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BIANCA GAZIERI CASTELUCCI
“INFLUÊNCIA DA DEPLEÇÃO DE
MACRÓFAGOS NA REMODELAÇÃO DA SÍNFISE
PÚBICA DE CAMUNDONGOS C57BL6 DURANTE
O FINAL DA PRENHEZ E O PÓS-PARTO.”
Campinas, 2015.
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Resumo
A sínfise púbica (SP) faz parte do conjunto de elementos do sistema
musculoesquelético que oferece suporte aos órgãos pélvicos. Em alguns animais, como
camundongos e cobaias, esta junção fibrocartilaginosa passa por drásticas modificações
hormonalmente reguladas durante a prenhez, resultando no afastamento dos ossos púbicos e
na formação de um ligamento elástico (LiP) que facilita a passagem dos fetos durante o
parto. Assim como o LiP, a cérvice uterina (CV) também sofre extensa remodelação
durante a prenhez e ambos apresentam similaridades no que diz respeito à composição
tecidual, proliferação celular e regulação por relaxina e hormônios esteroides. Embora
alguns achados relacionem o relaxamento da SP da e CV à ativação de uma resposta pró-
inflamatória sem a participação de granulócitos, a participação de outros leucócitos no
remodelamento da SP durante o parto e pós-parto ainda não foi devidamente investigada
em camundongos. Com a finalidade de caracterizar aspectos que envolvem a participação
de leucócitos neste remodelamento realizamos o presente estudo visando à caracterização
morfológica e análise da expressão gênica destas células durante o relaxamento (dias 12, 18
e 19ddg) e a remodelamento da SP no pós-parto (dias 1 e 3dpp) associadas à depleção de
monócitos/macrófago. A análise morfológica demonstrou a presença de
monócitos/macrófagos, positivos para os marcadores dos antígenos 7/4 e F4/80
respectivamente, dispersos na matriz e no interior de lacunas do LiP entre 18ddg e 3dpp nos
grupos controle e tratados. No grupo controle, as análises de PCR em tempo real
demonstraram o aumento da expressão de receptor (Ccr2) característico de monócitos
inflamatórios nos tecidos interpúbicos, no final da prenhez e pós-parto. Durante a separação
viii
dos ossos púbicos, as evidencias indicaram tendência à polarização dos macrófagos
favorável ao fenótipo anti-inflamatório M2 (Arg1). No relaxamento houve aumento dos
fenótipos pró-inflamatório M1 (Il1a, Tnfa) e anti-inflamatório M2 (Il10); enquanto no pós-
parto (1dpp) houve aumento na expressão de genes caraterísticos do fenótipo M1 e queda
da expressão relativa de Arg1, simultaneamente ao remodelamento da matriz necessário a
reorganização da articulação interpúbica. Posteriormente, no 3dpp, apesar da manutenção
dos níveis de expressão de Il1a e Tnfa houve aumento da expressão de Il10, Arg1 e Tgfb,
genes relacionados ao fenótipo M2, o que potencialmente pode ser associado à ativação de
mecanismos de reparo tecidual necessários à reaproximação dos ossos púbicos. A depleção
de monócitos/macrófagos nas etapas de separação e relaxamento dos tecidos interpúbicos,
assim como no 3dpp favoreceu a polarização de macrófagos de fenótipo M1 (Il1a, Tnfa),
resultando em alterações na compactação da matriz extracelular. Este estudo demonstra que
os fagócitos mononucleares são células importantes no processo fisiológico do
remodelamento da SP do camundongo durante a prenhez, parto e pós-parto. Estas células
atuam por meio de mecanismos finamente regulados capazes de garantir o sucesso da
reparação tecidual de estruturas suportes da cavidade pélvica do camundongo.
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Abstract
The pubic symphysis (PS) is part of the musculoskeletal system elements that
provide support to the pelvic organs. In mice, this fibrocartinaginous joint undergoes
hormonally regulated changes during pregnancy involving the pubic bones reabsorption
and formation of an elastic ligament (IpL) that leading to a safe delivery. At this period, the
uterine cervix (UC) also undergoes an extensive remodeling sharing some similarities with
the IpL tissue like connective tissue composition, cell proliferation and hormonal regulation
of that process. Although some findings relate the relaxation of PS and UC to the activation
of a pro-inflammatory response without the granulocytes involvement, others leukocytes
participation in PS remodeling at the delivery and postpartum were not well investigated in
mice. In order to characterize aspects of the participation of leukocytes in the PS
remodeling we conducted the morphological characterization and analysis of gene
expression of these cells during relaxation (12, 18 and 19 days of pregnancy) and the
remodeling of the PS postpartum (1 and 3dpp) associated with the depletion of monocytes /
macrophages. Morphological analysis revealed the presence of positive cells for antigen 7/4
and F4 / 80, monocytes and macrophages respectively, dispersed in the matrix and inside
gaps of the IpL between the 18dp and 3dpp in the control and treated groups. In control
group, the real-time PCR analysis showed increased expression of the characteristic
inflammatory monocytes receptor (Ccr2) at the interpúbicos tissues on late pregnancy and
postpartum. During pubic bones separation, evidences indicated that macrophages
preferentially tend to polarize in the anti-inflammatory phenotype M2 (Arg1). At the
relaxation of IpL pro-inflammatory M1 (Il1a, Tnfa) and anti-inflammatory M2 (I110)
x
phenotypes was increased; in the meantime, parallel to the remodeling of the extracellular
matrix necessary to the interpúbica joint reorganization at postpartum (1dpp), there was an
increase in the expression of genes characteristic of M1 phenotype and decreasing in the
Arg1 relative expression. Subsequently, at the 3dpp, despite the maintenance in expression
levels of Il1a and Tnfa there was an increased in M2 phenotype-related genes expression
(Il10, Arg1 and Tgfb) potentially involved in the activation of tissue repair mechanisms
necessary to pubic bones reapproximation. Depletion of monocytes / macrophages at
separation and interpubic tissue relaxation, as well as 3dpp favored the M1 macrophage
phenotype polarization (Il1a, Tnfa), leading to changes in the extracellular matrix
compression. This study shows that mononuclear phagocytes are important cells in the
physiological process of mice PS remodeling during pregnancy, labor and postpartum.
These cells act through finely regulated mechanisms to ensure the successful tissue repair
of the pelvic support structures in mice.
xi
Aos meus pais, por me ensinarem que o
caminho certo nem sempre é o mais simples. Aos
meus avós pelo apoio e carinho. A minhas irmãs,
pela amizade constante. A meus amigos, pela
compreensão e companheirismo. Ao Rogério, por me
alegrar e me ajudar sempre que precisei.
xii
Este trabalho foi realizado no Laboratório de
Citoquímica e Imunocitoquímica do Departamento
de Bioquímica e Biologia Tecidual do Instituto de
Biologia da Unicamp, pelo Programa de Pós-
Graduação em Biologia Celular e Estrutural, com
auxílio financeiro da Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo, bolsa de Mestrado,
processo número 2012/25038-8.
xiii
Agradecimentos
Aos meus pais, por todos os dias ao meu lado. Sem vocês nunca teria começado esta
carreira. Muito obrigada por fazerem parte da minha vida. Amo vocês, serão sempre meus
maiores exemplos.
As minhas irmãs Bruna e Marcela, de quem, apesar de dizerem por aí que sou o
Richard versão feminina, sinto falta de vocês todos os dias longe de casa. Amo muito vocês
duas, bru e magrela.
Aos meus avós pelo apoio e carinho constantes durante toda minha formação. Me
esforço para um dia possuir ao menos metade da simpatia, alegria, harmonia e simplicidade
de vocês.
Ao Rogério, pelos conselhos mirabolantes, ou não, e pela felicidade que me traz por
estar ao meu lado. Sem você este trabalho teria sido muito mais difícil. Obrigada meu lindo.
Ao Alpha, ou Guilherme, por ser o melhor amigo que poderia sonhar ter. Obrigada
por estar sempre perto e ser uma ótima companhia em todos os momentos.
A Débora, que mesmo em Chicago sempre esteve ao meu lado via WhatsApp ou
Skype, e fez minha vida muito mais feliz. Obrigada pela amizade Dedé. Sinto sua falta.
Ao Sílvio, por ser um grande amigo e muitas vezes um excelente professor.
Obrigada por me ajudar durante todo meu projeto, principalmente nas análises de PCR em
tempo real. Sem você este trabalho nunca teria saído! Espero poder ir ao restaurante
japonês ou dogão com você muitas outras vezes.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Paulo Pinto Joazeiro, pelos conselhos, conversas,
histórias, paciência e compreensão em momentos de crises de ansiedade. Agradeço por ter
xiv
me permitido entrar em seu grupo de pesquisa e por prosseguir com o senhor como
orientador neste mestrado e em meu futuro doutorado. Espero um dia ser tão boa como
pessoa e como profissional quanto o senhor.
A todas as pessoas da sala de pós-graduação do departamento de bioquímica e
biologia tecidual, meus grandes amigos. Vocês são incríveis. Viviane, minha eterna equipe
envolvida e companheira de jogos da copa; Paula, por ser sempre uma diva; Carol, por ter
mania de bichinhos na sua mesa, pelo carinho e alegria, mesmo nos momentos de briga
pelo ar condicionado; Marina, por ser minha filha nas horas vagas e ter a melhor risada que
o mundo já viu; Valquíria, por ser muito fofa; A Mary, por ser um anjo e sempre me ajudar
e ao Diego, o colombiano mais brasileiro que já conheci.
Agradeço às pessoas que foram mais do que amigas durante a recuperação de meu
pé quebrado. Lucimara, pelas caronas e conversas que lhe deram o título vitalício de melhor
companheira de quarto do mundo; Fernanda, por todas as caronas, conversas, almoços
fitness, dicas e corridas que sempre me ajudaram a relaxar e me fizeram muito feliz; Bruno,
pelas caronas, corridas, amizade e por me azucrinar em todos os dias possíveis!
À Natália, a melhor técnica que este mundo já viu. Às meninas da microscopia
eletrônica (Ana, Adriane e Stella) pela ajuda em meu trabalho e pelas risadas nos
momentos de descontração. Ao Matheus pela companhia e auxílio. À Nara e a Marília pela
amizade e pela ajuda em diversos pontos de minha formação. A Letícia, por todos os
almoços, conversas e conselhos. Ao Ricardo pelas conversas extraordinárias.
À Profa. Dra. Lúcia Elvira Alvares, pela convivência e exemplo. Obrigada por ter
me ensinado a purificação de RNA por cloreto de lítio e por ceder o espaço e materiais do
Laboratório de Biologia do Desenvolvimento (Lab. Azul), indispensáveis ao
desenvolvimento das análises de PCR em tempo real deste trabalho.
xv
Ao Prof. Dr. Henrique Marques Souza por me permitir participar como PED nas
aulas de Morfofisiologia II da medicina e por ceder o espaço do L.A.R.G.E. para
desenvolvimento das análises moleculares deste trabalho.
Aos demais professores do departamento pelo exemplo profissional e convívio
agradável.
Ao Prof. Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira por permitir o uso do
microscópio de fluorescência de seu grupo de pesquisa para as análises de imunomarcações
realizadas neste trabalho.
Aos meus amigos da graduação e do coral zíper na boca pelas risadas e pelo
convívio. Sem vocês minha graduação e este mestrado não teriam metade da graça.
Obrigada pela amizade e pela alegria.
À Lilian Panagio, secretária do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e
Estrutural, pelas informações, atenção e suporte a mim prestados.
À Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Pós-Graduação em
Biologia Celular e Estrutural por terem oferecido espaço e oportunidades para meu
crescimento profissional.
Aos órgãos de fomento à pesquisa CNPq e FAPESP cujo apoio financeiro
possibilitou a realização deste trabalho.
xvi
xvii
Lista de Abreviaturas
µg/mL: Microgramas por microlitros;
µL: Microlitros;
µ: Micrômetros;
12ddg: 12º dia de prenhez;
18ddg: 18º dia de prenhez;
19ddg: 19º dia de prenhez;
1dpp: 1 dia pós-parto;
3dpp: 3 dias pós-parto;
ADMITS: A disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin;
ANOVA: Análise de variância, do inglês Analysis of variance;
ARG1: Arginase 1, do inglês Arginase 1;
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool;
BSA: Albumina sérica bovina; do inglês bovine serum albumin.
cDNA: Ácido desoxirribonucleico complementar, do inglês complementary
deoxyribonucleic acid
CCL2: Quimiocina C-C ligante 2, do inglês C-C chemokine ligand 2;
CCR2: Receptor tipo 2 de quimiocinas C-C , do inglês C-C chemokine receptor type 2;
CL2MBP: Diclorometilenobifosfanato do inglês Dichloromethylenebisphosphonate;
CsF1: Fator estimulador 1 de colônia de macrófagos, do inglês Macrophage colony
stimulating fator 1;
Ct: Thershold cycle;
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CV: Cérvice uterina;
CX3CR1: Receptor 1 de quimiocinas CX3C, do inglês CX3C chemokine receptor 1;
DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole;
DNA: Ácido desoxirribonucléico, do inglês Deoxyribonucleic acid;
h: Horas;
IL: Interleucina, do inglês Interleukin;
iNKT: Células T exterminadoras naturais invariantes, do inglês Natural Killer T
invariant cells;
iNOS: Óxido nítrico sintase induzível, do inglês Inducible nitric oxide synthase;
IpL: Interpubic ligament;
LiCl: Cloreto de lítio;
LiP Ligamento interpúbico;
M: Molar;
M1: Macrófagos de ativação clássica;
M2: Macrófagos de ativação alternativa;
mg: Miligramas;
min: Minutos;
mm: Milímetros;
mM: Milimolar;
MMPs: Metaloproteinases, do inglês Metalloproteases;
NK: Células exterminadoras naturais, do inglês Natural Killer Cell;
nm: Nanometros;
NO: Óxido nítrico, do inglês Nitric oxide;
xix
PBS: Tampão fosfato-salino, do inglês Phosphate buffered saline;
PCR: Reação em cadeia da polimerase; do inglês Polymerase chain reaction;
pH: Potencial hiônico;
PS: Pubic symphysis;
PCR: Reação em cadeia da polimerase, do inglês polymerase chain reaction;
RT-PCR: Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa, do inglês Reverse
transcription polymerase chain reaction;
RNA: Ácido ribonucleico, do inglês Ribonucleic acid;
s: Segundos;
SEM: Média do erro padrão, do inglês Standard error of the mean;
SP: Sínfise púbica;
TGFb: Fator transformador do crescimento beta, do inglês Transforming growth factor
beta;
TIMPs: Inibidores teciduais de metaloproteinases, do inglês Tissue inhibitors of
metalloproteinases;
TNFa: Fator de crescimento tumoral alpha, do inglês Tummor necrose factor alpha;
UC: Uterine cervix;
G: Vezes de giros;
DEPC: Diethyl pyrocarbonate.
