i

BIANCA GAZIERI CASTELUCCI

“INFLUÊNCIA DA DEPLEÇÃO DE

MACRÓFAGOS NA REMODELAÇÃO DA SÍNFISE

PÚBICA DE CAMUNDONGOS C57BL6 DURANTE

O FINAL DA PRENHEZ E O PÓS-PARTO.”

Campinas, 2015.

ii

iii

iv

v

vi

vii

Resumo

A sínfise púbica (SP) faz parte do conjunto de elementos do sistema

musculoesquelético que oferece suporte aos órgãos pélvicos. Em alguns animais, como

camundongos e cobaias, esta junção fibrocartilaginosa passa por drásticas modificações

hormonalmente reguladas durante a prenhez, resultando no afastamento dos ossos púbicos e

na formação de um ligamento elástico (LiP) que facilita a passagem dos fetos durante o

parto. Assim como o LiP, a cérvice uterina (CV) também sofre extensa remodelação

durante a prenhez e ambos apresentam similaridades no que diz respeito à composição

tecidual, proliferação celular e regulação por relaxina e hormônios esteroides. Embora

alguns achados relacionem o relaxamento da SP da e CV à ativação de uma resposta pró-

inflamatória sem a participação de granulócitos, a participação de outros leucócitos no

remodelamento da SP durante o parto e pós-parto ainda não foi devidamente investigada

em camundongos. Com a finalidade de caracterizar aspectos que envolvem a participação

de leucócitos neste remodelamento realizamos o presente estudo visando à caracterização

morfológica e análise da expressão gênica destas células durante o relaxamento (dias 12, 18

e 19ddg) e a remodelamento da SP no pós-parto (dias 1 e 3dpp) associadas à depleção de

monócitos/macrófago. A análise morfológica demonstrou a presença de

monócitos/macrófagos, positivos para os marcadores dos antígenos 7/4 e F4/80

respectivamente, dispersos na matriz e no interior de lacunas do LiP entre 18ddg e 3dpp nos

grupos controle e tratados. No grupo controle, as análises de PCR em tempo real

demonstraram o aumento da expressão de receptor (Ccr2) característico de monócitos

inflamatórios nos tecidos interpúbicos, no final da prenhez e pós-parto. Durante a separação

viii

dos ossos púbicos, as evidencias indicaram tendência à polarização dos macrófagos

favorável ao fenótipo anti-inflamatório M2 (Arg1). No relaxamento houve aumento dos

fenótipos pró-inflamatório M1 (Il1a, Tnfa) e anti-inflamatório M2 (Il10); enquanto no pós-

parto (1dpp) houve aumento na expressão de genes caraterísticos do fenótipo M1 e queda

da expressão relativa de Arg1, simultaneamente ao remodelamento da matriz necessário a

reorganização da articulação interpúbica. Posteriormente, no 3dpp, apesar da manutenção

dos níveis de expressão de Il1a e Tnfa houve aumento da expressão de Il10, Arg1 e Tgfb,

genes relacionados ao fenótipo M2, o que potencialmente pode ser associado à ativação de

mecanismos de reparo tecidual necessários à reaproximação dos ossos púbicos. A depleção

de monócitos/macrófagos nas etapas de separação e relaxamento dos tecidos interpúbicos,

assim como no 3dpp favoreceu a polarização de macrófagos de fenótipo M1 (Il1a, Tnfa),

resultando em alterações na compactação da matriz extracelular. Este estudo demonstra que

os fagócitos mononucleares são células importantes no processo fisiológico do

remodelamento da SP do camundongo durante a prenhez, parto e pós-parto. Estas células

atuam por meio de mecanismos finamente regulados capazes de garantir o sucesso da

reparação tecidual de estruturas suportes da cavidade pélvica do camundongo.

ix

Abstract

The pubic symphysis (PS) is part of the musculoskeletal system elements that

provide support to the pelvic organs. In mice, this fibrocartinaginous joint undergoes

hormonally regulated changes during pregnancy involving the pubic bones reabsorption

and formation of an elastic ligament (IpL) that leading to a safe delivery. At this period, the

uterine cervix (UC) also undergoes an extensive remodeling sharing some similarities with

the IpL tissue like connective tissue composition, cell proliferation and hormonal regulation

of that process. Although some findings relate the relaxation of PS and UC to the activation

of a pro-inflammatory response without the granulocytes involvement, others leukocytes

participation in PS remodeling at the delivery and postpartum were not well investigated in

mice. In order to characterize aspects of the participation of leukocytes in the PS

remodeling we conducted the morphological characterization and analysis of gene

expression of these cells during relaxation (12, 18 and 19 days of pregnancy) and the

remodeling of the PS postpartum (1 and 3dpp) associated with the depletion of monocytes /

macrophages. Morphological analysis revealed the presence of positive cells for antigen 7/4

and F4 / 80, monocytes and macrophages respectively, dispersed in the matrix and inside

gaps of the IpL between the 18dp and 3dpp in the control and treated groups. In control

group, the real-time PCR analysis showed increased expression of the characteristic

inflammatory monocytes receptor (Ccr2) at the interpúbicos tissues on late pregnancy and

postpartum. During pubic bones separation, evidences indicated that macrophages

preferentially tend to polarize in the anti-inflammatory phenotype M2 (Arg1). At the

relaxation of IpL pro-inflammatory M1 (Il1a, Tnfa) and anti-inflammatory M2 (I110)

x

phenotypes was increased; in the meantime, parallel to the remodeling of the extracellular

matrix necessary to the interpúbica joint reorganization at postpartum (1dpp), there was an

increase in the expression of genes characteristic of M1 phenotype and decreasing in the

Arg1 relative expression. Subsequently, at the 3dpp, despite the maintenance in expression

levels of Il1a and Tnfa there was an increased in M2 phenotype-related genes expression

(Il10, Arg1 and Tgfb) potentially involved in the activation of tissue repair mechanisms

necessary to pubic bones reapproximation. Depletion of monocytes / macrophages at

separation and interpubic tissue relaxation, as well as 3dpp favored the M1 macrophage

phenotype polarization (Il1a, Tnfa), leading to changes in the extracellular matrix

compression. This study shows that mononuclear phagocytes are important cells in the

physiological process of mice PS remodeling during pregnancy, labor and postpartum.

These cells act through finely regulated mechanisms to ensure the successful tissue repair

of the pelvic support structures in mice.

xi

Aos meus pais, por me ensinarem que o

caminho certo nem sempre é o mais simples. Aos

meus avós pelo apoio e carinho. A minhas irmãs,

pela amizade constante. A meus amigos, pela

compreensão e companheirismo. Ao Rogério, por me

alegrar e me ajudar sempre que precisei.

xii

Este trabalho foi realizado no Laboratório de

Citoquímica e Imunocitoquímica do Departamento

de Bioquímica e Biologia Tecidual do Instituto de

Biologia da Unicamp, pelo Programa de Pós-

Graduação em Biologia Celular e Estrutural, com

auxílio financeiro da Fundação de Amparo à

Pesquisa do Estado de São Paulo, bolsa de Mestrado,

processo número 2012/25038-8.

xiii

Agradecimentos

Aos meus pais, por todos os dias ao meu lado. Sem vocês nunca teria começado esta

carreira. Muito obrigada por fazerem parte da minha vida. Amo vocês, serão sempre meus

maiores exemplos.

As minhas irmãs Bruna e Marcela, de quem, apesar de dizerem por aí que sou o

Richard versão feminina, sinto falta de vocês todos os dias longe de casa. Amo muito vocês

duas, bru e magrela.

Aos meus avós pelo apoio e carinho constantes durante toda minha formação. Me

esforço para um dia possuir ao menos metade da simpatia, alegria, harmonia e simplicidade

de vocês.

Ao Rogério, pelos conselhos mirabolantes, ou não, e pela felicidade que me traz por

estar ao meu lado. Sem você este trabalho teria sido muito mais difícil. Obrigada meu lindo.

Ao Alpha, ou Guilherme, por ser o melhor amigo que poderia sonhar ter. Obrigada

por estar sempre perto e ser uma ótima companhia em todos os momentos.

A Débora, que mesmo em Chicago sempre esteve ao meu lado via WhatsApp ou

Skype, e fez minha vida muito mais feliz. Obrigada pela amizade Dedé. Sinto sua falta.

Ao Sílvio, por ser um grande amigo e muitas vezes um excelente professor.

Obrigada por me ajudar durante todo meu projeto, principalmente nas análises de PCR em

tempo real. Sem você este trabalho nunca teria saído! Espero poder ir ao restaurante

japonês ou dogão com você muitas outras vezes.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Paulo Pinto Joazeiro, pelos conselhos, conversas,

histórias, paciência e compreensão em momentos de crises de ansiedade. Agradeço por ter

xiv

me permitido entrar em seu grupo de pesquisa e por prosseguir com o senhor como

orientador neste mestrado e em meu futuro doutorado. Espero um dia ser tão boa como

pessoa e como profissional quanto o senhor.

A todas as pessoas da sala de pós-graduação do departamento de bioquímica e

biologia tecidual, meus grandes amigos. Vocês são incríveis. Viviane, minha eterna equipe

envolvida e companheira de jogos da copa; Paula, por ser sempre uma diva; Carol, por ter

mania de bichinhos na sua mesa, pelo carinho e alegria, mesmo nos momentos de briga

pelo ar condicionado; Marina, por ser minha filha nas horas vagas e ter a melhor risada que

o mundo já viu; Valquíria, por ser muito fofa; A Mary, por ser um anjo e sempre me ajudar

e ao Diego, o colombiano mais brasileiro que já conheci.

Agradeço às pessoas que foram mais do que amigas durante a recuperação de meu

pé quebrado. Lucimara, pelas caronas e conversas que lhe deram o título vitalício de melhor

companheira de quarto do mundo; Fernanda, por todas as caronas, conversas, almoços

fitness, dicas e corridas que sempre me ajudaram a relaxar e me fizeram muito feliz; Bruno,

pelas caronas, corridas, amizade e por me azucrinar em todos os dias possíveis!

À Natália, a melhor técnica que este mundo já viu. Às meninas da microscopia

eletrônica (Ana, Adriane e Stella) pela ajuda em meu trabalho e pelas risadas nos

momentos de descontração. Ao Matheus pela companhia e auxílio. À Nara e a Marília pela

amizade e pela ajuda em diversos pontos de minha formação. A Letícia, por todos os

almoços, conversas e conselhos. Ao Ricardo pelas conversas extraordinárias.

À Profa. Dra. Lúcia Elvira Alvares, pela convivência e exemplo. Obrigada por ter

me ensinado a purificação de RNA por cloreto de lítio e por ceder o espaço e materiais do

Laboratório de Biologia do Desenvolvimento (Lab. Azul), indispensáveis ao

desenvolvimento das análises de PCR em tempo real deste trabalho.

xv

Ao Prof. Dr. Henrique Marques Souza por me permitir participar como PED nas

aulas de Morfofisiologia II da medicina e por ceder o espaço do L.A.R.G.E. para

desenvolvimento das análises moleculares deste trabalho.

Aos demais professores do departamento pelo exemplo profissional e convívio

agradável.

Ao Prof. Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira por permitir o uso do

microscópio de fluorescência de seu grupo de pesquisa para as análises de imunomarcações

realizadas neste trabalho.

Aos meus amigos da graduação e do coral zíper na boca pelas risadas e pelo

convívio. Sem vocês minha graduação e este mestrado não teriam metade da graça.

Obrigada pela amizade e pela alegria.

À Lilian Panagio, secretária do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e

Estrutural, pelas informações, atenção e suporte a mim prestados.

À Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Pós-Graduação em

Biologia Celular e Estrutural por terem oferecido espaço e oportunidades para meu

crescimento profissional.

Aos órgãos de fomento à pesquisa CNPq e FAPESP cujo apoio financeiro

possibilitou a realização deste trabalho.

xvi

xvii

Lista de Abreviaturas

µg/mL: Microgramas por microlitros;

µL: Microlitros;

µ: Micrômetros;

12ddg: 12º dia de prenhez;

18ddg: 18º dia de prenhez;

19ddg: 19º dia de prenhez;

1dpp: 1 dia pós-parto;

3dpp: 3 dias pós-parto;

ADMITS: A disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin;

ANOVA: Análise de variância, do inglês Analysis of variance;

ARG1: Arginase 1, do inglês Arginase 1;

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool;

BSA: Albumina sérica bovina; do inglês bovine serum albumin.

cDNA: Ácido desoxirribonucleico complementar, do inglês complementary

deoxyribonucleic acid

CCL2: Quimiocina C-C ligante 2, do inglês C-C chemokine ligand 2;

CCR2: Receptor tipo 2 de quimiocinas C-C , do inglês C-C chemokine receptor type 2;

CL2MBP: Diclorometilenobifosfanato do inglês Dichloromethylenebisphosphonate;

CsF1: Fator estimulador 1 de colônia de macrófagos, do inglês Macrophage colony

stimulating fator 1;

Ct: Thershold cycle;

xviii

CV: Cérvice uterina;

CX3CR1: Receptor 1 de quimiocinas CX3C, do inglês CX3C chemokine receptor 1;

DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole;

DNA: Ácido desoxirribonucléico, do inglês Deoxyribonucleic acid;

h: Horas;

IL: Interleucina, do inglês Interleukin;

iNKT: Células T exterminadoras naturais invariantes, do inglês Natural Killer T

invariant cells;

iNOS: Óxido nítrico sintase induzível, do inglês Inducible nitric oxide synthase;

IpL: Interpubic ligament;

LiCl: Cloreto de lítio;

LiP Ligamento interpúbico;

M: Molar;

M1: Macrófagos de ativação clássica;

M2: Macrófagos de ativação alternativa;

mg: Miligramas;

min: Minutos;

mm: Milímetros;

mM: Milimolar;

MMPs: Metaloproteinases, do inglês Metalloproteases;

NK: Células exterminadoras naturais, do inglês Natural Killer Cell;

nm: Nanometros;

NO: Óxido nítrico, do inglês Nitric oxide;

xix

PBS: Tampão fosfato-salino, do inglês Phosphate buffered saline;

PCR: Reação em cadeia da polimerase; do inglês Polymerase chain reaction;

pH: Potencial hiônico;

PS: Pubic symphysis;

PCR: Reação em cadeia da polimerase, do inglês polymerase chain reaction;

RT-PCR: Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa, do inglês Reverse

transcription polymerase chain reaction;

RNA: Ácido ribonucleico, do inglês Ribonucleic acid;

s: Segundos;

SEM: Média do erro padrão, do inglês Standard error of the mean;

SP: Sínfise púbica;

TGFb: Fator transformador do crescimento beta, do inglês Transforming growth factor

beta;

TIMPs: Inibidores teciduais de metaloproteinases, do inglês Tissue inhibitors of

metalloproteinases;

TNFa: Fator de crescimento tumoral alpha, do inglês Tummor necrose factor alpha;

UC: Uterine cervix;

G: Vezes de giros;

DEPC: Diethyl pyrocarbonate.

xx

xxi

Sumário

RESUMO .............................................................................................................................vii

ABSTRACT...........................................................................................................................ix

DEDICATÓRIA....................................................................................................................xi

AGRADECIMENTOS........................................................................................................xiii

LISTA DE ABREVIATURURAS.....................................................................................xvii

1.INTRODUÇÃO...................................................................................................................1

1.1. Sínfise Púbica..............................................................................................................1

1.2. Formação do Ligamento Interpúbico e Remodelamento de sua Matriz Extracelular

Durante a Prenhez em Camundongos.................................................................................3

1.3. Macrófagos e Monócitos: Heterogeneidade e Participação no Reparo Tecidual e

Manutenção da Homeostase...............................................................................................5

1.4. Participação de Monócitos/Macrófagos na Remodelamento de Elementos do Canal

do Parto Durante a Prenhez e o Pós-Parto.........................................................................9

1.5. Depleção de Leucócitos Durante a Prenhez e o Uso de Depleção via Lipossomos no

Estudo de Macrófagos......................................................................................................14

2. OBJETIVOS.....................................................................................................................19

2.1. Objetivo Geral ..........................................................................................................19

2.2. Objetivos Específicos................................................................................................19

3. MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................................21

3.1.Animais, Procedimentos Cirúrgicos e Tratamentos...................................................21

