Berk. Penel. Hayati Edisi Khusus: 3D (73–77), 2009

LAMA WAKTU LISIS DARI SEL PRIMER Spodoptera litura YANG TERINFEKSI Spodoptera litura MULTIPLE

NUCLEOPOLYHEDROSIS VIRUS (SpLtMNPV) DILIHAT DENGAN MIKROSKOP ELEKTRON TRANSMISI

Mahanani Tri Asri* dan Nur DuchaJurusan Biologi Fakultas FMIPA UNESA

*Alamat koresponsdensi E-mail: mahananitria@gmail.com

ABSTRACT

Primary cell of Spodoptera litura larvae is one of cell resulted by in vitro multiplication. It was developed successfully and it can be used to multiply Spodoptera litura Nucleopolyhedrosis Virus (SpLtMNPV). So far, virus multiplication commonly is throughed in vivo using true host. �ut in vivo multiplication has some obstacles which host readiness in large quantity is very difficult to get. �esides that, virus multiplication through in vitro take a long time to lyses cell. It needs 3 days and for virus harvest through infected larvae need around 10 – 12 days. Therefore, it is developed insect cell culture in vitro to multiply virus at the present time. In this experiment it will be known how long lyses time duration in epithelia intestine primary cell of SpLtMNPV infection is. Infected virus in primary cell was taken pictures using transmission electron microscope in incubation time 2�, �8, and 72 hours. The result of photograph are Epithelia intestine primary cell of Spodoptera litura larvae lyses and release new virus for 2� hours. It shows that during 2� hours, the primary cell can produce 2,5 PIBs/cell.

Key words: lyses time duration, primary cell,lyses time duration, primary cell,, primary cell,primary cell,, Spodoptera litura Multiple Nucleopolyhedrosis virus (SpLtMNPV)

PENGANTAR

SalahsatuinsektayangseringdianggapsebagaihamayangsangatmerugikanadalahSpodoptera litura.Padastadiumlarva/ulatdapatmenyerangberbagaitanamansepertikapas,tembakau,jarak,jagung,kedelai,dankobis(Sudarmo,1987)dengantingkatkerusakanmencapai50%(Naito,1983).Hamainidapatdikendalikandenganagenbiologisberupavirus.VirusyangsedangdikembangkansebagaibioinsektisidaadalahSpodoptera litura multipel nucleopolyhedrosis virus(SpltMNPV)in vivo,yangberdasarpenelitianAsri(2005)efektifmengendalikanSpodoptera lituradenganmortalitas80–90%padakonsentrasi107PIBs/mldigreenhousedandiLaboratoriumefektifpadakonsentrasi106PIBs((Polyhedra inclution bodies)/ml/ml(Asri,2004).

Perbanyakanagensiahayativirus tersebutsecarakonvensionaldilakukansecarain vivoyaitumenggunakaninanghidupberupaulatgrayak/Spodoptera litura.Carapembiakanvirussepertiinikurangefektifkarenatergantungpadakelimpahanulatdilapangan,atautergantungpadamusim terutamamusimpenghujan.Selain ituuntukmemperbanyak inangdi laboratoriummembutuhkanpersyaratanyangcukuprumitdengantingkatkegagalanmencapai70%danmembutuhkanwaktuyangrelatiflamayaitu12hari(Asri,2004).Sesampaimetodeini tidak

efektifuntukskalabesarsepertiuntukperusahaankarenakontinuitasinangdarivirustidakterpenuhi.

UntukitusekarangtelahdikembangkanmetodebaruyaitudenganmengkulturselinsektaterutamaSpodoptera liturasebagaiinanguntukvirus.Kulturinidapatdigunakanuntukmenghasilkanberbagaimacambioproduksepertiproduksibioinsektisidavirus(baculovirus)dalamskalabesaruntukpertaniandalamwaktuyangrelatifsingkat.