xx
xxi
Sumário
RESUMO .............................................................................................................................vii
ABSTRACT...........................................................................................................................ix
DEDICATÓRIA....................................................................................................................xi
AGRADECIMENTOS........................................................................................................xiii
LISTA DE ABREVIATURURAS.....................................................................................xvii
1.INTRODUÇÃO...................................................................................................................1
1.1. Sínfise Púbica..............................................................................................................1
1.2. Formação do Ligamento Interpúbico e Remodelamento de sua Matriz Extracelular
Durante a Prenhez em Camundongos.................................................................................3
1.3. Macrófagos e Monócitos: Heterogeneidade e Participação no Reparo Tecidual e
Manutenção da Homeostase...............................................................................................5
1.4. Participação de Monócitos/Macrófagos na Remodelamento de Elementos do Canal
do Parto Durante a Prenhez e o Pós-Parto.........................................................................9
1.5. Depleção de Leucócitos Durante a Prenhez e o Uso de Depleção via Lipossomos no
Estudo de Macrófagos......................................................................................................14
2. OBJETIVOS.....................................................................................................................19
2.1. Objetivo Geral ..........................................................................................................19
2.2. Objetivos Específicos................................................................................................19
3. MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................................21
3.1.Animais, Procedimentos Cirúrgicos e Tratamentos...................................................21
3.2. Processamento Histológico e Análise ao Microscópio de Luz.................................22
xxii
3.3. Processamento Histológico e Análise ao Microscópio Eletrônico............................23
3.4. Imunohistoquímica e Análise ao Microscópio de Fluorescência..............................24
3.5. Análise pela técnica de PCR em tempo real..............................................................25
3.5.1. Desenho de Primers...........................................................................................25
3.5.2. Extração de RNA...............................................................................................26
3.5.3. Precipitação com Cloreto de Lítio (LiCl) .........................................................27
3.5.4.Síntese de cDNA.................................................................................................28
3.5.5. PCR em Tempo Real.........................................................................................29
3.6. Análise Estatística.....................................................................................................29
4. RESULTADOS.................................................................................................................31
4.1. Análise Morfológica e Ultraestrutural da Articulação Interpúbica e de Células
Fagocitárias Presentes em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e
Clodronato........................................................................................................................31
4.1.1. Constatação Previa da Depleção sistêmica de Fagócitos Induzida pelo
Administração de Lipossomos Contendo Clodronato......................................................31
4.1.2. Aspectos do Remodelamento Tecidual da Articulação Interpúbica Durante a
Prenhez e o Pós-Parto em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e
Clodronato........................................................................................................................34
4.1.3. Caracterização Ultraestrutural de Fenótipos Celulares dos Tecidos Interpúbicos
Durante a Prenhez e Pós-Parto em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e
Clodronato........................................................................................................................40
4.1.4 Imunolocalização de Fagócitos Mononucleares na Articulação Interpúbica de
Camundongos dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato Durante a Prenhez e o
Pós-parto...........................................................................................................................45
xxiii
4.2 Análises de aspectos Moleculares Indicativos da Polarização de Fagócitos nas
Resposta Anti e Pró- Inflamatória durante a Remodelação da Articulação Interpúbica de
Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato Durante a Prenhez e o Pós-
Parto..................................................................................................................................54
4.2.1. Análise da expressão de moléculas características da resposta imune pró e anti-
inflamatória via M1/M2 durante o relaxamento do LiP e reparo pós-parto em
camundongos dos grupos Controle, Lipossomo e Clodronato.........................................54
5. DISCUSSÃO.....................................................................................................................61
6. CONCLUSÕES.................................................................................................................79
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................81
8. ANEXOS...........................................................................................................................99
8.1. Certificado e Declaração de Comitê de Ética em Pesquisa Animal..........................99
xxiv
1
1. Introdução
1.1 Sínfise Púbica
A cavidade pélvica de humanos e roedores de ambos os sexos é um conduto ósseo
semicilíndrico retilíneo que possui um dos eixos paralelo à espinha lombo-sacral e o outro
perpendicular e à abertura de saída da cavidade. Dorsalmente, os ossos ísquio- púbico e íleo
- púbico formam ângulos de 90º e 45º, respectivamente, com a espinha lombo-sacral e
ventralmente, convergem para constituir o arco púbico frontal, estabilizado por uma sínfise
fibrocartilaginosa. Esta articulação não sinovial móvel é denominada sínfise púbica e é
formada por um disco de fibrocartilagem interposto entre dois coxins de cartilagem hialina.
Estas estruturas são recobertas anteriormente por aponeuroses de músculos da parede
abdominal, os gráceis e os adutores longos, sendo que a fusão dos dois últimos ao
ligamento arqueado proporciona o suporte para a região anterior e o ligamento púbico
superior promove a sustentação da porção superior (Yiou et al., 2001; Ortega et al., 2003;
Ercoli et al., 2005; Cunningham et al., 2007; Becker et al., 2010 para revisão de bases
anatômicas).
Além de fazer parte do conjunto de elementos do sistema musculoesquelético, a
sínfise púbica (SP) oferece suporte aos órgãos pélvicos. Essa junção fibrocartilaginosa
possui o papel de prover estabilidade e auxiliar na neutralização de forças de compressão
atuantes sobre a pelve durante a movimentação, fato particularmente importante nas fêmeas
(Cunningham et al., 2007). Além disso, a SP apresenta dimorfismo sexual e é
metabolicamente ativa durante a prenhez de alguns modelos animais como camundongos e
2
cobaias, desencadeando em drásticas modificações para acomodação do canal do parto e
rápido reestabelecimento após o parto (Sherwood, 1994; Ortega et al., 2003; Becker et al.,
2010, para consulta das contribuições originais).
O remodelamento tecidual da SP em cobaias e camundongos prenhes resulta no
desenvolvimento de um ligamento interpúbico elástico (LiP) por meio de dois processos
principais: a separação dos ossos púbicos e o relaxamento do LiP. O primeiro tem início no
12º dia de prenhez a partir de quando ocorre o crescimento do tecido fibrocartilaginoso e a
formação do ligamento interpúbico, a reabsorção dos ossos púbicos e a substituição dos
coxins de cartilagem hialina que compõem o ligamento. Já o relaxamento tem início a partir
do 15º dia de prenhez e caracterizando-se pela acentuada reorganização dos tecidos
conjuntivos presentes (Talmage, 1947a, b). Após o primeiro parto, a involução deste
ligamento ocorre em aproximadamente 10 dias, com a restabelecimento de dimensões
semelhantes ao animal não prenhes (Hall, 1947; Storey, 1957; Veridiano et al., 2007).
Na mulher as modificações morfológicas da SP mostram-se discretas durante a
gestação quando comparadas às de modelos animais. Relatos de dores púbicas são
freqüentemente negligenciados no pós-parto, ainda que relativamente comuns (Becker et
al., 2010). Recentemente, minuciosos estudos em mulheres primíparas demostraram que
além das conhecidas lesões nos componentes do assoalho pélvico em indivíduos de grupos
de risco, também são observadas fraturas e edemas de medula dos ossos púbicos assim
como rupturas capsulares ao longo de regiões posteriores e inferiores da sinfise, locais de
intensa atuação das forças de tração. (Brandon, 2011;. Miller et al., 2011; Wei et al., 2012).
3
1.2 Formação do Ligamento Interpúbico e Remodelamento de sua Matriz
Extracelular Durante a Prenhez em Camundongos.
Durante a segunda metade da prenhez, a SP de camundongos sofre influência de
modificações hormonais finamente reguladas que induzem o afastamento dos ossos púbicos
para acomodação e passagem dos fetos pelo canal do parto. O remodelamento da sínfise é
um processo gradual que envolve a reabsorção dos ossos púbicos e peças de cartilagem
hialina, assim como a substituição do disco fibrocartilaginoso por um ligamento interpubico
flexível, dando origem a uma porção de transição osteoligamentosa com características de
enthese fibrocartilaginosa (Sherwood, 1994; Benjamin et al., 2006). Devido à sua
magnitude, este fenômeno foi descrito como a "transformação" ou "metamorfose" da
sínfise púbica em um ligamento interpúbico nos primeiros trabalhos relacionados a tais
alterações teciduais (Gardner, 1936; Hall, 1947; Storey, 1957; Crelin 1969).
O remodelamento da sínfise e o relaxamento do ligamento interpúbico durante a
segunda metade da prenhez requerem o equilíbrio dinâmico e espaço temporalmente
regulado entre deposição e degradação de componentes da matriz extracelular. Se por um
lado, o rearranjo e deposição de fibras colágenas grossas e elásticas neoformadas assim
como o aumento das concentrações de ácido hialurônico de alto peso molecular contribuem
para o suporte biomecânico durante a expansão máxima do ligamento (Moraes et al., 2003;
Pinheiro et al., 2004; 2005; Garcia et al., 2008; Consonni et al., 2012 a; Rosa et al., 2012) ;
por outro lado, as elevações dos níveis de expressões de enzimas como metaloproteinases,
MMP-8 (entre os dias 12 e 15), MMP-2 e -9 (entre os dias 15 e 19), catepsina B, inibidores
teciduais de metaloproteases (TIMP-1 e -2) e a diminuição da expressão de ADMITS (que
degrada versicam) desempenham papéis importantes no remodelamento e relaxamento do
4
tecido interpúbico, logo,necessários a acomodação do canal do parto (Rosa et al., 2008;
2011; 2012).
No que diz respeito aos fenótipos celulares presentes no LiP durante sua formação e
ao longo da prenhez, Crelin (1969) destacou que as modificações resultantes da expansão
gradual desta estrutura estão relacionadas ao potencial de células condrocíticas da sínfise de
“se liberarem de suas lacunas” e adquirirem fenótipo semelhante ao de fibroblastos, como
demonstrado ultraestruturalmente por Linck et al. (1976). Durante a formação do ligamento
ocorre expressão espaço-temporal de Vimentina (V), α-Actina de músculo liso (α-smA) e
Desmina (D) no citoesqueleto de células fibroblásticas do LiP, de modo semelhante às
células fenotipicamente classificadas como miofibroblasto VAD (Moraes et al., 2004).
Estas células possuem reconhecida capacidade proliferativa (Veridiano et al., 2007) e são
capazes de aumentar significativamente a geração de óxido nítrico (NO) por meio da
expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nos momentos que antecedem o
parto (19º. dia da prenhez), contribuindo eficientemente ao relaxamento do LiP e à
acomodação do canal do parto (Moro et al., 2012).
Durante o pós-parto a SP passa por uma série de modificações graduais que
acarretam na formação de um tecido de características morfológicas de fibrocartilagem 40
dias pós-parto (Consonni et al., 2012 b) constituindo em um processo indispensável à
homeostase do trato reprodutivo (Buhimschi et al., 2009). Ao mesmo tempo em que as
fibras de colágeno passam por um processo de recompactação e os níveis de ácido
hialurônico (Rosa et al., 2012) e do proteoglicano versican (Garcia et al., 2008) diminuem
consideravelmente, a ação de MMPs, TIMPS e catepsinas passa por alterações espaço-
temporais durante o pós-parto. A expressão e atividade destas colagenases e gelatinases
5
diminuem progressivamente até atingirem os níveis de animais não gravídicos no terceiro
dia após o parto (Rosa et al., 2011).
1.3 Macrófagos e Monócitos: Heterogeneidade e Participação no Reparo
Tecidual e Manutenção da Homeostase
Monócitos e macrófagos são fagócitos mononucleares com papéis cruciais porém
distintos na resposta imune e manutenção da homeostase tecidual (Ginhoux & Jung, 2014).
Estes fagócitos apresentam populações reconhecidamente heterogêneas resultantes, em
parte, de suas especializações em diferentes tecidos e/ou em microambientes particulares
(Gordon & Taylor, 2005).
Originários da medula óssea ou do baço, monócitos são precursores de macrófagos
e células dentríticas, possuindo função elementar nos processos inflamatórios e defesa
contra patógenos (Gordon & Taylor, 2005; Mosser & Edward, 2008; Soehnlein &
Lindbom, 2010). Em camundongos, estas células podem ser classificadas em duas
principais categorias de acordo com a presença de receptores para quimiocinas específicas.
Os monócitos “residentes” possuem grande expressão de CX3CR1 (receptor 1 de
quimiocinas CX3C) e estão principalmente relacionados ao patrulhamento de vasos
sanguíneos e reparo tecidual. Já os monócitos “inflamatórios” possuem grandes
quantidades de CCR2 (receptor tipo 2 de quimiocinas C-C) e são rapidamente recrutados
para tecidos durante a respostas inflamatórias (Shi & Pamer, 2011).
Uma vez nos tecidos, os monócitos podem dar origem a macrófagos,
particularmente residentes, que possuem papel de destaque durante o desenvolvimento, a
homeostase tecidual e a resolução de processos inflamatórios estéreis (iniciados após
6
injúria tecidual sem presença de microrganismos) ou não estéreis (iniciada pelo
reconhecimento de microrganismos) (Ginhoux & Jung, 2014).
Macrófagos possuem diferentes funções durante respostas distintas. No que diz
respeito a respostas pós-danos teciduais ou infecções como esquematizadas na Figura 1,
estes fagócitos profissionais tendem a apresentar fenótipo pró-inflamatório, também
conhecidos por M1 ou de ativação clássica, produzindo e liberando mediadores e citocinas
que regulam a ativação de mecanismos antimicrobianos da imunidade celular como fator de
necrose tumoral alpha (TNFa), e interleucinas 1, 12 e 17 (IL1, IL12 e IL17) (Gordon, 2003;
Murray & Wynn, 2011).
Figura 1. Representação esquemática da ação dos diferentes tipos de macrófagos nas respostas
inflamatória e de reparo tecidual (Esquema modificado de Murray & Wynn, 2011).
7
Os macrófagos M1 quando ativados produzem reativos intermediários de oxigênio e
nitrogênio como o óxido nítrico, extremamente tóxicos a microrganismos e também
danosos aos tecidos adjacentes, podendo acarretar em inflamações exuberantes geralmente
prolongadas por ativação de resposta de linfócitos T auxiliares 1 e 17 (Th1 e Th17)
(Gordon et al., 2003; Gordon & Taylor, 2005; Murray & Wynn, 2011).
Desta forma, considera-se crucial para ativação de resposta de reparo tecidual e
reestabelecimento da homeostase local que a ação de macrófagos M1 seja contrabalanceada
e regulada por macrófagos anti-inflamatórios, também conhecidos por M2 ou de ativação
alternativa, em um processo conhecido por “inflamação ordenada”. Esta classificação de
macrófagos M2 engloba subpopulações relacionadas a respostas de reparo tecidual,
coativação de resposta imune humoral, resposta a alergias, fibroses e reguladores de
resposta M1 (Gordon et al., 2003; Mantovani et al., 2004; Gordon & Taylor, 2005; Murray
& Wynn, 2011).
Os macrófagos M2 produzem fatores de crescimento como o TGFb (fator de
crescimento tumoral beta) capaz de estimular a diferenciação de fibroblastos em
miofibroblastos, células responsáveis pelo aumento na produção de colágeno assim como
pela produção conjunta a M2 de MMPs e TIMPs, controlando assim o turnover de
elementos de matriz extracelular (MEC). Estes fagócitos também possuem importante
papel na eferocitose, englobamento e digestão de células mortas, debris celulares e
diferentes componentes da MEC, além de produzirem proteínas imunoreguladoras como
interleucina 10 (IL10) e arginase 1 (ARG1), que juntamente a mediadores lipídicos
demonstram ação na diminuição da magnitude e da duração de resposta inflamatória,
promovendo o reparo tecidual assim como a resolução da inflamação. Estes mecanismos
evitam a promoção de resposta de dano tecidual por ação exacerbada de macrófagos M1 e
8
demais células de caráter pró-inflamatório (Gordon et al., 2003; Mantovani et al., 2004;
Gordon & Taylor, 2005; Serhan et al., 2008; Murray & Wynn, 2011).
O favorecimento de respostas pró-inflamatórias induzidas pela ação de macrófagos
M1 durante resolução de inflamação e reparo tecidual em estruturas osteo-articulares é
responsável pelo desenvolvimento de diversas patologias. Em quadros de osteoartrite e
hérnias de disco, o aumento na ativação e polarização de macrófagos de ativação clássica
em respostas a lesões cartilaginosas gera excessiva expressão de fatores pró-inflamatórios
tais quais IL1, TNFa e NO, desencadeando a degradação de componentes de MEC
cartilaginosa (Kato et al., 2004; Kondo et al., 2014; Martel- Pelletier et al., 2008)
Em quadros mais avançados de osteoartrites, o aumento na liberação de MMPs e
agrecanases resultando na destruição da cartilagem e o aumento na produção de citocinas
pró-inflamatórias levam a síntese de IL1, TNFa, prostaglandinas e NO por condrócitos,
desencadeando a apoptose de condrócitos maduros e inibindo a diferenciação de células
progenitoras da linhagem condrocítica (Kondo et al., 2014; Martel- Pelletier et al., 2008).
Processos inflamatórios exacerbados nas entheses dos ossos presentes nas porções
sacro-ilíacas associadas a alterações nas forças biomecânicas podem acarretar no
desenvolvimento de doenças como espondilose anquilosantes com fusão destas junções
pela formação de sindesmoses ou osteófitos (Lories & Haroon, 2014). Além disso, embora
recebam menor destaque que as disfunções do canal de parto que levam ao parto pré-
maturo também relacionadas a alterações nas repostas M1 e M2, as síndromes de prolapso
de órgãos pélvicos afetam cerca de 30% das gestantes, levando a relatos de dores nas
junções sacro-ilíacas na pelve posterior ou na sínfise púbica (Bjelland et al., 2014).