3.2. Processamento Histológico e Análise ao Microscópio de Luz.................................22

xxii

3.3. Processamento Histológico e Análise ao Microscópio Eletrônico............................23

3.4. Imunohistoquímica e Análise ao Microscópio de Fluorescência..............................24

3.5. Análise pela técnica de PCR em tempo real..............................................................25

3.5.1. Desenho de Primers...........................................................................................25

3.5.2. Extração de RNA...............................................................................................26

3.5.3. Precipitação com Cloreto de Lítio (LiCl) .........................................................27

3.5.4.Síntese de cDNA.................................................................................................28

3.5.5. PCR em Tempo Real.........................................................................................29

3.6. Análise Estatística.....................................................................................................29

4. RESULTADOS.................................................................................................................31

4.1. Análise Morfológica e Ultraestrutural da Articulação Interpúbica e de Células

Fagocitárias Presentes em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e

Clodronato........................................................................................................................31

4.1.1. Constatação Previa da Depleção sistêmica de Fagócitos Induzida pelo

Administração de Lipossomos Contendo Clodronato......................................................31

4.1.2. Aspectos do Remodelamento Tecidual da Articulação Interpúbica Durante a

Prenhez e o Pós-Parto em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e

Clodronato........................................................................................................................34

4.1.3. Caracterização Ultraestrutural de Fenótipos Celulares dos Tecidos Interpúbicos

Durante a Prenhez e Pós-Parto em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e

Clodronato........................................................................................................................40

4.1.4 Imunolocalização de Fagócitos Mononucleares na Articulação Interpúbica de

Camundongos dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato Durante a Prenhez e o

Pós-parto...........................................................................................................................45

xxiii

4.2 Análises de aspectos Moleculares Indicativos da Polarização de Fagócitos nas

Resposta Anti e Pró- Inflamatória durante a Remodelação da Articulação Interpúbica de

Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato Durante a Prenhez e o Pós-

Parto..................................................................................................................................54

4.2.1. Análise da expressão de moléculas características da resposta imune pró e anti-

inflamatória via M1/M2 durante o relaxamento do LiP e reparo pós-parto em

camundongos dos grupos Controle, Lipossomo e Clodronato.........................................54

5. DISCUSSÃO.....................................................................................................................61

6. CONCLUSÕES.................................................................................................................79

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................81

8. ANEXOS...........................................................................................................................99

8.1. Certificado e Declaração de Comitê de Ética em Pesquisa Animal..........................99

xxiv

1

1. Introdução

1.1 Sínfise Púbica

A cavidade pélvica de humanos e roedores de ambos os sexos é um conduto ósseo

semicilíndrico retilíneo que possui um dos eixos paralelo à espinha lombo-sacral e o outro

perpendicular e à abertura de saída da cavidade. Dorsalmente, os ossos ísquio- púbico e íleo

- púbico formam ângulos de 90º e 45º, respectivamente, com a espinha lombo-sacral e

ventralmente, convergem para constituir o arco púbico frontal, estabilizado por uma sínfise

fibrocartilaginosa. Esta articulação não sinovial móvel é denominada sínfise púbica e é

formada por um disco de fibrocartilagem interposto entre dois coxins de cartilagem hialina.

Estas estruturas são recobertas anteriormente por aponeuroses de músculos da parede

abdominal, os gráceis e os adutores longos, sendo que a fusão dos dois últimos ao

ligamento arqueado proporciona o suporte para a região anterior e o ligamento púbico

superior promove a sustentação da porção superior (Yiou et al., 2001; Ortega et al., 2003;

Ercoli et al., 2005; Cunningham et al., 2007; Becker et al., 2010 para revisão de bases

anatômicas).

Além de fazer parte do conjunto de elementos do sistema musculoesquelético, a

sínfise púbica (SP) oferece suporte aos órgãos pélvicos. Essa junção fibrocartilaginosa

possui o papel de prover estabilidade e auxiliar na neutralização de forças de compressão

atuantes sobre a pelve durante a movimentação, fato particularmente importante nas fêmeas

(Cunningham et al., 2007). Além disso, a SP apresenta dimorfismo sexual e é

metabolicamente ativa durante a prenhez de alguns modelos animais como camundongos e

2

cobaias, desencadeando em drásticas modificações para acomodação do canal do parto e

rápido reestabelecimento após o parto (Sherwood, 1994; Ortega et al., 2003; Becker et al.,

2010, para consulta das contribuições originais).

O remodelamento tecidual da SP em cobaias e camundongos prenhes resulta no

desenvolvimento de um ligamento interpúbico elástico (LiP) por meio de dois processos

principais: a separação dos ossos púbicos e o relaxamento do LiP. O primeiro tem início no

12º dia de prenhez a partir de quando ocorre o crescimento do tecido fibrocartilaginoso e a

formação do ligamento interpúbico, a reabsorção dos ossos púbicos e a substituição dos

coxins de cartilagem hialina que compõem o ligamento. Já o relaxamento tem início a partir

do 15º dia de prenhez e caracterizando-se pela acentuada reorganização dos tecidos

conjuntivos presentes (Talmage, 1947a, b). Após o primeiro parto, a involução deste

ligamento ocorre em aproximadamente 10 dias, com a restabelecimento de dimensões

semelhantes ao animal não prenhes (Hall, 1947; Storey, 1957; Veridiano et al., 2007).

Na mulher as modificações morfológicas da SP mostram-se discretas durante a

gestação quando comparadas às de modelos animais. Relatos de dores púbicas são

freqüentemente negligenciados no pós-parto, ainda que relativamente comuns (Becker et

al., 2010). Recentemente, minuciosos estudos em mulheres primíparas demostraram que

além das conhecidas lesões nos componentes do assoalho pélvico em indivíduos de grupos

de risco, também são observadas fraturas e edemas de medula dos ossos púbicos assim

como rupturas capsulares ao longo de regiões posteriores e inferiores da sinfise, locais de

intensa atuação das forças de tração. (Brandon, 2011;. Miller et al., 2011; Wei et al., 2012).

3

1.2 Formação do Ligamento Interpúbico e Remodelamento de sua Matriz

Extracelular Durante a Prenhez em Camundongos.

Durante a segunda metade da prenhez, a SP de camundongos sofre influência de

modificações hormonais finamente reguladas que induzem o afastamento dos ossos púbicos

para acomodação e passagem dos fetos pelo canal do parto. O remodelamento da sínfise é

um processo gradual que envolve a reabsorção dos ossos púbicos e peças de cartilagem

hialina, assim como a substituição do disco fibrocartilaginoso por um ligamento interpubico

flexível, dando origem a uma porção de transição osteoligamentosa com características de

enthese fibrocartilaginosa (Sherwood, 1994; Benjamin et al., 2006). Devido à sua

magnitude, este fenômeno foi descrito como a "transformação" ou "metamorfose" da

sínfise púbica em um ligamento interpúbico nos primeiros trabalhos relacionados a tais

alterações teciduais (Gardner, 1936; Hall, 1947; Storey, 1957; Crelin 1969).

O remodelamento da sínfise e o relaxamento do ligamento interpúbico durante a

segunda metade da prenhez requerem o equilíbrio dinâmico e espaço temporalmente

regulado entre deposição e degradação de componentes da matriz extracelular. Se por um

lado, o rearranjo e deposição de fibras colágenas grossas e elásticas neoformadas assim

como o aumento das concentrações de ácido hialurônico de alto peso molecular contribuem

para o suporte biomecânico durante a expansão máxima do ligamento (Moraes et al., 2003;

Pinheiro et al., 2004; 2005; Garcia et al., 2008; Consonni et al., 2012 a; Rosa et al., 2012) ;

por outro lado, as elevações dos níveis de expressões de enzimas como metaloproteinases,

MMP-8 (entre os dias 12 e 15), MMP-2 e -9 (entre os dias 15 e 19), catepsina B, inibidores

teciduais de metaloproteases (TIMP-1 e -2) e a diminuição da expressão de ADMITS (que

degrada versicam) desempenham papéis importantes no remodelamento e relaxamento do

4

tecido interpúbico, logo,necessários a acomodação do canal do parto (Rosa et al., 2008;

2011; 2012).

No que diz respeito aos fenótipos celulares presentes no LiP durante sua formação e

ao longo da prenhez, Crelin (1969) destacou que as modificações resultantes da expansão

gradual desta estrutura estão relacionadas ao potencial de células condrocíticas da sínfise de

“se liberarem de suas lacunas” e adquirirem fenótipo semelhante ao de fibroblastos, como

demonstrado ultraestruturalmente por Linck et al. (1976). Durante a formação do ligamento

ocorre expressão espaço-temporal de Vimentina (V), α-Actina de músculo liso (α-smA) e

Desmina (D) no citoesqueleto de células fibroblásticas do LiP, de modo semelhante às

células fenotipicamente classificadas como miofibroblasto VAD (Moraes et al., 2004).

Estas células possuem reconhecida capacidade proliferativa (Veridiano et al., 2007) e são

capazes de aumentar significativamente a geração de óxido nítrico (NO) por meio da

expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nos momentos que antecedem o

parto (19º. dia da prenhez), contribuindo eficientemente ao relaxamento do LiP e à

acomodação do canal do parto (Moro et al., 2012).

Durante o pós-parto a SP passa por uma série de modificações graduais que

acarretam na formação de um tecido de características morfológicas de fibrocartilagem 40

dias pós-parto (Consonni et al., 2012 b) constituindo em um processo indispensável à

homeostase do trato reprodutivo (Buhimschi et al., 2009). Ao mesmo tempo em que as

fibras de colágeno passam por um processo de recompactação e os níveis de ácido

hialurônico (Rosa et al., 2012) e do proteoglicano versican (Garcia et al., 2008) diminuem

consideravelmente, a ação de MMPs, TIMPS e catepsinas passa por alterações espaço-

temporais durante o pós-parto. A expressão e atividade destas colagenases e gelatinases

5

diminuem progressivamente até atingirem os níveis de animais não gravídicos no terceiro

dia após o parto (Rosa et al., 2011).

1.3 Macrófagos e Monócitos: Heterogeneidade e Participação no Reparo

Tecidual e Manutenção da Homeostase

Monócitos e macrófagos são fagócitos mononucleares com papéis cruciais porém

distintos na resposta imune e manutenção da homeostase tecidual (Ginhoux & Jung, 2014).

Estes fagócitos apresentam populações reconhecidamente heterogêneas resultantes, em

parte, de suas especializações em diferentes tecidos e/ou em microambientes particulares

(Gordon & Taylor, 2005).

Originários da medula óssea ou do baço, monócitos são precursores de macrófagos

e células dentríticas, possuindo função elementar nos processos inflamatórios e defesa

contra patógenos (Gordon & Taylor, 2005; Mosser & Edward, 2008; Soehnlein &

Lindbom, 2010). Em camundongos, estas células podem ser classificadas em duas

principais categorias de acordo com a presença de receptores para quimiocinas específicas.

Os monócitos “residentes” possuem grande expressão de CX3CR1 (receptor 1 de

quimiocinas CX3C) e estão principalmente relacionados ao patrulhamento de vasos

sanguíneos e reparo tecidual. Já os monócitos “inflamatórios” possuem grandes

quantidades de CCR2 (receptor tipo 2 de quimiocinas C-C) e são rapidamente recrutados

para tecidos durante a respostas inflamatórias (Shi & Pamer, 2011).

Uma vez nos tecidos, os monócitos podem dar origem a macrófagos,

particularmente residentes, que possuem papel de destaque durante o desenvolvimento, a

homeostase tecidual e a resolução de processos inflamatórios estéreis (iniciados após

6

injúria tecidual sem presença de microrganismos) ou não estéreis (iniciada pelo

reconhecimento de microrganismos) (Ginhoux & Jung, 2014).

Macrófagos possuem diferentes funções durante respostas distintas. No que diz

respeito a respostas pós-danos teciduais ou infecções como esquematizadas na Figura 1,

estes fagócitos profissionais tendem a apresentar fenótipo pró-inflamatório, também

conhecidos por M1 ou de ativação clássica, produzindo e liberando mediadores e citocinas

que regulam a ativação de mecanismos antimicrobianos da imunidade celular como fator de

necrose tumoral alpha (TNFa), e interleucinas 1, 12 e 17 (IL1, IL12 e IL17) (Gordon, 2003;

Murray & Wynn, 2011).

Figura 1. Representação esquemática da ação dos diferentes tipos de macrófagos nas respostas

inflamatória e de reparo tecidual (Esquema modificado de Murray & Wynn, 2011).

7

Os macrófagos M1 quando ativados produzem reativos intermediários de oxigênio e

nitrogênio como o óxido nítrico, extremamente tóxicos a microrganismos e também

danosos aos tecidos adjacentes, podendo acarretar em inflamações exuberantes geralmente

prolongadas por ativação de resposta de linfócitos T auxiliares 1 e 17 (Th1 e Th17)

(Gordon et al., 2003; Gordon & Taylor, 2005; Murray & Wynn, 2011).

Desta forma, considera-se crucial para ativação de resposta de reparo tecidual e

reestabelecimento da homeostase local que a ação de macrófagos M1 seja contrabalanceada

e regulada por macrófagos anti-inflamatórios, também conhecidos por M2 ou de ativação

alternativa, em um processo conhecido por “inflamação ordenada”. Esta classificação de

macrófagos M2 engloba subpopulações relacionadas a respostas de reparo tecidual,

coativação de resposta imune humoral, resposta a alergias, fibroses e reguladores de

resposta M1 (Gordon et al., 2003; Mantovani et al., 2004; Gordon & Taylor, 2005; Murray

& Wynn, 2011).

Os macrófagos M2 produzem fatores de crescimento como o TGFb (fator de

crescimento tumoral beta) capaz de estimular a diferenciação de fibroblastos em

miofibroblastos, células responsáveis pelo aumento na produção de colágeno assim como

pela produção conjunta a M2 de MMPs e TIMPs, controlando assim o turnover de

elementos de matriz extracelular (MEC). Estes fagócitos também possuem importante

papel na eferocitose, englobamento e digestão de células mortas, debris celulares e

diferentes componentes da MEC, além de produzirem proteínas imunoreguladoras como

interleucina 10 (IL10) e arginase 1 (ARG1), que juntamente a mediadores lipídicos

demonstram ação na diminuição da magnitude e da duração de resposta inflamatória,

promovendo o reparo tecidual assim como a resolução da inflamação. Estes mecanismos

evitam a promoção de resposta de dano tecidual por ação exacerbada de macrófagos M1 e

8

demais células de caráter pró-inflamatório (Gordon et al., 2003; Mantovani et al., 2004;

Gordon & Taylor, 2005; Serhan et al., 2008; Murray & Wynn, 2011).

O favorecimento de respostas pró-inflamatórias induzidas pela ação de macrófagos

M1 durante resolução de inflamação e reparo tecidual em estruturas osteo-articulares é

responsável pelo desenvolvimento de diversas patologias. Em quadros de osteoartrite e

hérnias de disco, o aumento na ativação e polarização de macrófagos de ativação clássica

em respostas a lesões cartilaginosas gera excessiva expressão de fatores pró-inflamatórios

tais quais IL1, TNFa e NO, desencadeando a degradação de componentes de MEC

cartilaginosa (Kato et al., 2004; Kondo et al., 2014; Martel- Pelletier et al., 2008)

Em quadros mais avançados de osteoartrites, o aumento na liberação de MMPs e

agrecanases resultando na destruição da cartilagem e o aumento na produção de citocinas

pró-inflamatórias levam a síntese de IL1, TNFa, prostaglandinas e NO por condrócitos,

desencadeando a apoptose de condrócitos maduros e inibindo a diferenciação de células

progenitoras da linhagem condrocítica (Kondo et al., 2014; Martel- Pelletier et al., 2008).

Processos inflamatórios exacerbados nas entheses dos ossos presentes nas porções

sacro-ilíacas associadas a alterações nas forças biomecânicas podem acarretar no

desenvolvimento de doenças como espondilose anquilosantes com fusão destas junções

pela formação de sindesmoses ou osteófitos (Lories & Haroon, 2014). Além disso, embora

recebam menor destaque que as disfunções do canal de parto que levam ao parto pré-

maturo também relacionadas a alterações nas repostas M1 e M2, as síndromes de prolapso

de órgãos pélvicos afetam cerca de 30% das gestantes, levando a relatos de dores nas

junções sacro-ilíacas na pelve posterior ou na sínfise púbica (Bjelland et al., 2014).