OlehkarenapembiakanSpLtMNPVsecarain vivomengalamibanyakkendalamakadalampenelitianinidikembangkankultursel insektasecara in vitroyangnantinyadiharapkandapatuntukmemperbanyakvirusdalamwaktuyangrelatifsingkat.KulturselinsektatelahberhasildilakukanpadaselepitelususlarvaSpodoptera liturainstar3,4,dan5.KulturtersebutdiperolehdariselprimeryangditumbuhkanpadamediumGrace'sdenganpenambahanfetal bovineserum.SelprimerinijugadapatdigunakanuntukmemperbanyakSpLtMNPV(Asri,2007),sesampaipenelitianinibertujuanmencarilamawaktulisisdariselepitelususlarvayangdiinfeksidenganSpLtMNPVdilihatdenganmenggunakanmikroskopelektrontranmisi.Penelitianinidilakukankarenadenganpembiakansecarain vivo membutuhkanwaktuyanglamauntuklisis.Selyangterinfeksimembutuhkanwaktu72jam(3hariuntukdapatmelisiskansel-selnyayangterinfeksi),FalcondalamMangoendiharjodanPollet (1991).Sedangkanuntuk

LamaWaktuLisisdariSelPrimerSpodoptera litura7�

sampaipanenyangditunjukkandenganmatinyalarvaSpodoptera lituramembutuhkanwaktusekitar12hari.

BAHAN DAN CARA KERJA

Bahan

Bahan-bahanyangdiperlukanpadapenelitian iniadalahmediumGrace's,Fetal Bovineserum,Posphat Buffer saline, enzim tripsin, SpLtMNPV, larva Spodoptera litura,pakanbuatanuntuklarvaSpodoptera litura,Bayclin,Na2CO3Alkohol70%sebagaiagenpensteril,antibiotikpenisilin-treptomisin,gentamycinsulfatdanantifungiberupaAmfoterisin-B,akuades.

Alat

Alat–alatyangdigunakandalampenelitianinimeliputiperalatanutamayangterdiridari:inkubator,mikroskopinverted,mikroskopstereo,Laminar Air Flow(LAF),inkubator,sterilisatorkering(oven),sentrifuse,magnetikstirer,membran milliporedanperalatanpendukungterdiridari:cawanpetri,cawankultur,jarumpentul,stereofom,tabungsentrifuse,botolvial,alatbedahmikro,spuit,Aluminiumfoil,penyaringbakteriologis,penyaringnilon(net plankton)ukuranT100dan150,mikroskopelektrontransmisi

Preparasi Sel Primer Epitel Usus Larva Spodoptera litura

LarvaSpodoptera liturainstar5awalhasilpemeliharaandi laboratoriumdenganpakanbuatan, terlebihdahuludibersihkandenganmenggunakanbayclin,antibiotikdanPosphatBufferSaline(PBS).Selanjutnyadilakukanpembedahanuntukmengambilorganususlarvadenganmenggunakanalatbedahmikrodandiamatidibawahmikroskopstereo.JaringanepitelususlarvayangterambildicucidenganPBSdandipotong-potongsampaihalusdidalamnya.PotonganUsuslarvaditripsinasidenganperbandingan1:1antaralarutantripsin(0,25%)dengancairan PBS dan usus, sambil distirer selama 1 jamdalamsuhuhangat.Hasil tripsinasi disentrifus denganHasiltripsinasidisentrifusdengankecepatan2500rpmselama10menit,dengantujuanuntukmengendapkanselyangtelahterdispersi.Selanjutnyadilakukanpengamatandibawahmikroskopinverteduntukmengetahuiapakahsel-selepitelusussudahterdispersi,apabilabelumterdispersimakatripsinasidiulangilagi.selanjutnyasupernatanhasilsentrifusdibuangsebagian.Padaendapansisaditambahkanmediumdanserum(FBS)kemudian difilter dengan menggunakan penyaring nilon denganukuranT100danT150untukmemisahkanselepiteldenganjaringanyangtidakterdispersi.Sel-selepitelusus

dalammediumpertumbuhanditanampadacawankulturberukuran2,5ml.Selanjutnyadiinkubasidalaminkubatordengansuhu27ºC.Setelah10hariselsudahmembentukmonolayer dansiapdiinfeksidenganSpLtMNPV.

