ESTUDO DA PROPAGAÇÃO IN VITRO E EX VITRO DE LEME ... · Resposta regenerativa in vitro de...

MOEMA CORTIZO BELLINTANI

ESTUDO DA PROPAGAÇÃO IN VITRO E EX VITRO DE

Neoregelia mucugensis LEME, Orthophytum mucugense

WAND. e CONCEIÇÃO e O. albopictum PHILCOX.

ESPÉCIES DE BROMELIACEAE ENDÊMICAS DA BAHIA.

FEIRA DE SANTANA – BAHIA

2006

2

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA

ESTUDO DA PROPAGAÇÃO IN VITRO E EX VITRO DE

Neoregelia mucugensis LEME, Orthophytum mucugense

WAND. e CONCEIÇÃO e O. albopictum PHILCOX

ESPÉCIES DE BROMELIACEAE ENDÊMICAS DA BAHIA.

MOEMA CORTIZO BELLINTANI

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Botânica da Universidade

Estadual de Feira de Santana como parte

dos requisitos para a obtenção do título de

Doutor em Botânica.

ORIENTADOR: PROFA. DRA. ANA LÚCIA CUNHA DORNELLES

CO-ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ RANIERE FERREIRA DE SANTANA

FEIRA DE SANTANA – BA

2006

3

Ficha Catalográfica

Bellintani, Moema Cortizo. Estudo da propagação in vitro e ex vitro de Neoregelia mucugensis Leme, Orthophytum mucugense Wand. e Conceição e Orthophytum albopictum Philcox, espécies de Bromeliaceae endêmicas da Bahia / Moema Cortizo Bellintani. – Feira de Santana: Universidade Estadual de Feira de Santana, 2006. 115p.:il. Tese (Doutorado em Botânica) – Departamento de Ciências Biológicas Universidade estadual de feira de Santana, BA, 2006.

4

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________

Dra. Ana Lúcia Cunha Dornelles (UFRRJ)

_____________________________________________

Dra. Claudinéia Regina Pelacani (UEFS)

_____________________________________________

Dra. Fernanda Vidigal Duarte Souza (EMBRAPA)

_____________________________________________

Dra. Janay Almeida dos Santos-Serejo (EMBRAPA)

_____________________________________________

Dr. Renato Paiva (UFLA)

Feira de Santana – BA

2006

5

A Antonio, meu amor, companheiro para a vida;

Aos meus pais, responsáveis pela fascinação, respeito e admiração que nutro

pela natureza e pela vida acadêmica;

Aos meus irmãos pela cumplicidade, amizade e alegria.

6

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste

trabalho.

A Ana Lúcia Cunha Dornelles, pela orientação, respeito e confiança, mas

principalmente pelo exemplo de vida;

A José Raniere Ferreira de Santana, pelas sugestões, disponibilidade e

orientação que tiveram grande importância para a conclusão deste trabalho;

A José Geraldo de Aquino Assis, Ana Lúcia Pires Cotias de Oliveira, Ervene

Barreto, João Paulo Loyola e demais membros da equipe do Laboratório de

Citogenética Vegetal da UFBA, pelo auxílio e por disponibilizar a estrutura do

laboratório e os equipamentos para a realização das análises histológicas;

A Claudinéia Pelacani, pelas sugestões e disponibilidade, principalmente durante

a primeira etapa deste trabalho;

Ao Projeto Sempre-Viva e à sua equipe, pelo excelente trabalho que vêm

realizando em Mucugê e pela força e incentivo, essenciais para a realização deste

trabalho;

A FAPESB, por ter apoiado o projeto que resultou neste trabalho;

A Maria das Graças Lapa Wanderley, pela identificação taxonômica das espécies

aqui estudadas;

A equipe de professores, funcionários e estudantes do Laboratório de Cultura de

Tecidos Vegetais e demais laboratórios do Horto Florestal, pela convivência e

colaboração ao longo dos últimos quatro anos. Ana Paula Sampaio, Ana Paula

7

Rios, Ana Carolina, Cristina, Janilza, José Roberto, Magnólia, Noeli, Sandra,

Solange, Vânia e Dona Zezé, muito obrigada;

A Alone Brito, pela força, pelas indispensáveis contribuições e principalmente pela

serenidade, convívio e amizade;

A Carolina Cerqueira, pela alegria e pela participação na montagem,

acompanhamento e avaliação de muitos experimentos deste trabalho;

A Sheila Resende, pela amizade e zelo, e também pelas discussões e pela

assistência, essenciais em muitos momentos;

As amigas Lia Miranda e Manuela Rodrigues, pelo companheirismo e carinho;

A Léa Lopes, pelo grande apoio e aprendizado, mas principalmente pela amizade;

A Lázaro Benedito da Silva, pelas boas e acolhedoras conversas;

A Andréa Karla, pela disponibilidade e ajuda com as exsicatas;

A Adriana Estrela, pela dedicação ao curso de Pós-Graduação;

As queridas amigas Ana Maria Almeida e Roberta Damasceno, pela revisão dos

abstracts;

A Leila Cruz, Leonardo Pacheco, Raymundo Sá Neto, Sílvia Passos e Tiana

Baqueiro, porque, próximos ou distantes, são sempre grandes amigos;

Aos meus alunos, que me possibilitam aprender e crescer a cada dia.

8

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS

RESUMO 1

ABSTRACT 3

INTRODUÇÃO GERAL 5

CAPÍTULO 1 19

Germinação e crescimento inicial de Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum

mucugense Wand. e Conceição. Bromélias endêmicas da Bahia – Brasil.

CAPÍTULO 2 38

Estabelecimento in vitro de Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum mucugense

Wand. e Conceição. Bromélias endêmicas da Chapada Diamantina, Bahia - Brasil.

CAPÍTULO 3 57

Resposta regenerativa in vitro de explantes caulinares de Neoregelia mucugensis Leme,

Orthophytum mucugense Wand. e Conceição e Orthophytum albopictum Philcox.

Bromélias endêmicas da Chapada Diamantina - Brasil, submetidas a diferentes

concentrações de BAP e ANA.

CAPÍTULO 4 78

Efeito da ventilação in vitro na aclimatização de plantas micropropagadas de

Orthophytum mucugense Wand. e Conceição, uma bromélia endêmica da Bahia - Brasil.

CONCLUSÕES GERAIS 99

APÊNDICES 105

Quadros de análise de variância

1

RESUMO

Orthophytum albopictum, Orthophytum mucugense e Neoregelia mucugensis são

bromélias endêmicas da Chapada Diamantina, com grande potencial ornamental

e relevante importância ecológica. Têm distribuição restrita, sendo importante a

realização de trabalhos de conservação. O cultivo in vitro de bromélias é muito

utilizado para fins comerciais e na preservação de espécies raras ou ameaçadas

de extinção. Os objetivos desse trabalho foram: (1) avaliar a influência do

substrato na germinação e crescimento ex vitro de O. mucugense e N.

mucugensis; (2) avaliar a influência da composição do meio de cultura na

germinação e no crescimento in vitro de O. mucugense e N. mucugensis; (3)

desenvolver um protocolo eficiente de regeneração in vitro para O. albopictum, O.

mucugense e N. mucugensis utilizando explantes caulinares na presença de

benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA) e (4) avaliar a influência

da forma de fechamento dos tubos e de diferentes concentrações de sacarose na

aclimatização de plantas da espécie O. mucugense propagadas in vitro. Os

percentuais de emergência (%E), foram maiores para N. mucugensis (91,2 –

96,5%) do que para O. mucugense. (58 – 77,5%). Em O. mucugense os maiores

valores para %E foram observados nos substratos terra vegetal (T) (77,5%) e

vermiculita + terra (V+T) (76%). O índice de velocidade de emergência e o tempo

médio de emergência para as duas espécies não diferiram significativamente

entre os três substratos. Aos 120 dias, os substratos T e V+T foram mais efetivos

na incorporação de matéria seca que o substrato V para O. mucugense. Enquanto

para N. mucugensis, o substrato V+T proporcionou um ganho quase duas vezes

maior que o substrato T. Aos 300 dias, a incorporação de matéria seca foi maior

no substrato T para as duas espécies. Nos experimentos in vitro, as sementes de

N. mucugensis germinam bem em ágar e em MS/2, já a espécie O. mucugense

teve uma boa germinação apenas no ágar. Os meios de cultura MS e MS/2

podem ser utilizados para o cultivo in vitro de N. mucugensis e O. mucugense. A

presença de carvão ativado favoreceu o crescimento da parte aérea de O.

mucugense e do sistema radicular de ambas espécies, sendo aconselhável a sua

utilização na fase de pré-aclimatização. Em geral O. albopictum e N. mucugensis

têm maior capacidade para regenerar brotos que O. mucugense. Os brotos de O.

albopictum apresentaram maior ganho de massa que as demais espécies. Quanto

2

à capacidade dos explantes em regenerar brotos, N. mucugensis e O. albopictum

apresentaram percentuais significativamente mais altos que O. mucugense. O

percentual de explantes formando calos foi maior para O. albopictum que para as

outras duas espécies. Para induzir a formação de brotos in vitro recomenda-se a

utilização das combinações de 2,22 ou 4,44µM BAP + 1,3µM de ANA para N.

mucugensis, 2,22µM de BAP + 0,65µM ANA para O. mucugense e 1,11µM de

BAP + 0,65µM ANA para O. albopictum. O selamento dos recipientes de cultura

com algodão reduziu a perda de água em 50% e possibilitou o desenvolvimento

da parede celular lignificada de células da epiderme adaxial e abaxial. A

concentração de sacarose não influenciou de forma significativa à sobrevivência

de plantas procedentes de tubos fechados com algodão. A restrição de sacarose

no meio de cultura prejudicou a sobrevivência de plantas provenientes de tubos

fechados com PVC.

3

ABSTRACT

Neoregelia mucugensis, Orthophytum mucugense and Orthophytum albopictum

are endemic bromeliads from Chapada Diamantina, Bahia, Brazil, and they have

great ornamental potential and ecological relevance. They have restricted

occurrence in Mucugê, Bahia – Brazil, vindicating conservation studies about

them. In vitro culture of bromeliads is widely used for commercial purposes and for

preservation of rare or endangered species. The purposes of the present study

were to: (1) to evaluate the effects of substrates at the ex vitro germination and

initial development of N. mucugensis and O. mucugense; (2) to evaluate the

effects of culture medium composition in the germination and growth of N.

mucugensis and O. mucugense; (3) develop an efficient protocol for in vitro

regeneration from stem explants of Orthophytum albopictum, Orthophytum

mucugense and Neoregelia mucugensis in the presence of benzylaminopurine

(BAP) e naphthaleneacetic acid (NAA) and (4) to evaluate the influence of different

tubes closing forms and the effect of sucrose in the acclimatization of

micropropagated O. mucugense shoots. The emergence percentage (%E) were

higher for N. mucugensis (91.2 – 96.5%) than for O. mucugense. (58 – 77.5%).

For O. mucugense the highest values of %E were observed in the substrates T

(77.5%) and V+T (76%). The emergence velocity index and the average period of

emergence, for both species, did not show significant differences between the

three substrates. At day 120, the substrates T and V+T were more efective

concerning dry weight incorporation than the substrate V for the O. mucugense.

The substrate V+T promoted a gain almost twice times greater than the substrate

T for N. mucugensis. After 300 days, the dry weight incoporation was greater in

the substrate T for both. In the in vitro experiments, seeds of N. mucugensis had a

good germination ratio in agar and in MS/2, but O. mucugense seeds had a better

germination ratio in agar. MS or MS/2 culture media can be used for the N.

mucugensis and O. mucugense in vitro culture. As the presence of activated

charcoal favoured leaf growth of O. mucugense and the root system growth of

both species, thus its use is recommended in the pre-acclimatization phase. In

general, O. albopictum e N. mucugensis had better capacity to regenerate shoots

and more responsive explants than O. mucugense. O. albopictum shoots showed

higher dry weights than other species. N. mucugensis explants were more

4

responsives in the presence of BAP (1.11 e 2.22µM) and in the absence of NAA.

O. albopictum showed the biggest callus formation. We recommend the use of

1.3µM NAA + 2.22 or 4.44µM BAP for N. mucugensis, 2.22µM BA + 0.65µM NAA

for O. mucugense and 1.11µM of BAP + 0.65µM NAA for O. albopictum. The use

of cotton for sealing culture containers reduced the loss of water in 50% and it

made possible the development of the lignified cellular wall of adaxial and abaxial

epidermis. The concentration of sucrose did not show significant influence on the

survival of cotton sealed tube plants. The restriction of sucrose in the culture

medium decreased the PVC sealed tubes plant’s survival.

5

INTRODUÇÃO GERAL

Bromeliaceae, com cerca de 3.000 espécies, forma a maior família de

plantas essencialmente americana, distribuindo-se do sul dos Estados Unidos até

o Chile. A única exceção é Pitcairnia feliciana (A. Chev.) Harms J. Mildbraed,

encontrada no Golfo da Guiné, África. Dados da biogeografia da família sugerem

que as primeiras espécies devem ter se originado e iniciado a sua diversificação

numa época bastante próxima à separação dos continentes, que originou o

Oceano Atlântico, há cerca de 200 milhões de anos (Leme e Marigo 1993). São

conhecidos três grandes centros de origem e dispersão de espécies: os Andes, o

planalto das Guianas e o leste brasileiro. Os representantes mais primitivos

(Pticairnioideae e gêneros mais primitivos de Tillandsioideae) aparecem na região

andina e nas Guianas. As espécies e táxons considerados mais avançados

(Bromelioideae e táxons mais evoluídos de Pitcairnioideae e Tillandsioideae)

encontram-se amplamente difundidos no leste brasileiro (Smith 1934).

No Brasil, encontram-se quase metade das espécies de bromélias

conhecidas, especialmente na região costeira, na Mata Atlântica e na restinga,

podendo aparecer também na Amazônia, na caatinga, no cerrado e nos campos

de altitude (Leme e Marigo 1993). O longo período de estabilidade geológica

ocorrido na região que envolve o território brasileiro proporcionou a sobrevivência

e desenvolvimento de grupos que hoje ocorrem na forma de vários gêneros

endêmicos tais como Canistrum, Cryptanthus, Encholirium, Nidularium,

Orthophytum, Quesnelia e Wittrockia (Leme e Marigo 1993; Leme 1998).

A família Bromeliaceae está dividida em 3 subfamílias: Pitcairnioideae

Harms, Bromelioideae Reichenbach e Tillandsioideae Harms. O número de

gêneros diverge entre os autores. Smith e Downs (1974) na Flora Neotrópica

apresentam 46 gêneros. Entretanto a descrição de novas espécies e o crescente

estudo da família, tem ampliado este número para 51, 50 e 56 (Brummitt 1992;

Leme e Marigo 1993; Leme 1997) (Tabela 1).

6

Tabela 1 – Subdivisões da família Bromeliaceae (Leme 1997).

FAMÍLIA BROMELIACEAE

SUBFAMÍLIA Pitcairnioideae SUBFAMÍLIA Bromelioideae

TRIBO Pitcairnieae GÊNERO Acanthostachys Aechmea GÊNERO Ayensua Ananas

Connelia Androlepis Cottendorfia Araeococcus Fosterella Billbergia Lindmania Bromelia Navia Canistropsis Pepinia Canistrum Pitcairnia Cryptanthus Steyerbromelia Deinacanthon

Disteganthus TRIBO Brocchinieae Edmundoa

Fascicularia GÊNERO Brocchinia Fernseea

Greigia TRIBO Puyeae Hohenbergia

Hohenbergiopsis GÊNERO Brewcaria Lymania

Deuterocohnia Neoglaziovia Dyckia Neoregelia Encholirium Nidularium Hechtia Ochagavia Puya Orthophytum

Portea SUBFAMÍLIA Tillandsioideae Pseudaechmea

Pseudananas GÊNERO Alcantarea Quesnelia

Catopsis Ronnbergia Glomeropitcairnia Streptocalyx Guzmania Ursulaea Mezobromelia Wittrockia Tillandsia Vriesea Werauhia

7

Schultz (1985) descreve as bromélias como uma grande família de

plantas herbáceas, terrestres ou epifíticas, com caule reduzido e, nas epífitas,

raízes restritas à fixação. As folhas lanceoladas se inserem em espiral no caule

ou formam uma roseta basal capaz de acumular grande quantidade de água. A

epiderme das folhas em várias espécies é revestida de escamas capazes de

absorver água e nutrientes necessários para o desenvolvimento da planta.

O desenvolvimento do epifitismo envolveu o surgimento de escamas cada

vez mais especializadas. Paralelamente à especialização das escamas, ocorre a

redução do sistema radicular. Se a espécie absorve água e nutrientes diretamente

do ar ela apresenta tricomas escamiformes altamente especializados, distribuídas

em grande quantidade pela superfície foliar, e as raízes são reduzidas visto que a

função de absorção radicular é restrita (Smith e Downs 1974).

Evolutivamente o ovário tende a se posicionar de forma cada vez mais

protegida, portanto os indivíduos morfologicamente derivados possuem ovário

ínfero. O fruto se desenvolve no sentido de proporcionar uma dispersão cada vez

mais especializada. Assim, o fruto capsular, composto de muitas sementes

pequenas dotadas de apêndices, assume a forma bacácea, onde as sementes

aparecem em maior tamanho e menor número. A relação tamanho-quantidade

apresentada pelas sementes é uma adaptação ao sucesso reprodutivo para o tipo

de dispersão desenvolvida. A dispersão pelo vento envolve uma redução no

tamanho, que resulta em sementes leves, mas ao mesmo tempo com menos

reservas energéticas (Smith e Downs 1974).

A família Bromeliaceae tem grande importância na manutenção da

biodiversidade animal e vegetal, fornecendo água e alimento além de ser utilizada

como abrigo e local de acasalamento para muitas espécies animais. As bromélias

vêm adquirindo importância econômica crescente devido à utilização no mercado

florístico e ornamental, sendo que a maioria das plantas utilizadas para estes fins

são obtidas de forma extrativista, o que vem acarretando uma perda genética

significativa.

O Estado da Bahia, como o Nordeste de uma forma geral, possui uma

flora bastante rica, com espécies, pertencentes a diversas famílias, com grande

potencial para exploração econômica.