9

1.4 Participação de Monócitos/Macrófagos no Remodelamento de Elementos do

Canal do Parto e Assoalho Pélvico Durante a Prenhez e o Pós-Parto.

O remodelamento dinâmico do tecido conjuntivo durante a prenhez é uma das

características das grandes modificações da histoarquitetura do trato reprodutivo e dos

elementos musculoesqueléticos circundantes para facilitar o parto sem distocia (Croy et al.,

2014). Uma vez que deficiências nos órgãos e estruturas que compreendem tanto o canal do

parto quanto o assoalho pélvico estão fortemente associadas a incontinência urinária e

prolapso genital (Liu et al, 2004; Drewes et al., 2007; Lee et al, 2008; Couri et al., 2014),

que tecidos conectivos anormais podem ser fator chave ao desenvolvimento de desordens

de suporte pélvico (Liu et al. , 2004; Couri et al., 2014) e que o amolecimento antecipado

dos tecidos cervicais levam ao parto pré-maturo, a regulação das modificações estruturais

desencadeadas pela prenhez devem ser finamente moduladas (Mahendroo 2012;Gonzalez

et al., 2009,2011,2013; Gomez-Lopez et al., 2014).

Durante a gestação os macrófagos estão entre as principais populações de leucócitos

no útero de camundongos, dando suporte não só ao remodelamento do tecido conjuntivo

uterino e estruturas associadas mas também a uma variedade de processos essenciais ao

sucesso da prenhez como a regulação da implantação do trofoblasto, imunotolerância a

antígenos fetais, imunomodulaçao de leucócitos, remodelamento de vasos uterinos,

iniciação do trabalho de parto e retorno a histoarquitetura semelhante a de fêmeas não

prenhes logo após o parto (Payne et al., 2012; Brown et al., 2014).

No útero de mamíferos gravídicos, macrófagos estão presentes tanto na camada

endometrial quanto na miometrial no início da gestação. Entretanto, após a decidualização

10

em ratos e camundongos, mecanismos relacionados a concentrações diferenciais de fator

estimulador 1 de colônia de macrófagos (CsF-1) nos distintos compartimentos uterinos

levam a predominância destes fagócitos no miométrio (Tagliani et al., 2011; Brown et al.,

2014, Gomez-Lopez et al., 2014). A ruptura do microambiente uterino, particularmente

durante os primeiros estágios da gravidez (decidualização, implantação e placentação) pode

ter efeitos profundos sobre a atividade de macrófagos e impactar posteriormente o resultado

da gravidez. (Brown et al., 2014; Favaro et al., 2014)

Após o completo desenvolvimento da placenta, a decídua adquire características de

ambiente tipicamente anti-inflamatório, favorecendo a diferenciação de macrófagos M2 que

previnem a rejeição do feto e permitem seu crescimento até o momento do nascimento.

Modificações inapropriadas na polarização de macrófagos em compartimentos da barreira

materno fetal podem acarretar em diversos problemas na gestação, levando até a morte do

feto (Brown et al., 2014).

Infecções no trato reprodutivo durante a prenhez, que induzem alterações nos níveis

de citocinas e infiltrado de leucócitos nos tecidos uterinos estão entre os eventos

relacionados ao parto pré-maturo, indicando a importância dos mecanismos de regulação de

resposta imune para a manutenção e desenvolvimento normal da prenhez (Shynlova et al.,

2013). Desta forma, é indispensável que somente nos dias precedentes ao parto ocorra o

influxo intenso de macrófagos para a decídua, miométrio, membrana fetal e cérvice uterina,

levando a alteração na distribuição espacial de macrófagos uterinos e posteriormente ao

início da indução do parto normal e remodelamento uterino após o parto (Tagliani et al.,

2011; Brown et al., 2014, Gomez-Lopez et al., 2014).

Em mulheres, estudos apontam a associação de abortos espontâneos durante as

primeiras 12 semanas de gestação a um influxo de macrófagos para a decídua que

11

possivelmente possuiriam características de macrófagos M1. Em paralelo, a excessiva

ativação de macrófagos M1 nas camadas subendoteliais das artérias espiralares presentes na

decídua durante sua etapa de remodelamento pode levar a quadros de aterose uterina no fim

da prenhez, desencadeando em complicações na gestação como pré-eclâmpsia, restrição no

crescimento fetal e desenvolvimento de doenças autoimunes (Brown et al., 2014, para

consulta às contribuições originais).

A cérvice uterina, assim como as demais porções uterinas e a SP, passa por

alterações graduais hormonalmente reguladas em sua estrutura e composição durante a

prenhez em camundongos. Estas modificações podem ser classificadas em três etapas que

se sobrepõem: 1) “softening” - fase observada por volta do 12º dia de prenhez caracterizada

por progressivo afrouxamento do tecido cervical -2) “ripening e dilatação” - etapas

observadas por volta do 18º dia de prenhez; -e 3) reparo pós-parto (Timmons &

Mahendroo, 2006; Timmons et al., 2009; Timmons et al., 2010; Akins et al., 2011;

Mahendroo, 2012).

Durante a primeira metade da prenhez de camundongos, a interação entre leucócitos

positivos para antígeno 7/4 (neutrófilos e monócitos) e macrófagos presentes no epitélio e

estroma cervicais, respectivamente, auxilia na manutenção de mecanismos de vigilância

que previnem possíveis infecções na mucosa cervical durante o softening (Read et al.,

2007). Esta interação, mantida nas etapas de ripening e reparo pós-parto, garante a

integridade do epitélio cervical e a manutenção da barreira física necessária a proteção da

matriz extracelular em remodelamento (Read et al., 2007; Gomez-Lopez et al., 2014).

O ripening, seguido da dilatação, é a fase que culmina na perda da integridade

biomecânica e em modificações da histoarquitetura da cérvice (Timmons & Mahendroo,

2006; Timmons et al., 2009; Timmons et al., 2010; Payne et al., 2012; Mahendroo, 2012).

12

Semelhante ao observado no relaxamento do LiP, nesta fase há elevados níveis séricos de

estrógeno e baixos níveis de progesterona desencadeando o aumento da produção de ácido

hialurônico de baixo peso molecular e glicosaminoglicanos que se associam a estas

moléculas assim como em alterações na solubilidade das fibrilas de colágeno e

vascularização cervicais que além de indispensáveis ao parto a termo, favorecem a

diapedese de leucócitos (Rodriguez et al., 2003; Timmons & Mahendroo, 2006; Gonzalez

et al., 2009; Timmons et al., 2009; Akgul et al., 2012; Payne et al., 2012).

Tais modificações levam à dilatação e ao amolecimento da cérvice, que em conjunto

às contrações uterinas e relaxamento do LiP, auxiliam na expulsão do feto durante o parto

(Becker et al., 2010; Timmons et al., 2010; Mahendroo, 2012; Gonzalez et al., 2013;

Gomez-Lopez et al., 2014). Na mulher, assim como em modelos animais, disfunções na

migração de células meloides durante a gestação podem acarretar no amolecimento precoce

da cérvice uterina, levando ao parto pré-maturo (Timmons & Mahendroo, 2006; Gonzalez

et al., 2011; Gonzalez et al., 2013; Gomez- Lopez et al., 2014).

No que diz respeito à diapedese de leucócitos na cérvice uterina do camundongo

durante a prenhez, acreditasse que monócitos são atraídos para a cérvice pelo

reconhecimento de quimiocinas CCL2 por meio de receptores CCR2 específicos (Timmons

et al., 2009; Menzies et al., 2012). Desta forma, uma vez no estroma cervical, os monócitos

se diferenciam em macrófagos que desempenham diversos papéis durante o remodelamento

da cérvice na prenhez (Timmons & Mahendroo, 2006; Gonzalez et al., 2009; Timmons et

al., 2009; Menzies et al., 2012; Payne, et al., 2012).

No entanto, até o presente momento, nota-se que não há consenso no que diz

respeito à contribuição de monócitos/macrófagos no amolecimento (ripening) da cérvice

uterina no final da prenhez (Gomez-Lopez et al., 2014). Se por um lado, afirma-se que

13

mesmo com o aumento de MMPs ao longo deste processo, monócitos e macrófagos apesar

de presentes não estão ativos nem são responsáveis pela produção de tais moléculas na

cérvice de camundongos durante o parto a termo (Gonzalez et al., 2009; Timmons et al.,

2009; Timmons et al., 2010; Gonzalez et al., 2011; Menzies et al., 2012; Gonzalez et al.,

2013); por outro lado, o emprego de imunohistoquímica e citometria de fluxo evidenciou a

presença de macrófagos relacionada ao aumento de fatores pró-inflamatórios no estroma

cervical no último dia de prenhez e no momento do parto (Payne et al., 2012).

Evidencias apontaram que monócitos atraídos durante a prenhez à cérvice uterina se

diferenciam em macrófagos com ação pró e anti-inflamatórios indispensáveis à fase de

reparo após o parto (Timmons et al., 2009; Mahendroo, 2012, Menzies et al., 2012). De

acordo com estes autores, macrófagos M1 teriam importante ação contra a invasão de

microrganismos oportunistas tanto no parto quanto no pós-parto (Timmons et al., 2009;

Payne et al., 2012) assim como no distanciamento entre moléculas da matriz extracelular

necessário ao ripening (Payne et al., 2012); já macrófagos M2 teriam papel de reparo

tecidual e respostas supressão e controle da inflamação predominantemente durante o

período de remodelamento pós-parto (Timmons et al., 2009; Mahendroo, 2012).

Além da presença de processos dependentes de monócitos e macrófagos no

remodelamento de órgãos e estruturas do canal parto, relatos da literatura evidenciaram a

participação destes tipos celulares no remodelamento do tecido adiposo parametrial

associado aos órgãos da pelve e do canal de parto que a exemplo da SP do camundongo

respondem ao estresse da prenhez. No tecido adiposo parametrial foi observado um

desequilíbrio na polarização destes fagócitos, com favorecimento de macrófagos M1 em

camundongos e humanos (Zhang et al., 2011; Resi et al., 2012). Uma vez ativadas, estas

células aumentam a secreção de fatores pró-inflamatórios na corrente sanguínea e deste

14

modo, contribuem à ativação e desencadeamento de resposta sistêmica e tecidual como

aquela observada por Zhang e colaboradores (2011) em camundongos no 17º dia da

prenhez.

No que diz respeito aos modelos animais nos quais ocorre o relaxamento da SP

durante a prenhez foram observadas diferenças significativas quanto a participação de

leucócitos neste fenômeno. Na cobaia foi verificada a infiltração de granulócitos,

eosinófilos e neutrófilos (Rodriguez et al., 2003), enquanto no camundongo este tipo de

infiltração não foi observada (Consonni et al., 2012b; Rosa et al., 2008; 2011). Apesar da

elevação nos níveis de óxido nítrico e MMPS ao fim da prenhez que contribuem para o

rápido relaxamento do LiP antes do parto, até o presente momento não há relatos sobre o

reconhecimento de agentes capazes de desencadear a produção destes fatores.

Tendo em vista a extensa participação de macrófagos nas modificações de estruturas

constituintes do trato reprodutivo, canal de parto e cintura pélvica durante a prenhez e após

o parto assim como as similaridades na regulação hormonal e componentes de matriz

extracelular nestes períodos entre a SP e a cérvice uterina (CV), o estudo da participação e

atuação destes tipos celulares no remodelamento da SP permitiria melhor compreensão de

mecanismos envolvidos no relaxamento do LiP durante o parto assim como no rápido

reestabelecimento da histoarquitetura da SP como elemento da pelve no pós-parto.

1.5 Depleção de Leucócitos Durante a Prenhez e o Uso de Depleção via

Lipossomos no Estudo de Macrófagos.

A resposta imune materna é um dos elementos cruciais ao desenvolvimento e

sucesso da prenhez (Negish et al., 2012). Tendo em vista que a remoção de células do

15

sistema imunológico de seus ambientes naturais é um dos mecanismos mais efetivos pelos

quais a imunidade é estudada (McGavern & Dustin, 2009), a utilização de distintas

estratégias de depleção leucocitária in vivo tem sido de grande ajuda na compreensão das

funções destes tipos celulares durante a gestação em mamíferos (Guimond et al., 1997).

O uso de animais geneticamente modificados, knockouts, para NKs (células

exterminadoras naturais) e a depleção de células dentríticas pelo uso de anticorpos

específicos durante a primeira metade da prenhez demonstraram ação abrangente, causando

desde diminuição nos sítios de implantação e redução no tamanho dos fetos até à aterose de

artérias uterinas e pré-eclâmpsia, indicando ação destes tipos celulares no remodelamento

de artérias espiralares uterinas, placentação, desenvolvimento fetal e posterior sucesso da

prenhez (Favaro et al., 2014; Yamada et al., 2014; Guimond et al., 1997; Negishi et al.,

2012).

Falhas nos mecanismos de tolerância imunológica desencadeadas pela depleção de

linfócitos T regulatórios levam a rejeição fetal, demonstrando a necessidade da atuação de

células da imunidade adaptativa na manutenção da prenhez (Aluvihare et al., 2004). Além

disso, interferências nas interações entre linfócitos T, NKs e células dentríticas em

camundongo knockout para células NKT indutíveis (iNKTs) podem estar relacionadas a

indução de inflamação coriônica e posterior parto pré-termo (Li et al., 2012).

A depleção de células presentes no timo e no baço destacam as modificações

fisiológicas geradas em órgãos imunes primários e secundários durante a prenhez assim

como a importância destes eventos para a manutenção da gestação (Shinomiya et al., 1991;

Hedge et al., 2001). Animais com depleção de timócitos na primeira metade da prenhez

possuem alterações na ação de macrófagos presentes no fígado, afetando o metabolismo e

imunidade maternos ao longo da gestação (Shinomiya et al., 1991); já a esplenectomia de

16

animais não prenhez uma semana antes ao primeiro dia de gestação leva a significantes

atrasos na decidualização e desenvolvimento placentário, indicando este órgão como

importante progenitor de NKs destinadas ao útero durante a prenhez (Zavan et al., 2012).

No que toca a atuação de células fagocitárias no remodelamento de estruturas do

canal de parto de camundongos, Timmons e Mahendroo (2006) detalharam a não

participação de neutrófilos tanto no remodelamento da cérvice no fim de prenhez como nos

mecanismos que desencadeiam o ripening cervical, dado que a depleção destes tipos

celulares via administração de anticorpos para antígeno 7/4 não desencadeia em alterações

no tempo ou sucesso do parto em animais selvagens.

No que diz respeito às estratégias mais difundidas para a identificação ou

envolvimento de monócito/macrófagos em determinadas vias biológicas estão:

administração de sílica; de anticorpos anti-glicoproteína F4/80 ou de lipossomos contendo

clodronato (Van Rooijen & Sandres, 1994; Gonzalez et al., 2009; 2011; Chow et al., 2011).

Estas estratégias diferem entre si quanto à especificidade da inativação de macrófagos,

entretanto, as duas últimas afetam outros tipos celulares em menores proporções (Van

Rooijen & Sandres, 1994; Gonzalez et al., 2009; Chow et al., 2011). No entanto, ressalta-se

que o aumento nas concentrações de colesterol e fosfolipídios catiônicos na composição

dos lipossomas carreadores de fármaco assim como diferentes vias de administração e

tecidos alvo podem acarretar na ação do veículo sobre as células fagocitárias, levando à

ativação de mecanismos de resposta imunitária, interação com componentes lipídicos do

plasma, bloqueio da capacidade fagocítica ou até mesmo à depleção destas células (Dave &

Patel., 1986 ; Van Rooijen & Sandres, 1994, Filion & Phillips, 1997; Weisser et al., 2012).

Lipossomos contendo clodronato (Cl²MBP), uma substância não tóxica quando livre

na corrente sanguínea, possuem tamanho e composição lipídica específicos que garantem

17

seu reconhecimento por macrófagos. Após endocitose, os lipossomos contendo este

fármaco sofrem ação de fosfolipases presentes nos endossomos e liberam o Cl²MBP no

meio intracelular. Uma vez que esse agente apresenta baixos níveis de transporte por

membranas celulares, ele se acumula nos monócitos/macrófagos induzindo a morte dessas

células (Krolmer et al., 2005; Ziegler & Groscurt, 2014) graças a despolarização da

membrana mitocondrial e posterior liberação de citocromo C e ativação de caspases (Van

Rooijen & Sandres, 1994; Lehenkari et al., 2002).