Persiapan SpLtMNPV yang Akan dinfeksi

SpLtMNPVmurnihasilpembiakanin vivo(Gambar1) dihitung konsentrasinya terlebih dahulu denganmenggunakanHaemocytometer.Konsentrasiyangdapatdigunakanuntukpenginfeksianadalah1,1×106PIBs/ml.OlehkarenaSpLtMNPVdalambentukpolyhedrayangukurannyarelatifbesar(dapatdilihatdenganmenggunakanmikroskopbiasadenganperbesaran400×)sesampaitidakmemungkinkanmasukkedalamselprimerususlarvaSpodoptera litura.maka PIBs ini harus dipecahmakaPIBsiniharusdipecahterlebihdahuludenganmenggunakanlarutanalkalisyaituNa2CO30,5Mdandiputardiatasmagnetikstirerselama1jam(virusnya berukuran lebih kurang 1 mikrometer(virusnyaberukuranlebihkurang1mikrometerlebih kecil dari sel primer berukuran lebih kurang2,5mikrometer). Selanjutnya diamati di bawah mikroskop.Selanjutnyadiamatidibawahmikroskopcahayadenganperbesaran400kaliapabilavirusnyasudahtidakterlihatberartiPIBsnyatelahpecahdanvirusdalambentukmultiplenucleocapsid.

Gambar 1. SpLtMNPV stater in vivo

Penginfeksian SpLtMNPV dalam Sel Primer Epitel Usus Larva Spodoptera litura

Untukmenjagasterilitaslarutanvirussebelumvirusdituang/diinfeksikandalammediumyangditumbuhiselprimerepitelususSpodoptera litura.LarutanSpLtMNPV-Na2CO3difiltrasidenganmembranfilterbakteriologis(pori-pori0,22mikron)danditeteskanpadamediumkulturselprimer.Selanjutnyamediumkulturyangtelahdiinfeksi

AsridanDucha 7�

diinkubasiselama24jam,48jam,dan72jam.Setiap24jam,sel terinfeksi di fiksasi/didormankan untuk memprosesan pembuatanpreparatberikutnyasupayadapatdilihatdenganmenggunakanmikroskopelektrontransmisi.

Persiapan Sel untuk Pengamatan dengan Mikroskop Elektron Transmisi (TEM)

PengamatanselterinfeksivirusdenganTEMdilakukandi Lembaga Eigment Jakarta. Sedangkan persiapanpengirimansampeldilakukandilaboratoriummikrobiologidankulturjaringanUnesadenganprosessebagaiberikut: a. Kulturselyangberadadalamdisk/flask/cawanpetri

dirontokkanb. Selyangtelahrontokdimasukkandalamfalcon tube

15ml/10mlc. Disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama

10menitd. Supernatandibuangdanditambahkancacodylate buffer

(1,5ml)kocokpelansampaisel-seltercampur.e. DipindahkankedalamtabungEpendrofdandisentrifuse

dengankecepatan3000rpmselama10menitf. Supernatandibuang,peletnyadicuci lagidengan

cacodylate buffer(1ml)g. Disentrifuselagipadakecepatan3000rpmselama

5menith. Supernatan dibuang dan ditambahkan fiksatif 2,5%

glutaraldehyde(1ml)dalamcacodylate bufferi. Dikocokpelansampaisel-sel tercampur.Sampel

disimpanpadasuhu4°CdansiapdikirimkeLembagaEigmentJakartauntukpreparasiberikutnya.

