CV 37,84 71,14 14,84 31,03
** - significativo ao nível de 1% de probabilidade, pelo teste F
113
QUADROS DE ANÁLISE DE VARIÂNCIA REFERENTES AO CAPÍTULO 3
Quadro 3.1 – Resumo das análises de variância para número de brotos, % de explantes com brotos, % de explantes com calos e matéria seca dos brotos (média por explante em mg) em função das espécies e das concentrações de ANA e BA P.
Quadrados médios
Causas de variação GL N de brotos % exp brotosz % exp calosz Mat. seca brotos
Espécie 2 16,98** 5274,50** 3534,05** 65,20**
ANA 3 12,88** 3588,15** 3404,75** 48,69**
BAP 3 11,49** 4145,23** 5641,75** 22,89**
Espécie x ANA 6 3,09** 2558,15** 979,76** 32,94**
Espécie x BAP 6 3,79** 302,55ns 663,49** 16,93**
ANA x BAP 9 1,49** 407,95ns 907,98** 4,94*
Espécie x ANA x BAP 18 2,12** 781,55** 588,35** 5,31**
Resíduo 192 0,34 305,10 125,71 2,36
CV (%) 38,55 36,31 85,51 77,25
ns -Não-Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F. ** - Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F. z - Dados em % foram transformados em arco seno.
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QUADROS DE ANÁLISE DE VARIÂNCIA REFERENTES AO CAPÍTULO 4
Quadro 4.1 – Resumo das análises de variância para espessura da parede lignificada de células da epiderme adaxial e abaxial de folhas de Orthophytum mucugense no dia da remoção do laboratório (1 o dia) e no 40 o dia após a transferência para o ambiente, em funçã o do tipo de selamento e da concentração de sacarose utilizada.
Quadrados médios
Causas de variação GL Adaxial 1o dia Abaxial 1o dia Adaxial 40o dia Abaxial 40o dia
Sacarose 2 12,083** 21,157** 18,486** 9,666**
Selamento 1 23,046** 55,173** 48,901** 22,047**
Sacarose X selamento 2 12,083** 21,157** 12,773** 7,107**
Resíduo 24 0,051 0,052 1,119 1,08
CV (%) 25,68 16,88 12,2 13,55
** - Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F.
Quadro 4.2 – Resumo da análise de variância para re dução de peso fresco (%) após 30 minutos, entre 30 e 60 minutos, e redução total apó s 60 minutos 60 minutos depois da exposição às condições ambientais, em função do tip o de selamento e da concentração de sacarose utilizada.
Quadrados médios Z
Causas de variação GL Até 30 minutos entre 30 e 60 min total
Sacarose 2 4,149ns 4,789** 13,107*
Selamento 1 220,773** 108,825** 639,612**
Sacarose X selamento 2 9,967** 0,995ns 8,376ns
Resíduo 24 1,310 0,410 2,675
CV (%) 11,110 13,450 10,520
ns -Não-Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F. * - Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F. ** - Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F. z - Dados originais transformados em arco seno.
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Quadro 4.3 – Resumo da análise de variância para so brevivência (%) de Orthophytum mucugense 100 dias após a transferência para o viveiro, em f unção do tipo de selamento e da concentração de sacarose utilizada.
Quadrado médio
Causas de variação GL % sobrevivênciaZ
Sacarose 2 1566,96**
Selamento 1 1648,35**
Sacarose X selamento 2 1034,57**
Resíduo 22 60,00
CV (%) 8,89
** - Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F. Z – Médias originais transformadas em arco seno