O gênero Neoregelia L.B.Sm. é composto por espécies terrestres, epífitas

ou saxícolas. Apresenta tamanho bastante variado, suas folhas são densamente

8

rosuladas e usualmente espinosa-serreadas. A disposição das folhas origina um

“tanque” característico, no qual a inflorescência está localizada (Smith e Downs

1983; Leme 1998). N. mucugensis Leme é uma planta típica dos campos

rupestres. Apresenta grande plasticidade fenotípica, sendo caracterizada por

variações na coloração, forma e conformação da roseta foliar e na coloração das

flores (Leme 1998) (Figura 1A).

Orthophytum Beer é um gênero exclusivamente brasileiro, composto por

espécies terrestres ou saxícolas. As folhas serreadas são completamente

recobertas por escamas, que refletem parte da luz solar que incide nas plantas.

Pode ser dividido em dois grupos: o primeiro reúne maior número de espécies,

apresenta inflorescência provida de escapo e folhas verdes; as espécies do outro

grupo apresentam inflorescência séssil e, durante a floração, tendem a apresentar

folhas coloridas na parte central da roseta foliar (Smith e Downs 1983; Wanderley

1990). Segundo Wanderley e Conceição (2006) as espécies de Orthophytum com

inflorescência séssil, ocorrentes na Chapada Diamantina têm grande valor

ornamental devido à intensa coloração vermelha que suas brácteas e folhas

atingem na antese. Esta característica torna estas espécies também muito

importantes por atrair beija-flores, desempenhando um importante papel

ecológico.

Orthophytum mucugense Wand. e Conceição é a mais nova espécie de

Orthophytum descrita. Os indivíduos deste táxon crescem formando grandes

populações em paredões rochosos localizados nas margens de rios. Os relatos

acerca da sua distribuição geográfica revelam que a sua ocorrência está restrita

ao município de Mucugê – Chapada Diamantina. Apesar de ser encontrada em

uma Unidade de Conservação Municipal e de formar grandes populações, a

ocorrência restrita a uma única localidade leva O. mucugense a categoria

vulnerável, fato que demonstra a importância da realização de trabalhos de

preservação com esta nova espécie (Wanderley e Conceição 2006) (Figura 1B).

9

A

B

C

Figura 1 – Plantas em flor (A) Neoregelia mucugensis; (B) Orthophytum

mucugense e (C) Orthophytum albopictum. As barras representam 1cm.

10

Orthophytum albopictum Philcox apresenta inflorescência séssil e durante

o período de florescimento as folhas centrais da roseta também adquirem

coloração vermelha. As duas espécies de Orthophytum aqui apresentadas têm o

mesmo habitat e distribuição geográfica, mas são facilmente diferenciadas pelo

tamanho; O. mucugense é uma planta de pequeno porte, já O. albopictum é

considerada uma espécie de grande porte (para este gênero), apresentando

folhas ao menos duas vezes mais largas que as de O. mucugense (Smith e

Downs 1983; Stannard 1995; Wanderley 1990; Wanderley e Conceição 2006)

(Figura 1C).

Os problemas ambientais e o intenso extrativismo têm afetado as

populações de bromélias, ressaltando a importância de trabalhos de conservação,

que protejam estes vegetais e, conseqüentemente, toda a fauna e flora

associadas a estas plantas (Fialho 1990, Fialho e Furtado 1993; Leme e Marigo

1993; Oliveira et al. 1994; Oliveira e Rocha 1997). A coleta indiscriminada destas

plantas tem prejudicado a recuperação das populações naturais, tornando as

bromélias cada vez mais escassas na natureza. Sendo assim, tornam-se

imprescindíveis novas medidas, que de um lado mantenham as espécies a salvo

do perigo de extinção, e de outro ajudem a manutenção da fonte de renda

relacionada à utilização ornamental destas plantas. Uma atenção especial deve

ser destinada a espécies com distribuição restrita ou ameaçadas de extinção.

Neoregelia mucugensis, Orthophytum mucugense e Orthophytum

albopictum são espécies endêmicas da Chapada Diamantina – Bahia, ocorrem

em unidades de conservação municipais ou federais, mas não são consideradas

protegidas devido às grandes queimadas que costumam atingir a região no

período de seca (Leme 1998; Wanderley e Conceição 2006). Estes três táxons

apresentam grande potencial ornamental. Portanto o estudo da propagação

destas espécies é importante para a conservação bem como para o

estabelecimento de um sistema de cultivo comercial.

A reprodução assexuada através dos brotamentos laterais da planta

“mãe” é feita com sucesso, mas limita bastante o número de plantas obtidas. A

reprodução por sementes promove a varibilidade genética e a obtenção de maior

número de indivíduos. Já a multiplicação in vitro possibilita a formação de um

grande número de mudas, essencial para a racionalização do cultivo (Mercier e

Kerbauy 1995, 1997). A propagação em larga escala reduz os custos de produção

11

e, conseqüentemente, o preço final das mudas, mas principalmente diminui o

extrativismo, favorecendo a preservação das espécies (Kanashiro 2005).

O cultivo in vitro de bromélias tem obtido espaço na preservação de

espécies raras ou ameaçadas de extinção (Arrabal et al. 2002; Carneiro et al.

1999; Mercier e Kerbauy 1997; Rech Filho et al. 2005). A escassez de estudos

sobre a biologia reprodutiva destas plantas tem elevado a importância da

conservação in vitro da família. A manutenção in vitro assegura a conservação de

germoplasma (Carneiro e Mansur 2004; Villalobos et al. 1991) e é vantajosa

inclusive por proporcionar a produção de plantas saudáveis, e a representação de

grande variedade de genótipos em espaços reduzidos (Engelmann 1991).

A micropropagação visando a preservação de espécies deve assegurar a

manutenção da variabilidade genética. Para tanto, é importante a utilização de

plântulas obtidas a partir da germinação in vitro de sementes oriundas de

diferentes populações (Mercier e Nievola 2003). Neste caso, o cultivo in vitro a

partir de sementes é aconselhado também por gerar um grande número de

plantas-matrizes, evitando a retirada de indivíduos da natureza, o que agravaria o

grau de ameaça sobre estas espécies (Carneiro e Mansur 2004). Outra

importante vantagem da obtenção de explantes a partir da germinação decorre da

maior facilidade na desinfestação de sementes quando comparadas com tecidos

extraídos de plantas nativas (Mercier e Kerbauy 1997).

Para a conservação in vitro as plantas devem manter a sua estabilidade

genética, sendo importante o desenvolvimento de métodos que reduzam a

ocorrência de mutações e a variação somaclonal. A regeneração de brotos a

partir de organogênese direta e a redução da concentração e do tempo de

exposição dos explantes aos reguladores de crescimento diminuem as chances

de ocorrência de alterações genéticas (Mercier e Nievola 2003).

Apesar de algumas espécies de bromélias serem amplamente

propagadas, muitos indivíduos comercializados ainda são obtidos pelo

extrativismo predatório, colocando muitas espécies em risco. A padronização de

protocolos de micropropagação tem possibilitado a produção de grande

quantidade de mudas para o abastecimento agrícola e comercial. No entanto, o

número de espécies micropropagadas ainda é bastante reduzido (Arrabal et al.

2002; Carneiro e Mansur, 2004; Carneiro et al. 1999; Droste et al. 2005; Endres et

12

al. 2002; Guimarães et al. 1999; Malda et al. 1999; Mercier e Kerbauy 1992, 1997,

1998).

Plantas procedentes de propagação in vitro podem apresentar problemas

na adaptação para o ambiente ex vitro, resultando freqüentemente num baixo

percentual de sobrevivência. A incapacidade de controlar a perda de água por

evaporação a partir da superfície foliar bem como o mau funcionamento dos

estômatos de plantas cultivadas in vitro afeta a capacidade de adaptação ao

ambiente externo (Seelye et al. 2003). Estas alterações que acarretam a

inabilidade das plantas em manter a sua umidade interna parecem ser

influenciadas pelo acúmulo de gases como, etileno, mas principalmente pelo

elevado teor de umidade presente no recipiente utilizado para o cultivo in vitro

(Buddendorf-Jooten e Woltering 1996; De Proft et al. 1985; Zobayed et al. 1999).

Assim, um modelo de cultivo que possibilite a ocorrência de trocas gasosas tem

mostrado facilitar a fase de aclimatização das mudas (Jackson 2003; Seelye et al.

2003).

A ventilação dos frascos de cultura obtida através do uso de tampas

permeáveis aumenta as trocas gasosas e, conseqüentemente, as taxas de

transpiração das plantas in vitro (Lai et al. 2005; Zobayed et al. 1999). A aeração

dos frascos estimula o desenvolvimento de adaptações contra a perda de água

ainda no ambiente de laboratório, resultando na produção de plantas com melhor

controle da evaporação (Santamaria et al. 2000). Outros trabalhos demonstraram

efeitos positivos das trocas gasosas sobre a propagação in vitro de mamão (Lai et

al. 1998), eucalipto (Zobayed et al. 2000a), batata doce (Zobayed et al. 2000b),

batata (Zobayed et al. 2001) e maçã (De Klerk 2002). Mills e Tal (2004), avaliando

a tolerância à salinidade em tomate, demonstraram que plantas crescendo sob

condições in vitro em frascos ventilados apresentaram comportamento

semelhante ao das plantas cultivadas em ambiente externo.

O meio de cultura utilizado para a micropropagação em geral contém

açúcar em quantidade suficiente para possibilitar o crescimento heterotrófico dos

brotos. Além disso, o típico ambiente de cultivo in vitro é caracterizado por

apresentar um grande acúmulo de substâncias como o etileno, decorrente da

ausência de trocas gasosas entre o recipiente de cultivo e o meio externo, de

forma que existe uma grande diferença entre estes ambientes (Kozai 1991). A

aproximação entre as condições da cultura in vitro e as condições ambientais tem

13

demonstrado melhorar o desenvolvimento das plantas. Kozai et al. (1991)

destacam a possibilidade de estimular a fotoautotrofia in vitro, reduzindo a

quantidade de carboidrato fornecido e aumentando a intensidade luminosa do

ambiente de cultivo. Alguns sistemas de micropropagação fotoautotróficos que

envolvem a utilização de meios sem açúcar, ventilação forçada e exposição a

altas intensidades luminosas têm mostrado resultados positivos, proporcionando

um melhor desempenho das plantas no que tange ao crescimento, qualidade e

sobrevivência (Zobayed et al. 2000a; Xiao e Kozai 2004).

O objetivo deste trabalho foi avaliar a germinação e o crescimento em

viveiro e estabelecer um protocolo eficiente para o estabelecimento e a

propagação in vitro bem como para a aclimatização de plantas micropropagadas

pertencentes às espécies Neoregelia mucugensis, Orthophytum mucugense e

Orthophytum albopictum.

14

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARRABAL, R.; AMANCIO, F.; CARNEIRO, L. A.; NEVES, L. J.; MANSUR, E.

2002. Micropropagation of endangered endemic Brazilian bromeliad Cryptanthus

sinuosus (L.B. Smith) for in vitro preservation. Biodiversity and Conservation,

11: 1081-1089.

BRUMMITT, R.K. 1992. Vascular Plant Families and Genera. Royal Botanic Gardens, Kew, 804p.

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19

CAPÍTULO 1

Germinação e crescimento inicial de Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum

mucugense Wand. e Conceição. Bromélias endêmicas da Bahia - Brasil1.

1 Este capítulo será submetido à revista Biodiversity and Conservation

20

RESUMO

As espécies Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense, endêmicas da

Chapada Diamantina - Bahia, têm grande potencial ornamental e importância

ecológica. Como outras bromélias, são obtidas de forma extrativista. O objetivo

desse trabalho foi avaliar a influência do substrato na germinação e

desenvolvimento inicial de N. mucugensis e O. mucugense. Foram utilizados três

substratos para a avaliação da germinação e do crescimento das plantas aos 120

dias: (V) vermiculita, (T) terra vegetal e (V+T) vermiculita + terra vegetal (1:1) e

dois substratos para a avaliação do crescimento aos 300 dias: (T) terra vegetal e

(V+T) vermiculita + terra vegetal. As duas espécies apresentaram altas

porcentagens de emergência (%E), sendo que os valores observados para N.

mucugensis (91,2 – 96,5%) foram maiores do que para O. mucugense (58 –

77,5%). Em O. mucugense os maiores valores para %E foram observados nos

substratos T (77,5%) e V+T (76%). O índice de velocidade de emergência e o

tempo médio de emergência para as duas espécies não diferiram

significativamente entre os três substratos. Aos 120 dias, os substratos T e V+T

foram mais efetivos no ganho de matéria seca que o substrato V para O.

mucugense. Enquanto para N. mucugensis, o substrato V+T proporcionou um

ganho quase duas vezes maior que o substrato T. Aos 300 dias, o ganho de

matéria seca foi maior no substrato T para as duas espécies. A germinação e o

desenvolvimento inicial de N. mucugensis e O. mucugense foram influenciados

pelos substratos utilizados neste experimento.

21

ABSTRACT

(Germination and initial development of Neoregelia mucugensis Leme and

Orthophytum mucugense Wand. e Conceição. Endemic bromeliads from

Bahia – Brazil.) Neoregelia mucugensis and Orthophytum mucugense are

endemic species from Chapada Diamantina, Bahia, Brazil and they have great

ornamental potential and ecological relevance. Like others bromeliads, they are

obtained through extractivism. The purpose of the present study was to evaluate

the effects of substrates at the germination and initial development of N.

mucugensis and O. mucugense. Three substrates were compared to evaluate

germination and plant growth at 120 days: (V) vermiculite, (T) organic soil and

(V+T) vermiculite + organic soil (1:1); and two substrates were used to evaluate

plant growth at 300 days: (T) organic soil and (V+T) vermiculite + organic soil.

Even though both species have presented high emergence percentage (%E), the

values observed for N. mucugensis (91.2 – 96.5%) were higher than the values for

O. mucugense (58 – 77.5%). For O. mucugense the highest values of %E were

observed in the substrates T (77.5%) and V+T (76%). The emergence velocity

index and the average period of emergence, for both species, did not show

significantly differences between the three substrates. At day 120, the substrates T

and V+T were more efective concerning dry weight incorporation than the

substrate V for the O. mucugense. The substrate V+T promoted a gain almost

twice times greater than the substrate T for N. mucugensis. After 300 days, the dry

weight incoporation was greater in the substrate T for both species. The

germination and the initial development of N. mucugensis and O. mucugense were

influenced by the substrates evaluated in this study.

22

INTRODUÇÃO

Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum mucugense Wand. e

Conceição são espécies de Bromeliaceae endêmicas da Chapada Diamantina –

Bahia (Leme 1998; Wanderley e Conceição 2006), têm grande potencial

ornamental e como muitos representantes da família, grande importância

ecológica pelas relações estabelecidas com a fauna local que podem utilizá-las

para forrageamento e como refúgio (Rivero 1989; Oliveira et al. 1994; Oliveira e

Rocha 1997). N. mucugensis apresenta ainda uma característica comum a muitos

representantes da família Bromeliaceae: a capacidade de reter água no “tanque”

(Rocha et al. 1997) que é o micro habitat de muitos organismos, possibilitando a

reprodução de muitas espécies animais (Rivero 1989; Oliveira et al. 1994; Oliveira

e Rocha 1997) e a germinação de sementes de alguns vegetais (Fialho 1990;

Fialho e Furtado 1993).

N. mucugensis ocorre no Parque Nacional da Chapada Diamantina, mas

não é considerada protegida devido às extensas queimadas que atingem o

Parque anualmente (Leme 1998). A espécie recém descrita O. mucugense foi

encontrada exclusivamente no município de Mucugê. A ocorrência restrita leva

essa planta a ser classificada como vulnerável (Wanderley e Conceição 2006). É

importante que se estabeleçam medidas para assegurar a conservação destas

espécies na área de Campos Rupestres, onde se pode observar uma elevada

freqüência de táxons endêmicos que hoje caminham a passos largos para a

extinção (Leme 1998).

Estudos relacionados à propagação podem auxiliar na preservação das

referidas espécies, promovendo a conservação ex situ, gerando indivíduos que

possam ser re-introduzidos na natureza. O estabelecimento de um protocolo de

propagação eficiente viabiliza os cultivos comerciais, reduzindo as atividades

extrativistas.

O entendimento dos principais processos envolvidos na germinação de

sementes de espécies nativas é de grande importância na preservação e

utilização destas em programas de revegetação (Smiderle e Sousa 2003; Cuzzuol

e Lucas 1999). O conhecimento do comportamento germinativo das sementes e

como a plântula se estabelece no ambiente é de grande relevância, porque além

de avaliar a qualidade das sementes, bem como a capacidade de produzir

23

plântulas normais (Garcia 1994), amplia as bases para a compreensão do

sucesso no estabelecimento desses indivíduos e da sua ampla variabilidade

morfológica, além de auxiliar na conservação dessas espécies (Navarro e Guitián

2003; Borghetti 2000).

A composição do substrato é um fator que desempenha papel importante

na germinação e no sucesso do desenvolvimento da planta. Segundo Carvalho

Filho et al. (2002) o substrato exerce influência na arquitetura do sistema radicular

e no estado nutricional das plantas. A depender da estrutura do substrato, da

qualidade de aeração, da capacidade de retenção de água, e do seu grau de

infestação por patógenos, haverá ou não sucesso na germinação das sementes e

no desenvolvimento das plantas (Popinigis 1985). Segundo Marques et al. (1999),

o material usado deve proporcionar a retenção de água ideal à germinação e

garantir a profundidade de semeadura, não dificultando a emergência das

plântulas. Estudos sobre o efeito do substrato são necessários para obtenção de

plântulas de melhor qualidade (Campos e Uchida 2002).

A análise de crescimento é um importante instrumento para a avaliação

dos efeitos ambientais sobre as espécies (Benincasa 2003). O conhecimento a

cerca do crescimento e da incorporação de matéria seca das espécies, é

essencial quando se pretende utilizá-las para fins comerciais ou em programas de

recuperação de ambientes degradados (Vieira et al. 1998).

O objetivo desse trabalho foi avaliar a germinação de sementes de N.

mucugensis e O. mucugense em diferentes substratos e o desenvolvimento inicial

das plântulas.

24

MATERIAL E MÉTODOS

As sementes das espécies Neoregelia mucugensis e Orthophytum

mucugense foram coletadas no Parque Municipal de Mucugê, Rodovia BA 142,

Km 96, município de Mucugê – Bahia em junho de 2003. Os experimentos foram

desenvolvidos na Unidade Experimental Horto Florestal da Universidade Estadual

de Feira de Santana (Feira de Santana – Bahia). As exsicatas das espécies

encontram-se depositadas no Herbário da Universidade Estadual de Feira de

Santana, com número HUEFS 91408 (N. mucugensis) e HUEFS 91407 (O.

mucugense).