De acordo com Buiting e colaboradores (1996) a depleção de macrófagos em determinados

tecidos por meio desta estratégia in vivo deve ser avaliada 48 horas após a aplicação de

lipossomos contendo clodronato, uma vez que nos primeiros dois dias após o tratamento

ocorre a retirada de lipossomos e clodronato da corrente sanguínea assim como de debris

celulares resultantes da apoptose dos macrófagos afetados.

Recentemente verificou-se que lipossomos contendo clodronato, além de

desencadearem a depleção de macrófagos, mostraram-se eficazes na depleção de células

CD115 classificadas como monócitos circulantes, diminuindo os níveis destas células no

sangue em mais de 90% (Wang et al., 2012). Além disso, no que diz respeito à ação do

clodronato sobre estruturas cartilaginosas, ensaios in vitro demonstram que este fármaco

possui efeito anabólico em cartilagens articulares graças a sua interação com receptores

purinérgicos, desencadeando no aumento da produção de proteoglicano e demais elementos

de matriz extracelular. Estes dados reafirmam seu potencial uso como terapia

complementar em doenças cartilaginosas degenerativas como a osteoartrite e a artrite

reumatoide (Rosa et al., 2014).

Tendo em mente que a elucidação de processos de remodelamento de tecidos em

modelos animais pode alicerçar escolhas de novos alvos para investigação biomédica,

18

empregamos a depleção de leucócitos por meio da administração de lipossomos contendo

clodronato como estratégia para identificar aspectos que possam ser associados à atuação

de células leucocitária durante as etapas de separação dos ossos púbicos, relaxamento do

LiP e o remodelamento da sínfise púbica no pós-parto.

19

2. Objetivos

2.1. Objetivo Geral:

Tínhamos por objetivo principal analisar a participação de monócitos/macrófagos durante o

relaxamento da SP no fim da prenhez e na etapa de reorganização de sua histoarquitetura nos

primeiros dias pós-parto em camundongos. Para tal, lançamos mão de estratégia para

depleção de monócitos/macrófagos e posteriores análises morfológica e de expressão gênica

de moléculas de sinalização destes tipos celulares nos tecidos interpúbicos.

2.2. Objetivos Específicos:

a) Caracterizar morfologicamente, com emprego das técnicas de microscopia de luz e

eletrônica de transmissão, as células leucocitárias presentes nos tecidos interpúbicos de

camundongos aos 12ddg (controles) e de animais dos grupos que compreendem o final da

prenhez e o pós-parto, tratados ou não com lipossomos contendo clodronato;

b) Realizar estudo imunohistoquímico de marcadores de monócitos/neutrófilos e

macrófagos nos tecidos de animais descritos no item a, utilizando anticorpos específicos para

antígeno 7/4 e glicoproteína F4/80 com emprego de microscopia de fluorescência;

c) Quantificar a expressão de genes envolvidos nos processos de recrutamento de

monócitos (Ccr2), diferenciação e ativação de macrófagos pró-inflamatórios M1 (Il1a, Tnfα)

e macrófagos anti-inflamatórios M2 (Arg1, Tgfβ, Il10) nos tecidos e animais descritos no

item a, utilizando a técnica de PCR em tempo real.

20

21

3. Materiais e Métodos

3.1. Animais, procedimentos cirúrgicos e tratamentos

Foram utilizados camundongos virgens da linhagem C57BL/6, de ambos os sexos,

com cerca de 4 a 5 semanas, provenientes do CEMIB/UNICAMP. As estratégias para

manutenção, manuseio, acasalamento, verificação do estágio da prenhez de animais e

procedimentos cirúrgicos foram semelhantes àquelas empregadas por Rosa et al. (2008) e

aprovadas pelo CEUA/UNICAMP - Comissão de Ética no Uso de Animais/IB-Unicamp (nº

protocolo 2995-1/Anexo). Aos 10 (10ddg), 16 (16ddg), 17(17ddg), 18(18ddg) dias da

prenhez e no primeiro dia após o parto (1dpp), os animais receberam por via intraperitoneal,

alíquotas de 200 µl de PBS (controle), 200 µl de Encapsome® (lipossomo com tampão

fosfato-PBS) e 200 µl de Clodrosome® (lipossomo com clodronat o), de acordo com as

recomendações do fabricante (Encapsula Nano Sciences; www. encapsula. com).

Dois dias após o tratamento, as fêmeas foram sacrificadas por aprofundamento de

anestesia (Ketamina e Cloridrato de Xilazina, 200 e 5 mg respectivamente) e tecidos

interpúbicos foram coletados, bem como amostras de cérvice uterina e baço de cerca de 13

animais, para cada um dos grupos/períodos: 12ddg (animais prenhes nos quais ainda se

observam todos os componentes da SP e por isso tomados como controle), 18ddg, 19ddg (dia

do parto) da prenhez; 1dpp e 3dpp (dias pós-parto). Após laparotomia, as amostras teciduais

foram dissecadas e submetidas ao processamento adequado para as técnicas desejadas

especificadas nos tópicos a seguir. Foram utilizadas amostras de tecidos de dois animais de

cada grupo/período para os métodos de análises de microscopia de luz convencional e

22

eletrônica de transmissão, 3 para cada grupo de análise por imunohistoquímica e 3 ou 6 para

PCR em tempo real, como indicado na tabela abaixo:

Tabela1. Quantidade de animais utilizados por cada dia de estudo para realização das técnicas nos

diferentes tratamentos.

Grupos

Experimentais

Tratado com PBS

(Controle)

Tratado com lipossomo

contendo PBS

(Lipossomo)

Tratado com lipossomo

contendo Clodronato

(Clodronato)

Dias de Estudo 12ddg 18ddg 19ddg 1dpp 3dpp 12ddg 18ddg 19ddg 1dpp 3dpp 12ddg 18ddg 19ddg 1dpp 3dpp

Nº

An

imai

s p

or

An

ális

e

Mo

rfoló

gic

a

Historresina 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Microscopia de

Eletrônica 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Mo

lecu

lar Imunohistoquímica 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

PCR Real Time 6 3 3 3 6 6 3 3 3 6 6 3 3 3 6

Total de Animais por Grupo Experimental: 56 Total de Animais Geral: 168

3.2. Processamento Histológico e Análise ao Microscópio de Luz

Fragmentos de tecidos foram fixados em paraformaldeído 4% (Merck, Darmstadt,

Germany) em solução-tampão de fosfato 0,1M (pH 7,4), durante 24 horas a 4º C. Para fins de

análise morfológica, os tecidos interpúbicos foram descalcificados em solução de ácido

etilenodiamino tetra-acético 5% (EDTA, Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA) com

2% de paraformaldeído em PBS 0,05M (pH 7,4) por cinco dias a 4ºC. Posteriormente, as

amostras foram processadas pelas técnicas histológicas convencionais para embebição em

Resina Glicol-metacrilato (Historresina–Leica- Áustria). Cortes de 3µm foram corados por

coloração de Rosenfeld por meio de técnicas histológicas básicas empregadas em estudos da

sínfise (Consonni et al 2012 a, b). Os materiais foram documentados em fotomicroscópio

23

Eclipse 800 (Nikon, Japão), utilizando-se câmera digital Coolsnap (Media Cybernetics,

USA).

3.3. Processamento Histológico e Análise ao Microscópio Eletrônico

As amostras de tecidos foram fixadas em solução fixadora contendo glutaraldeído

2,5% (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA), ácido tânico 0,5% (Electron

Microscopy Science) dissolvidos em tampão cacodilato de sódio 0,1M de pH 7,2, à

temperatura ambiente, durante 3 horas. Posteriormente, as amostras foram lavadas em

tampão cacodilato de sódio de mesma molaridade, pós-fixadas em tetróxido de ósmio 1%

(Electron Microscope Science) a 4ºC durante 1h. Logo após procedeu-se à desidratação pela

acetona em concentrações crescentes. Os fragmentos de tecidos foram pré-embebidos em

mistura de acetona e resina Epon (Electron Microscope Science) na proporção de 1:1, 1:3

durante 2h cada e embebidos em resina Epon pura overnight semelhante aos processamentos

de amostras de sínfise púbica de camundongos realizados por Moraes et al. (2004), Rosa et

al. (2008) e Consonni et al. (2012 a,b). As amostras foram então incluídas em resina pura e

mantidas em estufa a 60ºC, durante 72 horas. Desse material, para estudo morfológico e

análise de fenótipos celulares da área de interesse, foram obtidos cortes semi-finos (1µm)

corados a quente em solução de 0,5% de Azul de Toluidina (Kiernan, 1999). Desse material,

foram obtidos cortes ultrafinos de 70nm coletados em grades de cobre e contrastados com

acetato de uranila e citrato de chumbo. Os cortes ultrafinos foram estudados e micrografados

no microscópio eletrônico de transmissão LEO 906 do Laboratório de Microscopia

Eletrônica (LME) do IB-Unicamp.

24

3.4 Imunohistoquímica e Análise ao Microscópio de Fluorescência

Amostras de sínfises e ligamentos interpúbicos de fêmeas dos grupos em estudo

foram coletadas, imersas e congeladas em n-heptano e armazenadas a -80ºC. Posteriormente

os tecidos interpúbicos foram embebidos com Tissue Tek (Sakura, EUA) e criocortes de 8μm

foram realizados utilizando-se o criostato (CM1850, Leica Microsystems, Wetzlar,

Alemanha) a -25ºC. Em seguida, as lâminas foram fixadas com acetona gelada por 3min,

lavadas em PBS 0,1M e armazenadas a -20ºC.

Para realização dos ensaios de imunohistoquímica, as lâminas contendo os criocortes

previamente fixados foram incubadas nas etapas que se seguem:

1) Lavagem em PBS 0,1M (pH 7,4) durante 5min à temperatura ambiente;

2) Após a lavagem, as lâminas foram secas até as bordas dos cortes e sobre eles foram

depositados aproximadamente 50μL dos meios de incubação que se sucedem:

Albumina de soro bovino (BSA) 1% dissolvido em PBS 0,1M pH 7,4, durante 30min

à temperatura ambiente, em câmara úmida;

3) Para cada reação, foi aplicado anticorpo primário especifico (vide abaixo) diluído

em 1% de BSA/PBS 0,1M pH 7,4 e incubado overnight em câmara úmida a 4ºC;

Antígeno 7/4 (Neutrophil 7/4): anticorpo monoclonal obtido em rato que reconhece

monócitos e neutrófilos (Serotec, Raleigh, NC, USA).

BM8: anticorpo monoclonal obtido em rato que reconhece a glicoproteína F4/80 de

macrófagos (BACEM Biosciences, Inc., King of Prussia, PA).

4) Na manhã seguinte, foram realizadas lavagens com PBS 0,1M pH 7,4, em duas

etapas de 5min cada à temperatura ambiente;

25

5) Para cada reação, foi utilizado o anticorpo secundário anti-imunoglobulina G de

rato, obtido em cabra (1:900; Alexa Fluor® 488), diluído em PBS pH 7,4 e incubado durante

1h à temperatura ambiente, em câmara úmida;

6) Lavagens com PBS 0,1M pH 7,4 em duas etapas de 5min à temperatura ambiente;

7) Lavagens em PBS 0,1M pH 7,4 em duas etapas de 5min à temperatura ambiente;

8) Incubação com DAPI (sc-3598, Santa Cruz, CA, EUA) 1:1000, diluído em tampão

PBS 0,1M pH 7,4 durante 5min;

9) Lavagens com PBS 0,1M pH 7,4 em duas etapas de 5min à temperatura ambiente;

10) Montagem das lâminas em VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Labs,

Burlingame, CA, EUA).

Como controle negativo da reação a etapa de incubação com o anticorpo primário, foi

omitida. Os materiais foram documentados em microscópio de fluorescência Leica

DM5500B nas objetivas de 20x e 40x.

3.5. Análise pela técnica de PCR em tempo real

As estratégias que foram utilizadas para análise quantitativa de genes em LiP e SP de

camundongos foram aquelas padronizadas em nosso laboratório e descritas por Consonni et

al. (2012 a) com emprego da técnica de PCR em tempo real, conforme os itens que se

seguem;

3.5.1. Desenho de Primers

As sequências específicas de oligonucleotídeos para Ccr2, Il1a, Tnfa, Arg1, Tgfb,

Il10, e 36b4 (gene normalizador endógeno) foram obtidas do GenBank Database do National

26

Center for Biotechnology Information (NCBI) of the National Institutes of Health. Então os

primers foram desenhados com o auxílio do Primer Express 3. 0 Software for Real-Time

(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), verificados pelo BLAST e, assim, a confecção

desses primers (Tabela 2) foi solicitada à Exxtend- solução em oligos (Rua dos Estados,

1377, Paulínia - SP, 13140-536) e Invitrogen Brasil Ltda.

Tabela 2. Sequências de primers forwars e reverse obtidos no NCBI e utilizados na quantificação da

expressão dos genes Ccr2, Arg1, Il10, Il1a, Tgfb, Tnfa e 36b4 de Mus musculus por meio da técnica

PCR em tempo real.

Gene Primer Forward Primer Reverse

NCBI

Reference

Sequence

Ccr2 AAGACCAGAAGAGGGCATTG CCGTGGATGAACTGAGGTAA NM_009915.2

Arg1 TGGCAGAGGTCCAGAAGAAT AGCATCCACCCAAATGACAC NM_007482.3

Il10 CGGGAAGACAATAACTGCAC GGCAACCCAAGTAACCCTTA NM_010548.2

Il1A TTGCTGAAGGAGTTGCCAGA GCACCCGACTTTGTTCTTTG NM_010554.4

Tgfβ GACCCTGCCCCTATATT CCGGGTTGTGTTGGTTG NM_011577.1

Tnfα ACGGCATGGATCTCAAAGAC AGATAGCAAATCGGCTGACG NM_013693.2

36b4 CACTGGTCTAGGACCCGAGAAG GGTGCCTCTGGAGATT NM_007475.5

3.5.2. Extração de RNA

Após laparotomia realizada com emprego de materiais cirúrgicos estéreis, os tecidos

interpúbicos (SP e LiP) e os órgãos anteriormente citados foram removidos e imediatamente

transferidos para nitrogênio líquido e posteriormente armazenados à -80ºC. O RNA total de

amostras de SP foi extraído e isolado utilizando-se o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo o

protocolo do fabricante que prevê maceração de amostras em eppendorfs contendo 1mL de

Trizol; encubação durante 5min à temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados

200μL de clorofórmio (isento de RNase) a cada amostra, seguidos de agitação durante 15s e

27

incubação durante 3min, à temperatura ambiente. Na sequência, o material foi centrifugado a

12000G por 15min a 4ºC. Após a centrifugação, a fase aquosa superior foi removida

cuidadosamente para evitar contaminação por proteínas ou DNA genômico. Em seguida,

foram adicionados 500μL de isopropanol, incubados durante 10min à temperatura ambiente

e, novamente, o material foi centrifugado a 12000G durante 10min a 4ºC, detectando-se a

formação de um pellet na parede do tubo ao fim do procedimento. Após essa etapa, o

sobrenadante foi removido e 1mL de álcool etílico 70% a 4ºC foi adicionado; a solução

resultante foi centrifugada a 7000G por 5min a 4ºC. Finalmente, o sobrenadante foi retirado e

o pellet permaneceu durante 10min exposto para secar. Em seguida, o material foi reidratado

com 20μL de água DEPC (Diethyl pyrocarbonate). A avaliação da integridade das amostras

RNA total obtidas foi feita por meio da eletroforese em gel de agarose a 1% na cuba

horizontal, com corrente contínua a 100V durante 35min. Após a verificação da extração por

meio do gel de agarose, o RNA total foi quantificado com auxílio do NanoDrop (ND-1000

Spectrophotometer). Em seguida, alíquotas dos materiais foram armazenadas a -80ºC.