9
1.4 Participação de Monócitos/Macrófagos no Remodelamento de Elementos do
Canal do Parto e Assoalho Pélvico Durante a Prenhez e o Pós-Parto.
O remodelamento dinâmico do tecido conjuntivo durante a prenhez é uma das
características das grandes modificações da histoarquitetura do trato reprodutivo e dos
elementos musculoesqueléticos circundantes para facilitar o parto sem distocia (Croy et al.,
2014). Uma vez que deficiências nos órgãos e estruturas que compreendem tanto o canal do
parto quanto o assoalho pélvico estão fortemente associadas a incontinência urinária e
prolapso genital (Liu et al, 2004; Drewes et al., 2007; Lee et al, 2008; Couri et al., 2014),
que tecidos conectivos anormais podem ser fator chave ao desenvolvimento de desordens
de suporte pélvico (Liu et al. , 2004; Couri et al., 2014) e que o amolecimento antecipado
dos tecidos cervicais levam ao parto pré-maturo, a regulação das modificações estruturais
desencadeadas pela prenhez devem ser finamente moduladas (Mahendroo 2012;Gonzalez
et al., 2009,2011,2013; Gomez-Lopez et al., 2014).
Durante a gestação os macrófagos estão entre as principais populações de leucócitos
no útero de camundongos, dando suporte não só ao remodelamento do tecido conjuntivo
uterino e estruturas associadas mas também a uma variedade de processos essenciais ao
sucesso da prenhez como a regulação da implantação do trofoblasto, imunotolerância a
antígenos fetais, imunomodulaçao de leucócitos, remodelamento de vasos uterinos,
iniciação do trabalho de parto e retorno a histoarquitetura semelhante a de fêmeas não
prenhes logo após o parto (Payne et al., 2012; Brown et al., 2014).
No útero de mamíferos gravídicos, macrófagos estão presentes tanto na camada
endometrial quanto na miometrial no início da gestação. Entretanto, após a decidualização
10
em ratos e camundongos, mecanismos relacionados a concentrações diferenciais de fator
estimulador 1 de colônia de macrófagos (CsF-1) nos distintos compartimentos uterinos
levam a predominância destes fagócitos no miométrio (Tagliani et al., 2011; Brown et al.,
2014, Gomez-Lopez et al., 2014). A ruptura do microambiente uterino, particularmente
durante os primeiros estágios da gravidez (decidualização, implantação e placentação) pode
ter efeitos profundos sobre a atividade de macrófagos e impactar posteriormente o resultado
da gravidez. (Brown et al., 2014; Favaro et al., 2014)
Após o completo desenvolvimento da placenta, a decídua adquire características de
ambiente tipicamente anti-inflamatório, favorecendo a diferenciação de macrófagos M2 que
previnem a rejeição do feto e permitem seu crescimento até o momento do nascimento.
Modificações inapropriadas na polarização de macrófagos em compartimentos da barreira
materno fetal podem acarretar em diversos problemas na gestação, levando até a morte do
feto (Brown et al., 2014).
Infecções no trato reprodutivo durante a prenhez, que induzem alterações nos níveis
de citocinas e infiltrado de leucócitos nos tecidos uterinos estão entre os eventos
relacionados ao parto pré-maturo, indicando a importância dos mecanismos de regulação de
resposta imune para a manutenção e desenvolvimento normal da prenhez (Shynlova et al.,
2013). Desta forma, é indispensável que somente nos dias precedentes ao parto ocorra o
influxo intenso de macrófagos para a decídua, miométrio, membrana fetal e cérvice uterina,
levando a alteração na distribuição espacial de macrófagos uterinos e posteriormente ao
início da indução do parto normal e remodelamento uterino após o parto (Tagliani et al.,
2011; Brown et al., 2014, Gomez-Lopez et al., 2014).
Em mulheres, estudos apontam a associação de abortos espontâneos durante as
primeiras 12 semanas de gestação a um influxo de macrófagos para a decídua que
11
possivelmente possuiriam características de macrófagos M1. Em paralelo, a excessiva
ativação de macrófagos M1 nas camadas subendoteliais das artérias espiralares presentes na
decídua durante sua etapa de remodelamento pode levar a quadros de aterose uterina no fim
da prenhez, desencadeando em complicações na gestação como pré-eclâmpsia, restrição no
crescimento fetal e desenvolvimento de doenças autoimunes (Brown et al., 2014, para
consulta às contribuições originais).
A cérvice uterina, assim como as demais porções uterinas e a SP, passa por
alterações graduais hormonalmente reguladas em sua estrutura e composição durante a
prenhez em camundongos. Estas modificações podem ser classificadas em três etapas que
se sobrepõem: 1) “softening” - fase observada por volta do 12º dia de prenhez caracterizada
por progressivo afrouxamento do tecido cervical -2) “ripening e dilatação” - etapas
observadas por volta do 18º dia de prenhez; -e 3) reparo pós-parto (Timmons &
Mahendroo, 2006; Timmons et al., 2009; Timmons et al., 2010; Akins et al., 2011;
Mahendroo, 2012).
Durante a primeira metade da prenhez de camundongos, a interação entre leucócitos
positivos para antígeno 7/4 (neutrófilos e monócitos) e macrófagos presentes no epitélio e
estroma cervicais, respectivamente, auxilia na manutenção de mecanismos de vigilância
que previnem possíveis infecções na mucosa cervical durante o softening (Read et al.,
2007). Esta interação, mantida nas etapas de ripening e reparo pós-parto, garante a
integridade do epitélio cervical e a manutenção da barreira física necessária a proteção da
matriz extracelular em remodelamento (Read et al., 2007; Gomez-Lopez et al., 2014).
O ripening, seguido da dilatação, é a fase que culmina na perda da integridade
biomecânica e em modificações da histoarquitetura da cérvice (Timmons & Mahendroo,
2006; Timmons et al., 2009; Timmons et al., 2010; Payne et al., 2012; Mahendroo, 2012).
12
Semelhante ao observado no relaxamento do LiP, nesta fase há elevados níveis séricos de
estrógeno e baixos níveis de progesterona desencadeando o aumento da produção de ácido
hialurônico de baixo peso molecular e glicosaminoglicanos que se associam a estas
moléculas assim como em alterações na solubilidade das fibrilas de colágeno e
vascularização cervicais que além de indispensáveis ao parto a termo, favorecem a
diapedese de leucócitos (Rodriguez et al., 2003; Timmons & Mahendroo, 2006; Gonzalez
et al., 2009; Timmons et al., 2009; Akgul et al., 2012; Payne et al., 2012).
Tais modificações levam à dilatação e ao amolecimento da cérvice, que em conjunto
às contrações uterinas e relaxamento do LiP, auxiliam na expulsão do feto durante o parto
(Becker et al., 2010; Timmons et al., 2010; Mahendroo, 2012; Gonzalez et al., 2013;
Gomez-Lopez et al., 2014). Na mulher, assim como em modelos animais, disfunções na
migração de células meloides durante a gestação podem acarretar no amolecimento precoce
da cérvice uterina, levando ao parto pré-maturo (Timmons & Mahendroo, 2006; Gonzalez
et al., 2011; Gonzalez et al., 2013; Gomez- Lopez et al., 2014).
No que diz respeito à diapedese de leucócitos na cérvice uterina do camundongo
durante a prenhez, acreditasse que monócitos são atraídos para a cérvice pelo
reconhecimento de quimiocinas CCL2 por meio de receptores CCR2 específicos (Timmons
et al., 2009; Menzies et al., 2012). Desta forma, uma vez no estroma cervical, os monócitos
se diferenciam em macrófagos que desempenham diversos papéis durante o remodelamento
da cérvice na prenhez (Timmons & Mahendroo, 2006; Gonzalez et al., 2009; Timmons et
al., 2009; Menzies et al., 2012; Payne, et al., 2012).
No entanto, até o presente momento, nota-se que não há consenso no que diz
respeito à contribuição de monócitos/macrófagos no amolecimento (ripening) da cérvice
uterina no final da prenhez (Gomez-Lopez et al., 2014). Se por um lado, afirma-se que
13
mesmo com o aumento de MMPs ao longo deste processo, monócitos e macrófagos apesar
de presentes não estão ativos nem são responsáveis pela produção de tais moléculas na
cérvice de camundongos durante o parto a termo (Gonzalez et al., 2009; Timmons et al.,
2009; Timmons et al., 2010; Gonzalez et al., 2011; Menzies et al., 2012; Gonzalez et al.,
2013); por outro lado, o emprego de imunohistoquímica e citometria de fluxo evidenciou a
presença de macrófagos relacionada ao aumento de fatores pró-inflamatórios no estroma
cervical no último dia de prenhez e no momento do parto (Payne et al., 2012).
Evidencias apontaram que monócitos atraídos durante a prenhez à cérvice uterina se
diferenciam em macrófagos com ação pró e anti-inflamatórios indispensáveis à fase de
reparo após o parto (Timmons et al., 2009; Mahendroo, 2012, Menzies et al., 2012). De
acordo com estes autores, macrófagos M1 teriam importante ação contra a invasão de
microrganismos oportunistas tanto no parto quanto no pós-parto (Timmons et al., 2009;
Payne et al., 2012) assim como no distanciamento entre moléculas da matriz extracelular
necessário ao ripening (Payne et al., 2012); já macrófagos M2 teriam papel de reparo
tecidual e respostas supressão e controle da inflamação predominantemente durante o
período de remodelamento pós-parto (Timmons et al., 2009; Mahendroo, 2012).
Além da presença de processos dependentes de monócitos e macrófagos no
remodelamento de órgãos e estruturas do canal parto, relatos da literatura evidenciaram a
participação destes tipos celulares no remodelamento do tecido adiposo parametrial
associado aos órgãos da pelve e do canal de parto que a exemplo da SP do camundongo
respondem ao estresse da prenhez. No tecido adiposo parametrial foi observado um
desequilíbrio na polarização destes fagócitos, com favorecimento de macrófagos M1 em
camundongos e humanos (Zhang et al., 2011; Resi et al., 2012). Uma vez ativadas, estas
células aumentam a secreção de fatores pró-inflamatórios na corrente sanguínea e deste
14
modo, contribuem à ativação e desencadeamento de resposta sistêmica e tecidual como
aquela observada por Zhang e colaboradores (2011) em camundongos no 17º dia da
prenhez.
No que diz respeito aos modelos animais nos quais ocorre o relaxamento da SP
durante a prenhez foram observadas diferenças significativas quanto a participação de
leucócitos neste fenômeno. Na cobaia foi verificada a infiltração de granulócitos,
eosinófilos e neutrófilos (Rodriguez et al., 2003), enquanto no camundongo este tipo de
infiltração não foi observada (Consonni et al., 2012b; Rosa et al., 2008; 2011). Apesar da
elevação nos níveis de óxido nítrico e MMPS ao fim da prenhez que contribuem para o
rápido relaxamento do LiP antes do parto, até o presente momento não há relatos sobre o
reconhecimento de agentes capazes de desencadear a produção destes fatores.
Tendo em vista a extensa participação de macrófagos nas modificações de estruturas
constituintes do trato reprodutivo, canal de parto e cintura pélvica durante a prenhez e após
o parto assim como as similaridades na regulação hormonal e componentes de matriz
extracelular nestes períodos entre a SP e a cérvice uterina (CV), o estudo da participação e
atuação destes tipos celulares no remodelamento da SP permitiria melhor compreensão de
mecanismos envolvidos no relaxamento do LiP durante o parto assim como no rápido
reestabelecimento da histoarquitetura da SP como elemento da pelve no pós-parto.
1.5 Depleção de Leucócitos Durante a Prenhez e o Uso de Depleção via
Lipossomos no Estudo de Macrófagos.
A resposta imune materna é um dos elementos cruciais ao desenvolvimento e
sucesso da prenhez (Negish et al., 2012). Tendo em vista que a remoção de células do
15
sistema imunológico de seus ambientes naturais é um dos mecanismos mais efetivos pelos
quais a imunidade é estudada (McGavern & Dustin, 2009), a utilização de distintas
estratégias de depleção leucocitária in vivo tem sido de grande ajuda na compreensão das
funções destes tipos celulares durante a gestação em mamíferos (Guimond et al., 1997).
O uso de animais geneticamente modificados, knockouts, para NKs (células
exterminadoras naturais) e a depleção de células dentríticas pelo uso de anticorpos
específicos durante a primeira metade da prenhez demonstraram ação abrangente, causando
desde diminuição nos sítios de implantação e redução no tamanho dos fetos até à aterose de
artérias uterinas e pré-eclâmpsia, indicando ação destes tipos celulares no remodelamento
de artérias espiralares uterinas, placentação, desenvolvimento fetal e posterior sucesso da
prenhez (Favaro et al., 2014; Yamada et al., 2014; Guimond et al., 1997; Negishi et al.,
2012).
Falhas nos mecanismos de tolerância imunológica desencadeadas pela depleção de
linfócitos T regulatórios levam a rejeição fetal, demonstrando a necessidade da atuação de
células da imunidade adaptativa na manutenção da prenhez (Aluvihare et al., 2004). Além
disso, interferências nas interações entre linfócitos T, NKs e células dentríticas em
camundongo knockout para células NKT indutíveis (iNKTs) podem estar relacionadas a
indução de inflamação coriônica e posterior parto pré-termo (Li et al., 2012).
A depleção de células presentes no timo e no baço destacam as modificações
fisiológicas geradas em órgãos imunes primários e secundários durante a prenhez assim
como a importância destes eventos para a manutenção da gestação (Shinomiya et al., 1991;
Hedge et al., 2001). Animais com depleção de timócitos na primeira metade da prenhez
possuem alterações na ação de macrófagos presentes no fígado, afetando o metabolismo e
imunidade maternos ao longo da gestação (Shinomiya et al., 1991); já a esplenectomia de
16
animais não prenhez uma semana antes ao primeiro dia de gestação leva a significantes
atrasos na decidualização e desenvolvimento placentário, indicando este órgão como
importante progenitor de NKs destinadas ao útero durante a prenhez (Zavan et al., 2012).
No que toca a atuação de células fagocitárias no remodelamento de estruturas do
canal de parto de camundongos, Timmons e Mahendroo (2006) detalharam a não
participação de neutrófilos tanto no remodelamento da cérvice no fim de prenhez como nos
mecanismos que desencadeiam o ripening cervical, dado que a depleção destes tipos
celulares via administração de anticorpos para antígeno 7/4 não desencadeia em alterações
no tempo ou sucesso do parto em animais selvagens.
No que diz respeito às estratégias mais difundidas para a identificação ou
envolvimento de monócito/macrófagos em determinadas vias biológicas estão:
administração de sílica; de anticorpos anti-glicoproteína F4/80 ou de lipossomos contendo
clodronato (Van Rooijen & Sandres, 1994; Gonzalez et al., 2009; 2011; Chow et al., 2011).
Estas estratégias diferem entre si quanto à especificidade da inativação de macrófagos,
entretanto, as duas últimas afetam outros tipos celulares em menores proporções (Van
Rooijen & Sandres, 1994; Gonzalez et al., 2009; Chow et al., 2011). No entanto, ressalta-se
que o aumento nas concentrações de colesterol e fosfolipídios catiônicos na composição
dos lipossomas carreadores de fármaco assim como diferentes vias de administração e
tecidos alvo podem acarretar na ação do veículo sobre as células fagocitárias, levando à
ativação de mecanismos de resposta imunitária, interação com componentes lipídicos do
plasma, bloqueio da capacidade fagocítica ou até mesmo à depleção destas células (Dave &
Patel., 1986 ; Van Rooijen & Sandres, 1994, Filion & Phillips, 1997; Weisser et al., 2012).
Lipossomos contendo clodronato (Cl²MBP), uma substância não tóxica quando livre
na corrente sanguínea, possuem tamanho e composição lipídica específicos que garantem
17
seu reconhecimento por macrófagos. Após endocitose, os lipossomos contendo este
fármaco sofrem ação de fosfolipases presentes nos endossomos e liberam o Cl²MBP no
meio intracelular. Uma vez que esse agente apresenta baixos níveis de transporte por
membranas celulares, ele se acumula nos monócitos/macrófagos induzindo a morte dessas
células (Krolmer et al., 2005; Ziegler & Groscurt, 2014) graças a despolarização da
membrana mitocondrial e posterior liberação de citocromo C e ativação de caspases (Van
Rooijen & Sandres, 1994; Lehenkari et al., 2002).