Sementes procedentes de frutos maduros foram colocadas para secar

sobre papel filtro a temperatura ambiente durante 4 dias. Sementes secas foram

desinfestadas em álcool 70% durante um minuto e hipoclorito 3% por 15 minutos

e em seguida submetidas a quatro lavagens em água destilada e autoclavada. A

semeadura foi realizada superficialmente em recipientes plásticos de 50ml,

perfurados na base, contendo três diferentes substratos: (V) vermiculita de

granulação média, (T) terra vegetal e (V + T) vermiculita de granulação média +

terra vegetal (1:1). Os substratos foram esterilizados a 121OC durante 15 minutos.

As culturas foram mantidas em laboratório sob condição de 25 ± 2ºC, fotoperíodo

de 16h e densidade de fluxo de fótons fotossínteticamente ativos de 40 µmol.m-

2.s-1. A irrigação foi feita por capilaridade. A terra vegetal utilizada foi adquirida da

Bio Jardim.

A germinação das sementes foi avaliada diariamente durante 40 dias

após a semeadura, considerando-se como germinadas as sementes que emitiram

a primeira folha.

Para a comparação das sementes das duas espécies, a matéria seca

destas foi mensurada após a secagem em estufa com ventilação forçada a 60ºC

por 96 horas. Foram avaliadas cinco repetições de 100 sementes cada.

As variáveis analisadas foram baseadas em Borghetti (2000); Santana e

Ranal (2000) e Maguire (1962) e consistiram de: Porcentagem de emergência

(%E), Índice de Velocidade de Emergência (IVE), Tempo médio (Tm) e freqüência

relativa (Fr).

A primeira etapa da avaliação da resposta fisiológica das plântulas aos

diferentes tratamentos ocorreu 120 dias após semeadura onde foi avaliado o

25

crescimento nos três substratos, através da determinação da matéria seca da

parte aérea e do sistema radicular pelo método de estufa com ventilação forçada

a 60ºC por 96 horas. Considerando os resultados obtidos neste ensaio, o

substrato vermiculita foi excluído da segunda etapa da avaliação de

desenvolvimento. Assim, as plântulas remanescentes foram transferidas para

sacos de polietileno (10x18x5cm) contendo dois diferentes substratos: (T) terra

vegetal ou (V + T) vermiculita de granulação média + terra vegetal (1:1) e

mantidas em viveiro a 70% de luminosidade. Após 180 dias (300 dias após a

semeadura) foi realizada a segunda etapa de avaliação, novamente através da

determinação da matéria seca das plantas.

Para os ensaios de germinação, utilizou-se o delineamento inteiramente

casualizado em esquema fatorial 2 x 3 (espécie x substrato) com cinco repetições,

sendo cada parcela composta por 40 sementes. Os resultados expressos em

porcentagem foram transformados em arco seno (%G /100)0,5 para a realização

da análise estatística, a fim de normalizar a sua distribuição. Para a avaliação do

desenvolvimento das plântulas aos 120 e 300 dias, o delineamento experimental

utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 3 e 2 x 2 (espécie

x substrato) respectivamente, constituindo-se de quatro repetições, compostas

por 10 plântulas cada (120 dias) ou cinco repetições compostas de 15 indivíduos

cada (300 dias). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias

comparadas pelo teste de Tukey.

27

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A emergência de N. mucugensis nos três substratos foi iniciada 14 dias

após a inoculação das sementes e se estendeu até o 23o dia em vermiculita e

vermiculita + terra e até o 25o dia em terra. Já as sementes de O. mucugense

apresentaram uma emergência mais lenta, que se estendeu do 17o ao 40o dia no

substrato vermiculita, do 18o ao 40o dia em vermiculita+terra e do 19o ao 40o dia

quando semeadas em terra. Este resultado mostra que a germinação de N.

mucugensis é concentrada em um período de tempo mais restrito que a de O.

mucugense (Figura 1.1).

Na espécie N. mucugensis o percentual de emergência não diferiu

significativamente entre os substratos avaliados. Já as sementes de O.

mucugense, não apresentaram diferenças na emergência quando semeadas em

terra (77,5%) ou vermiculita + terra (76%), mas ambos os substratos foram

melhores para a germinação que a vermiculita (58%). O. mucugense apresentou

taxa de emergência significativamente inferior a N. mucugensis em todos os

substratos analisados (Tabela 1.1).

Tabela 1.1 – Valores médios para porcentagem de eme rgência (%E), tempo médio de

emergência (TmE) e índice de velocidade de emergênc ia (IVE) de sementes de Orthophytum

mucugense e Neoregelia mucugensis em função do tipo de substrato utilizado.

%EZ TmE IVE

Substratos N. mucugensis O. mucugense N. mucugensis O. mucugense N. mucugensis O. mucugense

Vermiculita (V) 94,0 aW AV 58,0 b B 16,47 a B 25,81 a A 2,31 a A 0,93 a B

Terra (T) 91,2 a A 77,5 a B 16,37 a B 26,01 a A 2,17 a A 1,22 a B

V + T 96,5 a A 76,0 a B 16,31 a B 25,00 a A 2,39 a A 1,26 a B

Média 92,8 A 70,5 B 16,38 B 25,61 A 2,29 A 1,14 B

Z – Médias originais. A estatística foi realizada em médias transformadas em arco seno.

W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada variável, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

28

Figura 1.1 – Freqüência relativa (%) da emergência de (A) N. mucugensis e

(B) O. mucugense em vermiculita (�), terra vegetal (�) ou vermiculita + terra

vegetal (�).

A

0

5

10

15

20

25

30

35

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 B

0

5

10

15

20

25

30

35

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39

Fre

qüên

cia

Rel

ativ

a (%

) F

reqü

ênci

a R

elat

iva

(%)

Tempo (dias)

29

N. mucugensis e O. mucugense apresentaram altos percentuais de

emergência mostrando que estas espécies possuem comportamento semelhante

a outros representantes da família (Mercier e Nievola 2003). Outros trabalhos

registraram uma taxa de 100% de germinação para Aechmea beeriana (Nara e

Webber 2002), cerca de 96% para Aechmea nudicaulis e Streptocalyx floribundus

(Pinheiro e Borghetti 2003), 76% para Tillandsia geminiflora (Stringheta et al.

2005), 99% para Vriesea gigantea, 88,9% para Vriesea philippocoburgii (Droste et

al. 2005), 90% para Vriesea hieroglyphica (Mercier e Kerbauy 1994),

aproximadamente 50% para Pitcairnia staminea e cerca de 76% para Pitcairnia

albiflos (Wendt et al. 2001).

Em O. mucugense o menor valor encontrado para a emergência no

substrato vermiculita (58%), cujas propriedades físico-químicas possibilitam uma

alta retenção de água (Andrade et al. 1999, 2000; Araújo et al. 1991), pode estar

relacionado com a inibição da germinação ocasionada pelo excesso de água no

meio. Além disso, quantidades elevadas de água podem interferir na

disponibilidade de O2, afetando a respiração do embrião, o que pode influenciar

negativamente na germinação (Kerbauy 2004). Supostamente a inviabilidade das

sementes de O. mucugense no substrato vermiculita não ocorreu em N.

mucugensis visto que o percentual encontrado para este tratamento (94%) não

difere significativamente dos valores encontrados para terra (91,2%) ou

vermiculita + terra (96,5%) (Tabela 1.1).

Foi observado que sementes de Canistrum aurantiacum germinam na sua

inflorescência (Siqueira Filho 2001). A geminação de sementes na inflorescência

situada no “tanque” da planta pôde ser observada em N. mucugensis durante as

coletas de sementes no seu habitat. Como este é um local de grande acúmulo de

água, o comportamento da espécie no ambiente justificaria a maior capacidade de

N. mucugensis de se desenvolver em locais com muita água, quando comparada

com O. mucugense, uma espécie desprovida de “tanque”.

O tempo médio e o índice de velocidade de germinação foram

significativamente diferentes para as duas espécies, independentemente do

substrato utilizado, confirmando que sementes de N. mucugensis germinam mais

rápido e em um menor intervalo de tempo que sementes de O. mucugense

(Tabela 1.1).

30

A matéria seca encontrada em 100 sementes de N. mucugensis pesou

em média de 57,4mg enquanto a mesma quantidade de sementes da espécie O.

mucugense pesou em média 24,3mg. N. mucugensis apresentou maiores taxas

de germinação, maior velocidade e conseqüentemente menor tempo médio para

a germinação. Este comportamento pode estar relacionado com o tamanho das

suas sementes que chegam a ter mais que o dobro do peso que as sementes de

O. mucugense, apresentando conseqüentemente um maior acúmulo de reservas

energéticas. Smith e Downs (1974) discorreram sobre a relação tamanho-

quantidade de sementes apresentada por integrantes da família Bromeliaceae,

sugerindo que este fator poderia estar relacionado com o sucesso reprodutivo e o

tipo de dispersão desenvolvida por cada espécie. A redução no tamanho é

geralmente acompanhada pelo aumento no número de sementes o que pode

facilitar a sua dispersão, mas resulta no menor acúmulo de reservas energéticas.

Segundo este princípio, ao comparar espécies que apresentam sementes de

tamanhos diferentes, as sementes maiores e com mais reservas energéticas

apresentariam vantagens no processo germinativo, mas precisariam dispor de

mecanismos de dispersão mais complexos.

Aos 120 dias da semeadura a avaliação do crescimento das plantas

através da mensuração da matéria seca demonstrou que para O. mucugense os

substratos terra vegetal e terra vegetal + vermiculita foram mais efetivos na

incorporação de matéria seca que o substrato vermiculita. Enquanto para N.

mucugensis o substrato terra vegetal + vermiculita proporcionou um ganho quase

duas vezes maior que o substrato composto exclusivamente por terra vegetal.

Nesta espécie as plantas cultivadas em vermiculita também apresentaram o

menor acúmulo de matéria seca. Na segunda avaliação do crescimento, aos 300

dias, foi observado que as plantas cultivadas em terra vegetal apresentaram um

ganho de matéria seca superior às plantas cultivadas em terra vegetal +

vermiculita para as duas espécies (Tabela 1.2). O tamanho médio das plantas aos

120 dias foi de 2,5 cm de altura para ambas espécies enquanto aos 300 dias as

plantas de N. mucugensis e O. mucugense tinham em média 6 e 4,5 cm de altura

respectivamente.

31

Tabela 1.2 – Valores médios para matéria seca da pa rte aérea e das raízes de plantas de N. mucugensis e O. mucugense aos 120 e 300 dias de idade em função do tipo de substrato utilizado.

Matéria seca da parte aérea (mg/planta) Matéria seca das raízes (mg/planta)

Substrato N. mucugensis O. mucugense N. mucugensis O. mucugense

120 dias

Vermiculita 8,82 cW AV 1,35 b B 2,65 b A 0,55 b B

Terra 30,65 b A 8,40 a B 13,20 a A 2,45 a B

Vermiculita + Terra 60,95 a A 8,00 a B 13,45 a A 2,75 a B

Média 33,48 A 5,92 B 9,77 A 1,92 B

300 dias

Terra 106,90 a A 42,93 a B 27,14 a A 8,71 a B

Vermiculita + Terra 72,36 b A 33,56 b B 23,99 a A 6,00 b B

Média 89,63 A 38,25 B 25,57 A 7,36 B


O menor desenvolvimento dos indivíduos de ambas espécies cultivados

em vermiculita pode ser explicado pela ausência de nutrientes neste substrato, o

que limita o crescimento dos vegetais. O maior ganho de matéria seca observado

em N. mucugensis no substrato vermiculita + terra aos 120 dias pode ser atribuída

à presença de nutrientes provenientes da terra, associados à maior retenção de

umidade proporcionada pela vermiculita (Andrade et al. 1999, 2000; Araújo et al.

1991). A presença de plântulas no “tanque” de indivíduos adultos pode indicar que

N. mucugensis necessita de maior suprimento de água para o seu

desenvolvimento inicial. No entanto, após a floração e frutificação, N. mucugensis

assim como a grande maioria das espécies de bromélias entra em declínio

fisiológico e morre (Leme e Marigo 1993; Smith e Downs 1974), neste momento

as plantas jovens precisam estar estabelecidas na população de forma a não

depender mais de plantas adultas. Neste sentido, Siqueira Filho e Machado

(2001) observaram que plântulas de Canistrum aurantiacum, que se desenvolvem

ainda na inflorescência atingem o solo 7-8 meses após o florescimento, com o

declínio fisiológico da planta adulta. A menor disponibilidade de água e a maior

32

disponibilidade de nutrientes no substrato terra pode ser responsável pelo melhor

desenvolvimento de ambas espécies nesse substrato aos 300 dias.

O maior ganho de matéria seca observada para N. mucugensis em

comparação com O. mucugense pode estar relacionada com as características

genéticas de cada espécie. O indivíduo adulto de N. mucugensis é

consideravelmente maior que plantas adultas da espécie O. mucugense.

A distribuição da matéria seca entre a parte aérea e o sistema radicular

revela baixas porcentagens de matéria seca para o sistema radicular em relação

à parte aérea para as duas espécies em todos os substratos. Em geral o ganho

de matéria seca das raízes foi proporcionalmente maior aos 120 dias (Figura

1.2A) que aos 300 dias (Figura 1.2B). O comportamento do sistema radicular na

família bromeliaceae pode ser correlacionado com o desenvolvimento das

características epífitas e saxícolas presentes em algumas de suas espécies. O

desenvolvimento destas características envolve o surgimento de escamas foliares

cada vez mais especializadas, paralelamente ocorre a redução das raízes, visto

que a função de absorção radicular tende a ser reduzida (Smith e Downs, 1974).

As duas espécies estudadas são saxícolas, portanto apresentam uma tendência à

redução do sistema radicular o que pode explicar o menor desenvolvimento de

raízes em relação à parte aérea. No entanto a função de fixação exercida pelas

raízes é muito importante para as bromélias. A fixação no início do

desenvolvimento bem como a função de absorver água em quantidade adequada

no momento em que o indivíduo está se estabelecendo podem explicar a maior

proporção de raízes observada aos 120 dias. A folha em seus estádios iniciais de

desenvolvimento é considerada um tecido heterotrófico, por isso sugere-se que a

absorção inicial de água e nutrientes em bromélias ocorra predominantemente

através das raízes, e posteriormente, com o desenvolvimento e estabelecimento

funcional das folhas, parte dessas funções venham a ser gradativamente

transferidas para a parte aérea destes vegetais.

Apesar dos percentuais de emergência não diferirem de forma

significativa entre os três substratos avaliados, para a espécie N. mucugensis, é

indicado que as sementes sejam semeadas em vermiculita + terra vegetal já que

neste substrato apresentam alta germinabilidade e melhor crescimento durante os

primeiros três meses, evitando o transplantio. Após esse período recomenda-se a

transferência das mudas para substrato composto exclusivamente por terra

33

vegetal. Para O. mucugense, indicam-se os substratos terra vegetal ou terra

vegetal + vermiculita para semeadura e desenvolvimento nos primeiros 120 dias,

mas decorridos três meses as plantas devem ser transferidas para terra vegetal,

procedimento semelhante ao utilizado para N. mucugensis.

Figura 1.2 – Distribuição da matéria seca em plantas das espécies N. mucugensis

e O. mucugense com 120 (A) ou 300 (B) dias de idade em função do substrato

utilizado. (V) vermiculita, (T) terra ou (V + T) vermiculita + terra.

Dis

trib

uiçã

o da

mat

éria

sec

a (%

do

tota

l)

A

N. mucugensis

0%

20%

40%

60%

80%

100%

T V + T T V + T

p. aérea

raiz

B

O. mucugense

O. mucugense N. mucugensis

0%

20%

40%

60%

80%

100%

V T V + T V T V + T

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38

CAPÍTULO 2

Estabelecimento in vitro de Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum

mucugense Wand. e Conceição. Bromélias endêmicas da Chapada Diamantina,

Bahia - Brasil.2

2 Este capítulo será submetido à revista Brazilian Archives of Biology and Technology

39

RESUMO

Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense são bromélias endêmicas da

Chapada Diamantina – Bahia com grande potencial ornamental e relevante

importância ecológica. O cultivo in vitro de bromélias é muito utilizado para fins

comerciais e na preservação de espécies raras ou ameaçadas de extinção. O

objetivo desse trabalho foi avaliar a influência da composição do meio de cultura

na germinação e no crescimento de N. mucugensis e O. mucugense, a fim de

estabelecer in vitro estas espécies. A germinação foi avaliada em ágar e no meio

de cultura MS com metade da concentração salina (MS/2). O crescimento foi

avaliado em MS e MS/2 na presença ou ausência de carvão ativado. As sementes

de N. mucugensis germinaram bem em ágar e em MS/2, já a espécie O.

mucugense teve melhor germinação em ágar. Os meios de cultura MS e MS/2

podem ser utilizados para o cultivo in vitro de N. mucugensis e O. mucugense. A

presença de carvão ativado favoreceu o crescimento da parte aérea de O.

mucugense e do sistema radicular de ambas espécies, sendo aconselhável a sua

utilização na fase de pré-aclimatização.

40

ABSTRACT

(In vitro establishment of Neoregelia mucugensis Leme and Orthophytum

mucugense Wand. and Conceição. Endemic bromeliads from Chapa da

Diamantina, Bahia - Brazil). Neoregelia mucugensis and Orthophytum

mucugense are endemic bromeliads from Chapada Diamantina, Bahia, Brazil, and

they have great ornamental potential and ecological relevance. In vitro culture of

bromeliads is widely used for commercial purposes and for preservation of rare or

endangered species. The purpose of the present study was to evaluate the effects

of culture medium composition in the germination and growth of N. mucugensis

and O. mucugense, for in vitro establishment. The germination was evaluated in

agar and MS culture medium with half salt concentration (MS/2). The growth was

evaluated in MS and MS/2 in the presence or absence of activated charcoal.

Seeds of N. mucugensis had a good germination ratio in agar and in MS/2, but O.

mucugense seeds had a better germination ratio in agar. MS or MS/2 culture

media can be used for the N. mucugensis and O. mucugense in vitro culture. As

the presence of activated charcoal favoure the leaf growth of O. mucugense and

the root system growth of both species, thus its use is recommended in the pre-

acclimatization phase.