3.5.3. Precipitação com Cloreto de Lítio (LiCl)

Para purificação de amostras de RNA contaminadas com Trizol, fenóis ou sais foram

adicionados à 20µl de amostra 100 µl de água DEPC, 10 µl de LiCl 4M e 300 µl de etanol

100% (gelado) e posteriormente armazenada por 30min à -80ºC. Após retirada do biofreezer,

a amostra foi centrifugada a 13000 G por 15 min a 4ºC. Na sequência foi descartado o

sobrenadante, adicionado 1 mL de etanol 70% a 4ºC e a solução resultante centrifugada à

13000 G por 5 min a 4ºC. Finalmente, o sobrenadante foi retirado e o pellet permaneceu

exposto para secar por 10 min a temperatura ambiente. Em seguida, o material foi reidratado

com 17μL de água DEPC. A avaliação da integridade das amostras RNA total após

28

precipitação com LiCl também foram obtidas por meio da eletroforese em gel de agarose a

1% na cuba horizontal, com corrente contínua a 100V durante 35min. Após a verificação da

extração por meio do gel de agarose, o RNA total pós-precipitação foi quantificado com

auxílio do NanoDrop (ND-1000 Spectrophotometer) e em seguida armazenadas a -80ºC.

3.5.4. Síntese de cDNA

Para síntese de cDNA, foi utilizado o Revertaid H Minus First Strand cDNA

Synthesis Kit (Fermentas, Maryland, EUA) conforme as instruções do fabricante; descritas

brevemente: À 1μg de RNA total obtido anteriormente foi adicionado 1μL de oligo(dT)18

primers (0,5μL/μL) e o volume final do produto de reação foi completado até 12μL de água

DEPC. Posteriormente, as amostras foram encubadas a 65ºC por 5min no termociclador. Em

seguida, em cada amostra, foram adicionados 8μL da mistura contendo: 4μL de 5x reaction

buffer, 1μL de Ribolock Ribonuclease inhibitor (20u/μL), 2μL de 10mM dNTP mix e 1μL de

RevertAid H Minus M-MuLV RT (200 u/μL), completando o volume final da reação para

20μL. Em seguida, as amostras foram incubadas no termociclador (90min a 42ºC e 5min a

70ºC). As amostras foram quantificadas com auxílio do NanoDrop, aliquotadas e

armazenadas a -80ºC.

Após a síntese de cDNA, foram efetuados testes dos primers utilizando os moldes de

cDNA recém-confeccionados por meio do RT-PCR (Taq DNA polymerase, Fermentas). As

alíquotas foram compostas por 4,5μL de Mix PCR (1x tampão Taq DNA polimerase, dNTP

0,2mM, MgCl2 1,5mM), 1,25μL de DMSO, 2μL de cDNA, 2μL de primers F+R (10mM),

0,125μL de Taq, 15,125μL de água DEPC. Em seguida, as amostras foram incubadas no

termociclador de acordo com o seguinte programa: etapa 1 (1 ciclo: 95ºC – 1min), etapa 2 (5

ciclos: 95ºC – 1min, 65ºC – 30s, 72ºC – 1min), etapa 3 (30 ciclos: 95ºC – 30s, 60ºC – 30s,

29

72ºC – 1min), etapa 4 (1 ciclo: 72ºC – 10min). A avaliação da reação da PCR foi feita por

meio da eletroforese em gel de agarose a 2% na cuba horizontal, com corrente contínua a

100V durante 30min com ladder de 100pb.

3.5.5. Real-Time PCR

Para cada reação foram utilizados 5μL de SYBR Green PCR Master Mix (Applied

Biosystems), 2μL de cDNA (200ng/uL), 3,5 μL de água DEPC, 0,5 μL de primer F (3mM) e

0,5uL de primer R (3mM) no seguinte programa: etapa 1 (1 ciclo: 50ºC – 2min, 95ºC –

10min), etapa 2 (45 ciclos: 95ºC – 15s, 60ºC – 1min). As reações de cada animal foram feitas

em triplicata (3x 21μL) utilizando placa apropriada para o termociclador Applied Biosystems

7500, presente no Laboratório Nacional de Biosciências/CNPEM, Campinas-São Paulo. O

gene normalizador (36B4) foi avaliado e padronizado previamente por Rosa et al., 2011. Os

resultados serão foram normalizados usando os valores de Ct (threshold cycle) do gene 36B4

da mesma placa. Para quantificar a expressão gênica relativa, foi utilizado o modelo

matemático 2-ΔΔCt, considerando o grupo 12ddg como calibrador. Para validar os ensaios

de PCR em tempo real, as curvas de eficiência e de dissociação foram confeccionadas

previamente e ajustes de concentração de cDNA e primers foram efetuados. A curva de

eficiência foi calculada por meio da equação E = 10(-1/slope), com valores resultantes acima

de 0,90 para todos os genes.

3.6. Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas com base nos trabalhos de Conover e Iman

(1981) e Montgomery (1991), utilizando o ranqueamento de dados para posterior análise

semiparamétrica. Os dados da expressão relativa dos genes entre os grupos Controle,

30

Lipossomo e Clodronato foram obtidos utilizando-se a estratégia de ranqueamento de dados

e análise semiparamétrica por ANOVA 2ways seguido do teste de Bonferroni. A análise da

expressão dos diferentes genes realizada entre os dias de estudo do grupo Controle foi feita a

partir do ranqueamento de dados e análise semiparamétrica por ANOVA 1way seguida do

teste de Tukey. A significância estatística foi definida como P<0,05. Os dados foram

apresentados como média ± erro-padrão da média (SEM±).

31

4.Resultados

4.1. Análise Morfológica e Ultraestrutural da Articulação Interpúbica e de Células

Fagocitárias Presentes em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato

4.1.1. Constatação Previa da Depleção sistêmica de Fagócitos Induzida pelo

Administração de Lipossomos Contendo Clodronato.

Nenhum animal dos grupos Controle e Lipossomo foi excluído devido às perdas de

peso ou parto pré-termo gerando ninhadas viáveis. No entanto em algumas oportunidades,

aplicações ocorridas no 18ddg para análise no 1dpp, o tratamento com lipossomo contendo

clodronato levou ao substancial atraso no início do trabalho de parto, prolongamento do

parto e atraso na gestação, assim como à morte de 16,6% dos animais tratados neste

período por distocia.

A depleção sistêmica de fagócitos por lipossomos contendo clodronato foi

constatada previamente no baço e cérvice uterina. No baço, a depleção mostrou-se evidente

na polpa vermelha, particularmente desde a zona marginal, que representa o limite entre as

polpas branca e vermelha (Fig. 2).

Na mucosa da cérvice uterina a estratégia de depleção empregada levou a redução

dos aglomerados de células leucocitárias predominantemente localizadas na camada apical

do epitélio estratificado que reveste o lúmen cervical (Fig. 3).

32

Figura 2. Fotomicrografias de baços de camundongos do grupo Controle (A-C), Lipossomo (D-F) e

Clodronato (G-I) durante o 12ddg. Nota-se a presença de macrófagos (setas) na polpa branca de

todos os grupos (B, E, H) e a diminuição de macrófagos na polpa vermelha de animais tratados com

clodronato (I). Neste grupo, observe a necrose do parênquima esplênico, assim como a presença de

células de cromatina extremamente condensada (*). pb- polpa branca. pv- polpa vermelha. (A, D,

G). ZM= zona marginal. (A, D, G) Barras = 30µm. (B, C, E, F, H, I) Barras = 20µm.

33

Figura 3. Fotomicrografias representativas da mucosa de cérvices uterinas de camundongos dos

grupos Controle (A, D, E), Lipossomo (B, F, G) e Clodronato (C, H, I) no 3ddp. Observa-se

tanto em animais do grupo controle (D-E) quanto tratados com lipossomo contendo PBS (F-G) a

presença de infiltrado e aglomerados leucocitário em meio ao epitélio cervical. No grupo tratado

com lipossomos contendo clodronato percebe-se a redução do número de células do infiltrado

celular no epitélio e a compactação do tecido conjuntivo da lâmina própria (C). Os detalhes H e I

mostram pequeno aglomerado de leucócitos de cromatina condensada (I-*) e mastócitos (setas)

na lâmina própria (H). (A-C) Barras = 30µm. (D-I) Barras = 20 µm.

34

4.1.2. Aspectos do Remodelamento Tecidual da Articulação Interpúbica Durante a

Prenhez e o Pós-Parto em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato.

O acompanhamento do remodelamento dinâmico da SP e LiP de animais do grupo

Controle (Fig.4) permitiu o reconhecimento das modificações espaço temporalmente

reguladas da histoarquitetura dos tecidos interpúbicos. Estas modificações se sobrepõem

nas fases de separação dos ossos púbicos, a partir do final da primeira etapa da prenhez

(12ddg); relaxamento, resultante da substituição gradual da fibrocartilagem interposta aos

coxins de cartilagem hialina por um LiP elástico, ao final da prenhez (18-19ddg); e

recuperação da articulação resultante do remodelamento do LiP e a reaproximação dos

ossos púbicos, que se inicia no pós-parto (1-3dpp) e se acelera gradativamente para

restabelecer a histoarquitetura semelhante à da SP, em cerca de 10 dias.

Adicionalmente aos aspectos dinâmicos do remodelamento tecidual, os resultados

evidenciados pela melhor preservação tecidual de porções proximais aos ossos púbicos

(cartilagem hialina ou enthese) e centrais do espaço interpúbico (fibrocartilagem e LiP)

permitiram observação de detalhes representativos de modificações de composição tecidual

a exemplo da celularidade de entheses e de diferenças no que diz respeito a organização do

tecido conjuntivo, tais como o aumento do esgarçamento e formações lacunares da matriz

extracelular presentes no LiP durante o relaxamento na etapa final da prenhez e da

recuperação da histoarquitetura no pós-parto nos grupos Controle, Lipossomo e Clodronato

(Fig. 5).

35

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37

Se por um lado, não se observam alterações qualitativas de composições teciduais

das porções centrais do espaço interpúbico (fibrocartilagem) de animais tratados com

Lipossomo e Clodronato antes do 12ddg (Fig. 5 P, Z); por outro lado, as avaliações

qualitativas da enthesis e ligamentos de animais tratados com Clodronato antes dos dias 18

e 19 de prenhez (Fig. 5 V, W, a, b) assim como 1 e 3 dias após o parto (Fig. 5 X, Y, c, d)

permitiram constatar o aumento de celularidade de enthesis e a redução do esgarçamento e

formações lacunares presentes no tecido conjuntivo que constitui o LiP. Estes aspectos

podem ser associados a uma maior densidade dos componentes fibrilares do tecido

conjuntivo do LiP após tratamento com Clodronato principalmente ao final da prenhez se

comparados com tecidos interpúbicos de animais dos grupos Controle e Lipossomo (Fig. 5

B-E, G-J, L-O, Q-T).

Quanto à formação de lacunas no LiP, estas podem ser observadas tanto nas regiões

próximas aos ossos púbicos quanto no interior do ligamento (Fig. 5 e 6). Inicialmente,

durante o remodelamento da fibrocartilagem e desenvolvimento do LiP, as formações se

assemelham a canais estreitos delimitados por tipos celulares cúbicos ou alongados (Fig. 5

B, G). Posteriormente, ao final da prenhez e pós-parto (Fig. 5 C-E, H-J), esses canais

confluem para lacunas mais volumosas, particularmente do 1dpp e 3dpp, revestidos por

células cubicas ou elípticas associadas à matriz extracelular do LiP ou a outras células

semelhantes contidas em suas luzes (Fig. 6 A-D). Estes canais e lacunas diferem dos

poucos vasos sanguíneos e linfáticos neo-formados no LiP que possuem túnicas vasculares

constituídas por células musculares lisas ou formação de tecido conjuntivo semelhante à

túnica adventícia (Fig. 6 E).

A exploração de características das células contidas nas lacunas de LiP dos grupos

controle e tratados evidenciou fenótipos celulares mononucleados que diferem nos formatos

38

(Fig. 7). No grupo Controle, as células cúbicas são mais volumosas, possuem fagossomos e

maior quantidade de prolongamentos citoplasmáticos nos dias 19ddg e 1dpp (Fig. 7 B, C),

enquanto as células elípticas ou de contorno irregular e menor quantidade prolongamentos

citoplasmáticos predominam no 3dpp (Fig. 7 D). No grupo Lipossomo ambos estão

presentes do 18ddg ao 3dpp (Fig. 7 E-H), entretanto, no 18ddg estas células encontravam-

se dispersas na matriz ou em pequenas cavidades existentes no LiP. O grupo Clodronato

(Fig. 7 I-L) apresenta predominantemente células de menor volume, alongadas, isoladas ou

em pequenos aglomerados presentes em pequenas lacunas.

Figura 6. Fotomicrografias ilustrativas de formações lacunares no LiP de animais do grupo Controle

no 3dpp (A-D) e de vaso sanguíneo no LiP de animal grupo Controle no 19ddg (E). Nota-se em A, a

proximidade das entheses da articulação e o estreito canal que conflui para a lacunas presente em

meio ao tecido do LiP (B). Em C, observa-se lacuna que possui aglomerados marginais de células

monoculares em sua luz. Esta histoarquitetura difere daquela de vasos sanguíneos como o apontado

em E. Barras: A = 50μm; B, D, E = 20μm; C = 30μm.

39

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40

4.1.3. Caracterização Ultraestrutural de Fenótipos Celulares dos Tecidos

Interpúbicos Durante a Prenhez e Pós-Parto em Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e

Clodronato.

A caracterização ultraestrutural dos tipos celulares presentes na SP de animais dos

diferentes grupos de estudo no 12ddg permitiu identificação de três fenótipos: condrócitos

nos coxins de cartilagem hialina; fibrocondrócitos e fibroblastos típicos da transição

fibrocartilaginosas (Fig. 8). Estes tipos celulares presente nos tecidos interpúbicos ao final

da primeira metade da prenhez têm potencial de sintetizar a matriz extracelular do LiP que

irá passar por etapa de relaxamento na segunda metade da prenhez.

Os fenótipos celulares observados nos tecidos interpúbicos (SP) até o 12ddg,

independentemente do grupo de estudo diferem do fenótipo de células presentes nos limites

e interiores de lacunas dos LiP de animais de 18ddg a 3dpp, a exemplo dos fenótipos

observados no grupo controle (Fig. 9). Estas células apresentam características

ultraestruturais de células fagocitárias de linhagem monocitária e que de modo geral

apresentam grande volume, numerosas vesículas citoplasmáticas, cisternas do complexo de

Golgi e reticulo endoplasmático, corpos lipídicos, fagossomos/fagolisossomos no formato

de corpos densos, núcleos de cromatina frouxa e numerosas projeções citoplasmáticas (Fig.

9 A-C).

41

Fig

ura

8.

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mic

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evid

ente

(N

u).

42

Figura 9. Eletromicrografias ilustrativas de fenótipos celulares presentes em lacunas do LiP de

animais Controle no período entre 18ddg e 3dpp. (A) Fenótipo correspondente ao de célula gigante

multinucleada de cromatina frouxa na qual se destaca citoplasma repleto de mitocôndrias (Mt),

múltiplos vacúolos (setas) e cisternas do RE. (B) Fenótipo correspondente ao de monócito de

núcleo reniforme (N), mitocôndrias de matriz interna eletrondensa (Mt), Complexo de Golgi (CG)

bem desenvolvido e projeções celulares (*). (C) Macrófago repleto de gotículas de lipídio (setas),

corpos densos (Cd), vacúolos fagocíticos (Vf), RE disperso com projeções celulares (*).

43

A caracterização ultraestrutural dos tecidos interpúbico dos grupos Lipossomo e

Clodronato permitiu explorar o fenótipo de células semelhantes a fagócitos presentes nas

lacunas ou envoltas por matriz extracelular do LiP desde o 18ddg até o 3dpp.

No grupo Lipossomo, foram observadas células alongadas, com núcleo de

cromatina frouxa que exibem prolongamentos citoplasmáticos longos que se projetam pela

matriz extracelular já degradada e fragmentada (Fig. 10 A). Estas células possuem RE e

complexo de Golgi bem desenvolvidos, uniformemente distribuídos no citoplasma, bem

como lisossomos elétron densos conhecidos por corpos densos (Fig. 10 B).