De acordo com Buiting e colaboradores (1996) a depleção de macrófagos em determinados
tecidos por meio desta estratégia in vivo deve ser avaliada 48 horas após a aplicação de
lipossomos contendo clodronato, uma vez que nos primeiros dois dias após o tratamento
ocorre a retirada de lipossomos e clodronato da corrente sanguínea assim como de debris
celulares resultantes da apoptose dos macrófagos afetados.
Recentemente verificou-se que lipossomos contendo clodronato, além de
desencadearem a depleção de macrófagos, mostraram-se eficazes na depleção de células
CD115 classificadas como monócitos circulantes, diminuindo os níveis destas células no
sangue em mais de 90% (Wang et al., 2012). Além disso, no que diz respeito à ação do
clodronato sobre estruturas cartilaginosas, ensaios in vitro demonstram que este fármaco
possui efeito anabólico em cartilagens articulares graças a sua interação com receptores
purinérgicos, desencadeando no aumento da produção de proteoglicano e demais elementos
de matriz extracelular. Estes dados reafirmam seu potencial uso como terapia
complementar em doenças cartilaginosas degenerativas como a osteoartrite e a artrite
reumatoide (Rosa et al., 2014).
Tendo em mente que a elucidação de processos de remodelamento de tecidos em
modelos animais pode alicerçar escolhas de novos alvos para investigação biomédica,
18
empregamos a depleção de leucócitos por meio da administração de lipossomos contendo
clodronato como estratégia para identificar aspectos que possam ser associados à atuação
de células leucocitária durante as etapas de separação dos ossos púbicos, relaxamento do
LiP e o remodelamento da sínfise púbica no pós-parto.
19
2. Objetivos
2.1. Objetivo Geral:
Tínhamos por objetivo principal analisar a participação de monócitos/macrófagos durante o
relaxamento da SP no fim da prenhez e na etapa de reorganização de sua histoarquitetura nos
primeiros dias pós-parto em camundongos. Para tal, lançamos mão de estratégia para
depleção de monócitos/macrófagos e posteriores análises morfológica e de expressão gênica
de moléculas de sinalização destes tipos celulares nos tecidos interpúbicos.
2.2. Objetivos Específicos:
a) Caracterizar morfologicamente, com emprego das técnicas de microscopia de luz e
eletrônica de transmissão, as células leucocitárias presentes nos tecidos interpúbicos de
camundongos aos 12ddg (controles) e de animais dos grupos que compreendem o final da
prenhez e o pós-parto, tratados ou não com lipossomos contendo clodronato;
b) Realizar estudo imunohistoquímico de marcadores de monócitos/neutrófilos e
macrófagos nos tecidos de animais descritos no item a, utilizando anticorpos específicos para
antígeno 7/4 e glicoproteína F4/80 com emprego de microscopia de fluorescência;
c) Quantificar a expressão de genes envolvidos nos processos de recrutamento de
monócitos (Ccr2), diferenciação e ativação de macrófagos pró-inflamatórios M1 (Il1a, Tnfα)
e macrófagos anti-inflamatórios M2 (Arg1, Tgfβ, Il10) nos tecidos e animais descritos no
item a, utilizando a técnica de PCR em tempo real.
20
21
3. Materiais e Métodos
3.1. Animais, procedimentos cirúrgicos e tratamentos
Foram utilizados camundongos virgens da linhagem C57BL/6, de ambos os sexos,
com cerca de 4 a 5 semanas, provenientes do CEMIB/UNICAMP. As estratégias para
manutenção, manuseio, acasalamento, verificação do estágio da prenhez de animais e
procedimentos cirúrgicos foram semelhantes àquelas empregadas por Rosa et al. (2008) e
aprovadas pelo CEUA/UNICAMP - Comissão de Ética no Uso de Animais/IB-Unicamp (nº
protocolo 2995-1/Anexo). Aos 10 (10ddg), 16 (16ddg), 17(17ddg), 18(18ddg) dias da
prenhez e no primeiro dia após o parto (1dpp), os animais receberam por via intraperitoneal,
alíquotas de 200 µl de PBS (controle), 200 µl de Encapsome® (lipossomo com tampão
fosfato-PBS) e 200 µl de Clodrosome® (lipossomo com clodronat o), de acordo com as
recomendações do fabricante (Encapsula Nano Sciences; www. encapsula. com).
Dois dias após o tratamento, as fêmeas foram sacrificadas por aprofundamento de
anestesia (Ketamina e Cloridrato de Xilazina, 200 e 5 mg respectivamente) e tecidos
interpúbicos foram coletados, bem como amostras de cérvice uterina e baço de cerca de 13
animais, para cada um dos grupos/períodos: 12ddg (animais prenhes nos quais ainda se
observam todos os componentes da SP e por isso tomados como controle), 18ddg, 19ddg (dia
do parto) da prenhez; 1dpp e 3dpp (dias pós-parto). Após laparotomia, as amostras teciduais
foram dissecadas e submetidas ao processamento adequado para as técnicas desejadas
especificadas nos tópicos a seguir. Foram utilizadas amostras de tecidos de dois animais de
cada grupo/período para os métodos de análises de microscopia de luz convencional e
22
eletrônica de transmissão, 3 para cada grupo de análise por imunohistoquímica e 3 ou 6 para
PCR em tempo real, como indicado na tabela abaixo:
Tabela1. Quantidade de animais utilizados por cada dia de estudo para realização das técnicas nos
diferentes tratamentos.
Grupos
Experimentais
Tratado com PBS
(Controle)
Tratado com lipossomo
contendo PBS
(Lipossomo)
Tratado com lipossomo
contendo Clodronato
(Clodronato)
Dias de Estudo 12ddg 18ddg 19ddg 1dpp 3dpp 12ddg 18ddg 19ddg 1dpp 3dpp 12ddg 18ddg 19ddg 1dpp 3dpp
Nº
An
imai
s p
or
An
ális
e
Mo
rfoló
gic
a
Historresina 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Microscopia de
Eletrônica 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Mo
lecu
lar Imunohistoquímica 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
PCR Real Time 6 3 3 3 6 6 3 3 3 6 6 3 3 3 6
Total de Animais por Grupo Experimental: 56 Total de Animais Geral: 168
3.2. Processamento Histológico e Análise ao Microscópio de Luz
Fragmentos de tecidos foram fixados em paraformaldeído 4% (Merck, Darmstadt,
Germany) em solução-tampão de fosfato 0,1M (pH 7,4), durante 24 horas a 4º C. Para fins de
análise morfológica, os tecidos interpúbicos foram descalcificados em solução de ácido
etilenodiamino tetra-acético 5% (EDTA, Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA) com
2% de paraformaldeído em PBS 0,05M (pH 7,4) por cinco dias a 4ºC. Posteriormente, as
amostras foram processadas pelas técnicas histológicas convencionais para embebição em
Resina Glicol-metacrilato (Historresina–Leica- Áustria). Cortes de 3µm foram corados por
coloração de Rosenfeld por meio de técnicas histológicas básicas empregadas em estudos da
sínfise (Consonni et al 2012 a, b). Os materiais foram documentados em fotomicroscópio
23
Eclipse 800 (Nikon, Japão), utilizando-se câmera digital Coolsnap (Media Cybernetics,
USA).
3.3. Processamento Histológico e Análise ao Microscópio Eletrônico
As amostras de tecidos foram fixadas em solução fixadora contendo glutaraldeído
2,5% (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA), ácido tânico 0,5% (Electron
Microscopy Science) dissolvidos em tampão cacodilato de sódio 0,1M de pH 7,2, à
temperatura ambiente, durante 3 horas. Posteriormente, as amostras foram lavadas em
tampão cacodilato de sódio de mesma molaridade, pós-fixadas em tetróxido de ósmio 1%
(Electron Microscope Science) a 4ºC durante 1h. Logo após procedeu-se à desidratação pela
acetona em concentrações crescentes. Os fragmentos de tecidos foram pré-embebidos em
mistura de acetona e resina Epon (Electron Microscope Science) na proporção de 1:1, 1:3
durante 2h cada e embebidos em resina Epon pura overnight semelhante aos processamentos
de amostras de sínfise púbica de camundongos realizados por Moraes et al. (2004), Rosa et
al. (2008) e Consonni et al. (2012 a,b). As amostras foram então incluídas em resina pura e
mantidas em estufa a 60ºC, durante 72 horas. Desse material, para estudo morfológico e
análise de fenótipos celulares da área de interesse, foram obtidos cortes semi-finos (1µm)
corados a quente em solução de 0,5% de Azul de Toluidina (Kiernan, 1999). Desse material,
foram obtidos cortes ultrafinos de 70nm coletados em grades de cobre e contrastados com
acetato de uranila e citrato de chumbo. Os cortes ultrafinos foram estudados e micrografados
no microscópio eletrônico de transmissão LEO 906 do Laboratório de Microscopia
Eletrônica (LME) do IB-Unicamp.
24
3.4 Imunohistoquímica e Análise ao Microscópio de Fluorescência
Amostras de sínfises e ligamentos interpúbicos de fêmeas dos grupos em estudo
foram coletadas, imersas e congeladas em n-heptano e armazenadas a -80ºC. Posteriormente
os tecidos interpúbicos foram embebidos com Tissue Tek (Sakura, EUA) e criocortes de 8μm
foram realizados utilizando-se o criostato (CM1850, Leica Microsystems, Wetzlar,
Alemanha) a -25ºC. Em seguida, as lâminas foram fixadas com acetona gelada por 3min,
lavadas em PBS 0,1M e armazenadas a -20ºC.
Para realização dos ensaios de imunohistoquímica, as lâminas contendo os criocortes
previamente fixados foram incubadas nas etapas que se seguem:
1) Lavagem em PBS 0,1M (pH 7,4) durante 5min à temperatura ambiente;
2) Após a lavagem, as lâminas foram secas até as bordas dos cortes e sobre eles foram
depositados aproximadamente 50μL dos meios de incubação que se sucedem:
Albumina de soro bovino (BSA) 1% dissolvido em PBS 0,1M pH 7,4, durante 30min
à temperatura ambiente, em câmara úmida;
3) Para cada reação, foi aplicado anticorpo primário especifico (vide abaixo) diluído
em 1% de BSA/PBS 0,1M pH 7,4 e incubado overnight em câmara úmida a 4ºC;
Antígeno 7/4 (Neutrophil 7/4): anticorpo monoclonal obtido em rato que reconhece
monócitos e neutrófilos (Serotec, Raleigh, NC, USA).
BM8: anticorpo monoclonal obtido em rato que reconhece a glicoproteína F4/80 de
macrófagos (BACEM Biosciences, Inc., King of Prussia, PA).
4) Na manhã seguinte, foram realizadas lavagens com PBS 0,1M pH 7,4, em duas
etapas de 5min cada à temperatura ambiente;
25
5) Para cada reação, foi utilizado o anticorpo secundário anti-imunoglobulina G de
rato, obtido em cabra (1:900; Alexa Fluor® 488), diluído em PBS pH 7,4 e incubado durante
1h à temperatura ambiente, em câmara úmida;
6) Lavagens com PBS 0,1M pH 7,4 em duas etapas de 5min à temperatura ambiente;
7) Lavagens em PBS 0,1M pH 7,4 em duas etapas de 5min à temperatura ambiente;
8) Incubação com DAPI (sc-3598, Santa Cruz, CA, EUA) 1:1000, diluído em tampão
PBS 0,1M pH 7,4 durante 5min;
9) Lavagens com PBS 0,1M pH 7,4 em duas etapas de 5min à temperatura ambiente;
10) Montagem das lâminas em VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Labs,
Burlingame, CA, EUA).
Como controle negativo da reação a etapa de incubação com o anticorpo primário, foi
omitida. Os materiais foram documentados em microscópio de fluorescência Leica
DM5500B nas objetivas de 20x e 40x.
3.5. Análise pela técnica de PCR em tempo real
As estratégias que foram utilizadas para análise quantitativa de genes em LiP e SP de
camundongos foram aquelas padronizadas em nosso laboratório e descritas por Consonni et
al. (2012 a) com emprego da técnica de PCR em tempo real, conforme os itens que se
seguem;
3.5.1. Desenho de Primers
As sequências específicas de oligonucleotídeos para Ccr2, Il1a, Tnfa, Arg1, Tgfb,
Il10, e 36b4 (gene normalizador endógeno) foram obtidas do GenBank Database do National
26
Center for Biotechnology Information (NCBI) of the National Institutes of Health. Então os
primers foram desenhados com o auxílio do Primer Express 3. 0 Software for Real-Time
(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), verificados pelo BLAST e, assim, a confecção
desses primers (Tabela 2) foi solicitada à Exxtend- solução em oligos (Rua dos Estados,
1377, Paulínia - SP, 13140-536) e Invitrogen Brasil Ltda.
Tabela 2. Sequências de primers forwars e reverse obtidos no NCBI e utilizados na quantificação da
expressão dos genes Ccr2, Arg1, Il10, Il1a, Tgfb, Tnfa e 36b4 de Mus musculus por meio da técnica
PCR em tempo real.
Gene Primer Forward Primer Reverse
NCBI
Reference
Sequence
Ccr2 AAGACCAGAAGAGGGCATTG CCGTGGATGAACTGAGGTAA NM_009915.2
Arg1 TGGCAGAGGTCCAGAAGAAT AGCATCCACCCAAATGACAC NM_007482.3
Il10 CGGGAAGACAATAACTGCAC GGCAACCCAAGTAACCCTTA NM_010548.2
Il1A TTGCTGAAGGAGTTGCCAGA GCACCCGACTTTGTTCTTTG NM_010554.4
Tgfβ GACCCTGCCCCTATATT CCGGGTTGTGTTGGTTG NM_011577.1
Tnfα ACGGCATGGATCTCAAAGAC AGATAGCAAATCGGCTGACG NM_013693.2
36b4 CACTGGTCTAGGACCCGAGAAG GGTGCCTCTGGAGATT NM_007475.5
3.5.2. Extração de RNA
Após laparotomia realizada com emprego de materiais cirúrgicos estéreis, os tecidos
interpúbicos (SP e LiP) e os órgãos anteriormente citados foram removidos e imediatamente
transferidos para nitrogênio líquido e posteriormente armazenados à -80ºC. O RNA total de
amostras de SP foi extraído e isolado utilizando-se o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo o
protocolo do fabricante que prevê maceração de amostras em eppendorfs contendo 1mL de
Trizol; encubação durante 5min à temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados
200μL de clorofórmio (isento de RNase) a cada amostra, seguidos de agitação durante 15s e
27
incubação durante 3min, à temperatura ambiente. Na sequência, o material foi centrifugado a
12000G por 15min a 4ºC. Após a centrifugação, a fase aquosa superior foi removida
cuidadosamente para evitar contaminação por proteínas ou DNA genômico. Em seguida,
foram adicionados 500μL de isopropanol, incubados durante 10min à temperatura ambiente
e, novamente, o material foi centrifugado a 12000G durante 10min a 4ºC, detectando-se a
formação de um pellet na parede do tubo ao fim do procedimento. Após essa etapa, o
sobrenadante foi removido e 1mL de álcool etílico 70% a 4ºC foi adicionado; a solução
resultante foi centrifugada a 7000G por 5min a 4ºC. Finalmente, o sobrenadante foi retirado e
o pellet permaneceu durante 10min exposto para secar. Em seguida, o material foi reidratado
com 20μL de água DEPC (Diethyl pyrocarbonate). A avaliação da integridade das amostras
RNA total obtidas foi feita por meio da eletroforese em gel de agarose a 1% na cuba
horizontal, com corrente contínua a 100V durante 35min. Após a verificação da extração por
meio do gel de agarose, o RNA total foi quantificado com auxílio do NanoDrop (ND-1000
Spectrophotometer). Em seguida, alíquotas dos materiais foram armazenadas a -80ºC.