41

INTRODUÇÃO

Neoregelia mucugensis Leme e Orthophytum mucugense Wand. e

Conceição são duas espécies da família Bromeliaceae endêmicas da Chapada

Diamantina, Bahia, Brasil (Leme 1998; Wanderley e Conceição 2006). N.

mucugensis Leme é uma planta típica dos campos rupestres. Apresenta grande

plasticidade fenotípica, sendo caracterizada por variações na coloração, forma e

conformação da roseta foliar e na coloração das flores. Ocorre no Parque

Nacional da Chapada Diamantina, mas não é considerada protegida devido às

extensas queimadas que atingem o Parque anualmente (Leme 1998).

Orthophytum mucugense é a mais nova espécie de Orthophytum descrita.

Os indivíduos deste táxon crescem formando grandes populações em paredões

rochosos localizados nas margens de rios. Os relatos acerca da sua distribuição

geográfica revelam que a sua ocorrência está restrita ao município de Mucugê.

Apesar de ser encontrada em uma Unidade de Conservação Municipal e de

formar grandes populações, a ocorrência restrita a uma única localidade leva O.

mucugense a categoria vulnerável, fato que demonstra a importância da

realização de trabalhos de preservação com esta nova espécie (Wanderley e

Conceição 2006).

A família Bromeliaceae tem grande importância na manutenção da

biodiversidade animal e vegetal, fornecendo água, alimento, condições de

acasalamento e abrigo para muitas espécies. Os problemas ambientais e o

intenso extrativismo têm afetado as populações de bromélias, ressaltando a

importância de trabalhos de conservação, que protejam estes vegetais e,

conseqüentemente, toda a fauna e flora associadas a estas plantas (Leme e

Marigo 1993; Oliveira et al. 1994).

O cultivo in vitro de bromélias é muito utilizado para fins comerciais, e tem

se destacado na preservação de espécies raras ou ameaçadas de extinção

(Arrabal et al. 2002; Carneiro et al. 1999; Mercier e Kerbauy 1997; Rech Filho et

al. 2005). A escassez de estudos sobre a biologia reprodutiva destas plantas tem

elevado a importância da conservação in vitro da família. A manutenção in vitro

assegura o armazenamento de germoplasma (Carneiro e Mansur 2004; Villalobos

et al. 1991) e é vantajosa inclusive por proporcionar a produção de plantas

42

saudáveis, e a representação de grande variedade de genótipos em espaços

reduzidos (Engelmann 1991).

A micropropagação visando a preservação de espécies deve assegurar a

manutenção da variabilidade genética. Para tanto, é importante a utilização de

plântulas obtidas a partir da germinação in vitro de sementes oriundas de

diferentes populações (Mercier e Nievola 2003). Neste caso, o cultivo in vitro a

partir de sementes é aconselhado também por gerar um grande número de

plantas-matrizes, evitando a retirada de indivíduos da natureza, o que agravaria o

grau de ameaça sobre estas espécies (Carneiro e Mansur 2004). Outra

importante vantagem da obtenção de explantes a partir da germinação decorre da

maior facilidade na desinfestação de sementes quando comparadas com tecidos

extraídos de plantas nativas (Mercier e Kerbauy 1997).

Estudos sobre a germinação in vitro de sementes de Bromeliaceae têm

demonstrado altas taxas de germinabilidade utilizando a forma gelificada dos

meios de Knudson (1946) ou Murashige e Skoog (1962), com sacarose e sem

reguladores de crescimento (Droste et al. 2005, Mercier e Kerbauy 1994; Mercier

e Nievola 2003). No entanto, a concentração salina destes meios pode influenciar

o desenvolvimento inicial de algumas espécies de bromélias (Mekers 1977).

As plântulas produzidas a partir da germinação in vitro podem ser

mantidas em meio de crescimento ou utilizadas como fonte de explantes para a

micropropagação. Em ambos os casos, é necessária a transferência para um

meio adequado ao seu desenvolvimento (Mercier e Nievola 2003). O meio

Murashige e Skoog (1962) tem mostrado bons resultados na propagação in vitro

de bromélias (Arrabal et al. 2002; Carneiro et al. 1999; Droste et al. 2005; Rech

Filho et al. 2005).

O carvão ativado favorece a diferenciação dos tecidos vegetais. Apesar

de não ser considerado um fitorregulador, é capaz de modificar a composição do

meio de cultura, influenciando o crescimento in vitro das plantas. A sua atuação

está associada com a retenção de reguladores de crescimento liberados pelos

tecidos vegetais ou presentes no meio de cultura (Fridborg et al. 1978; George

1993). A capacidade de absorção do carvão está relacionada com a sua estrutura

química. A existência de pequenos poros na parte exterior da molécula, somada à

sua grande área interna, propicia o ingresso de substâncias e sua posterior

retenção na superfície interna da molécula (Mohamed-Yasseen 2001).

43

O desenvolvimento de um protocolo eficaz para o estabelecimento in vitro

de bromélias possibilita a manutenção de plantas matrizes in vitro e constitui o

meio básico para a micropropagação de tais plantas. O presente estudo avaliou a

germinação de sementes e o desenvolvimento de plantas de N. mucugensis e O.

mucugense em diferentes concentrações salinas do meio de cultura de Murashige

e Skoog (1962). Foi analisada, ainda, a influência do carvão ativado no

crescimento destas plantas.

44

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal: origem e assepsia

Foram utilizadas sementes de Neoregelia mucugensis e Orthophytum

mucugense coletadas no Parque Municipal de Mucugê, Rodovia BA 142, Km 96,

município de Mucugê - Bahia.

As sementes foram retiradas de frutos maduros e colocadas para secar

sobre papel filtro a temperatura ambiente durante 4 dias. Para a desinfestação, as

sementes foram imersas em álcool 70% durante um minuto e hipoclorito 3% por

15 minutos, e posteriormente submetidas a quatro lavagens em água destilada

autoclavada.

Condições de cultivo

Os experimentos foram conduzidos em laboratório sob condição de

crescimento de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 16h e densidade de fluxo de fótons

fotossínteticamente ativos de 40 µmol.m-2.s-1.

Germinação in vitro

A semeadura foi realizada superficialmente em frascos de 250ml contendo

50ml de meio de cultura. Foram utilizados dois diferentes meios de cultivo: (1)

meio MS (Murashige e Skoog 1962) com metade da concentração salina,

suplementado com sacarose (30g.L-1) e ágar (7g.L-1) ou (2) água destilada

gelificada com ágar (7g.L-1). O pH foi ajustado para 5,8 antes da autoclavagem. A

esterilização foi realizada em autoclave sob temperatura de 120ºC por 15 minutos.

A germinação foi avaliada diariamente durante 78 dias após a semeadura.

A semente foi considerada germinada quando houve a emissão da radícula.

As variáveis analisadas foram baseadas em Borghetti (2000); Santana e

Ranal (2000) e Maguire (1962) e consistiram de: Porcentagem de Germinação

(%G), Índice de Velocidade de Germinação (IVG), Tempo Médio de Germinação

(Tm) e Freqüência Relativa da Germinação (Fr).

O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado em

arranjo fatorial 2x2 (espécies x meio de cultura) com cinco repetições compostas

por 40 sementes cada. Os resultados expressos em porcentagem foram

transformados em arco seno (%G/100)0,5 para a normalização da sua distribuição.

45

Crescimento in vitro

Na avaliação do crescimento de N. mucugensis foram utilizadas plântulas

com 15 a 30 dias, originadas a partir da germinação em ágar (7g.L-1). Cada

plântula foi colocada em um tubo de ensaio (25x200mm) com 15ml de meio de

cultura. Foram utilizados o meio MS ou MS com metade da concentração salina

(MS/2), suplementado com sacarose (30g.L-1) e ágar (7g.L-1) em dois níveis de

carvão ativado (0 e 1,0 g.L-1).


arranjo fatorial 2x2 (concentração salina do meio x carvão) com 14 repetições.

Cada repetição foi composta por cinco plantas.

A avaliação do crescimento de O. mucugense foi realizada em duas

etapas. No primeiro experimento, plântulas com 15 a 30 dias (cerca de 1cm de

altura), originadas a partir da germinação em ágar (7g.L-1), foram transferidas para

meio MS ou MS/2, suplementado com sacarose (30g.L-1) e ágar (7g.L-1). Após a

análise dos resultados obtidos neste experimento, foi montado o segundo

experimento. Neste, foram utilizados brotos, medindo entre 1 e 1,5cm de

comprimento, formados in vitro na ausência de fitorreguladores, sendo as

brotações estimuladas pela remoção do ápice de plantas estioladas. Os brotos

foram inoculados em meio MS/2, suplementado com sacarose (30g.L-1) e ágar

(7g.L-1) em dois níveis de carvão ativado (0 e 1,0 g.L-1). Nos dois experimentos o

material vegetal foi inoculado em tubos de ensaio (25x200mm) com 15ml de meio

de cultura.

O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado com 16

repetições. Cada repetição foi composta por cinco plantas.

A avaliação do crescimento das plantas das duas espécies em diferentes

meios foi realizada 90 dias após a inoculação. Foram mensurados o comprimento

da parte aérea e da raiz (mm) com o auxílio de um paquímetro de precisão

(150mm) e a matéria seca (mg) da parte aérea e das raízes, pelo método de

estufa com ventilação forçada a 60oC / 96 horas.

Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias

comparadas pelo teste de Tukey. O programa estatístico utilizado para análise

dos dados foi o software SISVAR (v 4.3, UFLA).

47

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Germinação in vitro

A germinação de N. mucugensis em ambos os meios foi iniciada seis dias

após a inoculação das sementes e se estendeu até o 21o (Ágar) ou 22o (MS/2) dia

depois da semeadura. Já as sementes de O. mucugense apresentaram uma

germinação mais lenta, que se estendeu do 18o ao 78o dia no meio MS/2 e do 23o

ao 76o dia no ágar. Este resultado mostra ainda que a germinação de N.

mucugensis é concentrada em um período de tempo mais restrito que a

germinação de O. mucugense (Figura 2.1).

A interação “espécie x meio de cultura” foi altamente significativa para a

porcentagem de germinação. O tempo médio de germinação e o índice de

velocidade de germinação foram influenciados significativamente tanto pela

espécie como pelo tipo de meio utilizado (Tabela 2.1).

N. mucugensis apresentou alta germinabilidade (93 – 95%) não ocorrendo

diferenças significativas em relação ao tipo de meio utilizado. Em estudo ex vitro,

esta espécie alcançou até 96,5% de germinação (capítulo 1), demonstrando que

N. mucugensis apresenta comportamento germinativo semelhante in vitro e ex

vitro (Tabela 2.1).

Tabela 2.1 – Valores médios para porcentagem de ger minação (%G), tempo médio de germinação (TmG) e índice de velocidade de germinaç ão (IVG) de sementes de Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense em função do meio de cultura.

%GZ TmG IVG

Ágar MS/2 Ágar MS/2 Ágar MS/2

N. mucugensis 95,0 aW AV 93,0 a A 9,86 b A 10,89 b A 4,05 a A 3,57 a B

O. mucugense 58,5 b A 14,0 b B 16,35 a B 18,96 a A 0,68 b A 0,13 b B

Z – Médias originais. A estatística foi realizada em médias transformadas em arco seno. W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada variável, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

48

Figura 2.1 – Freqüência relativa (%) da germinação de sementes de (A) N.

mucugensis e (B) O. mucugense em MS/2 (�) e ágar (�).

A

0

5

10

15

20

25

30

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77

B

0

1

2

3

4

5

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77

Fre

qüên

cia

Rel

ativ

a (%

) F

reqü

ênci

a R

elat

iva

(%)

Tempo (dias)

49

Já as sementes de O. mucugense, tiveram melhor desempenho em ágar

(58,5%) que em meio MS/2 (14%), mas em ambos os tratamentos apresentaram

germinabilidade significativamente mais baixa que N. mucugensis (Tabela 2.1).

Em outro experimento (dados não mostrados), foi possível observar a germinação

de 82% das sementes de O. mucugense em ágar, quando a avaliação foi

realizada após 110 dias da semeadura, o que revela que esta espécie também

apresenta alta germinabilidade, no entanto requer um período mais longo para a

germinação in vitro. Em avaliações realizadas ex vitro, 40 dias após semeadura,

sementes de O. mucugense atingiram até 77,5% de germinação (capítulo 1),

demonstrando que esta espécie apresenta comportamento germinativo

diferenciado, necessitando de um período mais prolongado para germinar in vitro

quando em relação à germinação ex vitro.

Estudos realizados com outras espécies de bromélias demonstraram que

a família apresenta alta germinabilidade e que a germinação em geral ocorre após

uma ou duas semanas da semeadura (Mercier e Nievola 2003). Nara e Webber

(2002) observaram 100% de germinação para Aechmea beeriana. Sementes de

Aechmea nudicaulis e Streptocalyx floribundus atingiram 95,7 e 96% de

germinação, respectivamente, sob condições ideais de luminosidade e

temperatura (Pinheiro e Borghetti 2003). A germinabilidade para Tillandsia

geminiflora chegou à taxa dos 76%, 30 dias após a semeadura ex vitro

(Stringheta et al. 2005). Vriesea gigantea e Vriesea philippocoburgii

apresentaram, respectivamente, 99% e 88,9% de germinação in vitro quando

semeadas em meio Knudson (1946) ou em combinações do meio Knudson com

MS, decorridos 45 dias da inoculação (Droste et al. 2005). Mercier e Kerbauy

(1994) obtiveram mais de 90% de germinação para Vriesea hieroglyphica

utilizando meio Knudson com 25 e 50% da concentração salina.

A concentração salina do meio influencia a germinação e o crescimento

inicial de algumas espécies de bromélias. Foi observado um pequeno decréscimo

na germinação de V. gigantea ao utilizar o meio MS com metade da concentração

de macronutrientes e uma taxa ainda menor quando utilizaram o meio MS com

todos os sais (Droste et al. 2005). Mekers (1977) observou que plântulas de

Vriesea splendens morreram algumas semanas após a inoculação em MS, e

sugeriu que esta espécie é sensível às altas concentrações salinas presentes

neste meio de cultura. Desta forma, a reduzida taxa de germinação observada

50

para sementes de O. mucugense inoculadas em MS/2 parece decorrer da

concentração de sais do meio de cultura.

Os cálculos do tempo médio e do índice de velocidade de germinação

apresentaram resultados significativamente diferentes para as duas espécies,

confirmando que sementes de N. mucugensis germinam mais rápido e em um

menor intervalo de tempo que sementes de O. mucugense. Estes dados

possibilitam ainda a observação de que o meio utilizado não influenciou nestas

variáveis para nenhuma das espécies (Tabela 2.1).

Crescimento in vitro

A interação “meio de cultura x carvão” foi altamente significativa para a

matéria seca da raiz, o comprimento da parte aérea e o comprimento das raízes.

A matéria seca da parte aérea foi influenciada pelo carvão ativado na espécie N.

mucugensis (Tabela 2.2).

Tabela 2.2 – Valores médios para matéria seca da pa rte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e comprimento das raízes de plantas de Neoregelia mucugensis em função da concentração de sais do meio de cultu ra e da presença de carvão ativado.

Matéria seca da parte aérea (mg)

Matéria seca da raiz (mg)

Comprimento parte aérea (mm)

Comprimento raiz (mm)

Carvão (g.L-1)

MS MS/2 MS MS/2 MS MS/2 MS MS/2

0,0 8,1 bWAV 7,8 b A 2,2 b B 5,0 b A 25,6 b A 26,4 b A 11,1 b B 24,6 a A

1,0 14,5 a AV 11,2 a A 9,1 a A 7,6 a B 56,5 a A 48,2 a A 35,7 a A 27,6 a B


O efeito do carvão ativado adicionado ao meio de cultura foi altamente

significativo para todas as variáveis analisadas, resultando em maior incorporação

de massa na parte aérea e nas raízes, assim como no comprimento da planta e

das raízes (Tabela 2.2).

O carvão proporciona o escurecimento do substrato estimulando o

crescimento de raízes que são fotoblásticas negativas. Além disso, a sua

capacidade de reter parte dos elementos que compõem o meio reduz a

51

concentração de compostos inibidores do enraizamento (Fridborg et al. 1978;

George 1993).

A diferença na concentração de sais do meio de cultura demonstrou

influenciar o comprimento da raiz. As plantas crescendo em meio MS + carvão

apresentaram raízes significativamente maiores e mais pesadas que as plantas

procedentes do meio MS/2 + carvão. No entanto, na ausência de carvão, o melhor

crescimento de raízes foi obtido para as plantas cultivadas em MS/2. As plantas

procedentes de ambos os meios não demonstraram diferir de maneira

significativa quanto ao tamanho e a incorporação de massa pela parte aérea

(Tabela 2.2), indicando que o meio MS/2 fornece os elementos necessários para

o cultivo in vitro de N. mucugensis com um menor gasto de reagentes, se

comparado ao meio MS.

Durante o crescimento in vitro a grande disponibilidade de nutrientes e

vitaminas possibilita a fácil nutrição da planta, que se desenvolve com raízes

pequenas ou ausentes. Na fase que antecede a transferência para o campo, a

formação de raízes se torna importante, pois a planta precisa estar apta a

desenvolver o seu sistema radicular para captar água e nutrientes do solo durante

a aclimatização. As raízes curtas são vantajosas na aclimatização, pois facilitam o

manuseio e como estão em fase de crescimento intenso, favorecem o

desenvolvimento do sistema radicular no ambiente externo. Raízes longas, por

sua vez, precisam ser podadas durante a transferência. No processo de poda

muitas regiões meristemáticas são removidas, dificultando o crescimento radicular

e o estabelecimento ex vitro das plantas (Grattapaglia e Machado 1988).

A análise de plantas da espécie O. mucugense desenvolvidas em MS e

MS/2 demonstrou que a concentração de sais no meio de cultura não interferiu no

seu crescimento. Plantas procedentes de MS ou MS/2 não apresentaram

diferenças significativas em nenhuma das variáveis analisadas. Diante desse

resultado, optou-se por utilizar a menor concentração salina (MS/2), pois ela

promoveu crescimento semelhante com menor gasto de reagentes (Tabela 2.3).

A análise do efeito do carvão ativado no crescimento das plantas de O.

mucugense demonstrou que a presença de carvão influenciou de forma

significativa, em todas as variáveis analisadas. A presença de carvão

proporcionou um aumento de quase 88% na matéria seca da parte aérea e de

mais de 66% na matéria seca da raiz. O comprimento da parte aérea de plantas

52

desenvolvidas na presença de carvão apresentou um aumento de 77% e um

aumento no comprimento da raiz de 57% (Tabela 2.4).

Tabela 2.3 – Valores médios para matéria seca da pa rte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e comprimento das raízes de plantas de Orthophytum mucugense, em função do meio de cultura.