No grupo tratado com Clodronato, a caracterização ultraestrutural permitiu a

identificação de fagócitos com núcleos contendo grumos de cromatina parcialmente

condensada e que exibem prolongamentos citoplasmáticos curtos. Além disto, apresentam-

se envoltas por matriz extracelular na qual estão presentes fibras colágenas preservadas

(Fig. 10 C). Estas células possuem citoplasma compactado com reticulo endoplasmático

fragmentado e disperso, além de lisossomos próximos aos vacúolos citoplasmáticos (Fig.10

D). Em algumas oportunidades, foram observados fagócitos cujo fenótipo pode ser

associado a estágios adiantados de morte celular, devido aspectos decorrentes da

fragmentação nuclear e citoplasma compactado contendo mitocôndrias com cristas de

difícil distinção (Fig. 10 E).

44

Fig

ura

10

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micro

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µm

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00

µm

.

45

4.1.4 Imunolocalização de Fagócitos Mononucleares na Articulação Interpúbica de

Camundongos dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato Durante a Prenhez e o Pós-

parto.

Simultaneamente às caracterizações fenotípicas, a avaliação de marcadores

moleculares de monócitos e macrófagos (antígeno7/4 e F4/80 respectivamente) permitiu

identificar a presença de ambos os tipos celulares no LiP durante a segunda metade da

prenhez e o pós-parto, tanto nos animais do grupo Controle quanto nos tratados com

Lipossomo e Clodronato (Fig. 11,12 e 13).

Diferentemente da CV, tomada como controle positivo para imunomarcações com o

uso dos anticorpos específicos para identificação de monócitos e macrófagos, não se

detecta a imunoexpressão destes marcadores moleculares em células da SP durante o 12ddg

em nenhum dos grupos de estudo (Fig.11 A, G, M, S e Fig.12 A, F, K, P). No entanto, de

modo semelhante ao que se observa na CV, tanto durante a separação dos ossos púbicos e

relaxamento do LiP na etapa final da prenhez (18ddg e 19ddg) quanto durante

remodelamento no pós-parto (1dpp e 3dpp) as imunomarcações evidenciarem células que

expressam tais marcadores.

Células semelhantes a monócitos ou que expressam o antígeno 7/4 foram

imunolocalizados tanto na enthese da SP quanto no LiP (Fig. 11 B-E, H-K), apresentando

maior intensidade de marcação durante a etapa final do relaxamento do LiP nos dias 18ddg

e 19ddg dos grupos Controle e Lipossomo (Fig. 11 C, D, I, J e Fig. 12 B, G, C, H). Já no

grupo Clodronato, tais células foram observadas predominantemente no final da prenhez e

início do pós-parto (Fig. 12 L-N, Q-S), com ausência de células no LiP no 3dpp,

semelhante ao observado para o grupo Lipossomo (Fig. 12 J, T). No entanto as células

imunopositivas para antígeno 7/4 apresentaram características típicas de apoptose, como

46

fragmentação citoplasmática e nuclear, desde o 18ddg ao 3dpp nos LiP de animais do grupo

Clodronato (Fig. 12 L-O, Q-S) e nos dias 19ddg e 1dpp de animais do grupo Lipossomo

(Fig. 12 D, H).

Quanto as células semelhantes a macrófagos, além de estarem presentes na enthese

e LiP durante o relaxamento (Fig. 11 N, O, T, U; Fig. 13 B, C, G, H, L, M, Q, R) estão

presentes principalmente no LiP em remodelamento durante o pós-parto (Fig. V, W, Fig. 13

I, J, S, T), formando grandes aglomerados em lacunas presentes no 1dpp e 3dpp tanto em

animais do grupo Controle quanto em animais dos grupos Lipossomo e Clodronato.

Neutrófilos, que também são identificados pela imunopositividade para antígeno

7/4, são facilmente diferenciados de monócitos pelo fenótipo, particularmente do formato

nuclear. Menor número de células semelhantes a neutrófilos foram imunolocalizadas na

enthese do LiP no 18ddg (Fig. 11 B) e no LiP nos 1dpp e 3dpp (Fig. 11 J, K) somente em

animais do grupo Controle.

47

48

Figura 11. Fotomicrografias representativas da imunomarcação dos Antígeno 7/4 (1:300 - Serotec) e

F4/80 (1:200- Biosciense) na SP e LiP de animais Controle nos diferentes dias de estudo. Antígeno

7/4 foi observado no citoplasma de células presentes nas entheses e no ligamento interpúbico de

animais com 18ddg, 19ddg, 1dpp e 3dpp, sendo possível a identificação fenótipos semelhantes a

neutrófilos (B) e monócitos (C-K). F4/80 apresentou imunopositividade no citoplasma de células de

perfis alongados (T, U) ou arredondados (N, O, P-W) e semelhantes a macrófagos presentes nas

entheses e LiP de animais do 18ddg, 19ddg, 1dpp e 3dpp. Controles positivos realizado em cérvices

uterinas de animais do 3dpp, neles se observa presença de monócitos e neutrófilos positivos para

Antígeno 7/4 e macrófagos positivos para F4/80, respectivamente. Controles negativos foram

realizados com a omissões de anticorpos primários. Ent: Entheses. CH= Cartilagem Hialina. FC=

Fibrocartilagem. Barras = 20μm.

49

50

Figura 12. Fotomicrografias representativas da imunomarcação do Antígeno 7/4 (1:300 - Serotec)

na SP e LiP de animais Lipossomo e Clodronato nos diferentes dias de estudo. Antígeno 7/4 foi

observado no citoplasma de células presentes nas entheses e no ligamento interpúbico de animais

com 18ddg, 19ddg, 1dpp e 3dpp de ambos os grupos de estudo. No entanto, em ambos os grupos

puderam ser observadas células de marcação positiva com citoplasma fragmentado e núcleo

compactado (D, H, Q, S, O). Controles positivos realizados em cérvices uterinas de animais do

3dpp. Neles observa-se a presença de monócitos e neutrófilos positivos para Antígeno 7/4.

Controles negativos foram realizados com a omissões de anticorpos primários. Ent: Entheses. CH=

Cartilagem Hialina. FC=Fibrocartilagem. Barras = 20μm.

51

52

Figura 13. Fotomicrografias representativas da imunomarcação de F4/80 (1:200- Biosciense) na SP

e LiP de animais Lipossomo e Clodronato nos diferentes dias de estudo. F4/80 apresentou

imunopositividade no citoplasma de células de perfis predominantemente arredondados e

semelhantes a macrófagos presentes nas entheses e LiP de animais do 18ddg, 19ddg, 1dpp e 3dpp

em ambos os grupos de estudo. Entretanto, células com núcleos condensados e citoplasma

fragmentado foram observadas nas entheses de animais com 1dpp (D) e no LiP de animais com

3ddp (J) tratados com lipossomo, assim como em animais com 18ddg a 3dpp tratados com

clodronato (L-O, Q-T). Controles positivos realizado em cérvices uterinas de animais do 3dpp.

Controles negativos foram realizados com a omissões de anticorpos primários. Ent: Entheses. CH=

Cartilagem Hialina. FC= Fibrocartilagem. Barras = 20μm.

53

54

4.2. Análises de aspectos Moleculares Indicativos da Polarização de Fagócitos nas

Resposta Anti e Pró- Inflamatória durante a Remodelação da Articulação Interpúbica de

Animais dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato Durante a Prenhez e o Pós-

Parto.

4.2.1. Análise da Expressão de Moléculas Características da Resposta Imune Pró e Anti-

inflamatória via M1/M2 Durante o Relaxamento do Lip e Reparo Pós-Parto em

Camundongos dos Grupos Controle, Lipossomo e Clodronato.

A expressão gênica relativa de fatores de resposta imune por M1/M2 do grupo

Controle apresentou alterações dinâmicas na SP e LiP durante a prenhez e pós-parto (Fig.

14). Durante a etapa de relaxamento foi registrada grande oscilação da expressão gênica

entre os dias 18 e 19 de gestação. No 18ddg ocorreu aumento nos níveis de genes

relacionados ação de macrófagos M2 (Arg1) além de queda na expressão de genes relativos

a respostas pró e anti-inflamatórias quando comparados ao 12ddg. Já no 19ddg ocorre a

elevação nos níveis de expressão dos genes relacionados principalmente a monócitos e

resposta anti-inflamatória (Ccr2, Arg1 e Il10) se comparados ao 12ddg e 18ddg e pequena

queda nos níveis de Il1a quando comparados com o 12ddg.

No 1dpp ocorre aumento generalizado na expressão de fatores pró-inflamatórios

(Il1a e Tnfa) assim como de recrutamento de monócitos (Ccr2) se comparado aos níveis

presentes durante a prenhez. Entretanto, no que toca a via de resposta anti-inflamatória,

apesar do aumento da expressão de IL10, nota-se a queda na expressão de Arg1 quando

comparado ao início da prenhez e relaxamento do LiP. No 3dpp observa-se a manutenção

dos altos níveis de fatores pró e anti-inflamatórios (Il10, Ccr2, Tnfa e Il1a) em relação ao

55

registrado principalmente nos últimos dias de prenhez. Além disso, o aumento nos níveis de

genes como Tgfb e Arg1 em relação ao observado na prenhez e pós-parto contribuem para o

aumento de fatores de ação anti-inflamatória.

No que diz respeito ao efeito dos tratamentos sobre a expressão de genes de resposta

pró e anti-inflamatória, nota-se que tanto o grupo Lipossomo como o grupo Clodronato

apresentaram variações nos níveis de expressão de diferentes genes nos dias de estudo (Fig.

15-20).

Nas amostras tratadas com Lipossomo percebe-se em relação ao grupo Controle o

aumento de fatores de resposta anti e pró-inflamatória durante a prenhez, com grande

elevação de Ccr2, Arg1, Tnfa e Il1a no 12ddg (Fig. 15, 16, 19 e 20) apesar da ausência de

imunomarcação para fagócitos neste dia de estudo (Fig. 12 e 13); O aumento de fatores

anti-inflamatórios (Fig. 16, 18) durante a separação dos ossos púbicos (18ddg) e a elevação

nos níveis de expressão de genes pró-inflamatórios (Fig. 20) na etapa de relaxamento do

LiP (19ddg).

Nas amostras tratadas com Clodronato ocorre o favorecimento de resposta pró-

inflamatória em toda a prenhez, graças a elevados níveis de Tnfa e/ou Il1a (Fig. 19 e 20) e

queda nos níveis de Il10 e/ou Arg1 (Fig. 16 e 18) quando ao comparados aos registrados

para o grupo Controle. Assim como Lipossomo, foi observada alta expressão de fatores pró

e anti inflamatórios no 12ddg, mesmo sem imunomarcação para fagócitos (Fig. 12 e 13).

Durante o pós-parto, o tratamento com Lipossomo leva a aumento na expressão

gênica de Arg1 (Fig. 16) e Il1a (Fig. 20), assim como a queda de níveis de expressão de

genes de respostas anti e pro-inflamatórias quando comparados ao Controle. Já no 3dpp,

ocorre queda tanto nos níveis de fatores pró como anti-inflamatórios (Fig. 15, 16, 18 e 19)

em relação ao observado para o grupo Controle.

56

No entanto, com relação aos resultados obtidos para o grupo Controle, o grupo

Clodronato apresentou aumento de fatores de resposta pró-inflamatória assim como queda

de fatores anti-inflamatórios em ambos os dias de estudo. No 1dpp, altos níveis de Il1a

podem ser observados (Fig. 20). Entretanto, apesar de níveis elevados de Arg1 (Fig. 16),

nota-se queda na expressão de Il10 (Fig. 18), favorecendo a resposta pró-inflamatória. Já no

3dpp o aumento na expressão tanto de Il1a (Fig. 20) quanto de Tnfa (Fig. 19), assim como a

queda na expressão de Il10 (Fig. 18), detalham um ambiente com características pró-

inflamatórias se comparados ao grupo Controle. Nenhuma alteração nos níveis de Tgfb foi

registrada por ação de tratamentos com Lipossomo ou Clodronato (Fig. 17).

57

Figura 14. Expressão de genes de vias pró e anti-inflamatórias por PCR em tempo real de SP e LiP

de animais Controle durante a prenhez e pós-parto. As análises de ANOVA1way seguidas de teste

de Tukey com significância (p < 0,05) são indicadas por comparação entre dia 12ddg (a), 18ddg

(b), 19ddg (c), 1dpp (d) e 3dpp (e). Barras representam SEM ±.

58

Ccr2

Controle Lipossomo Clodronato0

2

4

6

8

1012ddg

18ddg

19ddg

1dpp

3dpp

Exp

ress

ão G

ênic

a R

ela

tiva

***

**

***

** *** ***

Figura 15. Expressão gênica relativa de Ccr2 em tecidos da articulação interpúbica de animais dos

grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido

do teste de Bonferroni. Significância p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam

SEM ±.

Arg1

Controle Lipossomo Clodronato0

1

2

3

4

512ddg

18ddg

19ddg

1dpp

3dpp

Expre

ssão G

ênic

a R

ela

tiva

***

***

***

***

Figura 16. Expressão gênica relativa de Arg1 em tecidos da articulação interpúbica de animais dos

grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido

do teste de Bonferroni. Significâncias p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam

SEM ±.

59

Tgfb

Controle Lipossomo Clodronato0.0

0.5

1.0

1.5

2.012ddg

18ddg

19ddg

1dpp

3dpp

Exp

ress

ão G

ênic

a R

ela

tiva

Figura 17. Expressão gênica relativa de Tgfb em tecidos da articulação interpúbica de animais dos

grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido

do teste de Bonferroni. Significância p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam

SEM ±.

Il10

Controle Lipossomo Clodronato0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.512ddg

18ddg

19ddg

1dpp

3dpp

Exp

ress

ão G

ênic

a R

ela

tiva

*** ***

***

*

Figura 18. Expressão gênica relativa de IL10 em tecidos da articulação interpúbica de animais dos

grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido

do teste de Bonferroni. Significância p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam

SEM ±.

60

Tnfa

Controle Lipossomo Clodronato0

1

2

3

412ddg

18ddg

19ddg

1dpp

3dpp

Exp

ress

ão G

ênic

a R

ela

tiva

***

***

***

***

Figura 19. Expressão gênica relativa de Tnfa em tecidos da articulação interpúbica de animais dos

grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido

do teste de Bonferroni. Significância p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam

SEM ±.

Il1a

Controle Lipossomo Clodronato0

1

2

312ddg

18ddg

19ddg

1dpp

3dpp

Exp

ress

ão G

ênic

a R

ela

tiva

**

**

**

***

***

***

Figura 20. Expressão gênica relativa de Il1a em tecidos da articulação interpúbica de animais dos

grupos Controle, Lipossomo e Clodronato por meio de PCR em tempo real. ANOVA2ways seguido

do teste de Bonferroni. Significância p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p< 0,001 (***). Barras representam

SEM ±.

61

5. Discussão

O acompanhamento dos animais durante a etapa final da prenhez e parto dos grupos

Controle, Lipossomos e Clodronato permitiu constar que em nenhum dos grupos houve

antecipação do parto, que ocorreu normalmente no 19ddg. Entretanto, no grupo Clodronato,

ocorrências de alterações na parturição resultaram em mortes de fetos intra-útero e

imediatamente ao parto, além da morte de aproximadamente 17 % dos camundongos

fêmeas durante a segunda metade da prenhez. Estes dados foram semelhantes aos descritos

anteriormente em experimentos de manipulações gênicas em camundongos, tais como a

deleção do gene da isoenzima esteroide 5a-reductase tipo 1 que desempenha papel essencial

no catabolismo cervical da progesterona (Mahendroo et al., 1999); da relaxina (Zhao et al.,

2000) e de seu receptor RXFP1 (Hsu et al., 2002) que são elementos chaves no controle do

remodelamento tecidual de cérvice uterina e sínfise púbica durante a etapa final da prenhez

e indução do parto.

As explorações das composições teciduais do baço de animais prenhes para aferição

da estratégia empregada na depleção de macrófagos em camundongos durante a prenhez e

pós-parto mostraram que a via intraperitoneal possibilitou depleção semelhante àquela

obtida por via endovenosa (Rooijen & Sanders, 1994; McGaha et al., 2011). As diferenças

na histoarquitetura deste órgão observadas nos animais do grupo Clodronato se assemelham

àquelas que comprovaram a depleção de macrófagos da zona marginal, sem ruptura da

organização tecidual de outras estruturas esplênicas, principalmente da polpa branca

(Rooijen & Sanders, 1994; McGaha et al., 2011).