3.5.3. Precipitação com Cloreto de Lítio (LiCl)
Para purificação de amostras de RNA contaminadas com Trizol, fenóis ou sais foram
adicionados à 20µl de amostra 100 µl de água DEPC, 10 µl de LiCl 4M e 300 µl de etanol
100% (gelado) e posteriormente armazenada por 30min à -80ºC. Após retirada do biofreezer,
a amostra foi centrifugada a 13000 G por 15 min a 4ºC. Na sequência foi descartado o
sobrenadante, adicionado 1 mL de etanol 70% a 4ºC e a solução resultante centrifugada à
13000 G por 5 min a 4ºC. Finalmente, o sobrenadante foi retirado e o pellet permaneceu
exposto para secar por 10 min a temperatura ambiente. Em seguida, o material foi reidratado
com 17μL de água DEPC. A avaliação da integridade das amostras RNA total após
28
precipitação com LiCl também foram obtidas por meio da eletroforese em gel de agarose a
1% na cuba horizontal, com corrente contínua a 100V durante 35min. Após a verificação da
extração por meio do gel de agarose, o RNA total pós-precipitação foi quantificado com
auxílio do NanoDrop (ND-1000 Spectrophotometer) e em seguida armazenadas a -80ºC.
3.5.4. Síntese de cDNA
Para síntese de cDNA, foi utilizado o Revertaid H Minus First Strand cDNA
Synthesis Kit (Fermentas, Maryland, EUA) conforme as instruções do fabricante; descritas
brevemente: À 1μg de RNA total obtido anteriormente foi adicionado 1μL de oligo(dT)18
primers (0,5μL/μL) e o volume final do produto de reação foi completado até 12μL de água
DEPC. Posteriormente, as amostras foram encubadas a 65ºC por 5min no termociclador. Em
seguida, em cada amostra, foram adicionados 8μL da mistura contendo: 4μL de 5x reaction
buffer, 1μL de Ribolock Ribonuclease inhibitor (20u/μL), 2μL de 10mM dNTP mix e 1μL de
RevertAid H Minus M-MuLV RT (200 u/μL), completando o volume final da reação para
20μL. Em seguida, as amostras foram incubadas no termociclador (90min a 42ºC e 5min a
70ºC). As amostras foram quantificadas com auxílio do NanoDrop, aliquotadas e
armazenadas a -80ºC.
Após a síntese de cDNA, foram efetuados testes dos primers utilizando os moldes de
cDNA recém-confeccionados por meio do RT-PCR (Taq DNA polymerase, Fermentas). As
alíquotas foram compostas por 4,5μL de Mix PCR (1x tampão Taq DNA polimerase, dNTP
0,2mM, MgCl2 1,5mM), 1,25μL de DMSO, 2μL de cDNA, 2μL de primers F+R (10mM),
0,125μL de Taq, 15,125μL de água DEPC. Em seguida, as amostras foram incubadas no
termociclador de acordo com o seguinte programa: etapa 1 (1 ciclo: 95ºC – 1min), etapa 2 (5
ciclos: 95ºC – 1min, 65ºC – 30s, 72ºC – 1min), etapa 3 (30 ciclos: 95ºC – 30s, 60ºC – 30s,
29
72ºC – 1min), etapa 4 (1 ciclo: 72ºC – 10min). A avaliação da reação da PCR foi feita por
meio da eletroforese em gel de agarose a 2% na cuba horizontal, com corrente contínua a
100V durante 30min com ladder de 100pb.
3.5.5. Real-Time PCR
Para cada reação foram utilizados 5μL de SYBR Green PCR Master Mix (Applied
Biosystems), 2μL de cDNA (200ng/uL), 3,5 μL de água DEPC, 0,5 μL de primer F (3mM) e
0,5uL de primer R (3mM) no seguinte programa: etapa 1 (1 ciclo: 50ºC – 2min, 95ºC –
10min), etapa 2 (45 ciclos: 95ºC – 15s, 60ºC – 1min). As reações de cada animal foram feitas
em triplicata (3x 21μL) utilizando placa apropriada para o termociclador Applied Biosystems
7500, presente no Laboratório Nacional de Biosciências/CNPEM, Campinas-São Paulo. O
gene normalizador (36B4) foi avaliado e padronizado previamente por Rosa et al., 2011. Os
resultados serão foram normalizados usando os valores de Ct (threshold cycle) do gene 36B4
da mesma placa. Para quantificar a expressão gênica relativa, foi utilizado o modelo
matemático 2-ΔΔCt, considerando o grupo 12ddg como calibrador. Para validar os ensaios
de PCR em tempo real, as curvas de eficiência e de dissociação foram confeccionadas
previamente e ajustes de concentração de cDNA e primers foram efetuados. A curva de
eficiência foi calculada por meio da equação E = 10(-1/slope), com valores resultantes acima
de 0,90 para todos os genes.
3.6. Análise Estatística
As análises estatísticas foram realizadas com base nos trabalhos de Conover e Iman
(1981) e Montgomery (1991), utilizando o ranqueamento de dados para posterior análise
semiparamétrica. Os dados da expressão relativa dos genes entre os grupos Controle,
30
Lipossomo e Clodronato foram obtidos utilizando-se a estratégia de ranqueamento de dados
e análise semiparamétrica por ANOVA 2ways seguido do teste de Bonferroni. A análise da
expressão dos diferentes genes realizada entre os dias de estudo do grupo Controle foi feita a
partir do ranqueamento de dados e análise semiparamétrica por ANOVA 1way seguida do
teste de Tukey. A significância estatística foi definida como P<0,05. Os dados foram
apresentados como média ± erro-padrão da média (SEM±).
31
4.Resultados
4.1. Análise Morfológica e Ultraestrutural da Articulação Interpúbica e de Células
Fagocitárias Presentes em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato
4.1.1. Constatação Previa da Depleção sistêmica de Fagócitos Induzida pelo
Administração de Lipossomos Contendo Clodronato.
Nenhum animal dos grupos Controle e Lipossomo foi excluído devido às perdas de
peso ou parto pré-termo gerando ninhadas viáveis. No entanto em algumas oportunidades,
aplicações ocorridas no 18ddg para análise no 1dpp, o tratamento com lipossomo contendo
clodronato levou ao substancial atraso no início do trabalho de parto, prolongamento do
parto e atraso na gestação, assim como à morte de 16,6% dos animais tratados neste
período por distocia.
A depleção sistêmica de fagócitos por lipossomos contendo clodronato foi
constatada previamente no baço e cérvice uterina. No baço, a depleção mostrou-se evidente
na polpa vermelha, particularmente desde a zona marginal, que representa o limite entre as
polpas branca e vermelha (Fig. 2).
Na mucosa da cérvice uterina a estratégia de depleção empregada levou a redução
dos aglomerados de células leucocitárias predominantemente localizadas na camada apical
do epitélio estratificado que reveste o lúmen cervical (Fig. 3).
32
Figura 2. Fotomicrografias de baços de camundongos do grupo Controle (A-C), Lipossomo (D-F) e
Clodronato (G-I) durante o 12ddg. Nota-se a presença de macrófagos (setas) na polpa branca de
todos os grupos (B, E, H) e a diminuição de macrófagos na polpa vermelha de animais tratados com
clodronato (I). Neste grupo, observe a necrose do parênquima esplênico, assim como a presença de
células de cromatina extremamente condensada (*). pb- polpa branca. pv- polpa vermelha. (A, D,
G). ZM= zona marginal. (A, D, G) Barras = 30µm. (B, C, E, F, H, I) Barras = 20µm.
33
Figura 3. Fotomicrografias representativas da mucosa de cérvices uterinas de camundongos dos
grupos Controle (A, D, E), Lipossomo (B, F, G) e Clodronato (C, H, I) no 3ddp. Observa-se
tanto em animais do grupo controle (D-E) quanto tratados com lipossomo contendo PBS (F-G) a
presença de infiltrado e aglomerados leucocitário em meio ao epitélio cervical. No grupo tratado
com lipossomos contendo clodronato percebe-se a redução do número de células do infiltrado
celular no epitélio e a compactação do tecido conjuntivo da lâmina própria (C). Os detalhes H e I
mostram pequeno aglomerado de leucócitos de cromatina condensada (I-*) e mastócitos (setas)
na lâmina própria (H). (A-C) Barras = 30µm. (D-I) Barras = 20 µm.
34
4.1.2. Aspectos do Remodelamento Tecidual da Articulação Interpúbica Durante a
Prenhez e o Pós-Parto em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato.
O acompanhamento do remodelamento dinâmico da SP e LiP de animais do grupo
Controle (Fig.4) permitiu o reconhecimento das modificações espaço temporalmente
reguladas da histoarquitetura dos tecidos interpúbicos. Estas modificações se sobrepõem
nas fases de separação dos ossos púbicos, a partir do final da primeira etapa da prenhez
(12ddg); relaxamento, resultante da substituição gradual da fibrocartilagem interposta aos
coxins de cartilagem hialina por um LiP elástico, ao final da prenhez (18-19ddg); e
recuperação da articulação resultante do remodelamento do LiP e a reaproximação dos
ossos púbicos, que se inicia no pós-parto (1-3dpp) e se acelera gradativamente para
restabelecer a histoarquitetura semelhante à da SP, em cerca de 10 dias.
Adicionalmente aos aspectos dinâmicos do remodelamento tecidual, os resultados
evidenciados pela melhor preservação tecidual de porções proximais aos ossos púbicos
(cartilagem hialina ou enthese) e centrais do espaço interpúbico (fibrocartilagem e LiP)
permitiram observação de detalhes representativos de modificações de composição tecidual
a exemplo da celularidade de entheses e de diferenças no que diz respeito a organização do
tecido conjuntivo, tais como o aumento do esgarçamento e formações lacunares da matriz
extracelular presentes no LiP durante o relaxamento na etapa final da prenhez e da
recuperação da histoarquitetura no pós-parto nos grupos Controle, Lipossomo e Clodronato
(Fig. 5).
35
Fig
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37
Se por um lado, não se observam alterações qualitativas de composições teciduais
das porções centrais do espaço interpúbico (fibrocartilagem) de animais tratados com
Lipossomo e Clodronato antes do 12ddg (Fig. 5 P, Z); por outro lado, as avaliações
qualitativas da enthesis e ligamentos de animais tratados com Clodronato antes dos dias 18
e 19 de prenhez (Fig. 5 V, W, a, b) assim como 1 e 3 dias após o parto (Fig. 5 X, Y, c, d)
permitiram constatar o aumento de celularidade de enthesis e a redução do esgarçamento e
formações lacunares presentes no tecido conjuntivo que constitui o LiP. Estes aspectos
podem ser associados a uma maior densidade dos componentes fibrilares do tecido
conjuntivo do LiP após tratamento com Clodronato principalmente ao final da prenhez se
comparados com tecidos interpúbicos de animais dos grupos Controle e Lipossomo (Fig. 5
B-E, G-J, L-O, Q-T).
Quanto à formação de lacunas no LiP, estas podem ser observadas tanto nas regiões
próximas aos ossos púbicos quanto no interior do ligamento (Fig. 5 e 6). Inicialmente,
durante o remodelamento da fibrocartilagem e desenvolvimento do LiP, as formações se
assemelham a canais estreitos delimitados por tipos celulares cúbicos ou alongados (Fig. 5
B, G). Posteriormente, ao final da prenhez e pós-parto (Fig. 5 C-E, H-J), esses canais
confluem para lacunas mais volumosas, particularmente do 1dpp e 3dpp, revestidos por
células cubicas ou elípticas associadas à matriz extracelular do LiP ou a outras células
semelhantes contidas em suas luzes (Fig. 6 A-D). Estes canais e lacunas diferem dos
poucos vasos sanguíneos e linfáticos neo-formados no LiP que possuem túnicas vasculares
constituídas por células musculares lisas ou formação de tecido conjuntivo semelhante à
túnica adventícia (Fig. 6 E).
A exploração de características das células contidas nas lacunas de LiP dos grupos
controle e tratados evidenciou fenótipos celulares mononucleados que diferem nos formatos
38
(Fig. 7). No grupo Controle, as células cúbicas são mais volumosas, possuem fagossomos e
maior quantidade de prolongamentos citoplasmáticos nos dias 19ddg e 1dpp (Fig. 7 B, C),
enquanto as células elípticas ou de contorno irregular e menor quantidade prolongamentos
citoplasmáticos predominam no 3dpp (Fig. 7 D). No grupo Lipossomo ambos estão
presentes do 18ddg ao 3dpp (Fig. 7 E-H), entretanto, no 18ddg estas células encontravam-
se dispersas na matriz ou em pequenas cavidades existentes no LiP. O grupo Clodronato
(Fig. 7 I-L) apresenta predominantemente células de menor volume, alongadas, isoladas ou
em pequenos aglomerados presentes em pequenas lacunas.
Figura 6. Fotomicrografias ilustrativas de formações lacunares no LiP de animais do grupo Controle
no 3dpp (A-D) e de vaso sanguíneo no LiP de animal grupo Controle no 19ddg (E). Nota-se em A, a
proximidade das entheses da articulação e o estreito canal que conflui para a lacunas presente em
meio ao tecido do LiP (B). Em C, observa-se lacuna que possui aglomerados marginais de células
monoculares em sua luz. Esta histoarquitetura difere daquela de vasos sanguíneos como o apontado
em E. Barras: A = 50μm; B, D, E = 20μm; C = 30μm.
39
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40
4.1.3. Caracterização Ultraestrutural de Fenótipos Celulares dos Tecidos
Interpúbicos Durante a Prenhez e Pós-Parto em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e
Clodronato.
A caracterização ultraestrutural dos tipos celulares presentes na SP de animais dos
diferentes grupos de estudo no 12ddg permitiu identificação de três fenótipos: condrócitos
nos coxins de cartilagem hialina; fibrocondrócitos e fibroblastos típicos da transição
fibrocartilaginosas (Fig. 8). Estes tipos celulares presente nos tecidos interpúbicos ao final
da primeira metade da prenhez têm potencial de sintetizar a matriz extracelular do LiP que
irá passar por etapa de relaxamento na segunda metade da prenhez.
Os fenótipos celulares observados nos tecidos interpúbicos (SP) até o 12ddg,
independentemente do grupo de estudo diferem do fenótipo de células presentes nos limites
e interiores de lacunas dos LiP de animais de 18ddg a 3dpp, a exemplo dos fenótipos
observados no grupo controle (Fig. 9). Estas células apresentam características
ultraestruturais de células fagocitárias de linhagem monocitária e que de modo geral
apresentam grande volume, numerosas vesículas citoplasmáticas, cisternas do complexo de
Golgi e reticulo endoplasmático, corpos lipídicos, fagossomos/fagolisossomos no formato
de corpos densos, núcleos de cromatina frouxa e numerosas projeções citoplasmáticas (Fig.
9 A-C).
41
Fig
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8.
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ente
(N
u).
42
Figura 9. Eletromicrografias ilustrativas de fenótipos celulares presentes em lacunas do LiP de
animais Controle no período entre 18ddg e 3dpp. (A) Fenótipo correspondente ao de célula gigante
multinucleada de cromatina frouxa na qual se destaca citoplasma repleto de mitocôndrias (Mt),
múltiplos vacúolos (setas) e cisternas do RE. (B) Fenótipo correspondente ao de monócito de
núcleo reniforme (N), mitocôndrias de matriz interna eletrondensa (Mt), Complexo de Golgi (CG)
bem desenvolvido e projeções celulares (*). (C) Macrófago repleto de gotículas de lipídio (setas),
corpos densos (Cd), vacúolos fagocíticos (Vf), RE disperso com projeções celulares (*).
43
A caracterização ultraestrutural dos tecidos interpúbico dos grupos Lipossomo e
Clodronato permitiu explorar o fenótipo de células semelhantes a fagócitos presentes nas
lacunas ou envoltas por matriz extracelular do LiP desde o 18ddg até o 3dpp.
No grupo Lipossomo, foram observadas células alongadas, com núcleo de
cromatina frouxa que exibem prolongamentos citoplasmáticos longos que se projetam pela
matriz extracelular já degradada e fragmentada (Fig. 10 A). Estas células possuem RE e
complexo de Golgi bem desenvolvidos, uniformemente distribuídos no citoplasma, bem
como lisossomos elétron densos conhecidos por corpos densos (Fig. 10 B).