Meio de cultura Matéria seca da parte aérea (mg)




MS 6,57 aW 1,34 a 17,46 a 23,81 a

MS/2 5,44 a 1,01 a 15,71 a 21,16 a

W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

Tabela 2.4 – Valores médios para matéria seca da pa rte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e comprimento das raízes de plantas de Orthophytum mucugense, em função de diferentes níveis de carvão ativado no meio de cultura.

Carvão (g.L-1) Matéria seca da parte aérea (mg)




0,0 19,92 bW 3,68 b 28,64 b 30,47 b

1,0 37,43 a 9,81 a 50,70 a 47,93 a

W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

A presença de carvão ativado no meio de cultura tem favorecido a

morfogênese, a rizogênese e o crescimento do vegetal. O estímulo à

diferenciação de tecidos está relacionado com a sua capacidade de absorver

substâncias inibidoras, mas a forma exata pela qual o carvão estimula o

crescimento ainda não está esclarecida (Fridborg et al. 1978; George 1993;

Mohamed-Yasseen, 2001).

Apesar do carvão ativado atuar na redução da oxidação e na inativação

de resíduos de fitorreguladores, deve-se considerar que a retenção de elementos

do meio pode ocasionar deficiências na planta tornando indisponíveis

componentes essenciais para o desenvolvimento dos vegetais como os

macronutrientes e os micronutrientes (Grattapaglia e Machado 1988).

A presença de carvão favoreceu o crescimento da parte aérea e do

sistema radicular de ambas espécies. Considerando os resultados benéficos

53

decorrentes da utilização de carvão é recomendável a sua utilização em uma fase

rápida, que anteceda a aclimatização, já que o desenvolvimento de raízes muito

grandes pode afetar a transferência. É preciso considerar também que a

utilização excessiva do carvão pode interferir no crescimento vegetal, por

indisponibilizar elementos essenciais para o seu desenvolvimento.

As sementes de N. mucugensis podem ser semeadas em ágar ou MS/2,

originando plântulas já na segunda semana após a inoculação, enquanto as

sementes de O. mucugense devem ser semeadas no ágar com ao menos quatro

ou cinco semanas de antecedência à utilização das plântulas.

Foi possível verificar que plantas de ambas espécies não apresentaram

diferenças significativas no crescimento quando foram cultivadas em MS ou MS/2.

Portanto, os dois meios podem ser utilizados para o cultivo in vitro de N.

mucugensis e O. mucugense.

54





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57

CAPÍTULO 3 Resposta regenerativa in vitro de explantes caulinares de Neoregelia mucugensis Leme, Orthophytum mucugense Wand. e Conceição e Orthophytum albopictum Philcox. Bromélias endêmicas da Chapada Diamantina - Brasil, submetidas a diferentes concentrações de BAP e ANA.3

3 Este capítulo será submetido à revista Plant Cell Tissue and Organ Culture

58

RESUMO

Este trabalho teve por objetivo o desenvolvimento de protocolos eficientes de

regeneração in vitro para N. mucugensis, O. mucugense e O. albopictum

utilizando explantes caulinares na presença de benzilaminopurina (BAP) e ácido

naftalenoacético (ANA). Segmentos nodais de plantas com seis meses de idade,

procedentes da germinação in vitro foram inoculados em meio MS/2

suplementado com sacarose, ágar, e combinações de BAP e ANA. Em geral N.

mucugensis e O. albopictum tiveram maior capacidade para regenerar brotos e

mais explantes responsivos que O. mucugense. Os brotos de O. albopictum

apresentaram maior ganho de massa que as demais espécies. Na presença de

1,11 e 2,22µM de BAP e ausência de ANA, N. mucugensis apresentou maior

número de explantes responsivos. O percentual de explantes formando calos foi

maior para O. albopictum que para as outras duas espécies. Os resultados

apresentados neste trabalho revelaram que a micropropagação pode ser

empregada com sucesso para a propagação em larga escala destas espécies de

bromélias. Para induzir a formação de brotos in vitro recomenda-se a utilização

das combinações de 2,22 ou 4,44µM BAP + 1,3µM de ANA para N. mucugensis,

2,22µM de BAP + 0,65µM ANA para O. mucugense e 1,11µM de BAP + 0,65µM

ANA para O. albopictum.

59

ABSTRACT

In vitro regenerative response from stem explants of Neoregelia mucugensis

Leme , Orthophytum mucugense Wand. and Conceição and Orthophytum

albopictum Philcox, endemic bromeliads from Chapada Diamantin a - Brazil,

treated with different concentration of BAP and ANA . This study aimed to

develop an efficient protocol for in vitro regeneration from stem explants of

Neoregelia mucugensis, Orthophytum mucugense and Orthophytum albopictum in

the presence of benzylaminopurine (BAP) e naphthaleneacetic acid (NAA). Stem

segments of six-month-old plants, originated by in vitro germination, were

cultivated in MS/2 medium supplemented with sucrose, BAP and NAA

combinations and agar. In general, N. mucugensis e O. albopictum had better

capacity to regenerate shoots and more responsive explants than O. mucugense.

O. albopictum shoots showed higher dry weights than other species. N.

mucugensis explants were more responsives in the presence of BAP (1.11 e

2.22µM) and in the absence of NAA. O. albopictum showed the biggest callus

formation. The results presented in this study show that micropropagation can be

successfully for conservation purposes and on large scale propagation of these

bromeliads species. We recommend the use of 1.3µM NAA + 2.22 or 4.44µM BAP

for N. mucugensis, 2.22µM BA + 0.65µM NAA for O. mucugense and 1.11µM of

BAP + 0.65µM NAA for O. albopictum.

60

INTRODUÇÃO

As espécies Neoregelia mucugensis Leme, Orthophytum mucugense

Wand. e Conceição e Orthophytum albopictum Philcox, pertencentes à família

Bromeliaceae, são endêmicas da Chapada Diamantina, sendo encontradas no

Parque Nacional da Chapada Diamantina (N. mucugensis) e no Parque Municipal

Sempre-viva (N. mucugensis, O. mucugense e O. albopictum). Apesar de

ocorrerem em unidades de conservação, não são consideradas protegidas devido

às grandes queimadas que costumam atingir a região no período de seca (Leme

1998; Wanderley e Conceição 2006). Além disso, a espécie recém descrita O.

mucugense, assim como O. albopictum, são classificadas como vulneráveis

devido à ocorrência restrita ao município de Mucugê (Wanderley e Conceição

2006). Os três táxons estudados apresentam grande potencial ornamental devido

à coloração de suas folhas, principalmente na fase de floração. Portanto, a

propagação destas espécies é importante para a conservação bem como para o

cultivo comercial.

A propagação natural de bromélias produz um número reduzido de

plantas. Já a multiplicação in vitro possibilita a formação de um grande número de

mudas, característica essencial para a agricultura (Mercier e Kerbauy 1995,

1997). Inicialmente métodos de conservação e propagação in vitro de plantas

tiveram como alvo espécies com interesse econômico. No entanto, estas técnicas

ganharam espaço também na conservação de espécies com ocorrência restrita

ou sob risco de extinção (Arrabal et al. 2002; Carneiro et al. 1999; Malda et al.

1999; Mercier e Kerbauy 1997; Rech Filho et al. 2005). O desenvolvimento de

sistemas de micropropagação geralmente é necessário para o estabelecimento

de programas de conservação. Para a conservação in vitro de bromélias

recomenda-se a utilização de plântulas obtidas a partir de germinação in vitro,

assegurando a variabilidade genética das populações naturais (Carneiro e Mansur

2004).

Para a conservação in vitro as plantas devem manter a sua estabilidade

genética, sendo importante o desenvolvimento de métodos que reduzam a

ocorrência de mutações e a variação somaclonal. A obtenção de plantas a partir

de organogênese direta e a redução da concentração e do tempo de exposição

61

dos explantes aos reguladores de crescimento diminuem as chances de

ocorrência de alterações genéticas (Mercier e Nievola 2003).

O meio MS (Murashige e Skoog 1962) suplementado com os reguladores

benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA) é muito utilizado para a

micropropagação de bromélias, proporcionando a formação de brotos adventícios

em várias espécies (Arrabal et al. 2002; Carneiro et al. 1999; Droste et al. 2005;

Koh e Davies Jr 2001; Rech Filho et al. 2005).

O presente estudo avaliou o efeito de diferentes concentrações dos

reguladores de crescimento vegetal BAP e ANA na micropropagação de N.

mucugensis, O. mucugense e O. albopictum.

62

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

Sementes de N. mucugensis, O. mucugense e O. albopictum foram

desinfestadas com álcool 70% (1 minuto) e hipoclorito 3% (15 minutos), lavadas

em água destilada autoclavada (4x) e semeadas em frascos de 250ml contendo

50ml de ágar (7g. L-1). Após a germinação as plântulas foram mantidas em meio

MS/2, sendo transferidas para novos meios a cada 90 dias.

Plantas com seis meses de idade, procedentes de germinação in vitro

foram utilizadas como fonte de explantes. Os segmentos nodais foram obtidos

após a remoção das folhas e do ápice caulinar. Cada planta forneceu em média

três explantes a partir da divisão do caule em cilindros com aproximadamente

5mm de comprimento.

Condições de cultivo, pH e esterilização do meio de cultura.

Os experimentos foram conduzidos em laboratório sob condição de

crescimento de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 16h e densidade de fluxo de fótons

fotossínteticamente ativos de 40 µmol.m-2.s-1.

Os meios utilizados tiveram o pH ajustado para 5,8 antes da

autoclavagem, que foi realizada sob temperatura de 120ºC por 15 minutos.

Estudos prévios mostraram que o crescimento de N. mucugensis e O.

mucugense não diferiu entre plantas cultivadas em MS (Murashige e Skoog 1962)

e MS com metade da concentração de sais (MS/2) (capítulo 2). Além disso, a

utilização de meio com concentração salina reduzida tem beneficiado a

multiplicação in vitro de bromélias (Mekers 1977; Mercier e Kerbauy 1992). Por

isso, neste trabalho o meio MS/2 foi utilizado como base para todos os

tratamentos.

Cultura de explantes

Segmentos nodais foram inoculados em tubos de ensaio (25x200mm)

contendo 15ml de meio MS/2, gelificado com ágar (7g.L-1), suplementado com

sacarose (30g.L-1) e diferentes combinações de BAP (0,00; 1,11; 2,22 e 4,44µM)

e ANA (0,00; 0,33; 0,65 e 1,30µM). Os tubos foram fechados com película de

polivinilcloreto (PVC).

63

Decorridos seis meses da inoculação, sem a transferência para

subculturas, foram avaliados: o número de brotações por explante; a incorporação

de matéria seca pelos brotos (mg); o percentual de explantes que produziram

brotos e o percentual de explantes que formaram calos.

Para a avaliação da média de número de brotos produzidos por explante,

foram estabelecidas quatro classes de mensuração: (1) menos de um broto por

explante, (2) 1 a 3 brotos, (3) 4 a 6 brotos, (4) 7 a 12 brotos e (5) a formação de

mais de 12 brotos por explante.


arranjo fatorial 3x4x4 (espécies x concentrações de ANA x concentrações de

BAP) utilizando cinco repetições, sendo cada uma delas formada por ao menos

quatro tubos com um explante cada. Os resultados expressos em porcentagem

foram transformados em arco seno para a normalização da sua distribuição. Os

dados foram submetidos à análise de variância e regressão e as médias

comparadas pelo teste de Tukey. Utilizou-se o software SISVAR (v 4.3, UFLA)

para análise dos dados.

65

RESULTADOS

A formação de brotos adventícios foi iniciada entre a segunda e a quarta

semana após a inoculação dos explantes. De modo geral os brotos foram

originados diretamente do segmento nodal utilizado como explante e a formação

de calos, quando ocorreu, foi observada somente após quatro meses de cultura.

A formação direta de brotos a partir do caule já foi descrita para outras espécies

de Bromeliaceae como Cryptanthus sinuosus, Vriesea gigantea e V.

philippocoburgii (Arrabal et al. 2002; Carneiro et al. 1998; Droste et al. 2005).

A regeneração de brotos pela espécie N. mucugensis foi observada em

todas as combinações de reguladores de crescimento testadas. O. mucugense

formou em média menos de um broto por explante em 31% dos tratamentos

utilizados. Já O. albopictum apresentou em média menos de um broto por

explante quando utilizados 4,44µM de BAP na ausência de ANA. As melhores

taxas de regeneração ocorreram nas combinações de 2,22 ou 4,44µM de BAP

associado com 1,30µM de ANA para N. mucugensis (7 a 12 brotos) e 2,22µM de

BAP com 0,65µM de ANA para O. mucugense (7 a 12 brotos). Explantes de O.

albopictum regeneraram maior número de brotos em meios suplementados com

1,11µM de BAP associado a 0,33; 0,65 ou 1,30 µM de ANA (Tabela 3.1).

A avaliação comparativa demonstrou que em geral N. mucugensis (4 a 6

brotos por explante) e O. albopictum (4 a 6 brotos por explante) regeneram brotos

que O. mucugense (1 a 3 brotos por explante). Os brotos de N. mucugensis

(1,95mg) e de O. mucugense (1,11mg) apresentaram em geral menor ganho em

matéria seca que os brotos de O. albopictum (2,91mg). A comparação das três

espécies quanto à capacidade dos explantes em regenerar brotos mostra que N.

mucugensis (54,6%) e O. albopictum (50,8%) não diferem entre si, mas ambos

apresentaram percentuais significativamente mais altos que O. mucugense

(39,0%). O percentual de explantes formando calos em média foi menor para N.

mucugensis (10,2%) e O. mucugense (8,4%) que para O. albopictum (20,7%)

(Tabela 3.2).

66

TABELA 3.1 – Valores médios para número de brotos p or explante de O. albopictum, O. mucugense e N. mucugensis em função das espécies e das concentrações de BAP e ANA (µM).

Número de brotosZ

BAP (µM) ANA (µM) N. mucugensis O. mucugense O. albopictum

0,00 2 bW 1 c 2 cdW

0,00 0,33 3 b 2 bc 2 cd

0,65 2 b 1 c 2 cd

1,30 3 b 1 c 2 cd

0,00 3 b 1 c 2 cd

1,11 0,33 3 b 2 bc 4 ab

0,65 3 b 2 bc 5 a

1,30 3 b 3 b 4 ab

0,00 3 b 1 c 2 cd

2,22 0,33 3 b 2 bc 3 bc

0,65 2 b 4 a 3 bc

1,30 4 a 3 b 3 bc

0,00 2 b 2 bc 1 d

4,44 0,33 3 b 2 bc 3 bc

0,65 3 b 3 b 3 bc

1,30 4 a 2 bc 2 cd

Z – O número de brotos está apresentado em classes de mensuração. (1) menos de um broto por explante, (2) 1 a 3 brotos, (3) 4 a 6 brotos, (4) 7 a 12 brotos e (5) a formação de mais de 12 brotos por explante. W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

TABELA 3.2 – Valores médios por espécie para número de brotos, matéria seca dos brotos regenerados por explante, porcentagem de explantes que formaram brotos e porcentagem de explantes que formaram calos.

Número de brotosZ Matéria seca dos

brotos (mg/explante) Explantes com

brotos (%) Explantes com

calos (%)

N. mucugensis 3 aW 1,95 b 54,6 a

10,2 b

O. mucugense 2 b 1,11 c 39,0 b 8,4 b

O. albopictum 3 a 2,91 a 50,8 a 20,7 a

Z – O número de brotos está apresentado em classes de mensuração. (2) 1 a 3 brotos e (3) 4 a 6 brotos por explante. W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

67

A avaliação da incorporação de matéria seca por brotos de N. mucugensis

obteve variações insignificantes para os diferentes tratamentos utilizados (Figura

3.1A). A associação de 2,22µM de BAP com 0,65µM de ANA promoveu o maior

ganho de matéria seca por brotos de O. mucugense. A linha de tendência revela

que nesta concentração de BAP, menores ou maiores taxas de ANA promovem

uma menor incorporação de matéria seca (Figura 3.1B). Ainda com relação à

incorporação de massa pelos brotos de O. mucugense, na ausência de BAP, o

aumento da concentração de ANA favoreceu o acúmulo de matéria seca. A

análise de regressão deste tratamento mostrou uma tendência linear, sugerindo

que concentrações de ANA maiores que as avaliadas neste trabalho podem

resultar em um ganho de matéria seca maior do que o observado para a

associação de 2,22µM de BAP com 0,65µM de ANA (Figura 3.1B). Os brotos de

O. albopictum adquiriram mais matéria seca em meio suplementado com 1,11µM

de BAP. A análise de regressão para este tratamento mostrou uma curva

quadrática que aumenta até aproximadamente 0,65µM de ANA e depois começa

a decrescer (Figura 3.1C).

O maior número de explantes de N. mucugensis responsivos à formação

de brotos foi obtido para a estimulação com 1,11 ou 2,22µM de BAP na ausência

de ANA. No entanto, a análise de regressão mostra que na presença de BAP

(1,11; 2,22 ou 4,44µM) existe uma tendência à elevação do percentual de

explantes responsivos com a utilização de concentrações de ANA maiores que

1,30µM (Figura 3.2A). O percentual de explantes que regeneraram brotos de O.

mucugense foi maior na concentração de 2,22µM de BAP. A curva quadrática

atinge maiores taxas de explantes responsivos entre as concentrações de 0,65 e

1,30µM de ANA. No entanto, a presença de 1,11µM de BAP mostra uma

tendência ao aumento do percentual de explantes formadores de brotos,

sugerindo que a utilização de ANA em concentrações maiores que 1,30µM

associadas a 1,11µM de BAP podem resultar no aumento da proporção de

explantes responsivos (Figura 3.2B). Os melhores percentuais de explantes

responsivos à formação de brotos para O. albopictum foram obtidos ao utilizar

BAP na concentração de 1,11µM. A análise de regressão obteve uma curva

quadrática que atinge o seu pico em uma concentração próxima a 0,65µM de

ANA (Figura 3.2C).

68

Figura 3.1 – Valores médios estimados para matéria seca dos brotos obtidos a

partir de explantes caulinares de N. mucugensis (A), O. mucugense (B) e O.

albopictum (C) em função de diferentes concentrações de ANA e BAP. Linhas de

tendência com coeficiente de correlação inferior a 70% não foram mostradas nos

gráficos. **significativo ao nível de 1% de probabilidade, *significativo ao nível de

5% de probabilidade, nsnão significativo ao nível de 5% de probabilidade.

