Mapeamento genético em procariotos

Prof. Dra. Adriana DantasProf. Dra. Adriana Dantas

Engenharia de Bioprocessos e BiotecnologiaEngenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

UERGS – Bento GonçalvesUERGS – Bento Gonçalves

Definições

Mapa genético: define a distância entre mutações em termos de freqüência de recombinação

Mapa por restrição: Digestão do DNA com enzimas de restrição e medição da distância entre os sítios de quebra

Mapa definitivo: conseguido através do seqüenciamento do DNA

Introdução

No mapeamento genético, utilizamos conhecimentos de diversas áreas da genética,

além de procedimentos estatísticos adequados.

Assim, o mapeamento genético envolve a genética mendeliana, a citogenética, a

genética molecular, a genética quantitativa (para mapeamento de QTL’s) e a genética de

populações.

Polimorfismo

Fenotípico: função do gene é afetada

Fragmento de restrição: sítio alvo de enzima é afetado

Seqüência: análise direta do DNA

• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): diferença no mapa de restrição entre dois (ou mais) indivíduos

Variação genôomica

Marcadores moleculares podem ser usados para mapeamento

Marcadores são úteis para a construção de mapas de ligação e testes de paternidade.

Mapeamento genético: marcadores: RFLPs, SSR, AFLPs, RAPDs,

enzimas, proteínas, aminoácidos, etc. genótipo e/ou fenótipo de interesse

freqüência de recombinação

Teoria Cromossômica da Herança

De acordo com a teoria cromossômica...

Se os genes R e G estão em cromossomos diferentes:

observe os núcleos das células híbridas F1: RrGg

Considerações

Um indivíduo possui duas cópias de cada partícula de herança (gene).

Essas duas cópias são separadas durante a formação dos gametas e juntam-se novamente quando os dois gametas de encontram para formar um zigoto.

Um locus (plural=loci) é um local em um cromossomo onde ficam os genes.

Os traços são distribuídos independentemente quando os loci dos gene R e G estão em diferentes cromossomos.

Genes no mesmo cromossomo

Se os genes estiverem no mesmo cromossomo, quando

observamos o produto de diferentes meioses, temos os

seguintes gametas: RG 50% : rg 50% ; Rg 0% : rG 0b

De acordo com Mendel, os traços devem estar distribuídos

de maneira independente: RG 25% : rg 25% ; Rg 25% : rG

25%

De acordo com a teoria cromossômica, os traços devem

estar distribuídos com os cromossomos : RG 50% ; rg 50%

Então, qual é o modo de herança real?

Na verdade, pode haver um terceiro resultado quando os dois genes estão

no mesmo cromossomo.

Observa-se também a progênie resultante dos gametas RG e rg em uma

maior freqüência do que a progênie dos gametas Rg e rG.

RG, rg são gametas do tipo parental (o cromossomo no gameta é o mesmo

dos pais) = Rg e rG são gametas não parentais.

Como isso acontece?

Os gametas não-parentais Rg e rG são formados por meio de um processo

chamado de recombinação.

Crossing Over e Recombinação

Permuta simples

Permutas duplas envolvendo 2 cromátides

Permutas duplas envolvendo 3 cromátides

Permutas duplas envolvendo 4 cromátides

Ligação gênica

É um dos fenômenos genéticos mais amplamente conhecidos e estudados.

Logo após a redescoberta dos trabalhos de Mendel, surgiram relatos de genes que não seguiam a lei de segregação independente.

Batenson e Punnett foram os primeiros a relatar o fenômeno em 1905.

No entanto, o trabalho mais célebre sobre ligação gênica deve-se a Morgan e seu discípulo Stutervant, em 1911.

Estes autores relacionaram os desvios da segregação independente à presença dos genes no mesmo cromossomo e propuseram a utilização da freqüência de recombinação para a realização de mapeamento genético.

Proporções na progênie

proporção na progênie: 944 : 965 : 206 : 185

Números 944 e 965 são do tipo parental.

Números 206 e 185 não são do tipo parental (recombinantes).

Se os genes b e vg estiverem em cromossomos diferentes, a

proporção 1 : 1 : 1 : 1 poderia ser esperada para os genótipos

Se os genes b e vg estiverem nos mesmos cromossomos, a

proporção 1 : 1 : 0 : 0 poderia ser esperada para os genótipos

Recombinaçao na meiose

A recombinação ocorre durante a metáfase da meiose I, (células são 4n, cada

cromossomo é duplicado e os cromossomos homólogos são alinhados).