PadasampelyangterkirimakandilakukanpengeblokandenganmenggunakanmetodeSPURRyangterdiridari:Tahap Dehidrasi, Tahap infiltrasi/peresapan, dan Tahap Embedding/Penanaman.Selanjutnyadibuatsayatandarisampelbloktersebutdengantujuanmemotongsayatansetipismungkinagarmudahdiamatidibawahmikroskop.Sebelumpreparatdilapisidenganmonomerresinmelaluiprosespemanasandandilanjutkandenganpemotonganmenggunakanmikrotom.Umumnyamatapisaumikrotomterbuatdariberliankarenaberliantersusundariatomkarbonyangpadatsesampaisayatanlebihrapi.Sayatanyangtelahterbentukdiletakkandiatascincinberpetakuntukdiamati.Pelapisan/pewarnaanbiasanyajugadilakukanuntukmemperbesarkontrasantarapreparatyangakandiamatidenganlingkungansekitarnya.

HASIL

HasilpenelitianmenunjukkanbahwaselepitelususlarvaSpodoptera liturayangdiinfeksidenganSpLtMNPV

dandiinkubasipadawaktu24,48,dan72jammenunjukkanselterinfeksimulaimengalamilisisdiwaktuinkubasi24jam.Sedangkanpadawaktu48dan72jamhampirsemuaselnyasudahlisissehinggapadagambaryangtertangkaptinggalPIBsvirussertasisa-sisadariselyanglisistersebut.GambardarisuspensivirusPIBsdanselyanglisispadawaktuinkubasi24jamdapatdilihatpadagambar2,3,dan4.

Gambar 2. PIBs dari SpLtMNPV dengan mikroskop inverted (400×)

D

A

C

B

Gambar 3. Sel kultur yang normal dan terinfeksi SpLtMNPV

A. Giant Cell B. Sel normalC. Sel budding berisi virus D. Sel yang sudah terbuka/lisis Pada waktu inkubasi 24 jam (Perbesaran 5000 kali dengan TEM) (Perbesaran 5000 kali dengan TEM)(Perbesaran 5000 kali dengan TEM)

LamaWaktuLisisdariSelPrimerSpodoptera litura76

Gambar 4. Sel yang sudah terbuka dan mengeluarkan PIBs dilihat dengan TEM pada waktu inkubasi 24 jam (Perbesaran 20.000×)

PEMBAHASAN

BerdasarkangambaryangdiperolehbaikmenggunakanmikroskopinfertedmaupunmikroskopelektrontransmisiterlihatbahwaPIBsdariSpLtMNPVberbentukbulat(Gambar2).Padawaktuinkubasi24jamternyatavirussudahpadatahapreproduksiyangterakhiryaitupelepasanvirus(Gambar3dan4).Tahapreproduksiviruspadaumumnyaterdiridaridari5tahapyaitu:pelekatan padapadamembranselinangyangcocokdanabsorpsipadamembranselinang,penetrasidanpelepasanselubungdisitoplasma,reproduksi/replikasidanbiosintesiskomponenvirusdiintisel,perakitankomponenvirus,danpelepasanvirusdariselinang.SedangkanberdasarkanpenelitiandariFalcondalamMangoendiharjodanPollet(1991)keseluruhandaritahapanreproduksiNPVadalahpartikelvirustermakaninang(0jam),melepaskanpartikel-partikelpertamanyakedalamsitoplasma (4–8 jam), mengalami modifikasi pertama dalam intiselyangterinfeksi(16jam),pembentukanviroplasma(24 jam), replikasinucleocapsid (36 jam), replikasipolyhedra (48 jam),danpembentukanPIBs lengkap(72jam).ProsespelepasanNPVyangmembutuhkanwaktu72jamtersebutdilakukansecarain vivo,sedangkanpada

penelitianinidilakukansecarain vitrosehinggawaktulisis/lepasnyaPIBdarisellebihsingkatyaitu24jam.