62

Tendo em vista que no décimo segundo dia de prenhez o baço ainda se encontra em

período de expansão conhecido por “esplenomegalia” (Hedge et al., 2001), as apoptoses na

polpa vermelha e zona marginal observadas no grupo Clodronato foram causadas

efetivamente pela administração do fármaco via lipossomos, que de acordo com McGaha e

colaboradores (2011), resultaram na depleção de macrófagos altamente capacitados à

fagocitose mediada por receptores de padrões moleculares (scavangers) de alta afinidade

por lipídeos que são prontamente direcionados à remoção dos lipossomos.

No que diz respeito à cérvice uterina, a comparação da histoarquitetura da mucosa

do órgão e particularmente no epitélio entre os grupos controle e tratados mostrou evidente

redução no infiltrado celular no grupo Clodronato de modo semelhante ao que foi

observado com emprego de outros agentes para reconhecimento de macrófagos/monócitos

durante a prenhez, sem a presença de ulcerações do epitélio cervical (Read et al., 2007;

Timmon et al., 2010; Mahendroo, 2012; Gomez-Lopez et al., 2014).

Nos grupos Controle e Lipossomo, os aspectos do remodelamento tecidual da

articulação interpúbica e da caracterização ultra estrutural de fenótipos celulares e grau de

preservação da MEC dos tecidos interpúbicos durante prenhez e pós-parto são coincidentes

com aqueles que permitiram distinguir fases nas modificações histofisiológicas da SP que

se sobrepõem, e foram reconhecidas como separação, relaxamento e recuperação pós-parto

(Joazeiro et al., 2014). Estes aspectos diferem daqueles reportados no que diz respeito à

celularidade da enthese e redução do esgarçamento e formações lacunares do ligamento

interpúbico de animais tratados com clodronato

No que diz respeito à preservação de estruturas da articulação interpúbica em

decorrência dos tratamentos empregados, não foram notados comprometimentos da

histoarquitetura ou fenótipos celulares no 12ddg, em que pese a diminuição dos coxins de

63

cartilagem hialina e celularidade das entheses no grupo Clodronato, quando comparados

aos grupos Controle e Lipossomo. No entanto, ressaltamos que a administração do

Clodronato não encapsulado em células condrogênicas cultivadas em biorreator resultou na

estimulação do metabolismo de condrócito e aumento de síntese de componentes da matriz

extracelular, particularmente de colágeno e proteoglicanos (Rosa et al., 2014). Deste modo,

estas observações asseguram que o clodronato isoladamente não pode ser tomado como

indutor das alterações acimas relatadas na SP no 12ddg, possuindo ação restrita às células

fagocitárias (Rooijen & Sanders, 1994).

O emprego de meio de embebição adequado para preservação de caraterísticas

histofisiológicas da articulação interpúbica durante o fim da prenhez e o pós-parto

proporcionou a preservação de canais e lacunas contendo células cubicas em seus

revestimentos ou dispersas nos seus interiores, além de porções esgarçadas da MEC.

Estruturas e células semelhantes foram descritas por Storey (1957), um dos pioneiros no

estudo morfofisiológico de tecidos conjuntivos da SP, com o emprego de cortes

histológicos espessos do LiP de animais prenhes e puerpéreis. De acordo com este autor

tais lacunas, denominadas de “espaço sinfisial”, teriam participação no remodelamento da

SP durante a prenhez e o pós-parto, enquanto que as células aí presentes, apesar de serem

componentes do tecido conjuntivo, não participariam de processo de remodelamento.

Segundo à proposição de Storey (1957), o desencadeamento de eventos relacionados ao

remodelamento dos tecidos interpúbicos era creditado unicamente ao “espaço sinfisial”,

que possuía como principal função a reaproximação dos ossos púbicos durante o pós-parto.

No que diz respeito à existência de canais microscópicos na região de transição

fibrocartilaginosa do LiP do 18ddg ao 3dpp, estes corresponderiam às microfraturas ou edemas

de medula dos ossos púbicos observadas com emprego de ressonância magnéticas em mulheres

64

primíparas após parto. Estas microlesões são comuns em estruturas cartilaginosas de roedores

em locais de intensa atuação de forças de tração (Martel-Pelletier et al., 2008) e contribuem

para formação de soluções de continuidade na interface entre ossos púbicos e estruturas

cartilaginosas (Brandon et al 2011; Miller et al., 2011).

Quanto às áreas esgarçadas de MEC presentes no LiP, estas corresponderiam à

alternância de zonas de diferentes densidades fibrilares, dado que o gradiente nos graus de

compactação de elementos de matriz é capaz de proporcionar o aparecimento de poros ou

espaços na MEC (Wolf et al., 2009). Tendo em mente que estes espaços possibilitam e

auxiliam na infiltração de leucócitos em tecidos conjuntivos (Wolf et al., 2009) e que

durante o remodelamento da SP ocorre grande secreção de metaloproteinases [Mmp-8, e

gelatinases (Mmp-2 e-9)] e catepsinas por células semelhantes a fibroblastos assim como a

síntese de ácido hialurônico, que permite a hidratação do ligamento formado (Rosa et al

2011; 2012); consequentemente, os esgarçamentos ou lacunas da MEC do LiP seriam

resultantes das modificações dos componentes de matriz e da ação de enzimas específicas e

provavelmente possuiriam a capacidade de constituir vias facilitadoras do deslocamentos e

migração de células monocitárias aos tecidos interpúbicos fragilizados durante a prenhez e o

pós-parto.

Sendo assim, as evidências morfofisiológicas resultantes dos estresses biomecânicos

e/ou bioquímicos presentes nos tecidos interpúbicos do camundongo, durante o remodelamento

da SP do camundongo são indicativos de que há nesta articulação a produção de fatores e

mediadores capazes de recrutar leucócitos para o LiP durante seu relaxamento e reparo pós-

parto (Rosa et al., 2008; 2011 e 2012).

Em todos os grupos de estudo, as características ultraestruturais de células

fagocitárias presentes nas lacunas ou emersas na matriz extracelular do LiP, principalmente

65

durante o período de relaxamento e reparo pós-parto corresponderam ao descrito para

monócitos típicos (Sutton & Weiss, 1966) e para macrófagos ricos em podossomos e

grandes quantidades de fagossomos e, portanto, portadores de características de macrófagos

ativados (Dias et al., 2014). De modo geral, os aspectos que sugerem ativação das células

fagocitárias no LiP coincidem com aqueles observados em macrófagos de características

fenotípica variáveis, que as vezes se apresentam como células alongadas semelhantes a

fibroblastos, com podossomos para adesão e migração em espaços da matriz particulada

resultante da ação de proteases, ou ainda como células de formato esférico semelhantes ao

de monócitos que migram por movimentos ameboides (Lämmermann & Germain, 2014).

Além dos diferentes fenótipos de macrófagos, estão presentes no LiP células

gigantes multinucleadas semelhantes às descritas por Sutton & Weiss (1966). As células

gigantes foram observadas nos últimos dias de prenhez no grupo Controle, indicando ação

acentuada de células fagocitárias neste período. Assim como apontado por Rooijen e

colaboradores (1996), no grupo Clodronato os registros de alterações ultraestruturais na

distensão de podossomos ou pseudópodes, na morfologia de mitocôndrias e principalmente

quanto à fragmentação nuclear e citoplasmática apontam que o tratamento com clodronato

carreado por lipossomos desencadeou o processo de morte celular por apoptose de maneira

específica e eficiente tanto em monócitos quanto em macrófagos presentes nos canais,

lacunas e áreas esgarçadas do LiP de animais prenhez e puerpéreis.

Ainda no que diz respeito ao potencial fagocitário das células semelhantes aos

macrófagos presentes nos canais, áreas esgarçadas e formações lacunnares da matriz do LiP

dos grupos Controle e Lipossomo, estas células apresentaram grande quantidade de

fagossomos e lisossomos no citoplasma, sendo encontradas dispersas em porções de matriz

66

colágena solubilizada, enquanto que no grupo Clodronato estes fagócitos possuem

citoplasma compacto e encontravam-se circundados de fibras colágenas compactas.

É digno de nota que estes tipos celulares são observados quase que imediatamente

após aumentos das expressões gênicas de enzimas metaloproteinases [Mmp-8, e gelatinases

(Mmp-2 e-9) ] e catepsinas (B e K) que ocorrem concomitantemente ao aumento

significativo das contrações de ácido hialurônico de alto peso molecular e expressão do

proteoglicano versican (Pinheiro et al., 2005; Rosa et al., 2011; 2012). Deste modo, há uma

correlação espaço temporal entre acúmulos de ácido hialurônico e proteoglicano versican,

favorecendo a hidratação e consequentemente relaxamento progressivo do LiP

concomitantemente às expressões de enzimas capazes de clivar estes proteoglicano e liberar

os glicosaminoglicanos condroitim-4-sulfato e O-sulfato no meio fluído (Rosa et al., 2011;

2012). Coincidentemente, dentre os glicosaminoglicanos sulfatados de proteoglicanos,

somente o condroitim-4-sulfato é capaz de induzir degradação da MEC cartilaginosa para

facilitar deslocamentos celulares, regular a químioatração de células monocitárias, ativar a

secreção de IL-1b e promover diferenciação de macrófagos e células dendríticas (Yoshino, et

al., 2010).

Os aspectos relativos ao turnover de componentes da MEC com participação de

metaloproteinases e catepsinas específicas no LiP ao final da prenhez capazes de clivar

moléculas de colágeno (Rosa et al., 2011; 2012), o que leva à formação de fragmentos que

também podem ter potencial para atrair populações de macrófagos que expressam

receptores do tipo “scavenger”, capazes de internalizar colágeno particulado e não fibrilas

integras das fibras compactas (Gowen et al., 2000). Estes fagócitos têm papel funcional

relevante em diferentes fenômenos espaço temporalmente regulados, a exemplo da

liberação de mediadores chaves que contribuem para remodelamento de diferentes órgãos

67

do sistema reprodutor feminino, particularmente durante a prenhez e pós-parto (Erlebacher,

2014).

A ocorrência destes fenômenos, em um curto espaço de tempo, permite traçar

paralelos entre às acentuadas adaptações da SP do camundongo na prenhez, parto e pós-

parto e as respostas dadas por tecidos lesionados ou sob estresse, nos quais células e/ou

matriz extracelular liberam moléculas responsáveis pela ativação do sistema imunitário

(Frey et al., 2013 para revisão de contribuições originais).

A imunolocalização de células positivas para os biomarcadores antígeno 7/4 e

glicoproteína F4/80 coincide com características morfológicas de células monocitárias

presentes nas bordas e no interior de canais, lacunas e também em regiões esgarçadas da MEC

do LiP no relaxamento e reparo pós-parto em todos os grupos. No 12ddg da prenhez, em todos

os grupos, não foram identificadas células imunomarcadas na sínfise fibrocartilaginosa. Raros

“spots” ou “background” foram observados nos resíduos celulares de tecidos conjuntivos

frouxo e adiposo resultantes de suas debridações; particularmente dos tecidos retro púbicos que

se continuam com paramétrio que recobre bexiga, cérvice uterina e vagina. A presença de

células que expressam estes marcadores, até então não detectados no LiP do camundongo, é

traço comum do remodelamento tecidual de estruturas do aparelho reprodutor, contribuindo

para o sucesso de eventos que asseguram a manutenção da prenhez, parto a termo e reparo pós-

parto (Timmons & Mahendroo, 2006; Payne et al 2012; Shynlova et al 2013, Erlebacher,

2014; Gomez-Lopez et al., 2014)

A associação das características morfológicas e da imunomarcação com antígeno

7/4 confirmaram resultados anteriores no que diz respeito a ausência de granulócitos na SP

do camundongo como observado inicialmente por Rosa e colaboradores (2008) e Consonni

e colaboradores (2012b) na sínfise de camundongos fêmeas primíparas ou multíparas

68

senescentes, respectivamente, por meio de coloração seletiva com sirius red em pH alcalino

para detecção de granulócitos (Wehrend et al., 2004).

De modo semelhante, não foram observadas grandes quantidades de granulócitos

no LiP de animais dos grupos Lipossomos e Clodronato. Apesar da similaridade entre os

mecanismos gerais do processo de relaxamento do LiP e regulação hormonal entre

camundongos e cobaias (Ortega et al., 2003), os resultados obtidos para os grupos

Controle, Lipossomo e Clodronato corroboram os achados acima citados, a respeito da

diferença significativa quanto aos fenótipos dos leucócitos que participam no

remodelamento no início do relaxamento deste ligamento, que predominantemente é

resultante da infiltração de eosinófilos e neutrófilos na articulação interpúbica da cobaia

(Rodriquez et al., 2003).

A presença de células de fenótipos característicos de monócitos e macrófagos, que

expressam antígeno 7/4 e a glicoproteína F4/80 respectivamente, a partir do 18ddg na

enthesis e LiP pode estar relacionada a queda de progesterona descrita durante este dia de

prenhez em camundongos (Mahendroo, 2012, Croy et al., 2014), de modo semelhante ao

mecanismo que desencadeia a migração de monócitos para a cérvice uterina a partir do

mesmo período gestacional (Timmons et al., 2009).

No que diz respeito a homeostase de tecidos articulares, a inesperada localização de

linfócitos T residentes em entheses fibrocartilaginosas de camundongos fez com que estas

células passassem a ser consideradas sensores de danos e estresse ambientais, ainda que

mínimos como os biomecânicos. Nesta condição, os linfócitos T das entheses reconhecem e

monitoram adequadamente quebras de homeostases e em resposta desencadeiam libração

de citocinas, sinais de transdução, ativadores de transcrição e proteínas indutoras de

remodelação tecidual como Wnt e BMP (Lories & McInnes, 2012). Deste modo, presença

69

de macrófagos e monócitos nos pequenos canais das entheses do LiP durante a prenhez e o

pós-parto nos diferentes grupos pode ser um indicativo de que assim como nas transições

fibrocartilaginosas de tendões e ligamentos, na SP esta região possui características de

sensores de estresse ambiental e de permanente vigilância imunológica.

Adicionalmente as caracterizações imunohistoquímicas acima discutidas, as

avaliações quantitativas dos índices de expressão de mRNAs para os genes Ccr2, Arg1,

Tgfβ, Il10, Tnfa; Il1a permitiram verificar com segurança as tendências de polarização

entre os fenótipos pró-inflamatório M1 e anti-inflamatório M2 de macrófagos nos tecidos

interpúbicos nos diferentes dias da prenhez de animais do grupo Controle, com emprego de

estratégias semelhantes àquelas utilizadas por Zhang e colaboradores (2011) na

identificação de reação inflamatória tanto nos tecidos adiposos subcutâneo e parametrial de

camundongos C57BL/6N primíparos não obesos no final da prenhez.

Apesar da ausência de imunomarcação para antígeno 7/4 em células da SP no 12ddg

nos grupos Controle, Lipossomo e Clodronato, os índices altamente significativos de expressão

do mRNA de Ccr2 (receptor da quimiocina Ccl2) neste dia de prenhez na SP de camundongos

tratados com lipossomo contendo PBS ou clodronato corroboram com observações de que as

mudanças que regem a mobilização de leucócitos que participam das remodelações teciduais

durante a prenhez são sistêmicas e precedem modificações que levam ao remodelamento dos

órgãos (Brown et al., 2014; Gomez-Lopez et al., 2014 para revisão das principais

colaborações) e estruturas suportes pélvicos, a exemplo daquele que observamos na sínfise

fibrocartilaginosa e descritas no tecido adiposo parametrial ao final da prenhez por Zhang et al

(2011).

A elevação gradual dos índices de expressão de Ccr2 até o valor máximo detectado no

1ddp e mantido ao 3ddp no grupo Controle oferece suporte a existência de mecanismos

70

relativos à modulação da migração, influxo e manutenção do potencial de diferenciação de

monócitos no remodelamento do LiP do camundongo na segunda metade da prenhez, tendo em

mente o papel crítico deste receptor de quimiocina na mobilização e recrutamento de monócitos

da medula óssea aos locais de inflamação (Tsou et al., 2007).