Mat

éria

sec

a do

s br

otos

(m

g)

ANA (µM)

Y (�) = 2,087x + 0,368 R2 = 85%*

Y (�) = -1,1748x2 + 1,9018x + 0,2398 R2= 70%ns

B O. mucugense

Y (�) = -4,8585x2 + 7,899x - 0,0484 R2 = 85%ns

Y (�) = 0,4448x + 0,202 R2= 89%ns

B

0

2

4

6

8

10

0 0,325 0,65 0,975 1,3

C

0

2

4

6

8

10

0 0,325 0,65 0,975 1,3

Y (�) = -7,7483x2 + 10,527x + 1,2892 R2 = 96%**

Y (�) = -15,346x2 + 22,864x + 0,3582 R2= 100%**

Y (�) = -6,582x2 + 9,8961x + 0,5415 R2 = 98%*

C O. albopictum

A N. mucugensis

Y (�) = 1,738x + 0,474 R2= 83%ns

A

0

2

4

6

8

10

0 0,325 0,65 0,975 1,3

BAP 0 BAP 1,11

BAP 2,22 BAP 4,44

69

Figura 3.2 – Valores médios estimados para o percentual de explantes de N.

mucugensis (A), O. mucugense (B) e O. albopictum (C) que regeneraram brotos

em função de diferentes concentrações de ANA e BAP. Linhas de tendência com

coeficiente de correlação inferior a 70% não foram mostradas nos gráficos.

**significativo ao nível de 1% de probabilidade, *significativo ao nível de 5% de

probabilidade, nsnão significativo ao nível de 5% de probabilidade.

% e

xpla

ntes

com

bro

tos

Y (�) = 24,316x + 28,12 R2= 76%*

B O. mucugense

Y (�) = -41,399x2 + 88,655x + 22,135 R2 = 100%*

ANA (µM)

B

0

20

40

60

80

0 0,325 0,65 0,975 1,3

Y (�) = 37,439x2 - 63,86x + 79,309 R2= 95%ns

A N. mucugensis

Y (�) = 74,233x2 - 111,82x + 81,682 R2 = 84,5%**

Y (�) = 18,989x + 43,2 R2= 88%*

A

0

20

40

60

80

0 0,325 0,65 0,975 1,3

BAP 0 BAP 1,11

BAP 2,22 BAP 4,44

Y (�) = -38,515x2 + 47,287x + 34,464 R2 = 74%ns

Y (�) = -57,881x2 + 107,73x + 30,573 R2= 100%**

C O. albopictum

Y (�) = -32,06x2 + 51,958x + 40,227 R2 = 92%ns

Y (�) = -75,74x2 + 124,92x + 22,2 R2= 86%**

C

0

20

40

60

80

0 0,325 0,65 0,975 1,3

70

N. mucugensis apresentou baixos percentuais de formação de calos,

sendo observada uma tendência para maiores percentuais utilizando 1,11 e

4,44µM de BAP associado à concentrações de ANA superiores à 1,30µM (Figura

3.3A). O. mucugense assim como N. mucugensis, apresentou baixos percentuais

de explantes formadores de calos, mas a análise de regressão mostra que nas

concentrações de 1,11 e 4,44µM de BAP existe uma tendência de crescimento

destes percentuais, podendo atingir taxas mais elevadas em concentrações de

ANA superiores a 1,30µM (Figura 3.3B). O maior percentual de explantes com

calos na espécie O. albopictum foi obtido ao utilizar 1,11µM de BAP. Sob este

estímulo, a linha de tendência tem comportamento quadrático, crescendo até uma

concentração de ANA próxima a 1µM (Figura 3.3C).

71

Figura 3.3 – Valores médios estimados para percentual de explantes de N.

mucugensis (A), O. mucugense (B) e O. albopictum (C) que originaram calos em

função de diferentes concentrações de ANA e BAP. Linhas de tendência com

coeficiente de correlação inferior a 70% não foram mostradas nos gráficos.

**significativo ao nível de 1% de probabilidade, *significativo ao nível de 5% de

probabilidade, ns não significativo ao nível de 5% de probabilidade.

ANA (µM)

% e

xpla

ntes

com

cal

os

Y (�) = 19,042x + 2,32 R2= 95%**

B O. mucugense

Y (�) = -60,032x2 + 80,618x + 0,6382 R2 = 99%**

Y (�) = 18,356x - 3,24 R2= 75%*

B

0

20

40

60

0 0,325 0,65 0,975 1,3

Y (�) = 0,7378x2 - 2,9451x + 24,098 R2 = 80%ns

Y (�) = -3,9917x2 + 13,476x + 36,244 R2= 100%*

A N. mucugensis

Y (�) = -4,8587x2 + 28,51x + 20,947 R2 = 98,5%*

Y (�) = -5,4194x2 + 26,25x + 35,365 R2= 100%**

A

0

20

40

60

0 0,325 0,65 0,975 1,3

BAP 0 BAP 1,11

BAP 2,22 BAP 4,44

Y (�) = 0,022x - 1,2 R2 = 94%*

Y (�) = -75,783x2 + 141,12x - 0,2891 R2= 100%**

C O. albopictum

Y (�) = -35,46x2 + 77,248x + 5,6291 R2 = 72%**

C

0

20

40

60

0 0,325 0,65 0,975 1,3

72

DISCUSSÃO

Este trabalho descreve um protocolo eficiente de regeneração in vitro para

N. mucugensis, O. mucugense e O. albopictum utilizando explantes nodais na

presença de BAP e ANA.

Os resultados obtidos a partir da estimulação com BAP e ANA estão de

acordo com sistemas de micropropagação estabelecidos para outras espécies

(Mercier e Kerbauy 1997). Os dados apresentados possibilitam estabelecer que a

associação de 2,22 ou 4,44µM de BAP com 1,30µM de ANA tem a capacidade de

promover a regeneração de 7 a 12 brotos por explante de N. mucugensis. Em O.

mucugense a interação de 2,22µM de BAP com 0,65µM de ANA também induz a

formação de 7 a 12 brotos por explante, enquanto que para O. albopictum 1,11µM

de BAP associado com 0,65µM de ANA promove a formação de mais 12 novos

brotos por explante (Tabela 3.1). Estas mesmas associações entre BAP e ANA

demonstraram bons resultados para o aumento da biomassa dos brotos (Figura

3.1) bem como para o percentual de explantes responsivos à formação de brotos

para cada uma das espécies (Figura 3.2).

Ocorre que o percentual de explantes que originaram calos também foi

alto (60%) para o tratamento de O. albopictum com 1,11µM de BAP associado

com 0,65µM de ANA (Figura 3.3). A formação de calos é muito importante para

alguns procedimentos da cultura in vitro de plantas como a embriogênese indireta

(George 1993). No entanto, para a conservação de germoplasma, o uso de

sistemas de regeneração não associados com a formação de calos é

recomendado por minimizar o risco de alterações genéticas (Villalobos et al.

1991). A ocorrência de calos para as três espécies estudadas só foi observada

após quatro meses de cultura, período no qual mais de 85% dos brotos já haviam

sido formados. Desta forma é possível controlar a calogênese manipulando o

tempo de cultura.

Em relação ao número de brotos, os valores obtidos neste trabalho foram

iguais ou superiores aos encontrados para outras espécies de bromélias. Droste

et al. (2005) obtiveram 40 a 68% de explantes de Vriesea gigantea responsivos à

formação de brotos, sendo observados até 3,14 brotos por explante. Já a V.

philippocoburgii apresentou 100% de explantes responsivos e em média 4,3

brotos por explante. Mercier e Kerbauy (1994) estimularam a formação de 7,0

73

brotos por plântula de V. hieroglyphica. Brotos de Vriesea reitzii geraram em

média 4,0 a 4,5 brotos adventícios por explante após três meses de cultura (Rech

Filho et al. 2005).

Alguns estudos apresentaram taxas de regeneração superiores às

encontradas para O. albopictum, O. mucugense e N. mucugensis. Mercier e

Kerbauy (1992) induziram a formação de 22 brotos por plântula de V. fosteriana.

Explantes de Cryptanthus sinuosus regeneraram em média 30 brotos (Carneiro et

al. 1998). Em estudos realizados com a espécie Neoregelia cruenta Carneiro et al.

(1999) não obtiveram sucesso na indução da formação de brotos a partir de

segmentos do caule. No entanto, uma alta taxa de formação de brotos foi

observada estimulando folhas de Cryptanthus sinuosus (50 brotos/explante) e

Neoregelia cruenta (60 brotos/explante) com BAP (Carneiro et al. 1998, 1999).

Apesar das altas taxas de regeneração observadas nestes sistemas de

micropropagação, é importante considerar que o BAP foi utilizado em altas

concentrações, aumentando a possibilidade de variação somaclonal e outras

instabilidades genéticas que podem comprometer a conservação in vitro (Mercier

e Nievola 2003).

Neste sentido, Arrabal et al. (2002) avaliaram a micropropagação de

Cryptanthus sinuosus na ausência ou em baixas concentrações de BAP e ANA.

O número de brotos regenerados foi maior na ausência de reguladores e na

combinação de 2,2µM de BAP com 0,05µM de ANA (cerca de 22 a 25 brotos por

explante). Estes resultados foram obtidos após seis meses de cultura em meio

líquido, sendo realizadas subculturas a cada dois meses. A utilização de meio

semi-sólido, sem a transferência para subculturas, condição semelhante à

avaliada para O. albopictum, O. mucugense e N. mucugensis, promove uma

redução de 66% no número de brotos formados após seis meses de cultura.

Portanto, a transferência para subculturas a cada um ou dois meses deve otimizar

a regeneração de brotos nas espécies aqui estudadas, o que seria adequado para

a propagação em escala comercial.

No entanto, o aumento do tempo das subculturas é importante para

projetos de conservação in vitro a curto e médio prazo, que são beneficiados pelo

retardamento do crescimento das plantas, pois assim são reduzidos também o

risco de contaminação e as despesas com manutenção (Villalobos et al. 1991).

Por isso neste trabalho as avaliações foram encerradas após seis meses de

74

cultivo e não foram realizadas transferências para subculturas neste intervalo de

tempo.

Os resultados aqui apresentados revelam que a micropropagação pode

ser empregada com sucesso para a propagação em larga escala destas espécies

de bromélias. Recomenda-se a utilização das combinações de 2,22 ou 4,44µM

BAP + 1,3µM de ANA para N. mucugensis, 2,22µM de BAP + 0,65µM ANA para

O. mucugense e 1,11µM de BAP + 0,65µM ANA para O. albopictum.

A produção de mudas através de organogênese direta deve utilizar as

combinações de reguladores supra citadas em culturas mantidas por um período

máximo de quatro meses, visto que após esse tempo foi observado o início da

formação de calos, principalmente para O. albopictum.

A utilização dos calos formados após quatro meses de cultura pode

favorecer a produção de mudas para comercialização, otimizando a produção de

mudas por organogênese indireta. Neste caso será necessária a realização de

novos trabalhos que estabeleçam protocolos adequados à regeneração de brotos

a partir dos calos bem como que avaliem o potencial ornamental e a produtividade

das plantas obtidas.

75





11: 1081-1089.







CARNEIRO, L.A.; CÂNDIDO, M.S.D.; ARAUJO, R.F.G.; FONSECA, M.H.P.B.;

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77


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78

CAPÍTULO 4

Efeito da ventilação in vitro na aclimatização de plantas micropropagadas de Orthophytum mucugense Wand. e Conceição, uma bromélia endêmica da Bahia - Brasil.4

4 Este capítulo será submetido à revista Plant Cell Tissue and Organ Culture

79

RESUMO Orthophytum mucugense é a mais nova espécie de Orthophytum descrita. Com

distribuição restrita ao município de Mucugê – Chapada Diamantina é classificada

na categoria vulnerável, o que justifica a realização de trabalhos que dêem

suporte à preservação da espécie. Este estudo avalia a influência da forma de

fechamento dos tubos e de diferentes concentrações de sacarose na

aclimatização de plantas da espécie O. mucugense propagadas in vitro. Brotos

micropropagados foram transferidos para MS/2 acrescido de ágar (7g.L-1), carvão

ativado (1g.L-1) e diferentes concentrações de sacarose (0, 15 e 30g.L-1). Após 30

dias as plantas foram submetidas a dois tipos de fechamento de tubos: película

PVC e algodão. Na ocasião da transferência para o viveiro as plantas foram

avaliadas quanto à perda de água e foram coletados os tecidos para a realização

das análises histológicas. No viveiro, as plantas foram transferidas para substrato

(vermiculita + terra) e cobertas com garrafas ¨PET¨, as quais foram destampadas

após 30 dias e retiradas após 40 dias. O selamento dos recipientes de cultura

com algodão reduziu a perda de água em 50% e possibilitou o desenvolvimento

da parede celular lignificada de células da epiderme adaxial e abaxial. A

concentração de sacarose não influenciou de forma significativa à sobrevivência

de plantas procedentes de tubos fechados com algodão. A restrição de sacarose

no meio de cultura prejudicou a sobrevivência de plantas provenientes de tubos

fechados com PVC.

80

ABSTRACT Effect of in vitro ventilation in the acclimatization of micropropaga ted plants

of Orthophytum mucugense, an endemic bromeliad from Bahia – Brazil.

Orthophytum mucugense is the newest described species of Orthophytum. They

have restricted occurrence in Mucugê, Bahia – Brazil, vindicating conservation

studies about them. The purpose of the present study was to evaluate the

influence of different tubes closing forms and the effect of sucrose in the

acclimatization of micropropagated O. mucugense shoots. Micropropagated

shoots were transferred to MS/2 supplemented with agar (7g.L-1), activated

charcoal (1g.L-1) and different concentrations of sucrose (0, 15 e 30g.L-1). After 30

days, the shoots were submitted to two types of tubes closing: PVC film and

cotton. When transferred to the nursery, water plant loss was evaluted and plant

tissues were collected for leaf anatomy analyses. In the nursery, plants were

transferred to substrates (vermiculite + organic soil) and covered with “PET”

bottles, which were opened after 30 days and were removed after 40 days. The

use of cotton for sealing culture containers reduced the loss of water in 50% and it

made possible the development of the lignified cellular wall of adaxial and abaxial

epidermis. The concentration of sucrose did not show significant influence on the

survival of cotton sealed tube plants. The restriction of sucrose in the culture

medium decreased the PVC sealed tubes plant’s survival.

81

INTRODUÇÃO

O Brasil abriga quase metade das espécies de bromélias conhecidas. O

Leste do país é considerado um centro de desenvolvimento e dispersão da família

contendo um grande número de espécies endêmicas (Leme e Marigo 1993; Leme

1998).

Orthophytum Beer é um gênero exclusivamente brasileiro, composto por

espécies com inflorescências sésseis ou providas de escapo (Smith e Downs

1983; Wanderley 1990). Segundo Wanderley e Conceição (2006) as espécies de

Orthophytum com inflorescência séssil, ocorrentes na Chapada Diamantina são

muito valorizadas como plantas ornamentais devido à coloração de suas brácteas

e folhas, geralmente vermelhas na antese. Esta característica confere às espécies

importante papel ecológico pela capacidade de atrair beija-flores.

Orthophytum mucugense Wand. e Conceição é a mais nova espécie de

Orthophytum descrita. Os indivíduos deste táxon crescem formando grandes

populações em paredões rochosos localizados nas margens de rios, constituindo

uma espécie típica de locais sombreados e úmidos. Os relatos acerca da sua

distribuição geográfica revelam que a sua ocorrência está restrita ao município de

Mucugê – Chapada Diamantina. Apesar de ser encontrada em uma Unidade de

Conservação Municipal e de formar grandes populações, a ocorrência restrita a

uma única localidade leva O. mucugense a categoria vulnerável, fato que

demonstra a importância da realização de trabalhos de preservação com esta

nova espécie (Wanderley e Conceição 2006).

Técnicas de cultura de tecidos têm sido aplicadas na conservação e

multiplicação de genótipos específicos de bromélias. A micropropagação é muito

importante para biofábricas por proporcionar a rápida propagação,

disponibilizando uma grande quantidade de mudas, com características

homogêneas, independentemente da estação do ano (Arrabal et al. 2002;

Carneiro et al. 1999; Carneiro e Mansur, 2004; Droste et al. 2005; Endres et al.

2002; Guimarães et al. 1999; Malda et al. 1999; Mercier e Kerbauy 1992, 1997,

1998).

Plantas procedentes de propagação in vitro podem apresentar problemas

na adaptação para o ambiente ex vitro, resultando freqüentemente num baixo

82

percentual de sobrevivência. A incapacidade de controlar a perda de água por

transpiração a partir da superfície foliar, bem como o mau funcionamento dos

estômatos de plantas cultivadas in vitro, afetam a capacidade de adaptação ao

ambiente externo (Seelye et al. 2003). Estas alterações que acarretam a

inabilidade das plantas em manter o seu conteúdo de água parecem ser

influenciadas pelo acúmulo de gases, como etileno, mas principalmente pelo

elevado teor de umidade presente no recipiente utilizado para o cultivo in vitro

(Buddendorf-Jooten e Woltering 1996; De Proft et al. 1985; Zobayed et al. 1999).

Assim, um modelo de cultivo que possibilite o aumento das trocas gasosas tem

facilitado a fase de aclimatização das mudas (Jackson 2003; Seelye et al. 2003).

A ventilação dos frascos de cultura obtida através do uso de tampas

permeáveis aumenta as trocas gasosas e, conseqüentemente, as taxas de

transpiração in vitro das plantas (Lai et al. 2005; Zobayed et al. 1999). A aeração

dos frascos estimula o desenvolvimento de adaptações contra a perda de água

ainda no ambiente de laboratório, resultando na produção de plantas com melhor

controle da transpiração (Santamaria et al. 2000). Usando essa estratégia

Trevisan e Mendes (2005) obtiveram um aumento na alongação de brotos de

maracujá. Outros trabalhos demonstraram efeitos positivos das trocas gasosas

sobre a propagação in vitro de mamão (Lai et al. 1998), eucalipto (Zobayed et al.

2000a), batata doce (Zobayed et al. 2000b), batata (Zobayed et al. 2001) e maçã

(De Klerk 2002). Mills e Tal (2004), avaliando a tolerância à salinidade em tomate,

demonstraram que plantas crescendo sob condições in vitro em frascos

ventilados apresentaram comportamento semelhante ao das plantas cultivadas

em ambiente externo.

