Genética Geral II

Prof. Dr. Ricardo Lehtonen R. de Souza

Depto de Genética – UFPR

lehtonen@ufpr.br

www.ufpr.br/~lehtonen

PCRReação em Cadeia da Polimerase

Inventada em 1983 por Kary Mullis é uma das técnicas mais comuns utilizadas em

laboratórios de pesquisas médicas e biológicas

Aplicações: seqüenciamento de genes diagnóstico de doenças hereditárias testes de paternidade e na medicina forense diagnóstico de doenças infecciosas

PCR

Reação de PCR: DNA dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) iniciadores (também chamados de primers) DNA polimerase solução tampão

PCR

Toda esta mistura é colocada na máquina de PCR, o termociclador, que faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos

Desnaturação

Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por meio da elevação da temperatura.

As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante um a vários minutos.

Hibridação

A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante alguns segundos.

Os iniciadores hibridam com as sequências complementares do DNA molde

Extensão

Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns segundos.

A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a partir dos iniciadores

PCR

animação

PCR – desenho dos iniciadores

Comprimento: em torno de 20 bases GC: ideal em torno de 50% Software para desenhar iniciadores: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-

blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome

PCR – desenho dos iniciadores

PCR-RFLP

Enzima de restrição:– mutação cria sítio de restrição– mutação elimina sítio de restrição

Transforma uma diferença de nt, que não detectada em uma eletroforese, em uma diferença de tamanho

Fragmentos com tamanhos diferentes migram diferente na eletroforese

PCR-RFLP

PCR-RFLP

ALA 539 540 541 545 546 Seqüência normal....5'..GAA GCA GAA TGG.....GCA GG...3' Iniciador (3') GT CGT ACC.....CGT CC Produto da PCR 5'..GAA GCA GCA TGG..............3' Fnu4HI ou BsoFI ____________85 pb__________'________21 pb_________

PCR-RFLP

85pb 106pbUU UK KK

PCR-RFLP

Vantagem: rapidez

Desvantagem: algumas enzimas tem digestão parcial

PCR-SSCA (ou SSCP)Análise de Conformação de Fita Simples

Descrita originalmente por ORITA e cols. (1989). DNA é amplificado por PCR Depois é desnaturado por calor Gel de poliacrilamida não desnaturante As fitas simples adquirem conformações tridimensionais e

correm em posições diferentes no gel. Uma simples mutação de ponto pode alterar essa conformação

e, conseqüentemente, o padrão de bandas do fragmento (IWAHANA e cols., 1992).

PCR-SSCA

Padronização da técnica vários fatores Relação bisacrilamida x acrilamida Concentração de acrilamida Tampão do gel pH Tempo de corrida Temperatura de polimerização Temperatura da corrida

PCR-SSCA

PCR-SSCA

Seqüenciamento didesoxi

Método de Sanger Síntese de DNA na presença de

nucleotídeos didesoxi, os quais não tem o grupo 3’-hidroxila.

Eles podem ser incorporados na cadeia, mas terminam a síntese

Seqüenciamento

animação

PCR em tempo real

É uma técnica para a detecção e medida de produtos gerados durante cada ciclo da PCR

A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumentará na proporção direta da quantidade de produto da PCR.

Em tempo real é possível saber a quantidade de produto em um ponto no qual a reação ainda está na fase exponencial

Por este motivo, essa técnica permite a quantificação, o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese.

PCR em tempo real

PCR em tempo real

SYBR Green é um fluoróforo em suspensão, intercalante de DNA

dupla fita, que emite uma fluorescência verde com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador.

Durante a PCR, as moléculas do SYBR Green vão se ligando ao DNA recém sintetizado

Um aumento da fluorescência é observado em tempo real, o que possibilita o monitoramento contínuo da reação

PCR em tempo real

SYBRSYBR GreenGreen

PCR em tempo real

Taqman

PCR em tempo real

PCR em tempo real

Aplicações Quantificação Detecção de carga viral Determinação do número de cópias de um

gene Análise da expressão gênica

PCR em tempo real

Exemplo de aplicação: Investigação de amplificação ou deleção dos

genes BCHE e ACHE em tecido mamário tumoral com relação ao tecido normal.

PCR em tempo real

Quantificação relativa

TumorCHE / Tumor18S

Q = ───────────────────────

SangueCHE / Sangue18S

PCR em tempo real

Sem Informação20,93%

Inalterado9,30%

Amplificado18,60%

Deletado51,16%

Gene BCHE

Genotipagem com Taqman

Homozigoto para o alelo marcado com FAM

Heterozigoto

Homozigoto para o alelo marcado com VIC

Genotipagem

FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs2863381

População1 Grupo n2 TT TC CC HW T CGuarani (GRC) Ameríndio 58 0,431 0,414 0,155 >0,250 0,6379 0,3621

Kaingang (KRC) Ameríndio 58 0,793 0,190 0,017 >0,500 0,8898 0,1102

Japão (JPT) Asiático 85 0,294 0,494 0,212 >0,950 0,5410 0,4590

China (HCB) Asiático 81 0,272 0,506 0,222 >0,750 0,5250 0,4750

Europa (CEU) Euro-americano 111 0,441 0,477 0,081 >0,250 0,6800 0,3200

Nigéria (YRI) Africano 112 0,955 0,045 0,000 >0,750 0,9780 0,0220

Características da Amostra Detalhes dos Genótipos Frequência Alélica

Fonte: Alves, 2009

FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs3495

População1 Grupo n2 GG GA AA HW G AGuarani (GRC) Ameríndio 57 0,000 0,035 0,965 >0,750 0,0175 0,9825

Kaingang (KRC) Ameríndio 58 0,000 0,069 0,931 >0,750 0,0345 0,9655

Europa (EUR) Euro-americano 24 0,042 0,375 0,583 1,000 0,2290 0,7710

China (CHN) Asio-americano 24 0,000 0,458 0,542 0,150 0,2290 0,7710

Afro-brasileiros (AFBII) Afro-brasileiro 218 0,170 0,427 0,404 >0,100 0,3830 0,6170

África (AFR) Afro-americano 22 0,364 0,591 0,045 0,150 0,6590 0,3410

Características da Amostra Detalhes dos Genótipos Frequência Alélica

Fonte: Alves, 2009