Berdasarkandatatersebutdapatdijelaskanbahwalamawaktulisisnyaselepitelyangterinfeksisecarain vitrolebihsingkat(24jam)karenavirusyangdimasukkandalamcawankultursudahdipecahterlebihdahulupolyhedranyadenganmenggunakanlarutanNaNa2CO30,5Msehinggayangdiinfeksikanadalahmultiplenucleocapsidyangberukuranlebihkecil.Halinidapatmempersingkatwaktuuntukmemulaitahappertamadariinfeksivirusyaitupenetrasidanabsorpsi.Padainfeksiin vivo polyhedravirusharusdipecahterlebihdahuluolehlarutanalkalisdarisaluranpencernaanlarvaSpodoptera liturayangmenurutFalconFalcondalamMangoendiharjodanPollet(1991)membutuhkanwaktu0–4jam,selainitusebelummencapaiseltargetvirus jugaharusmenghadapisistemkekebalan inangyangtersebardiseluruhtubuhinang.Tahapberikutnyasetelahpenetrasidanabsorpsitidaktergambarkarenapadapenelitianinipemotretandilakukansetelahselterinfeksiselama24jam.Padawaktuiniterlihatselsudahmembesar/Giant cell (Gambar3)danhampirsemuaorganelseltelahdihancurkan,sertadidalamnyasudahdipenuhidenganrakitanvirus(multiplenucleocapsid).Selainitujugaditemuiselyangsedanglisis,membranselnyaterbuka,danterlihatPIByangakankeluar(Gambar4).

Padaselkulturyangterinfeksi48dan72jam(dilihatdenganmenggunakanmikroskopelektontransmisi)tidakterlihatlagiselyangterinfeksi,yangterlihathanyaPIBsSpLtMNPVyangsudahlengkapdansiapmenginfeksisellain.Sedangkandenganmikroskopinfertedperbesaran400kali,tidaktampakadanyaPIBsmaupunselkultur,yangtampakhanyamediayangkeruhdanpenuhdengandebrissel.HalinidisebabkankarenaseluruhselsudahlisissesampaitinggalPIBsyanglepasdariselkulturtersebut.

Selainwaktulisis,daripemotretanjugadapatdiketahuikemampuantiapselkulturuntukmenghasilkanvirus.Berdasarkanjumlahselkulturyangdinfeksidanjumlahvirusyangdiinfeksikanmakadapatditentukankemampuantiapseldalammemperbanyakvirusyaitukuranglebih2,545PIBs/ml(angkainidiperolehdari23,67×106PIBs/ml;9,3×106sel/ml=2,545PIBs/ml)

Dengandemikiandapatdisimpulkanbahwa lama waktulamawaktulisisdariselprimerepitelususlarvaSpodoptera liturayangdiinfeksidenganSpLtMNPV denganlamainkubasi24,48,dan72 jammenunjukkanbahwaselkulturtersebutmulaimengalamilisis dalamwaktu24jam.DantiapselkulturmampumemproduksiPIBssebanyak2,545.

AsridanDucha 77

KEPUSTAKAAN

AsriMT,2004.PerbanyakanSlNPVsecarain VivopadaLarvaSpodoptera litura.Unesa,Surabaya.

Asri MT 1 dan Isnawati, 2005. Effektifitas dan Karakterisasi SpLtMNPVyangTelahTerpotongMaterialGenetiknya.Unesa,Surabaya.

AsriMT2,FidaR,Yuliani,EvieR,danHerlinaF,2005.PengaruhBeauveria bassiana danSpLtMNPVterhadapLarvaSpodoptera liturapadaTanamanJarak.Unesa,Surabaya.

AsriMTdanNurDucha,2007.UpayaPerbanyakanSpLtMNPVsebagaiBioinsektisidasecaraIn vitrodenganTeknikKulturSelInsekta.Unesa,Surabaya.

Mangoendiharjo,SdanPollet,1991.InsectvirusesandthePossibleAplicationandNPVfortheControlofArmyWormSpodoptera litura.RisalahLokakaryaPengendalianHamaTerpaduTanamanKedelai.DepartemenPertanian.BalaiPenelitianTanamanPangan,Malang.

Naito,Harnoto,danIqbal,1983.PengendalianHamaKedelai.BalaiPenelitianTanaman,Bogor

SudarmoS,1987.Tembakau,PengendalianHamadanPenyakit.Kanisius,Yogyakarta,41–43.