O meio de cultura utilizado para a micropropagação costuma conter

açúcar em quantidade suficiente para possibilitar o crescimento heterotrófico dos

brotos. Além disso, o típico ambiente de cultivo in vitro é caracterizado por

apresentar um grande acúmulo de substâncias, decorrente da ocorrência

reduzida de trocas gasosas entre o recipiente de cultivo e o meio externo, de

forma que existe uma grande diferença entre estes ambientes (Kozai 1991). A

aproximação entre as características de cultura in vitro e as características

ambientais têm demonstrado melhorar o desenvolvimento das plantas. Kozai et

al. (1991) destacam a possibilidade de estimular a fotoautotrofia in vitro, reduzindo

a quantidade de carboidrato fornecido e aumentando a intensidade luminosa do

83

ambiente de cultivo. Alguns sistemas de micropropagação fotoautotróficos que

envolvem a utilização de meios sem açúcar, ventilação forçada e exposição a

altas intensidades luminosas têm mostrado resultados positivos, proporcionando

um melhor desempenho das mudas no que tange ao crescimento, à qualidade e à

sobrevivência (Zobayed et al. 2000a; Xiao e Kozai 2004).

O presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da forma de

fechamento dos tubos e de diferentes concentrações de sacarose sobre a

aclimatização de plantas da espécie O. mucugense propagadas in vitro.

84

MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram inicialmente conduzidos em laboratório sob

condição de crescimento de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 16h e densidade de fluxo de

fótons fotossínteticamente ativos de 40 µmol.m-2.s-1 e posteriormente transferidos

para viveiro com 70% de luminosidade, obtida mediante o uso de tela sombrite de

30%.

Multiplicação in vitro

A multiplicação in vitro do material foi realizada em meio MS (Murashige e

Skoog 1962) com metade da concentração salina (MS/2), suplementado com

sacarose (30g.L-1), BAP (2,2 µM), ANA (0,65 µM) e gelificado com ágar (7g.L-1). O

pH foi ajustado para 5,8 antes da autoclavagem. A esterilização foi realizada em

autoclave sob temperatura de 120ºC por 15 minutos. Como explantes foram

utilizados segmentos de caule de Orthophytum mucugense procedentes de

plantas germinadas in vitro com seis meses de idade. Cada explante foi inoculado

em um tubo de ensaio (25x200mm) com 15 ml de meio de cultura (capítulo 3).

Enraizamento

Os brotos produzidos in vitro com parte aérea medindo entre 1 e 2cm de

comprimento foram transferidos para meio de cultura MS/2, suplementado com

diferentes concentrações de sacarose (0, 15 ou 30g.L-1) e carvão ativado (1,0 g.L-

1) e gelificado com agar (7g.L-1). O pH foi ajustado para 5,8 antes da

autoclavagem (120ºC por 15 minutos). Foi utilizada uma brotação para cada tubo

de ensaio (25x200mm) com 15 ml de meio de cultura. Os tubos foram fechados

com película de polivinilcloreto (PVC) e mantidos em sala de crescimento durante

30 dias.

Pré-aclimatização

A pré-aclimatização foi realizada na sala de crescimento, consistindo na

substituição da película de PVC por um tampão de algodão (autoclavado à 120ºC

por 15 minutos) ou por uma nova película de PVC. Para cada uma das

concentrações de sacarose utilizadas, 50% dos tubos foram novamente vedados

85

com PVC e os outros 50% com algodão. Os tubos foram mantidos em sala de

crescimento por 30 dias.

Para a determinação da água perdida por evaporação foram realizadas

análises nas plantas após a pré-aclimatização. As plantas retiradas dos tubos de

ensaio foram pesadas no momento da retirada e após 30 e 60 minutos de

exposição às condições ambientais. Foi calculado o percentual de redução de

peso relacionando o peso obtido após 30 e 60 minutos com o peso inicial de cada

indivíduo por metodologia baseada em Mills e Tal (2004).

Aclimatização

A aclimatização foi realizada em viveiro com 70% de luminosidade. As

plantas foram transferidas para substrato composto de vermiculita + terra (1:1) e

cobertas com garrafas “PET” (2L) as quais foram destampadas após 30 dias e

retiradas, após 40 dias (Figura 4.1).

A porcentagem de sobrevivência foi determinada pela contagem do

número de plantas vivas em relação ao total de plantas submetidas à

aclimatização. Essa avaliação foi realizada 100 dias após a transferência para o

viveiro.

Figura 4.1 – Aclimatização de Orthophytum mucugense. A) Plantas cobertas com

garrafas “PET” tampadas - 15 dias após transferência para viveiro; B) Plantas

cobertas com garrafas “PET” sem tampas - 30 dias após transferência para

viveiro.

A B

86

Análise histológica

Amostras de tecido foliar foram coletadas no dia da transferência das

plantas para o viveiro (1o dia) e 40 dias depois, quando as garrafas “PET” foram

removidas (40o dia). Em cada folha foram tomadas as medidas da espessura da

parede celular lignificada das células da epiderme adaxial e abaxial. As medidas

foram tomadas da célula da epiderme localizada imediatamente acima (adaxial)

ou imediatamente abaixo (abaxial) da nervura central da folha, bem como das

quatro células mais próximas à célula central, duas à direita e duas à esquerda.

As amostras foram retiradas da porção mediana, entre o bordo e a região

central do limbo da primeira folha jovem recém-expandida do ápice da planta. O

material fixado em álcool 70% foi seccionado transversalmente com auxílio de

lâmina de barbear. Os cortes foram clarificados com hipoclorito de sódio a 20%,

lavados em água destilada, corados com Azul de Astra 1% - Safranina 1%, 9:1

(Bukatsch 1972 modificado por Kraus e Arduin 1997) e montados em glicerina

50%. As imagens foram capturadas e avaliadas com o auxílio do software Axion

Vision (v 3.0, Zeiss). A presença de lignina foi confirmada com floroglucina

clorídrica (Jensen 1962).

Delineamento e análise estatística


arranjo fatorial 3x2 (sacarose x selamento) com cinco repetições. Nos

experimentos in vitro cada repetição foi formada por cinco tubos. Para avaliar a

sobrevivência, cada repetição agrupou 10 plantas enquanto nos estudos

histológicos, cada repetição consiste nas medidas de espessura da parede celular

de cinco células de cada folha.

Todos os experimentos descritos foram repetidos pelo menos duas vezes.

Os resultados avaliados representam a média dos dois experimentos e foram

submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey

através do uso do software SISVAR (v 4.3, UFLA).

88

RESULTADOS

A interação “tipo de selamento x concentração de sacarose” influenciou

significativamente a redução de peso fresco das plantas após 30 minutos de

exposição às condições ambientais. A maior redução ocorreu na concentração de

15g.L-1 de sacarose com tubos vedados com PVC (14,7%), contrastando com a

menor redução de peso fresco observada para as plantas que cresceram em

tubos vedados com algodão (7,1 a 8,0%). A redução de peso obtida quando os

tubos foram fechados com PVC não diferiu significativamente em meio sem

sacarose (11,5%) ou com 30g.L-1 de sacarose (12,9%), sendo que estes dois

tratamentos demonstraram menor redução de peso do que o tratamento com 15

g.L-1 de sacarose (14,7%), em tubos também vedados com PVC, após 30 minutos

de exposição ao ambiente. Para tubos fechados com algodão, não foram

observadas diferenças significativas em relação à concentração de sacarose,

sendo que os três tratamentos demonstraram uma redução de peso (7,6%)

bastante inferior aos tratamentos que utilizaram o PVC para vedar os tubos

(13,0%), após 30 minutos de exposição ao ambiente. A redução de peso fresco

em todos os tratamentos foi maior nos primeiros 30 minutos de exposição às

condições ambientais (Tabela 4.1).

Tabela 4.1 – Valores médios para redução de peso fr esco (%) após 30 minutos, entre 30 e 60 minutos, e redução total 60 minutos depois da ex posição às condições ambientais, em função do tipo de selamento e da concentração de sa carose utilizada.

Até 30 minutosZ entre 30 e 60 minZ TotalZ Concentração de Sacarose (g.L-1)

PVC algodão PVC algodão PVC algodão

0 11,5 bW AV 7,7 a B 7,4 a A 2,9 b B 18,9 b A 10,7 a B

15 14,7 a A 7,1 a B 7,8 a A 4,1 a B 22,5 a A 11,2 a B

30 12,9 b A 8,0 a B 6,3 b A 3,0 b B 19,1 b A 11,0 a B

média 13,0 A 7,6 B 7,2 A 3,4 B 20,2 A 10,9 B

Z – Médias originais. A estatística foi realizada em médias transformadas em arco seno. W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada variável, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

89

Entre 30 e 60 minutos de exposição às condições ambientais foi

observada em média uma redução de mais 7,2% em relação ao peso inicial para

as plantas provenientes de tubos vedados com PVC enquanto que para a

vedação com algodão essa redução foi de apenas 3,4% em relação ao peso

inicial. A redução total de peso fresco após 60 minutos de exposição ao ambiente

demonstra que as plantas provenientes de tubos vedados com algodão (10,9%)

tiveram uma redução de peso fresco aproximadamente 50% menor que as

plantas oriundas dos tubos fechados com PVC (20,2%) (Tabela 4.1).

A combinação de concentração de sacarose e tipo de selamento produziu

efeitos positivos na redução de peso por transpiração. Tubos tampados com

algodão em qualquer uma das concentrações de sacarose utilizadas mostram

uma redução de peso significativamente inferior que as plantas procedentes de

tubos fechados com PVC em todos os momentos de avaliação. A redução de

peso observada entre 30 e 60 minutos para plantas provenientes de tubos

selados com algodão demonstrou ser maior na concentração intermediária de

sacarose (15g.L-1). Já os tratamentos vedados com PVC apresentaram maior

redução de peso fresco tanto após 30 minutos como na avaliação total quando

utilizada a concentração de 15 g.L-1 de sacarose. Ainda considerando os tubos

fechados com PVC, entre 30 e 60 minutos as concentrações de 0 e 15 g.L-1 de

sacarose promoveram a maior redução de peso fresco (Tabela 4.1).

As análises histológicas realizadas em folhas coletadas no 40o dia após a

transferência das plantas para o ambiente mostraram que a interação “tipo de

selamento x concentração de sacarose” foi significativa no que se refere a

espessura da parede lignificada das células da epiderme adaxial e abaxial. As

maiores espessuras foram observadas para as células da epiderme adaxial

(9,95µm) e abaxial (8,53µm) de folhas procedentes de tubos vedados com

algodão. Nestas situações, a concentração de sacarose não influenciou de forma

significativa na espessura da parede celular. As folhas de plantas procedentes de

tubos tampados com PVC apresentaram a parede lignificada de células da

epiderme adaxial e abaxial menos espessas (7,39 e 6,81µm respectivamente) que

as procedentes de tubos fechados com algodão. As células da epiderme adaxial e

abaxial apresentaram tendência semelhante, sendo observado um aumento na

espessura da parede celular nas concentrações de 15 (8,82 e 8,27µm) e 30g.L-1

90

(8,82 e 7,10µm) de sacarose, quando comparados com o tratamento sem

sacarose (4,54 e 5,07µm) (Tabela 4.2 e Figura 4.2).

Tabela 4.2 – Valores médios para espessura da pared e lignificada ( µµµµm) de células da epiderme adaxial e abaxial de folhas de Orthophytum mucugense no dia da remoção do laboratório (1 o dia) e no 40 o dia após a transferência para o ambiente em função do tipo de selamento e da concentração de sacarose utilizada.

1o dia 40o dia Concentração de Sacarose (g.L-1)

Algodão PVC Algodão PVC

Adaxial

0 0,00 cW AV 0,00 A 9,68 a A 4,54 b B

15 1,04 b A 0,00 B 9,76 a A 8,82 a A

30 4,22 a A 0,00 B 10,41 a A 8,82 a B

Média 1,75 A 0,00 B 9,95 A 7,39 B

Abaxial

0 0,00 c A 0,00 A 8,01 a A 5,07 b B

15 2,35 b A 0,00 B 8,06 a A 8,27 a A

30 5,79 a A 0,00 B 9,51 a A 7,10 a B

Média 2,71 A 0,00 B 8,53 A 6,81 B

W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada dia, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

Já as análises realizadas em folhas coletadas no dia da transferência das

plantas para o ambiente (1o dia) mostraram que as células da epiderme foliar

adaxial e abaxial de plantas crescidas em tubos vedados com PVC não

apresentaram parede celular lignificada em nenhuma das concentrações de

sacarose avaliadas. Foi observada uma correlação positiva entre a concentração

de sacarose e a espessura da parede celular lignificada em plantas procedentes

de tubos fechados com algodão: na ausência de sacarose não foi observado o

espessamento da parede celular, no tratamento com 15g.L-1 de sacarose foi

observado um pequeno espessamento da parede de células da epiderme adaxial

e abaxial (1,04 e 2,35µm) e na concentração mais alta de sacarose (30g.L-1)

foram encontradas as paredes celulares mais espessas (4,22 e 5,78µm) para

folhas formadas ainda no ambiente de laboratório (Tabela 4.2 e Figura 4.2).

92

A avaliação da sobrevivência das plantas aclimatizadas, após 100 dias de

transferência para o viveiro mostrou que houve interação significativa entre

selamento e sacarose (Tabela 4.3). Plantas provenientes de tubos fechados com

algodão apresentaram percentual de sobrevivência maior (95%) do que as

provenientes de tubos vedados com PVC (80%). Relacionando a sobrevivência

com a concentração de sacarose utilizada ainda na fase in vitro, os resultados

mostram que a presença de sacarose favorece a sobrevivência quando as plantas

são provenientes de tubos selados com PVC. Já as plantas procedentes de tubos

fechados com algodão não apresentaram diferenças significativas na

sobrevivência quando comparadas quanto à concentração de sacarose (Tabela

4.3).

Tabela 4.3 – Valores médios para sobrevivência de Orthophytum mucugense 100 dias após a transferência para o viveiro, em função do tipo d e selamento e da concentração de sacarose utilizada no experimento in vitro.

% sobrevivênciaZ Concentração de Sacarose (g.L-1)

PVC algodão

0 54 bW BV 92 a A

15 92 a A 96 a A

30 94 a A 100 a A

média 80 B 95 A

Z – Médias originais. A estatística foi realizada em médias transformadas em arco seno. W – Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. V – Médias seguidas pela letra maiúscula em cada linha, para cada dia, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

93

DISCUSSÃO

A vedação do recipiente de cultura com tampas ou filmes plásticos pode

dificultar a troca gasosa entre a cultura e o ambiente, promovendo um acúmulo de

gases liberados pelo tecido vegetal em crescimento, entre eles, etileno e vapor de

água. A retenção de vapor de água promove a formação de uma microatmosfera

com alta umidade relativa, que pode interferir no desenvolvimento do vegetal de

forma a dificultar o processo de aclimatização. O fechamento dos frascos de

cultura com tampas permeáveis possibilita as trocas gasosas, proporcionando a

redução da umidade relativa das culturas (Seelye et al. 2003). A redução da

umidade antecedendo a transferência das plantas para o ambiente externo tem

favorecido a aclimatização e aumentado a sobrevivência de mudas produzidas

através de micropropagação (De Klerk 2002; Xiao e Kozai 2004; Zobayed et

al.2000a).

A transferência da condição in vitro para o ambiente externo é uma etapa

crítica podendo ser um fator limitante para a micropropagação, pois acarreta uma

grande mudança no ambiente de desenvolvimento do vegetal. No laboratório, a

planta cresce sob baixa luminosidade e alta umidade relativa, condições que

resultam num fluxo transpiratório bastante reduzido. Por outro lado, o ambiente

externo apresenta características climáticas que promovem o aumento da

transpiração, sendo importante à atuação de estruturas vegetais, que ajudem a

reduzir a susceptibilidade ao estresse hídrico. Entre estas adaptações podem ser

citadas o espessamento da cutícula ou da parede de células da epiderme e a

presença de estômatos plenamente funcionais. Culturas mantidas em frascos

com trocas gasosas reduzidas com freqüência não apresentam tais adaptações

plenamente desenvolvidas, já que a alta umidade observada in vitro reduz a sua

importância para a sobrevivência e o desenvolvimento do vegetal no laboratório

(Grattapaglia e Machado 1998; Seelye et al. 2003).

Neste trabalho foi observada uma vantagem do selamento com algodão

em relação ao fechamento com PVC, que dificulta as trocas gasosas entre a

cultura e o ambiente. Estes resultados demonstram que a ocorrência de trocas

gasosas entre o microambiente in vitro e o ambiente externo, favoreceu o

desenvolvimento de adaptações contra a perda de água por evaporação e

94

transpiração e conseqüentemente reduziu o deficit hídrico durante a fase de

aclimatização.

Foi observado o aumento da sobrevivência e a atuação de estômatos em

mudas de macieira submetidas a um decréscimo da umidade relativa pela

abertura das tampas 4 a 5 dias antes da transferência (Brainerd e Fuchigami

1981). Já Wardle et al. (1983), ao reduzirem a umidade relativa do frasco de

cultura, conseguiram estimular a produção de cera, promover o desenvolvimento

da cutícula foliar e reduzir a perda de água durante a transferência de plantas

para o ambiente externo.

A presença de espessamento das paredes das células epidérmicas é uma

característica marcante de vários membros da família Bromeliaceae (Tomlinson

1969; Sajo et al. 1998). Esse espessamento parece estar relacionado com a

redução da evaporação de água dos tecidos, evitando o estresse hídrico e

assegurando a sobrevivência das espécies em condições extremas (Tomlinson

1969; Esaú 1977).

Gilly et al. (1997) avaliaram a formação da cutícula em folhas de hera

produzidas in vitro e ex vitro. Os autores observaram que nas condições de

cultura, com a umidade relativa acima de 95%, as folhas não apresentavam as

deposições de cera que formam a cutícula, enquanto as folhas formadas no

ambiente externo apresentaram o desenvolvimento normal desta estrutura. Neste

mesmo sentido, Zaid e Hughes (1995) mostraram que folhas de palmeiras não

aclimatizadas contém apenas 15% dos depósitos de cera encontrados nas

plantas desenvolvidas em viveiros. No entanto, durante o processo de

aclimatização, ocorre um aumento na biossíntese da cutícula e, ao fim deste

período as folhas estarão adaptadas às novas condições de crescimento (Gilly et

al. 1997).

O estudo histológico de plantas micropropagadas de abacaxi mostrou que

as folhas originadas in vitro não apresentavam espessamento da parede de

células da epiderme, mas decorridos seis meses da aclimatização, as novas

folhas mostravam intenso espessamento destas paredes (Barboza et al. 2006).