No grupo tratado com Clodronato, a caracterização ultraestrutural permitiu a
identificação de fagócitos com núcleos contendo grumos de cromatina parcialmente
condensada e que exibem prolongamentos citoplasmáticos curtos. Além disto, apresentam-
se envoltas por matriz extracelular na qual estão presentes fibras colágenas preservadas
(Fig. 10 C). Estas células possuem citoplasma compactado com reticulo endoplasmático
fragmentado e disperso, além de lisossomos próximos aos vacúolos citoplasmáticos (Fig.10
D). Em algumas oportunidades, foram observados fagócitos cujo fenótipo pode ser
associado a estágios adiantados de morte celular, devido aspectos decorrentes da
fragmentação nuclear e citoplasma compactado contendo mitocôndrias com cristas de
difícil distinção (Fig. 10 E).
44
Fig
ura
10
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micro
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µm
. (B, D
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00
µm
.
45
4.1.4 Imunolocalização de Fagócitos Mononucleares na Articulação Interpúbica de
Camundongos dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato Durante a Prenhez e o Pós-
parto.
Simultaneamente às caracterizações fenotípicas, a avaliação de marcadores
moleculares de monócitos e macrófagos (antígeno7/4 e F4/80 respectivamente) permitiu
identificar a presença de ambos os tipos celulares no LiP durante a segunda metade da
prenhez e o pós-parto, tanto nos animais do grupo Controle quanto nos tratados com
Lipossomo e Clodronato (Fig. 11,12 e 13).
Diferentemente da CV, tomada como controle positivo para imunomarcações com o
uso dos anticorpos específicos para identificação de monócitos e macrófagos, não se
detecta a imunoexpressão destes marcadores moleculares em células da SP durante o 12ddg
em nenhum dos grupos de estudo (Fig.11 A, G, M, S e Fig.12 A, F, K, P). No entanto, de
modo semelhante ao que se observa na CV, tanto durante a separação dos ossos púbicos e
relaxamento do LiP na etapa final da prenhez (18ddg e 19ddg) quanto durante
remodelamento no pós-parto (1dpp e 3dpp) as imunomarcações evidenciarem células que
expressam tais marcadores.
Células semelhantes a monócitos ou que expressam o antígeno 7/4 foram
imunolocalizados tanto na enthese da SP quanto no LiP (Fig. 11 B-E, H-K), apresentando
maior intensidade de marcação durante a etapa final do relaxamento do LiP nos dias 18ddg
e 19ddg dos grupos Controle e Lipossomo (Fig. 11 C, D, I, J e Fig. 12 B, G, C, H). Já no
grupo Clodronato, tais células foram observadas predominantemente no final da prenhez e
início do pós-parto (Fig. 12 L-N, Q-S), com ausência de células no LiP no 3dpp,
semelhante ao observado para o grupo Lipossomo (Fig. 12 J, T). No entanto as células
imunopositivas para antígeno 7/4 apresentaram características típicas de apoptose, como
46
fragmentação citoplasmática e nuclear, desde o 18ddg ao 3dpp nos LiP de animais do grupo
Clodronato (Fig. 12 L-O, Q-S) e nos dias 19ddg e 1dpp de animais do grupo Lipossomo
(Fig. 12 D, H).
Quanto as células semelhantes a macrófagos, além de estarem presentes na enthese
e LiP durante o relaxamento (Fig. 11 N, O, T, U; Fig. 13 B, C, G, H, L, M, Q, R) estão
presentes principalmente no LiP em remodelamento durante o pós-parto (Fig. V, W, Fig. 13
I, J, S, T), formando grandes aglomerados em lacunas presentes no 1dpp e 3dpp tanto em
animais do grupo Controle quanto em animais dos grupos Lipossomo e Clodronato.
Neutrófilos, que também são identificados pela imunopositividade para antígeno
7/4, são facilmente diferenciados de monócitos pelo fenótipo, particularmente do formato
nuclear. Menor número de células semelhantes a neutrófilos foram imunolocalizadas na
enthese do LiP no 18ddg (Fig. 11 B) e no LiP nos 1dpp e 3dpp (Fig. 11 J, K) somente em
animais do grupo Controle.
47
48
Figura 11. Fotomicrografias representativas da imunomarcação dos Antígeno 7/4 (1:300 - Serotec) e
F4/80 (1:200- Biosciense) na SP e LiP de animais Controle nos diferentes dias de estudo. Antígeno
7/4 foi observado no citoplasma de células presentes nas entheses e no ligamento interpúbico de
animais com 18ddg, 19ddg, 1dpp e 3dpp, sendo possível a identificação fenótipos semelhantes a
neutrófilos (B) e monócitos (C-K). F4/80 apresentou imunopositividade no citoplasma de células de
perfis alongados (T, U) ou arredondados (N, O, P-W) e semelhantes a macrófagos presentes nas
entheses e LiP de animais do 18ddg, 19ddg, 1dpp e 3dpp. Controles positivos realizado em cérvices
uterinas de animais do 3dpp, neles se observa presença de monócitos e neutrófilos positivos para
Antígeno 7/4 e macrófagos positivos para F4/80, respectivamente. Controles negativos foram
realizados com a omissões de anticorpos primários. Ent: Entheses. CH= Cartilagem Hialina. FC=
Fibrocartilagem. Barras = 20μm.
49
50
Figura 12. Fotomicrografias representativas da imunomarcação do Antígeno 7/4 (1:300 - Serotec)
na SP e LiP de animais Lipossomo e Clodronato nos diferentes dias de estudo. Antígeno 7/4 foi
observado no citoplasma de células presentes nas entheses e no ligamento interpúbico de animais
com 18ddg, 19ddg, 1dpp e 3dpp de ambos os grupos de estudo. No entanto, em ambos os grupos
puderam ser observadas células de marcação positiva com citoplasma fragmentado e núcleo
compactado (D, H, Q, S, O). Controles positivos realizados em cérvices uterinas de animais do
3dpp. Neles observa-se a presença de monócitos e neutrófilos positivos para Antígeno 7/4.
Controles negativos foram realizados com a omissões de anticorpos primários. Ent: Entheses. CH=
Cartilagem Hialina. FC=Fibrocartilagem. Barras = 20μm.
51
52
Figura 13. Fotomicrografias representativas da imunomarcação de F4/80 (1:200- Biosciense) na SP
e LiP de animais Lipossomo e Clodronato nos diferentes dias de estudo. F4/80 apresentou
imunopositividade no citoplasma de células de perfis predominantemente arredondados e
semelhantes a macrófagos presentes nas entheses e LiP de animais do 18ddg, 19ddg, 1dpp e 3dpp
em ambos os grupos de estudo. Entretanto, células com núcleos condensados e citoplasma
fragmentado foram observadas nas entheses de animais com 1dpp (D) e no LiP de animais com
3ddp (J) tratados com lipossomo, assim como em animais com 18ddg a 3dpp tratados com
clodronato (L-O, Q-T). Controles positivos realizado em cérvices uterinas de animais do 3dpp.
Controles negativos foram realizados com a omissões de anticorpos primários. Ent: Entheses. CH=
Cartilagem Hialina. FC= Fibrocartilagem. Barras = 20μm.
53
54
4.2. Análises de aspectos Moleculares Indicativos da Polarização de Fagócitos nas
Resposta Anti e Pró- Inflamatória durante a Remodelação da Articulação Interpúbica de
Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato Durante a Prenhez e o Pós-
Parto.
4.2.1. Análise da Expressão de Moléculas Características da Resposta Imune Pró e Anti-
inflamatória via M1/M2 Durante o Relaxamento do Lip e Reparo Pós-Parto em
Camundongos dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato.
A expressão gênica relativa de fatores de resposta imune por M1/M2 do grupo
Controle apresentou alterações dinâmicas na SP e LiP durante a prenhez e pós-parto (Fig.
14). Durante a etapa de relaxamento foi registrada grande oscilação da expressão gênica
entre os dias 18 e 19 de gestação. No 18ddg ocorreu aumento nos níveis de genes
relacionados ação de macrófagos M2 (Arg1) além de queda na expressão de genes relativos
a respostas pró e anti-inflamatórias quando comparados ao 12ddg. Já no 19ddg ocorre a
elevação nos níveis de expressão dos genes relacionados principalmente a monócitos e
resposta anti-inflamatória (Ccr2, Arg1 e Il10) se comparados ao 12ddg e 18ddg e pequena
queda nos níveis de Il1a quando comparados com o 12ddg.
No 1dpp ocorre aumento generalizado na expressão de fatores pró-inflamatórios
(Il1a e Tnfa) assim como de recrutamento de monócitos (Ccr2) se comparado aos níveis
presentes durante a prenhez. Entretanto, no que toca a via de resposta anti-inflamatória,
apesar do aumento da expressão de IL10, nota-se a queda na expressão de Arg1 quando
comparado ao início da prenhez e relaxamento do LiP. No 3dpp observa-se a manutenção
dos altos níveis de fatores pró e anti-inflamatórios (Il10, Ccr2, Tnfa e Il1a) em relação ao
55
registrado principalmente nos últimos dias de prenhez. Além disso, o aumento nos níveis de
genes como Tgfb e Arg1 em relação ao observado na prenhez e pós-parto contribuem para o
aumento de fatores de ação anti-inflamatória.
No que diz respeito ao efeito dos tratamentos sobre a expressão de genes de resposta
pró e anti-inflamatória, nota-se que tanto o grupo Lipossomo como o grupo Clodronato
apresentaram variações nos níveis de expressão de diferentes genes nos dias de estudo (Fig.
15-20).
Nas amostras tratadas com Lipossomo percebe-se em relação ao grupo Controle o
aumento de fatores de resposta anti e pró-inflamatória durante a prenhez, com grande
elevação de Ccr2, Arg1, Tnfa e Il1a no 12ddg (Fig. 15, 16, 19 e 20) apesar da ausência de
imunomarcação para fagócitos neste dia de estudo (Fig. 12 e 13); O aumento de fatores
anti-inflamatórios (Fig. 16, 18) durante a separação dos ossos púbicos (18ddg) e a elevação
nos níveis de expressão de genes pró-inflamatórios (Fig. 20) na etapa de relaxamento do
LiP (19ddg).
Nas amostras tratadas com Clodronato ocorre o favorecimento de resposta pró-
inflamatória em toda a prenhez, graças a elevados níveis de Tnfa e/ou Il1a (Fig. 19 e 20) e
queda nos níveis de Il10 e/ou Arg1 (Fig. 16 e 18) quando ao comparados aos registrados
para o grupo Controle. Assim como Lipossomo, foi observada alta expressão de fatores pró
e anti inflamatórios no 12ddg, mesmo sem imunomarcação para fagócitos (Fig. 12 e 13).
Durante o pós-parto, o tratamento com Lipossomo leva a aumento na expressão
gênica de Arg1 (Fig. 16) e Il1a (Fig. 20), assim como a queda de níveis de expressão de
genes de respostas anti e pro-inflamatórias quando comparados ao Controle. Já no 3dpp,
ocorre queda tanto nos níveis de fatores pró como anti-inflamatórios (Fig. 15, 16, 18 e 19)
em relação ao observado para o grupo Controle.
56
No entanto, com relação aos resultados obtidos para o grupo Controle, o grupo
Clodronato apresentou aumento de fatores de resposta pró-inflamatória assim como queda
de fatores anti-inflamatórios em ambos os dias de estudo. No 1dpp, altos níveis de Il1a
podem ser observados (Fig. 20). Entretanto, apesar de níveis elevados de Arg1 (Fig. 16),
nota-se queda na expressão de Il10 (Fig. 18), favorecendo a resposta pró-inflamatória. Já no
3dpp o aumento na expressão tanto de Il1a (Fig. 20) quanto de Tnfa (Fig. 19), assim como a
queda na expressão de Il10 (Fig. 18), detalham um ambiente com características pró-
inflamatórias se comparados ao grupo Controle. Nenhuma alteração nos níveis de Tgfb foi
registrada por ação de tratamentos com Lipossomo ou Clodronato (Fig. 17).
57
Figura 14. Expressão de genes de vias pró e anti-inflamatórias por PCR em tempo real de SP e LiP
de animais Controle durante a prenhez e pós-parto. As análises de ANOVA1way seguidas de teste
de Tukey com significância (p < 0,05) são indicadas por comparação entre dia 12ddg (a), 18ddg
(b), 19ddg (c), 1dpp (d) e 3dpp (e). Barras representam SEM ±.
58
Ccr2
Controle Lipossomo Clodronato0
2
4
6
8
1012ddg
18ddg
19ddg
1dpp
3dpp
Exp
ress
ão G
ênic
a R
ela
tiva
***
**
***
** *** ***
Figura 15. Expressão gênica relativa de Ccr2 em tecidos da articulação interpúbica de animais dos
grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido
do teste de Bonferroni. Significância p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam
SEM ±.
Arg1
Controle Lipossomo Clodronato0
1
2
3
4
512ddg
18ddg
19ddg
1dpp
3dpp
Expre
ssão G
ênic
a R
ela
tiva
***
***
***
***
Figura 16. Expressão gênica relativa de Arg1 em tecidos da articulação interpúbica de animais dos
grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido
do teste de Bonferroni. Significâncias p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam
SEM ±.
59
Tgfb
Controle Lipossomo Clodronato0.0
0.5
1.0
1.5
2.012ddg
18ddg
19ddg
1dpp
3dpp
Exp
ress
ão G
ênic
a R
ela
tiva
Figura 17. Expressão gênica relativa de Tgfb em tecidos da articulação interpúbica de animais dos
grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido
do teste de Bonferroni. Significância p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam
SEM ±.
Il10
Controle Lipossomo Clodronato0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.512ddg
18ddg
19ddg
1dpp
3dpp
Exp
ress
ão G
ênic
a R
ela
tiva
*** ***
***
*
Figura 18. Expressão gênica relativa de IL10 em tecidos da articulação interpúbica de animais dos
grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido
do teste de Bonferroni. Significância p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam
SEM ±.
60
Tnfa
Controle Lipossomo Clodronato0
1
2
3
412ddg
18ddg
19ddg
1dpp
3dpp
Exp
ress
ão G
ênic
a R
ela
tiva
***
***
***
***
Figura 19. Expressão gênica relativa de Tnfa em tecidos da articulação interpúbica de animais dos
grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido
do teste de Bonferroni. Significância p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam
SEM ±.
Il1a
Controle Lipossomo Clodronato0
1
2
312ddg
18ddg
19ddg
1dpp
3dpp
Exp
ress
ão G
ênic
a R
ela
tiva
**
**
**
***
***
***
Figura 20. Expressão gênica relativa de Il1a em tecidos da articulação interpúbica de animais dos
grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido
do teste de Bonferroni. Significância p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam
SEM ±.
61
5. Discussão
O acompanhamento dos animais durante a etapa final da prenhez e parto dos grupos
Controle, Lipossomos e Clodronato permitiu constar que em nenhum dos grupos houve
antecipação do parto, que ocorreu normalmente no 19ddg. Entretanto, no grupo Clodronato,
ocorrências de alterações na parturição resultaram em mortes de fetos intra-útero e
imediatamente ao parto, além da morte de aproximadamente 17 % dos camundongos
fêmeas durante a segunda metade da prenhez. Estes dados foram semelhantes aos descritos
anteriormente em experimentos de manipulações gênicas em camundongos, tais como a
deleção do gene da isoenzima esteroide 5a-reductase tipo 1 que desempenha papel essencial
no catabolismo cervical da progesterona (Mahendroo et al., 1999); da relaxina (Zhao et al.,
2000) e de seu receptor RXFP1 (Hsu et al., 2002) que são elementos chaves no controle do
remodelamento tecidual de cérvice uterina e sínfise púbica durante a etapa final da prenhez
e indução do parto.
As explorações das composições teciduais do baço de animais prenhes para aferição
da estratégia empregada na depleção de macrófagos em camundongos durante a prenhez e
pós-parto mostraram que a via intraperitoneal possibilitou depleção semelhante àquela
obtida por via endovenosa (Rooijen & Sanders, 1994; McGaha et al., 2011). As diferenças
na histoarquitetura deste órgão observadas nos animais do grupo Clodronato se assemelham
àquelas que comprovaram a depleção de macrófagos da zona marginal, sem ruptura da
organização tecidual de outras estruturas esplênicas, principalmente da polpa branca
(Rooijen & Sanders, 1994; McGaha et al., 2011).