No grupo Controle, concomitante ao aumento progressivo dos índices de Ccr2, a

análise comparativa de índices de expressão de citocinas evidenciou tendências na polarização

M1/M2 durante relaxamento, parto e pós-parto. A predominante polarização do fenótipo M2 ao

final da prenhez e durante o reestabelecimento pós-parto se reflete nos aumentos significativos

dos índices de expressões de Arg1 (máximo no 19ddg), Il10 (máximo no 3dpp) e tendência de

elevação progressiva de Tgfb (máximo no 3ddp). A polarização do fenótipo M1, por outro lado,

reflete-se nos aumentos graduais na expressão das citocinas Tnfa e Il1a a partir do dia do parto

até o 1dpp, onde ocorrem os índices máximos para ambas citocinas.

Sendo assim, ao final da prenhez, são condizentes às elevações nos níveis de expressão

de citocinas Il1a e Tnfa e da enzima óxido nítrico sintase responsável pela produção de óxido

nítrico (Moro et al., 2010), característicos de macrófagos M1 (Gordon & Taylor, 2005) e que

ocorrem concomitantemente ao aumento nos índices de expressão de mRNAs para IL10 e para

a enzima Arg1, específicas de macrófagos com caráter anti-inflamatório M2 (Gordon, 2003).

Esta contraposição leva ao desenvolvimento do processo conhecido por “inflamação

ordenada” associado à manutenção da homeostase tecidual (Murray & Wynn, 2011), tendo

em mente o drástico remodelamento que leva a mudanças da composição fibrilar, de

proteoglicanos e GAGs e de enzimas e metaloproteinases da MEC que resultam na formação

de canais, lacunas e áreas de matriz esgarçada no LiP (Joazeiro et al., 2014); paralelamente à

efetiva ação contrária às tendências de polarização do fenótipo pro-inflamatório/M1, garantindo

71

a integridade dos tecidos interpúbicos e a regulação da resposta inflamatória no local (Murray

& Wynn, 2011; Ginhoux & Jung, 2014),.

Ainda no que diz respeito às tendências de polarização M1/M2 no início do reparo do

LiP após o parto (1dpp), a queda nos níveis de Arg1 indica prevalência de fenótipo pró-

inflamatório, visto que as vias de metabolização de arginina por Arginase e iNOS são

antagônicas e intimamente relacionadas a polarização de fenótipos anti e pró-inflamatórios

respectivamente (Brown et al., 2014). Esta proposição está de acordo com os picos de

expressão de citocinas Il1a e Tnfa detectados durante o início do reparo do LiP. Entretanto, os

índices máximos de expressão para IL10 durante o 1dpp e 3dpp, assim como aqueles

observados no tecido adiposo parametrial durante o final da prenhez, tem o potencial para

desencadear mecanismos compensadores de resposta M1 possivelmente associados ao aumento

de células com fenótipo M2 (Zhang et al., 2011). Coincidentemente, macrófagos peritoneais de

fenótipo M2d de camundongos expressam altos índices de Il10 e iNOS, baixos de Tnfa e

intermediários de Arg1 (Ferrante et al., 2013), assim como o subtipo M2b é capaz de secretar

Tnfa quando influenciado por citocinas pró-inflamatórias (Brown et al., 2014). Deste modo, os

índices de expressão medidos no 1dpp para diferentes fatores de resposta inflamatória são

sugestivos de um provável balanço na polarização de fenótipos M2 para M1; que de acordo

com Davis e colaboradores (2013) pode ocorrer de forma rápida e reversível de acordo com as

alterações de citocinas no ambiente.

Apesar da manutenção no 3dpp dos maiores índices de expressão gênica de Il1a e

Tnfa (citocinas pró-inflamatória), o aumento em fatores anti-inflamatórios como Arg1 e

Tgfb deixa evidente o início de um processo que pode ser associado ao mecanismo de

controle, refreamento e finalização de resposta inflamatória (Gordon et al., 2003; Gordon &

Taylor, 2005; Murray & Wynn, 2011). Corroborando com esta hipótese ocorre a

72

estimulação de fibroblastos e miofibroblastos, queda dos níveis de MMPs, TIMPS e

catepsinas, ligeira redução na concentração de ácido hialurônico de alto peso molecular e

proteoglicanos associados, rápida recompactação do colágeno e reorganização de fibras

elásticas no 3dpp (Moraes et al., 2004; Consonni et al., 2012 a; Moro et al., 2012; Rosa et

al., 2011; 2012), e que conduzem ao retorno de estrutura semelhante àquela presente em

animais não prenhez após 40dpp (Consonni et al., 2012 b).

Sendo assim, o fenótipo M2 observado particularmente na separação dos ossos púbicos,

relaxamento do LiP e remodelamento pós-parto pode ser associado à manutenção da

homeostase tecidual, tendo em mente o drástico remodelamento que leva a mudanças da

composição fibrilar, de proteoglicanos e GAGs e de enzimas e metaloproteinases da MEC que

resultam na formação de canais, lacunas e áreas de matriz esgarçada no LiP; bem como à

efetiva ação contrária às tendências de polarização do fenótipo pro-inflamatório/M1, garantindo

a integridade dos tecidos interpúbicos e a regulação da resposta inflamatória no local.

Polarizações semelhantes às observadas no LiP ao final da prenhez e início de pós-parto estão

presentes tanto na decídua a partir da segunda metade da prenhez, onde o favorecimento do

fenótipo M2 até os últimos dias pré-parto é indispensável à progressão e sucesso da prenhez. O

influxo de macrófagos (M1 ou M2b) com características pró-inflamatórias no miométrio e na

decídua nos últimos dias de gestação gera à indução de mecanismos necessários ao parto

(Brown et al., 2014), e também na cérvice uterina, onde a ação conjunta de macrófagos M1/M2

garante o rápido reparo tecidual logo após o parto (Timmons et al., 2009; Mahendroo, 2012).

A estratégia que utilizamos para depleção de macrófagos no LiP de camundongos

durante a prenhez foi semelhante àquela empregada por Chamberlain e colaboradores (2011)

que utilizaram clodronato encapsulado em lipossomos e também lipossomos contendo PBS

para mensurar a influência da depleção de macrófagos na reparação do ligamento medial

73

colateral de ratos. Estes autores constataram que uma única aplicação de lipossomos contendo

clodronato dois dias antes da realização de processo cirúrgico resultou em efetiva depleção de

monócitos circulantes/futuros residentes do tecido de granulação por um período de 5 dias,

contudo sem depletar completamente as populações de macrófagos M1 e M2. Estes

resultados obtidos em tecido de histoarquitetura e processo de reparação semelhante à do LiP

no início da segunda metade da prenhez refendam a exequibilidade da depleção de macrófagos

com clodronato encapsulado em lipossomos para reconhecimento de expressões referente a

presença e polarização de macrófagos.

Nos animais dos grupos Lipossomo e Clodronato a partir do 18ddg até o 1ddp, índices

menores de expressão de Ccr2 se contrapõem a índices maiores de Arg1, associado a fenótipo

M2, e Il1a/Tnfa associado ao fenótipo M1 como o observado em culturas de monócitos de

mulheres gestantes após estimulação com LPS e interferon gama (Faas et al., 2014). Este

fenômeno pode ser associado às restrições de funções que ocorrem em células de linhagem

monocitária em condições inflamatórias (Fekete et al., 2012). De acordo com estes autores,

a diferenciação de células monocitárias nos tecidos periféricos pode ser prejudicada se

sinais de ativação atuarem sobre células precursoras de monócitos antes do

comprometimento destas com as vias de diferenciação de células monocitárias.

A aparente perda de homeostase em relação ao grupo Controle, observada nos grupos

Lipossomo e Clodronato, em virtude dos maiores índices da expressão de Arg1, típico do

fenótipo M2, assim como de Il1a e Tnfa ,típicos do fenótipo M1 em contrapartida aos baixos

índices de expressão de Ccr2, pode estar associada ao incremento da produção de citocinas

com potencial de restringir ou interferir nas respostas de células monocitárias que realizaram

migração para o LiP, anteriormente aos tratamentos com lipossomo ou clodronato. Este tipo de

interferência leva ao desenvolvimento da exaustão funcional antes que precursores

74

monocitários se diferenciem em células maduras capazes de reprogramar seu repertório de

receptores de quimiocinas (Fekete et al., 2012), que no LiP dos animais tratados poderia

estar ocorrendo em função da indução de mecanismos justácrinos ou parácrinos que afetariam

a expressão do mRNA do Ccr2 em decorrência do aumento dos citocinas expressas por

macrófagos M1 e M2.

As modificações nos índices de expressão de citocinas nos tecidos interpúbicos de

animais do grupo Clodronato do 18ddg ao 3dpp podem estar associadas ao desbalanço de

no mecanismo de reparo tecidual graças às modificações na polarização M1/M2. Uma vez

que os índices de expressão das citocinas Il1a e Tnfa (típicas do fenótipo M1) são

favorecidos em relação os de citocinas anti-inflamatórias, principalmente IL10, ocorre

resposta pró-inflamatória exacerbada que acarreta na perda da integridade tecidual no

18ddg e 19ddg e na formação de tecido conjuntivo denso no LiP do 18ddg ao 3dpp, de

modo semelhante ao mecanismo observado em quadros de fibrose (Gordon & Taylor,

2005; Murray & Wynn, 2011).

Os desequilíbrios observados nos LiPs de camundongos tratados são semelhantes

aos que indicam a perda na habilidade de macrófagos em transitar normalmente de M1 para

M2 no seu estado ativado (Kodali et al., 2013), o que ressalta a existência da modulação de

macrófagos M1/M2 na ativação da resposta de reparo tecidual e reestabelecimento da

homeostase local no LiP, que quando desestabilizada durante a segunda metade da prenhez

gera complicações no parto a termo, como o observado em quadros patológicos com

aumento de resposta M1 no útero de mulheres e roedores (Brown et al., 2014; Gomez-

Lopez et al., 2014) e durante o pós-parto levam a aparente diminuição nas respostas de

reparo tecidual, que também se manifesta na depleção precoce de macrófagos por

75

lipossomos contendo clodronato durante o reparo do ligamento colateral medial de ratos

(Chamberlain et al., 2011).

A consonância entre as imunolocalizações dos biomarcadores 7/4 e F4/80 de monócitos

e macrófagos, suas presenças nos canais, lacunas e áreas esgarçadas do ligamento interpúbico

bem como todas as modificações celulares e de matriz do LiP e as quantificação dos índices de

expressão de fatores pró e anti-inflamatórios do 18ddg ao 3ddp de camundongos permitiram o

reconhecimento de aspectos que dizem respeito à participação e a fina modulação da

polarização M1/M2 como contribuição ao remodelamento do LiP durante o final da prenhez,

parto e pós-parto.

Os resultados obtidos durante o remodelamento da sínfise púbica do camundongo são

consistentes com a hipótese de que o recrutamento espaço temporalmente regulado de

macrófagos em componentes do canal de parto e cintura pélvica de modo geral pode contribuir

para adaptações destas estruturas no final da prenhez e no pós-parto, como aquelas que

mostram modificações relacionadas à modulação de resposta M1/M2 nos tecidos cervicais

durante o reparo pós-parto, bem como no miométrio e decídua necessárias à indução do parto

em mulheres e camundongos, e também no tecido adiposo durante a prenhez em mulheres e,

particularmente, no tecido adiposo parametrial em camundongos ao final da prenhez (Zhang et

al., 2011; Mahendroo, 2012; Resi et al., 2012; Brown et al., 2014; Gomez-Lopez et al., 2014;

Pedroni et al., 2014).

Além das semelhanças no que diz respeito à linhagem, idade, estratégias no manejo

animal até o 17º dia da prenhez contabilizado por Zhang et al. (2011) e que corresponde ao

18ddg conforme os critérios que adotamos; destacamos como elemento primordial para o

entendimento das semelhanças entre as tendências de polarização M1/M2 nos tecidos

interpúbicos e no tecido adiposo parametrial o fato de que ambos estão submetidos as

76

mudanças fisiológicas e biomecânicos do final da prenhez, particularmente no que diz respeito

às forças de compressão que atuam sobre a cavidade pélvica, e deste modo, possuem maiores

interfaces ou mesmo interpenetrações de tecidos do ligamentos e invólucro da SP pelo tecido

adiposo parametrial, como se pode constatar nas ilustrações contidas em artigos que

exploram a conectividade da estruturas da pélvis feminina (Becker et al., 2010;Ercoli et al.,

2005; Shin et al 2012; Yiou et al., 2001).

O grau de interpenetração entre o tecido adiposos parametrial e os órgãos pélvicos

dificulta reconhecimento de limites anatomopatológicos destes órgãos (Shin et al., 2012) e faz

com que, do ponto de vista histofisiológico, o tecido adiposo também seja descrito como

componente normal do estroma da cérvice uterina, estabelecendo a comunicação entre estas

estruturas independentemente da idade de indivíduos, paridade, infamação e traumas anteriores

(Doldan et al., 2009). Desta forma, a interconexão entre estruturas de suporte da cintura pélvica

e do aparelho reprodutor feminino por meio do tecido adiposo do paramétrio permite à

compreensão das estreitas similaridades nos mecanismos de remodelamento durante a prenhez

(Brown et al., 2014), assim como na regulação da polarização de macrófagos M1/M2 (Gomez-

Lopez et al., 2014) desencadeadas no final da prenhez, parto e no remodelamento pós-parto em

mamíferos gravídicos.

Os resultados apresentados neste trabalho apontam para as participações de

monócitos e macrófagos dentre as células da resposta imunitária inata que contribuem

ativamente para modificações espaço temporalmente reguladas da sínfise do camundongo

durante a prenhez parto e pós-parto. Este processo de remodelamento da sínfise, guarda

estreita associação com aqueles representados por um padrão de danos moleculares,

reconhecido por receptores celulares específicos na inter-relação biológica entre

proteoglicanos e seus receptores na resposta inflamatória, como revisto por Frey et al.

77

(2013). De acordo com estes autores esta inter-relação se faz principalmente em doenças

articulares ou inflamações estéreis onde vários componentes da MEC desempenham papeis

chaves na interação padrão de danos moleculares /receptores específicos; dentre estes

conferiram posições de destaque para decorin, ácido hialurônico ligado ao versican, ácido

hialurônico isoladamente, bem como produtos de suas degradações enzimáticas.

Coincidentemente, são estes os componentes da MEC abundantemente secretados

concomitantemente à elevação das expressões de enzimas durante o processo de

remodelamento do LiP do camundongo primíparo. Sendo assim, o reconhecimento de

interações biológicas entre monócito/macrófagos, proteoglicanos, ácido hialurônico e/ou

seus resíduos metabólicos, intermediada por receptores específicos no processo de

remodelamento do ligamento interpúbico do camundongo durante a prenhez constitui

desafio relevante do ponto de vista da biologia tecidual e que, portanto, deve ser colocado

como meta.

78

79

6.Conclusões

1) Os resultados obtidos evidenciaram que os leucócitos que participam do

remodelamento tecidual do LiP na etapa final da prenhez e no pós-parto do camundongo

possuem fenótipos correspondentes ao de monócitos positivos para antígeno 7/4 e

macrófagos positivos para F4/80.

2) O aumento nos índices de expressão do receptor Ccr2 de quimiocinas típico

de monócitos no LiP de camundongos ao final da prenhez e durante o pós-parto é

concomitante ao aumento na expressão de fatores associados a polarização de macrófagos

nos fenótipos M1 e M2. Deste modo, os resultados evidenciaram que a modulação na

polarização de macrófagos é uma característica importante no remodelamento e manutenção

da homeostase tecidual da SP durante a prenhez.

3) A estratégia empregada para a depleção de macrófagos evidenciou o

favorecimento de resposta pró-inflamatória pelo tratamento com lipossomos contendo

clodronato que acarreta no desbalanço na polarização de macrófagos com favorecimento do

fenótipo M1 e resulta em perda de integridade tecidual no final da prenhez e atraso nos

mecanismos de reparo no pós-parto. No entanto, reconhecemos as limitações deste estudo

dado a grande variedade de células, moléculas e fatores provenientes da prenhez que atuam

no remodelamento da SP, o que para nós, representa novos desafios.

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8. Anexos

8.1. Certificado e Declaração de Comissão de Ética em Pesquisa Animal

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