Withner et al. (1974) correlacionaram o espessamento da parede de células

epidérmicas de orquídeas com o nível de exposição ao sol, sendo esta

característica típica de folhas expostas a sol intenso.

95

No presente trabalho a avaliação da espessura da parede lignificada de

células da epiderme foliar mostrou que no momento de transferência das mudas

para o viveiro, as plantas procedentes de tubos vedados com PVC não

apresentaram presença de lignina nem espessamento nas paredes das células da

epiderme foliar abaxial ou adaxial em nenhuma das concentrações de sacarose.

Como a parede espessa e lignificada está associada com a proteção contra perda

de água por evaporação (Tomlinson 1969), é natural que tenha sido observada

uma grande redução de peso fresco em decorrência da elevada evaporação

presente nestas plantas. As folhas provenientes de plantas desenvolvidas em

tubos fechados com algodão, apesar de não desenvolverem paredes espessas na

ausência de sacarose, apresentaram paredes lignificadas em desenvolvimento,

nas concentrações de 1,5 e 3% de sacarose, onde um maior espessamento foi

observado com o aumento da concentração de sacarose.

Estes resultados sugerem que o espessamento da parede de células

epidérmicas não está diretamente relacionado com a exposição solar intensa

como sugerido por Withner et al. (1974) mas sim, com a redução da umidade do

ambiente. Como a umidade pode ser influenciada pela exposição ao sol, algumas

correlações indiretas acabam por ser erroneamente atribuídas à irradiação solar.

Quando comparadas com mudas procedentes de culturas vedadas com

PVC, as plantas oriundas de tubos tampados com algodão apresentaram uma

menor perda de água, demonstrando possuir um maior controle da evaporação.

Ocorre que as plantas cultivadas na ausência de sacarose, apesar de não

apresentarem células da epiderme abaxial ou adaxial com paredes espessas e

lignificadas, ainda assim mostraram comportamento semelhante às plantas

procedentes de meio de cultura acrescido de 1,5 ou 3% de sacarose, em relação

à redução de peso fresco. Estes resultados indicam que nesta situação, outros

fatores, como o controle estomático, podem estar associados à redução da perda

de água.

A análise histológica das plantas no 40o dia após a transferência para o

viveiro revelou que existe uma tendência das plantas, submetidas aos diferentes

tratamentos, se igualarem quanto ao espessamento da parede celular lignificada

de células da epiderme, apesar de ainda terem sido observadas diferenças entre

as plantas provenientes de meio com 0 e 3% de sacarose, quando comparadas

em relação ao tipo de fechamento dos tubos.

96

A planta tem um comportamento heterotrófico no laboratório, utilizando a

sacarose presente no meio de cultura como fonte de energia. A transferência para

o ambiente externo requer o desenvolvimento de capacidade autotrófica já que a

sacarose deixará de ser fornecida para o vegetal. É necessária também a

otimização da capacidade de captar nutrientes, já que no substrato utilizado em

viveiro, a dificuldade na absorção de nutrientes poderá ser maior. Além disso,

alguns estudos relatam que o excesso de sacarose no meio de cultura pode

regular negativamente a fotossíntese, isso ocorre por que a maior quantidade de

soluto no meio reduz a disponibilidade de água (Farrar et al. 2000; Guimarães et

al. 1999). O estímulo à autotrofia in vitro, através do decréscimo nas taxas de

açúcar do meio bem como pelo aumento da intensidade luminosa e da

concentração de CO2, pode favorecer o processo de adaptação, pois estará

facilitando a realização da fotossíntese (Grattapaglia e Machado 1988; Kozai et al.

1991). Zobayed et al. (2000b) submeteram brotos de batata doce a condições

fotoautotróficas, conseguindo aumentar a sobrevivência e o crescimento das

mudas além de estimular a formação de estômatos funcionais e o

desenvolvimento de cutícula de cera nas folhas. No entanto, outros estudos

mostraram que maiores concentrações de sacarose desempenharam um efeito

favorável na qualidade das mudas (Gollagunta et al. 2004), apesar de

estimularem a manutenção das plantas em condições heterotróficas.

O tampão de algodão forneceu um sistema permeável às trocas gasosas,

que reduziu a umidade relativa da cultura, favorecendo o desenvolvimento de

adaptações contra a perda de água pelas mudas, além de ter possibilitado a

realização da fotossíntese, estimulando o início do crescimento autotrófico.

Estimava-se que plantas procedentes de cultura em tubos fechados com algodão

e meio sem sacarose seriam mais estimuladas ao crescimento autotrófico tendo

em vista a ausência de sacarose e, conseqüentemente, a necessidade de

produzir açúcar para o seu metabolismo. No entanto, não foi observado o melhor

desempenho por parte destas plantas. Estas observações sugerem que o

comportamento fotoautotrófico não foi induzido com sucesso, possivelmente em

decorrência de uma densidade de fluxo de fótons fotossínteticamente ativos

(40µmol.m-2.s-1) inferior que a necessária para estimular a fotossíntese nesta

espécie. Zobayed et al. (2000a) utilizou 120µmol.m-2.s-1 para eucalipto e Xiao e

97

Kozai (2004) entre 50 e 100µmol.m-2.s-1 para Zantedeschia elliottiana e

Cunninghamia lanceolata. Entretanto, deve-se ressaltar que plantas de O.

mucugense obtiveram vantagens proporcionadas pelas trocas gasosas já que

apresentaram desempenho bastante superior àquelas cultivadas na ausência de

sacarose em frascos nos quais a ventilação não foi possibilitada.

O emprego de estratégias que possibilitem o aumento da umidade

relativa, durante o início do desenvolvimento do vegetal no ambiente externo, é

muito importante para assegurar a sobrevivência das mudas transplantadas. Um

período de transição de 15 a 20 dias no qual a umidade relativa do ar seja

reduzida aos poucos tem sido recomendado por favorecer a sobrevivência e a

adaptação das plantas ao ambiente externo (Grattapaglia e Machado 1988). No

presente estudo, após a transferência das mudas para o viveiro, as plantas

passaram por um período de 30 dias em ambiente de alta umidade relativa,

seguidos de 10 dias de transição para somente depois destes 40 dias estarem

submetidas à umidade relativa do ambiente. O grande período de transição pode

ter favorecido os altos percentuais de sobrevivência observados mesmo para

mudas procedentes de tubos vedados com PVC nos tratamentos com 1,5 e 3%

de sacarose.

O decréscimo da umidade relativa na atmosfera de cultura associado ao

ambiente de alta umidade relativa promovido durante o início do desenvolvimento

das mudas no viveiro contribuiu para o sucesso do processo de aclimatização das

mudas micropropagadas de Orthophytum mucugense, devendo-se destacar a

sobrevivência de todas as mudas procedentes de tubos fechados com algodão e

meio com 3% de sacarose, decorridos 100 dias da transferência. A baixa taxa de

sobrevivência (54%) observada apenas para o tratamento PVC na ausência de

sacarose demonstrou a importância desta fonte de carbono em ambientes onde

as trocas gasosas são restritas.

Este trabalho mostrou que a manipulação do ambiente in vitro possibilita a

formação de plantas mais adaptadas à evaporação, favorecendo o processo de

aclimatização, além de apresentar um método acessível e altamente eficaz, que

garante o sucesso na aclimatização de mudas micropropagadas de Orthophytum

mucugense, uma espécie recém descrita de bromélia, com grande valor

ornamental. Pôde ser observado também que as modificações anatômicas

ocorridas nas folhas de Orthophytum mucugense decorreram de plasticidade

98

fenotípica uma vez que a mudança no ambiente de crescimento promoveu as

alterações no espessamento da parede da epiderme.

99

CONCLUSÕES • O selamento dos recipientes de cultura com algodão na fase de pré-

aclimatização foi eficiente na redução de perda de água na ocasião do

transplante para o viveiro.

• O selamento dos recipientes de cultura com algodão possibilitou o

desenvolvimento da parede celular lignificada de células da epiderme adaxial

e abaxial, favorecendo o processo de aclimatização.

• A presença de sacarose não influenciou a sobrevivência de plantas

procedentes de tubos fechados com algodão.

• A restrição de sacarose no meio de cultura prejudica a sobrevivência de

plantas provenientes de tubos fechados com PVC.

100

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106

CONCLUSÕES GERAIS

1 – A germinação de sementes de Neoregelia mucugensis não diferiu

significativamente entre os três substratos avaliados.

2 – O substrato terra vegetal + vermiculita foi o mais indicado para o

desenvolvimento de Neoregelia mucugensis até o 120o dia após a semeadura.

Posteriormente o substrato composto exclusivamente por terra vegetal

proporcionou o melhor desenvolvimento das plantas.

3 – Os substratos terra vegetal e terra vegetal + vermiculita tiveram melhor

desempenho na germinação e no desenvolvimento de Orthophytum mucugense

até o 120o dia após a semeadura. Posteriormente o substrato composto

exclusivamente por terra vegetal proporcionou o melhor desenvolvimento das

plantas.

4 – A grande quantidade de água retida pela vermiculita pode estar relacionada

com a redução da capacidade germinativa de sementes de O. mucugense.

5 – O sistema radicular de O. mucugense e N. mucugensis teve baixa

representatividade na matéria seca total.

6 - N. mucugensis apresentou maiores taxas de germinação, maior velocidade e

menor tempo médio para a germinação que sementes de O. mucugense.

7 – A germinação in vitro de O. mucugense deve ser realizada em ágar.

8 – A semeadura in vitro de N. mucugensis pode ser realizada em ágar ou MS/2.

9 – Sugere-se a utilização de MS/2 para o crescimento in vitro de O. mucugense e

N. mucugensis.

10 – O carvão ativado favoreceu o crescimento da parte aérea de O. mucugense

e do sistema radicular de ambas espécies, sendo indicada a sua utilização

durante a pré-aclimatização.

11 – Para induzir a formação de brotos in vitro recomenda-se a utilização de MS/2

associado a 2,22 ou 4,44µM BAP + 1,3µM de ANA para N. mucugensis, 2,22µM

107

de BAP + 0,65µM ANA para O. mucugense e 1,11µM de BAP + 0,65µM ANA para

O. albopictum.

12 – A transferência dos brotos produzidos por micropropagação para meio sem

reguladores de crescimento deve ser realizada até o 4o mês de cultura.

13 - O selamento dos recipientes de cultura com algodão na fase de pré-

aclimatização reduziu a perda de água em 50% por ocasião do transplante para o

viveiro.

14 - O selamento dos recipientes de cultura com algodão possibilitou o

desenvolvimento da parede celular lignificada de células da epiderme adaxial e

abaxial.

15 - A concentração de sacarose não influenciou a sobrevivência de plantas

procedentes de tubos fechados com algodão.

16 - A restrição de sacarose no meio de cultura prejudicou a sobrevivência de

plantas provenientes de tubos fechados com PVC.

108

APÊNDICES

Quadros de análise de variância

109

QUADROS DE ANÁLISE DE VARIÂNCIA REFERENTES AO CAPÍTULO 1

Quadro 1.1 - Resumo das análises de variância para porcentagem de emergência (%E), tempo médio de emergência (TmE) e índice de velocid ade de emergência (IVE) de sementes de Orthophytum mucugense e Neoregelia mucugensis em função do tipo de substrato utilizado.

Quadrados médios

Causas de variação GL % Ez TmE IVE

Espécie 1 2789,62** 637,86** 9,95**

Substrato 2 151,21* 0,87ns 0,11*

Espécie x Substrato 2 160,5* 0,59ns 0,11*

resíduo 24 38,70 0,87 0,02

CV (%) 9,22 4,44 8,71

** - significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F * - significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ns – não significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F z – dados transformados em arco seno

Quadro 1.2 – Resumo das análises de variância para matéria seca da parte aérea e matéria seca das raízes de plantas de Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense aos 120 dias de idade, em função do tipo de substrato utili zado.

Quadrados médios

Causa de variação GL Parte aérea Raízes

Espécie 1 4556,78** 369,74**

Substrato 2 127,43** 108,10**

Espécie x Substrato 2 1076,26** 49,60**

Resíduo 18 28,37 1,47

CV 27,04 20,73

** - significativo ao nível de 1% de probabilidade, pelo teste F

110

Quadro 1.3 – Resumo das análises de variância para matéria seca da parte aérea e matéria secao das raízes de plantas de Neoregelia mucugensis e Orthophytum mucugense aos 300 dias de idade, em função do tipo de substrato utili zado.

Quadrados médios

Causa de variação GL Parte aérea Raízes

Espécie 1 2,16** 1,47**

Substrato 1 8,87** 0,23**

Espécie x Substrato 1 0,78** 0,02ns

Resíduo 16 0,02 0,02

CV 3,63 14,35

** - significativo ao nível de 1% de probabilidade, pelo teste F ns – não significativo ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste F

111


Quadro 2.1 - Resumo das análises de variância para porcentagem de germinação (%G), tempo médio de germinação (TmG) e índice de velocid ade de germinação (IVG) de sementes de Orthophytum mucugense e Neoregelia mucugensis em função do meio de cultura.

Quadrados médios

Causas de variação GL % Gz TmG IVG

Espécie 1 8140,17** 264,90** 58,14**

Meio 1 1155,61** 16,67* 1,32**

Espécie x Meio 1 811,60** 3,13ns 0,01ns

resíduo 16 8,39 3,44 0,03

CV (%) 5,16 13,24 8,74

** - significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F * - significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ns – não significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F z – dados transformados em arco seno

Quadro 2.2 – Resumo das análises de variância para matéria seca da parte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e compr imento das raízes de plantas de Neoregelia mucugensis em função do meio de cultura e do carvão ativado.

Quadrados médios

Causa de variação GL Matéria seca da parte aérea

Matéria seca da raiz

Comprimento parte aérea

Comprimento raiz

Meio de cultura (M) 1 46,87* 5,84ns 199,51** 97,26ns

Carvão ativado (C) 1 335,89** 325,40** 9738,97** 2660,64**

M x C 1 33,93ns 65,38** 289,38** 1635,12**

Resíduo 52 9,84 3,46 25,75 34,92

CV 30,16 31,13 12,95 23,87

** - significativo ao nível de 1% de probabilidade, pelo teste F * - significativo ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste F ns – não significativo ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste F

112

Quadro 2.3 – Resumo das análises de variância para matéria seca da parte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e compr imento das raízes de plantas de Orthophytum mucugense, em função do meio de cultura.

Quadrados médios

Causa de variação

GL Matéria seca da parte aérea

Matéria seca da raiz Comprimento parte aérea

Comprimento raiz

Meio de cultura 1 10,25ns 0,88ns 24,50ns 56,18ns

Resíduo 30 4,18 0,27 10,38 29,93

CV 34,05 44,52 19,42 24,33

ns – não significativo ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey

Quadro 2.4 – Resumo das análises de variância para matéria seca da parte aérea, matéria seca das raízes, comprimento da parte aérea e compr imento das raízes de plantas de Orthophytum mucugense, em de diferentes níveis de carvão ativado no meio de cultura.

Quadrados médios

Causa de variação

GL Matéria seca da parte aérea

Matéria seca da raiz Comprimento parte aérea

Comprimento raiz

Carvão ativado 1 2452,28** 300,33** 3894,03** 2439,51**

Resíduo 30 117,73 23,03 34,67 147,94

CV 37,84 71,14 14,84 31,03

** - significativo ao nível de 1% de probabilidade, pelo teste F

113


Quadro 3.1 – Resumo das análises de variância para número de brotos, % de explantes com brotos, % de explantes com calos e matéria seca dos brotos (média por explante em mg) em função das espécies e das concentrações de ANA e BA P.

Quadrados médios

Causas de variação GL N de brotos % exp brotosz % exp calosz Mat. seca brotos

Espécie 2 16,98** 5274,50** 3534,05** 65,20**

ANA 3 12,88** 3588,15** 3404,75** 48,69**

BAP 3 11,49** 4145,23** 5641,75** 22,89**

Espécie x ANA 6 3,09** 2558,15** 979,76** 32,94**

Espécie x BAP 6 3,79** 302,55ns 663,49** 16,93**

ANA x BAP 9 1,49** 407,95ns 907,98** 4,94*

Espécie x ANA x BAP 18 2,12** 781,55** 588,35** 5,31**

Resíduo 192 0,34 305,10 125,71 2,36

CV (%) 38,55 36,31 85,51 77,25

ns -Não-Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F. ** - Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F. z - Dados em % foram transformados em arco seno.

114


Quadro 4.1 – Resumo das análises de variância para espessura da parede lignificada de células da epiderme adaxial e abaxial de folhas de Orthophytum mucugense no dia da remoção do laboratório (1 o dia) e no 40 o dia após a transferência para o ambiente, em funçã o do tipo de selamento e da concentração de sacarose utilizada.

Quadrados médios

Causas de variação GL Adaxial 1o dia Abaxial 1o dia Adaxial 40o dia Abaxial 40o dia

Sacarose 2 12,083** 21,157** 18,486** 9,666**

Selamento 1 23,046** 55,173** 48,901** 22,047**

Sacarose X selamento 2 12,083** 21,157** 12,773** 7,107**

Resíduo 24 0,051 0,052 1,119 1,08

CV (%) 25,68 16,88 12,2 13,55

** - Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F.

Quadro 4.2 – Resumo da análise de variância para re dução de peso fresco (%) após 30 minutos, entre 30 e 60 minutos, e redução total apó s 60 minutos 60 minutos depois da exposição às condições ambientais, em função do tip o de selamento e da concentração de sacarose utilizada.

Quadrados médios Z

Causas de variação GL Até 30 minutos entre 30 e 60 min total

Sacarose 2 4,149ns 4,789** 13,107*

Selamento 1 220,773** 108,825** 639,612**

Sacarose X selamento 2 9,967** 0,995ns 8,376ns

Resíduo 24 1,310 0,410 2,675

CV (%) 11,110 13,450 10,520

ns -Não-Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F. * - Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F. ** - Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F. z - Dados originais transformados em arco seno.

115

Quadro 4.3 – Resumo da análise de variância para so brevivência (%) de Orthophytum mucugense 100 dias após a transferência para o viveiro, em f unção do tipo de selamento e da concentração de sacarose utilizada.

Quadrado médio

Causas de variação GL % sobrevivênciaZ

Sacarose 2 1566,96**

Selamento 1 1648,35**

Sacarose X selamento 2 1034,57**

Resíduo 22 60,00

CV (%) 8,89

** - Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F. Z – Médias originais transformadas em arco seno

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