62
Tendo em vista que no décimo segundo dia de prenhez o baço ainda se encontra em
período de expansão conhecido por “esplenomegalia” (Hedge et al., 2001), as apoptoses na
polpa vermelha e zona marginal observadas no grupo Clodronato foram causadas
efetivamente pela administração do fármaco via lipossomos, que de acordo com McGaha e
colaboradores (2011), resultaram na depleção de macrófagos altamente capacitados à
fagocitose mediada por receptores de padrões moleculares (scavangers) de alta afinidade
por lipídeos que são prontamente direcionados à remoção dos lipossomos.
No que diz respeito à cérvice uterina, a comparação da histoarquitetura da mucosa
do órgão e particularmente no epitélio entre os grupos controle e tratados mostrou evidente
redução no infiltrado celular no grupo Clodronato de modo semelhante ao que foi
observado com emprego de outros agentes para reconhecimento de macrófagos/monócitos
durante a prenhez, sem a presença de ulcerações do epitélio cervical (Read et al., 2007;
Timmon et al., 2010; Mahendroo, 2012; Gomez-Lopez et al., 2014).
Nos grupos Controle e Lipossomo, os aspectos do remodelamento tecidual da
articulação interpúbica e da caracterização ultra estrutural de fenótipos celulares e grau de
preservação da MEC dos tecidos interpúbicos durante prenhez e pós-parto são coincidentes
com aqueles que permitiram distinguir fases nas modificações histofisiológicas da SP que
se sobrepõem, e foram reconhecidas como separação, relaxamento e recuperação pós-parto
(Joazeiro et al., 2014). Estes aspectos diferem daqueles reportados no que diz respeito à
celularidade da enthese e redução do esgarçamento e formações lacunares do ligamento
interpúbico de animais tratados com clodronato
No que diz respeito à preservação de estruturas da articulação interpúbica em
decorrência dos tratamentos empregados, não foram notados comprometimentos da
histoarquitetura ou fenótipos celulares no 12ddg, em que pese a diminuição dos coxins de
63
cartilagem hialina e celularidade das entheses no grupo Clodronato, quando comparados
aos grupos Controle e Lipossomo. No entanto, ressaltamos que a administração do
Clodronato não encapsulado em células condrogênicas cultivadas em biorreator resultou na
estimulação do metabolismo de condrócito e aumento de síntese de componentes da matriz
extracelular, particularmente de colágeno e proteoglicanos (Rosa et al., 2014). Deste modo,
estas observações asseguram que o clodronato isoladamente não pode ser tomado como
indutor das alterações acimas relatadas na SP no 12ddg, possuindo ação restrita às células
fagocitárias (Rooijen & Sanders, 1994).
O emprego de meio de embebição adequado para preservação de caraterísticas
histofisiológicas da articulação interpúbica durante o fim da prenhez e o pós-parto
proporcionou a preservação de canais e lacunas contendo células cubicas em seus
revestimentos ou dispersas nos seus interiores, além de porções esgarçadas da MEC.
Estruturas e células semelhantes foram descritas por Storey (1957), um dos pioneiros no
estudo morfofisiológico de tecidos conjuntivos da SP, com o emprego de cortes
histológicos espessos do LiP de animais prenhes e puerpéreis. De acordo com este autor
tais lacunas, denominadas de “espaço sinfisial”, teriam participação no remodelamento da
SP durante a prenhez e o pós-parto, enquanto que as células aí presentes, apesar de serem
componentes do tecido conjuntivo, não participariam de processo de remodelamento.
Segundo à proposição de Storey (1957), o desencadeamento de eventos relacionados ao
remodelamento dos tecidos interpúbicos era creditado unicamente ao “espaço sinfisial”,
que possuía como principal função a reaproximação dos ossos púbicos durante o pós-parto.
No que diz respeito à existência de canais microscópicos na região de transição
fibrocartilaginosa do LiP do 18ddg ao 3dpp, estes corresponderiam às microfraturas ou edemas
de medula dos ossos púbicos observadas com emprego de ressonância magnéticas em mulheres
64
primíparas após parto. Estas microlesões são comuns em estruturas cartilaginosas de roedores
em locais de intensa atuação de forças de tração (Martel-Pelletier et al., 2008) e contribuem
para formação de soluções de continuidade na interface entre ossos púbicos e estruturas
cartilaginosas (Brandon et al 2011; Miller et al., 2011).
Quanto às áreas esgarçadas de MEC presentes no LiP, estas corresponderiam à
alternância de zonas de diferentes densidades fibrilares, dado que o gradiente nos graus de
compactação de elementos de matriz é capaz de proporcionar o aparecimento de poros ou
espaços na MEC (Wolf et al., 2009). Tendo em mente que estes espaços possibilitam e
auxiliam na infiltração de leucócitos em tecidos conjuntivos (Wolf et al., 2009) e que
durante o remodelamento da SP ocorre grande secreção de metaloproteinases [Mmp-8, e
gelatinases (Mmp-2 e-9)] e catepsinas por células semelhantes a fibroblastos assim como a
síntese de ácido hialurônico, que permite a hidratação do ligamento formado (Rosa et al
2011; 2012); consequentemente, os esgarçamentos ou lacunas da MEC do LiP seriam
resultantes das modificações dos componentes de matriz e da ação de enzimas específicas e
provavelmente possuiriam a capacidade de constituir vias facilitadoras do deslocamentos e
migração de células monocitárias aos tecidos interpúbicos fragilizados durante a prenhez e o
pós-parto.
Sendo assim, as evidências morfofisiológicas resultantes dos estresses biomecânicos
e/ou bioquímicos presentes nos tecidos interpúbicos do camundongo, durante o remodelamento
da SP do camundongo são indicativos de que há nesta articulação a produção de fatores e
mediadores capazes de recrutar leucócitos para o LiP durante seu relaxamento e reparo pós-
parto (Rosa et al., 2008; 2011 e 2012).
Em todos os grupos de estudo, as características ultraestruturais de células
fagocitárias presentes nas lacunas ou emersas na matriz extracelular do LiP, principalmente
65
durante o período de relaxamento e reparo pós-parto corresponderam ao descrito para
monócitos típicos (Sutton & Weiss, 1966) e para macrófagos ricos em podossomos e
grandes quantidades de fagossomos e, portanto, portadores de características de macrófagos
ativados (Dias et al., 2014). De modo geral, os aspectos que sugerem ativação das células
fagocitárias no LiP coincidem com aqueles observados em macrófagos de características
fenotípica variáveis, que as vezes se apresentam como células alongadas semelhantes a
fibroblastos, com podossomos para adesão e migração em espaços da matriz particulada
resultante da ação de proteases, ou ainda como células de formato esférico semelhantes ao
de monócitos que migram por movimentos ameboides (Lämmermann & Germain, 2014).
Além dos diferentes fenótipos de macrófagos, estão presentes no LiP células
gigantes multinucleadas semelhantes às descritas por Sutton & Weiss (1966). As células
gigantes foram observadas nos últimos dias de prenhez no grupo Controle, indicando ação
acentuada de células fagocitárias neste período. Assim como apontado por Rooijen e
colaboradores (1996), no grupo Clodronato os registros de alterações ultraestruturais na
distensão de podossomos ou pseudópodes, na morfologia de mitocôndrias e principalmente
quanto à fragmentação nuclear e citoplasmática apontam que o tratamento com clodronato
carreado por lipossomos desencadeou o processo de morte celular por apoptose de maneira
específica e eficiente tanto em monócitos quanto em macrófagos presentes nos canais,
lacunas e áreas esgarçadas do LiP de animais prenhez e puerpéreis.
Ainda no que diz respeito ao potencial fagocitário das células semelhantes aos
macrófagos presentes nos canais, áreas esgarçadas e formações lacunnares da matriz do LiP
dos grupos Controle e Lipossomo, estas células apresentaram grande quantidade de
fagossomos e lisossomos no citoplasma, sendo encontradas dispersas em porções de matriz
66
colágena solubilizada, enquanto que no grupo Clodronato estes fagócitos possuem
citoplasma compacto e encontravam-se circundados de fibras colágenas compactas.
É digno de nota que estes tipos celulares são observados quase que imediatamente
após aumentos das expressões gênicas de enzimas metaloproteinases [Mmp-8, e gelatinases
(Mmp-2 e-9) ] e catepsinas (B e K) que ocorrem concomitantemente ao aumento
significativo das contrações de ácido hialurônico de alto peso molecular e expressão do
proteoglicano versican (Pinheiro et al., 2005; Rosa et al., 2011; 2012). Deste modo, há uma
correlação espaço temporal entre acúmulos de ácido hialurônico e proteoglicano versican,
favorecendo a hidratação e consequentemente relaxamento progressivo do LiP
concomitantemente às expressões de enzimas capazes de clivar estes proteoglicano e liberar
os glicosaminoglicanos condroitim-4-sulfato e O-sulfato no meio fluído (Rosa et al., 2011;
2012). Coincidentemente, dentre os glicosaminoglicanos sulfatados de proteoglicanos,
somente o condroitim-4-sulfato é capaz de induzir degradação da MEC cartilaginosa para
facilitar deslocamentos celulares, regular a químioatração de células monocitárias, ativar a
secreção de IL-1b e promover diferenciação de macrófagos e células dendríticas (Yoshino, et
al., 2010).
Os aspectos relativos ao turnover de componentes da MEC com participação de
metaloproteinases e catepsinas específicas no LiP ao final da prenhez capazes de clivar
moléculas de colágeno (Rosa et al., 2011; 2012), o que leva à formação de fragmentos que
também podem ter potencial para atrair populações de macrófagos que expressam
receptores do tipo “scavenger”, capazes de internalizar colágeno particulado e não fibrilas
integras das fibras compactas (Gowen et al., 2000). Estes fagócitos têm papel funcional
relevante em diferentes fenômenos espaço temporalmente regulados, a exemplo da
liberação de mediadores chaves que contribuem para remodelamento de diferentes órgãos
67
do sistema reprodutor feminino, particularmente durante a prenhez e pós-parto (Erlebacher,
2014).
A ocorrência destes fenômenos, em um curto espaço de tempo, permite traçar
paralelos entre às acentuadas adaptações da SP do camundongo na prenhez, parto e pós-
parto e as respostas dadas por tecidos lesionados ou sob estresse, nos quais células e/ou
matriz extracelular liberam moléculas responsáveis pela ativação do sistema imunitário
(Frey et al., 2013 para revisão de contribuições originais).
A imunolocalização de células positivas para os biomarcadores antígeno 7/4 e
glicoproteína F4/80 coincide com características morfológicas de células monocitárias
presentes nas bordas e no interior de canais, lacunas e também em regiões esgarçadas da MEC
do LiP no relaxamento e reparo pós-parto em todos os grupos. No 12ddg da prenhez, em todos
os grupos, não foram identificadas células imunomarcadas na sínfise fibrocartilaginosa. Raros
“spots” ou “background” foram observados nos resíduos celulares de tecidos conjuntivos
frouxo e adiposo resultantes de suas debridações; particularmente dos tecidos retro púbicos que
se continuam com paramétrio que recobre bexiga, cérvice uterina e vagina. A presença de
células que expressam estes marcadores, até então não detectados no LiP do camundongo, é
traço comum do remodelamento tecidual de estruturas do aparelho reprodutor, contribuindo
para o sucesso de eventos que asseguram a manutenção da prenhez, parto a termo e reparo pós-
parto (Timmons & Mahendroo, 2006; Payne et al 2012; Shynlova et al 2013, Erlebacher,
2014; Gomez-Lopez et al., 2014)
A associação das características morfológicas e da imunomarcação com antígeno
7/4 confirmaram resultados anteriores no que diz respeito a ausência de granulócitos na SP
do camundongo como observado inicialmente por Rosa e colaboradores (2008) e Consonni
e colaboradores (2012b) na sínfise de camundongos fêmeas primíparas ou multíparas
68
senescentes, respectivamente, por meio de coloração seletiva com sirius red em pH alcalino
para detecção de granulócitos (Wehrend et al., 2004).
De modo semelhante, não foram observadas grandes quantidades de granulócitos
no LiP de animais dos grupos Lipossomos e Clodronato. Apesar da similaridade entre os
mecanismos gerais do processo de relaxamento do LiP e regulação hormonal entre
camundongos e cobaias (Ortega et al., 2003), os resultados obtidos para os grupos
Controle, Lipossomo e Clodronato corroboram os achados acima citados, a respeito da
diferença significativa quanto aos fenótipos dos leucócitos que participam no
remodelamento no início do relaxamento deste ligamento, que predominantemente é
resultante da infiltração de eosinófilos e neutrófilos na articulação interpúbica da cobaia
(Rodriquez et al., 2003).
A presença de células de fenótipos característicos de monócitos e macrófagos, que
expressam antígeno 7/4 e a glicoproteína F4/80 respectivamente, a partir do 18ddg na
enthesis e LiP pode estar relacionada a queda de progesterona descrita durante este dia de
prenhez em camundongos (Mahendroo, 2012, Croy et al., 2014), de modo semelhante ao
mecanismo que desencadeia a migração de monócitos para a cérvice uterina a partir do
mesmo período gestacional (Timmons et al., 2009).
No que diz respeito a homeostase de tecidos articulares, a inesperada localização de
linfócitos T residentes em entheses fibrocartilaginosas de camundongos fez com que estas
células passassem a ser consideradas sensores de danos e estresse ambientais, ainda que
mínimos como os biomecânicos. Nesta condição, os linfócitos T das entheses reconhecem e
monitoram adequadamente quebras de homeostases e em resposta desencadeiam libração
de citocinas, sinais de transdução, ativadores de transcrição e proteínas indutoras de
remodelação tecidual como Wnt e BMP (Lories & McInnes, 2012). Deste modo, presença
69
de macrófagos e monócitos nos pequenos canais das entheses do LiP durante a prenhez e o
pós-parto nos diferentes grupos pode ser um indicativo de que assim como nas transições
fibrocartilaginosas de tendões e ligamentos, na SP esta região possui características de
sensores de estresse ambiental e de permanente vigilância imunológica.
Adicionalmente as caracterizações imunohistoquímicas acima discutidas, as
avaliações quantitativas dos índices de expressão de mRNAs para os genes Ccr2, Arg1,
Tgfβ, Il10, Tnfa; Il1a permitiram verificar com segurança as tendências de polarização
entre os fenótipos pró-inflamatório M1 e anti-inflamatório M2 de macrófagos nos tecidos
interpúbicos nos diferentes dias da prenhez de animais do grupo Controle, com emprego de
estratégias semelhantes àquelas utilizadas por Zhang e colaboradores (2011) na
identificação de reação inflamatória tanto nos tecidos adiposos subcutâneo e parametrial de
camundongos C57BL/6N primíparos não obesos no final da prenhez.
Apesar da ausência de imunomarcação para antígeno 7/4 em células da SP no 12ddg
nos grupos Controle, Lipossomo e Clodronato, os índices altamente significativos de expressão
do mRNA de Ccr2 (receptor da quimiocina Ccl2) neste dia de prenhez na SP de camundongos
tratados com lipossomo contendo PBS ou clodronato corroboram com observações de que as
mudanças que regem a mobilização de leucócitos que participam das remodelações teciduais
durante a prenhez são sistêmicas e precedem modificações que levam ao remodelamento dos
órgãos (Brown et al., 2014; Gomez-Lopez et al., 2014 para revisão das principais
colaborações) e estruturas suportes pélvicos, a exemplo daquele que observamos na sínfise
fibrocartilaginosa e descritas no tecido adiposo parametrial ao final da prenhez por Zhang et al
(2011).
A elevação gradual dos índices de expressão de Ccr2 até o valor máximo detectado no
1ddp e mantido ao 3ddp no grupo Controle oferece suporte a existência de mecanismos
70
relativos à modulação da migração, influxo e manutenção do potencial de diferenciação de
monócitos no remodelamento do LiP do camundongo na segunda metade da prenhez, tendo em
mente o papel crítico deste receptor de quimiocina na mobilização e recrutamento de monócitos
da medula óssea aos locais de inflamação (Tsou et al., 2007).