Partes de cada cromossomo homólogo realizam o crossing over, trocando, de

forma eficaz, o material genético

Recombinação (evento de crossing over) ocorre com uma certa freqüência .

Os tipos não parentais (recombinantes) são produzidos durante a recombinação.

- As células em meiose foram estudadas e observou-se os cromossomos se

tocando para formar o quiasma (crossing-over).

Seria essa uma evidência de que a recombinação ocorreu?

Para provar que houve recombinação, é necessário observar o número de recombinações produzidas.

A freqüência da recombinação (FR) é uma medida da probabilidade de troca genética

Se os dois genes estão próximos, a freqüência de recombinação é baixa 0%

Se dois genes estão distantes, a freqüência de recombinação é alta ~50%

Diz-se que os genes estão ligados em um mesmo cromossomo se FR for menor do que 50%

Diz-se que os genes não estão ligados se FR for ~ 50%.

Eles podem estar bem distantes em um cromossomo ou podem estar em cromossomos diferentes.

Frequência de recombinação (FR) calculado

Mapas Genéticos

Um Mapa de Ligação Genética mostra a ordem dos genes em um cromossomo. A ordem está baseada nos dados de freqüência de recombinação entre os genes Alfred Sturtevant, um aluno no laboratório de T. H. Morgan, usou os dados de freqüência

de recombinação para construir mapas de ligação genética. Troca da material genético resultam em gametas “b+” e “vg+” Ele usou valores de FR para atribuir distâncias entre os genes em unidades do mapa

(m.u) Exemplo: os genes b e vg em um cromossomo mostram uma freqüência de

recombinação de 17% Portanto, o valor FR informa que os genes b e vg estão separados por 17 unidades de

mapa no mesmo cromossomo

Sturtevant sabia que a RF entre o gene vg e um outro gene chamado cinnabar (cn) era de 8%

Sturtevant descobriu que se os cromossomos fossem entidades lineares, então haveria duas possibilidades:

Descobriu que a freqüência de recombinação entre ao genes b e cn era de 9%, assumindo então que o mapa #2 estava correto.

Sturtevant compilou todos os dados de ligação e desenvolveu um mapa genético bem mais extenso.

Ele inferiu que os genes residiam em cromossomos e conseguiu mapear os genes nos cromossomos observando os dados de FR entre os genes.

Recombinação entre dois genes

1) Para a recombinação ocorrer entre dois genes ligados deve ocorrer “crossing over“entre eles.

2) A probabilidade do “crossing” ocorrer entre dois genes ligados é diretamente proporcional à distância entre eles.

3) Então, a freqüência de recombinação pode ser usada como um indicador da distância entre dois genes.

Analise de recombinação

A análise de recombinação é a técnica usada para determinar quão freqüentemente um “crossing” pode ocorrer entre dois genes durante a meiose e portanto quão distantes esses genes estão um do outro.

Para fazer análises de recombinação :Para fazer análises de recombinação :

1) Um heterozigota para dois genes conhecidos no mesmo cromossomo.

2) Um homozigota recessivo para fazer o cruzamento teste (assim cada genótipo terá um fenótipo único).

3) Suficiente descendência para cálculos acurados da progenie proveniente ou não de “crossing over”.

Mapeamento do cromossomo de Mapeamento do cromossomo de E. coliE. coli

Recombinação entre genes marcadores após transferência

A transferência entre um cruzamento é deduzida da existência de recombinantes produzidos pelo cruzamento

Antes de ser produzido um gene estável, os genes transferidos devem ser integrados ou incorporados ao genoma receptor por um mecanismo de troca.

Troca genética em procariotos

Em procariotos não ocorre entre dois genomas inteiros (como ocorre em eucariotos)

Ocorre entre genoma completo, derivados de F-, chamados endogenoto, e um incompleto, derivado do doador, chamado exogenoto.