No grupo Controle, concomitante ao aumento progressivo dos índices de Ccr2, a
análise comparativa de índices de expressão de citocinas evidenciou tendências na polarização
M1/M2 durante relaxamento, parto e pós-parto. A predominante polarização do fenótipo M2 ao
final da prenhez e durante o reestabelecimento pós-parto se reflete nos aumentos significativos
dos índices de expressões de Arg1 (máximo no 19ddg), Il10 (máximo no 3dpp) e tendência de
elevação progressiva de Tgfb (máximo no 3ddp). A polarização do fenótipo M1, por outro lado,
reflete-se nos aumentos graduais na expressão das citocinas Tnfa e Il1a a partir do dia do parto
até o 1dpp, onde ocorrem os índices máximos para ambas citocinas.
Sendo assim, ao final da prenhez, são condizentes às elevações nos níveis de expressão
de citocinas Il1a e Tnfa e da enzima óxido nítrico sintase responsável pela produção de óxido
nítrico (Moro et al., 2010), característicos de macrófagos M1 (Gordon & Taylor, 2005) e que
ocorrem concomitantemente ao aumento nos índices de expressão de mRNAs para IL10 e para
a enzima Arg1, específicas de macrófagos com caráter anti-inflamatório M2 (Gordon, 2003).
Esta contraposição leva ao desenvolvimento do processo conhecido por “inflamação
ordenada” associado à manutenção da homeostase tecidual (Murray & Wynn, 2011), tendo
em mente o drástico remodelamento que leva a mudanças da composição fibrilar, de
proteoglicanos e GAGs e de enzimas e metaloproteinases da MEC que resultam na formação
de canais, lacunas e áreas de matriz esgarçada no LiP (Joazeiro et al., 2014); paralelamente à
efetiva ação contrária às tendências de polarização do fenótipo pro-inflamatório/M1, garantindo
71
a integridade dos tecidos interpúbicos e a regulação da resposta inflamatória no local (Murray
& Wynn, 2011; Ginhoux & Jung, 2014),.
Ainda no que diz respeito às tendências de polarização M1/M2 no início do reparo do
LiP após o parto (1dpp), a queda nos níveis de Arg1 indica prevalência de fenótipo pró-
inflamatório, visto que as vias de metabolização de arginina por Arginase e iNOS são
antagônicas e intimamente relacionadas a polarização de fenótipos anti e pró-inflamatórios
respectivamente (Brown et al., 2014). Esta proposição está de acordo com os picos de
expressão de citocinas Il1a e Tnfa detectados durante o início do reparo do LiP. Entretanto, os
índices máximos de expressão para IL10 durante o 1dpp e 3dpp, assim como aqueles
observados no tecido adiposo parametrial durante o final da prenhez, tem o potencial para
desencadear mecanismos compensadores de resposta M1 possivelmente associados ao aumento
de células com fenótipo M2 (Zhang et al., 2011). Coincidentemente, macrófagos peritoneais de
fenótipo M2d de camundongos expressam altos índices de Il10 e iNOS, baixos de Tnfa e
intermediários de Arg1 (Ferrante et al., 2013), assim como o subtipo M2b é capaz de secretar
Tnfa quando influenciado por citocinas pró-inflamatórias (Brown et al., 2014). Deste modo, os
índices de expressão medidos no 1dpp para diferentes fatores de resposta inflamatória são
sugestivos de um provável balanço na polarização de fenótipos M2 para M1; que de acordo
com Davis e colaboradores (2013) pode ocorrer de forma rápida e reversível de acordo com as
alterações de citocinas no ambiente.
Apesar da manutenção no 3dpp dos maiores índices de expressão gênica de Il1a e
Tnfa (citocinas pró-inflamatória), o aumento em fatores anti-inflamatórios como Arg1 e
Tgfb deixa evidente o início de um processo que pode ser associado ao mecanismo de
controle, refreamento e finalização de resposta inflamatória (Gordon et al., 2003; Gordon &
Taylor, 2005; Murray & Wynn, 2011). Corroborando com esta hipótese ocorre a
72
estimulação de fibroblastos e miofibroblastos, queda dos níveis de MMPs, TIMPS e
catepsinas, ligeira redução na concentração de ácido hialurônico de alto peso molecular e
proteoglicanos associados, rápida recompactação do colágeno e reorganização de fibras
elásticas no 3dpp (Moraes et al., 2004; Consonni et al., 2012 a; Moro et al., 2012; Rosa et
al., 2011; 2012), e que conduzem ao retorno de estrutura semelhante àquela presente em
animais não prenhez após 40dpp (Consonni et al., 2012 b).
Sendo assim, o fenótipo M2 observado particularmente na separação dos ossos púbicos,
relaxamento do LiP e remodelamento pós-parto pode ser associado à manutenção da
homeostase tecidual, tendo em mente o drástico remodelamento que leva a mudanças da
composição fibrilar, de proteoglicanos e GAGs e de enzimas e metaloproteinases da MEC que
resultam na formação de canais, lacunas e áreas de matriz esgarçada no LiP; bem como à
efetiva ação contrária às tendências de polarização do fenótipo pro-inflamatório/M1, garantindo
a integridade dos tecidos interpúbicos e a regulação da resposta inflamatória no local.
Polarizações semelhantes às observadas no LiP ao final da prenhez e início de pós-parto estão
presentes tanto na decídua a partir da segunda metade da prenhez, onde o favorecimento do
fenótipo M2 até os últimos dias pré-parto é indispensável à progressão e sucesso da prenhez. O
influxo de macrófagos (M1 ou M2b) com características pró-inflamatórias no miométrio e na
decídua nos últimos dias de gestação gera à indução de mecanismos necessários ao parto
(Brown et al., 2014), e também na cérvice uterina, onde a ação conjunta de macrófagos M1/M2
garante o rápido reparo tecidual logo após o parto (Timmons et al., 2009; Mahendroo, 2012).
A estratégia que utilizamos para depleção de macrófagos no LiP de camundongos
durante a prenhez foi semelhante àquela empregada por Chamberlain e colaboradores (2011)
que utilizaram clodronato encapsulado em lipossomos e também lipossomos contendo PBS
para mensurar a influência da depleção de macrófagos na reparação do ligamento medial
73
colateral de ratos. Estes autores constataram que uma única aplicação de lipossomos contendo
clodronato dois dias antes da realização de processo cirúrgico resultou em efetiva depleção de
monócitos circulantes/futuros residentes do tecido de granulação por um período de 5 dias,
contudo sem depletar completamente as populações de macrófagos M1 e M2. Estes
resultados obtidos em tecido de histoarquitetura e processo de reparação semelhante à do LiP
no início da segunda metade da prenhez refendam a exequibilidade da depleção de macrófagos
com clodronato encapsulado em lipossomos para reconhecimento de expressões referente a
presença e polarização de macrófagos.
Nos animais dos grupos Lipossomo e Clodronato a partir do 18ddg até o 1ddp, índices
menores de expressão de Ccr2 se contrapõem a índices maiores de Arg1, associado a fenótipo
M2, e Il1a/Tnfa associado ao fenótipo M1 como o observado em culturas de monócitos de
mulheres gestantes após estimulação com LPS e interferon gama (Faas et al., 2014). Este
fenômeno pode ser associado às restrições de funções que ocorrem em células de linhagem
monocitária em condições inflamatórias (Fekete et al., 2012). De acordo com estes autores,
a diferenciação de células monocitárias nos tecidos periféricos pode ser prejudicada se
sinais de ativação atuarem sobre células precursoras de monócitos antes do
comprometimento destas com as vias de diferenciação de células monocitárias.
A aparente perda de homeostase em relação ao grupo Controle, observada nos grupos
Lipossomo e Clodronato, em virtude dos maiores índices da expressão de Arg1, típico do
fenótipo M2, assim como de Il1a e Tnfa ,típicos do fenótipo M1 em contrapartida aos baixos
índices de expressão de Ccr2, pode estar associada ao incremento da produção de citocinas
com potencial de restringir ou interferir nas respostas de células monocitárias que realizaram
migração para o LiP, anteriormente aos tratamentos com lipossomo ou clodronato. Este tipo de
interferência leva ao desenvolvimento da exaustão funcional antes que precursores
74
monocitários se diferenciem em células maduras capazes de reprogramar seu repertório de
receptores de quimiocinas (Fekete et al., 2012), que no LiP dos animais tratados poderia
estar ocorrendo em função da indução de mecanismos justácrinos ou parácrinos que afetariam
a expressão do mRNA do Ccr2 em decorrência do aumento dos citocinas expressas por
macrófagos M1 e M2.
As modificações nos índices de expressão de citocinas nos tecidos interpúbicos de
animais do grupo Clodronato do 18ddg ao 3dpp podem estar associadas ao desbalanço de
no mecanismo de reparo tecidual graças às modificações na polarização M1/M2. Uma vez
que os índices de expressão das citocinas Il1a e Tnfa (típicas do fenótipo M1) são
favorecidos em relação os de citocinas anti-inflamatórias, principalmente IL10, ocorre
resposta pró-inflamatória exacerbada que acarreta na perda da integridade tecidual no
18ddg e 19ddg e na formação de tecido conjuntivo denso no LiP do 18ddg ao 3dpp, de
modo semelhante ao mecanismo observado em quadros de fibrose (Gordon & Taylor,
2005; Murray & Wynn, 2011).
Os desequilíbrios observados nos LiPs de camundongos tratados são semelhantes
aos que indicam a perda na habilidade de macrófagos em transitar normalmente de M1 para
M2 no seu estado ativado (Kodali et al., 2013), o que ressalta a existência da modulação de
macrófagos M1/M2 na ativação da resposta de reparo tecidual e reestabelecimento da
homeostase local no LiP, que quando desestabilizada durante a segunda metade da prenhez
gera complicações no parto a termo, como o observado em quadros patológicos com
aumento de resposta M1 no útero de mulheres e roedores (Brown et al., 2014; Gomez-
Lopez et al., 2014) e durante o pós-parto levam a aparente diminuição nas respostas de
reparo tecidual, que também se manifesta na depleção precoce de macrófagos por
75
lipossomos contendo clodronato durante o reparo do ligamento colateral medial de ratos
(Chamberlain et al., 2011).
A consonância entre as imunolocalizações dos biomarcadores 7/4 e F4/80 de monócitos
e macrófagos, suas presenças nos canais, lacunas e áreas esgarçadas do ligamento interpúbico
bem como todas as modificações celulares e de matriz do LiP e as quantificação dos índices de
expressão de fatores pró e anti-inflamatórios do 18ddg ao 3ddp de camundongos permitiram o
reconhecimento de aspectos que dizem respeito à participação e a fina modulação da
polarização M1/M2 como contribuição ao remodelamento do LiP durante o final da prenhez,
parto e pós-parto.
Os resultados obtidos durante o remodelamento da sínfise púbica do camundongo são
consistentes com a hipótese de que o recrutamento espaço temporalmente regulado de
macrófagos em componentes do canal de parto e cintura pélvica de modo geral pode contribuir
para adaptações destas estruturas no final da prenhez e no pós-parto, como aquelas que
mostram modificações relacionadas à modulação de resposta M1/M2 nos tecidos cervicais
durante o reparo pós-parto, bem como no miométrio e decídua necessárias à indução do parto
em mulheres e camundongos, e também no tecido adiposo durante a prenhez em mulheres e,
particularmente, no tecido adiposo parametrial em camundongos ao final da prenhez (Zhang et
al., 2011; Mahendroo, 2012; Resi et al., 2012; Brown et al., 2014; Gomez-Lopez et al., 2014;
Pedroni et al., 2014).
Além das semelhanças no que diz respeito à linhagem, idade, estratégias no manejo
animal até o 17º dia da prenhez contabilizado por Zhang et al. (2011) e que corresponde ao
18ddg conforme os critérios que adotamos; destacamos como elemento primordial para o
entendimento das semelhanças entre as tendências de polarização M1/M2 nos tecidos
interpúbicos e no tecido adiposo parametrial o fato de que ambos estão submetidos as
76
mudanças fisiológicas e biomecânicos do final da prenhez, particularmente no que diz respeito
às forças de compressão que atuam sobre a cavidade pélvica, e deste modo, possuem maiores
interfaces ou mesmo interpenetrações de tecidos do ligamentos e invólucro da SP pelo tecido
adiposo parametrial, como se pode constatar nas ilustrações contidas em artigos que
exploram a conectividade da estruturas da pélvis feminina (Becker et al., 2010;Ercoli et al.,
2005; Shin et al 2012; Yiou et al., 2001).
O grau de interpenetração entre o tecido adiposos parametrial e os órgãos pélvicos
dificulta reconhecimento de limites anatomopatológicos destes órgãos (Shin et al., 2012) e faz
com que, do ponto de vista histofisiológico, o tecido adiposo também seja descrito como
componente normal do estroma da cérvice uterina, estabelecendo a comunicação entre estas
estruturas independentemente da idade de indivíduos, paridade, infamação e traumas anteriores
(Doldan et al., 2009). Desta forma, a interconexão entre estruturas de suporte da cintura pélvica
e do aparelho reprodutor feminino por meio do tecido adiposo do paramétrio permite à
compreensão das estreitas similaridades nos mecanismos de remodelamento durante a prenhez
(Brown et al., 2014), assim como na regulação da polarização de macrófagos M1/M2 (Gomez-
Lopez et al., 2014) desencadeadas no final da prenhez, parto e no remodelamento pós-parto em
mamíferos gravídicos.
Os resultados apresentados neste trabalho apontam para as participações de
monócitos e macrófagos dentre as células da resposta imunitária inata que contribuem
ativamente para modificações espaço temporalmente reguladas da sínfise do camundongo
durante a prenhez parto e pós-parto. Este processo de remodelamento da sínfise, guarda
estreita associação com aqueles representados por um padrão de danos moleculares,
reconhecido por receptores celulares específicos na inter-relação biológica entre
proteoglicanos e seus receptores na resposta inflamatória, como revisto por Frey et al.
77
(2013). De acordo com estes autores esta inter-relação se faz principalmente em doenças
articulares ou inflamações estéreis onde vários componentes da MEC desempenham papeis
chaves na interação padrão de danos moleculares /receptores específicos; dentre estes
conferiram posições de destaque para decorin, ácido hialurônico ligado ao versican, ácido
hialurônico isoladamente, bem como produtos de suas degradações enzimáticas.
Coincidentemente, são estes os componentes da MEC abundantemente secretados
concomitantemente à elevação das expressões de enzimas durante o processo de
remodelamento do LiP do camundongo primíparo. Sendo assim, o reconhecimento de
interações biológicas entre monócito/macrófagos, proteoglicanos, ácido hialurônico e/ou
seus resíduos metabólicos, intermediada por receptores específicos no processo de
remodelamento do ligamento interpúbico do camundongo durante a prenhez constitui
desafio relevante do ponto de vista da biologia tecidual e que, portanto, deve ser colocado
como meta.
78
79
6.Conclusões
1) Os resultados obtidos evidenciaram que os leucócitos que participam do
remodelamento tecidual do LiP na etapa final da prenhez e no pós-parto do camundongo
possuem fenótipos correspondentes ao de monócitos positivos para antígeno 7/4 e
macrófagos positivos para F4/80.
2) O aumento nos índices de expressão do receptor Ccr2 de quimiocinas típico
de monócitos no LiP de camundongos ao final da prenhez e durante o pós-parto é
concomitante ao aumento na expressão de fatores associados a polarização de macrófagos
nos fenótipos M1 e M2. Deste modo, os resultados evidenciaram que a modulação na
polarização de macrófagos é uma característica importante no remodelamento e manutenção
da homeostase tecidual da SP durante a prenhez.
3) A estratégia empregada para a depleção de macrófagos evidenciou o
favorecimento de resposta pró-inflamatória pelo tratamento com lipossomos contendo
clodronato que acarreta no desbalanço na polarização de macrófagos com favorecimento do
fenótipo M1 e resulta em perda de integridade tecidual no final da prenhez e atraso nos
mecanismos de reparo no pós-parto. No entanto, reconhecemos as limitações deste estudo
dado a grande variedade de células, moléculas e fatores provenientes da prenhez que atuam
no remodelamento da SP, o que para nós, representa novos desafios.
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8. Anexos
8.1. Certificado e Declaração de Comissão de Ética em Pesquisa Animal
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