A genetica por recombinaçao em bacterias é a genetica de merozigotos.

a+

a-

exogenoto

endogenoto

merozigotomerozigoto

a+

a-

exogenoto

endogenoto

a+

a-

exogenoto

endogenoto

merozigotomerozigoto

a+

a- a+ a-

inviável

a+

a-

a+

a-a- a+ a-

inviável

a+

a-

a+

a-

inviável

viável

a+

a-

a+

a-

a+a+

a-a-a-

inviável

viável

(a)

(b)

(a)Um único crossing leva a cromossomo linear parcialmente diplóide

(b) Um numero par de crossing leva a um anel mais um fragmento linear

a+

a-

exogenoto

endogenoto

merozigotomerozigoto

a+

a-

exogenoto

endogenoto

a+

a-

exogenoto

endogenoto

merozigotomerozigoto

a+

a- a+ a-

inviável

a+

a-

a+

a-a- a+ a-

inviável

a+

a-

a+

a-

inviável

viável

a+

a-

a+

a-

a+a+

a-a-a-

inviável

viável

(a)

(b)

(a)Um único crossing leva a cromossomo linear parcialmente diplóide

(b) Um numero par de crossing leva a um anel mais um fragmento linear

Possibilidades de crossing

Um único crossing não é muito útil para gerar recombinantes viáveis, pois o anel é quebrado para produzir um cromossomo estranho, linear, parcialmente diplóide.

Para haver o anel intacto, deve haver um numero par de crossing.

O fragmento produzido é apenas um genoma parcial, o qual é perdido durante crescimento celular.

Gradiente de Transferência

Em geral apenas um fragmento do cromossomo doador aparece no receptor

Ocorre a quebra espontânea dos pares conjugantes, de modo que o cromossomo inteiro é raramente transferido

Isso cria um gradiente de transferência natural, o qual torna menos provável que uma célula receptora receba marcadores genéticos mais finais (marcadores mais longe da origem).

Cruzamentos de marcadores doados por Hfr na ordem met, arg, leu

•Ocorre muitos fragmento contendo met do que o locus arg, e o locus leu esta presente apenas num fragmento.

•Desta forma, quanto mais próximo o marcador esta de origem, maior a chance de que ele seja transferido durante a conjugação.

met + arg + met +

met + arg + met +

met + arg + met +

met + arg + met +

met + arg + met +

met + arg + met +

met + arg + met +met + arg + met +

met + arg + met +met + arg + met +

met + arg + met +met + arg + met +

met + arg + met +met + arg + met +

met + arg + met +met + arg + met +

met + arg + met +met + arg + met +

Mapeamento por FR em cruzamentos de Mapeamento por FR em cruzamentos de bactériasbactérias

Para obtermos uma resolução alta entre o loci marcador que estão próximos ao gene

Usamos a FR para medir essa ligação.

Para medir a ligação e obter a distancia de mapa calculada, é necessário que o marcador tenha chance igual de ser transferido junto ao gene.

Três marcadores: met, arg, leu

•A ordem é met, arg, leu

•met é transferido primeiro e leu por ultimo

•Porque o ultimo é o leu?

•Porque se selecionamos o ultimo, então saberemos que todas as células que receberam o fragmento contendo esse ultimo marcador também receberá os outros, met e arg.

Fragmento transferido de cromossomo HfrFragmento transferido de cromossomo Hfr

Leu- arg - met -

Cromossomo F -

Leu- arg - met -Leu- arg - met -

Cromossomo F -

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

met+ arg+ met+met+ arg+ met+

Cálculo da distancia do mapa

Unidade do mapa é (u.m) é igual a 1 por cento de crossing no respectivo intervalo.

Na pratica isso é calculado, entre o total de recombinantes recuperados, a porcentagem de recombinantes produzidos por crossings entre dois marcadores.

Por definição, uma unidade de mapa genético (cM) corresponde a 1% de recombinação.

Entretanto, não existe uma relação direta entre cM e número de pares de bases (pb) pois a freqüência de recombinação é influenciada por muitos fatores.

Mapeamento cromossômico

Mapas em bactérias combina as técnicas de mapeamento de conjugação interrompida, mapeamento de recombinação, transformaçao e transdução.

Mapas atuais são utilizados linhagens de Hfr que transferem a partir de pontos diferentes do cromossomo.

Em 1963, o mapa de E. coli já detalhava 100 genes, em 1990 mais de 1.400 genes

Mapa genetico de 1963 de E. coli

Fatores de recombinação

Dentre os fatores ambientais, os que mais alteram as taxas de permuta genética são: ‘status’ iônico celular, nutrição, idade e temperatura

Em estudos de mapeamento, no entanto, deve-se manter o ambiente o mais homogêneo possível para assegurar a confiabilidade dos dados obtidos.

A freqüência de recombinação varia significativamente ao longo dos cromossomos, ocorrendo muito mais recombinação nas regiões medianas dos cromossomos que em regiões estruturais como centrômeros e telômeros.

A escolha dos cruzamentos utilizados para mapeamento genético deve ser criteriosa, pois a freqüência de recombinação é extremamente dependente dos genótipos parentais.