METODOLOGIAS PARA AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE CELULAR

Salvador – BAJulho - 2013

Linf B Linf TCD4+ Linf TCD8+

(Linf. TH) (Linf. TC)

Reconhecimento de Antígenos pelos Linfócitos B e T

Métodos para Detecção e Quantificação de Linfócitos

• Citometria de Fluxo: baseada em anticorpos monoclonais específicos para cada tipo de marcador celular

• Kits específicos para CD3, CD4 e CD8• Análise espécie-específica• Quantitativo total / relativo• CD4/CD8

Detector de dispersão de luz em ângulo de 90º Complexidade celular

SSC (Side Scatter)

Detector de dispersão de luz frontal

Tamanho celularFSC (Forward Scatter)

Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm

METODOLOGIA

ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)

ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)

LASER

CÉLULA

METODOLOGIA

3)Dispersão lateral de luz

1)Suspensão de células

Laser3)Dispersão de luz para a frente

4)Filtro

6) Análise de dados

5)A luz refletida passa através de filtros e é detectada por tubos fotomultiplicadores que convertem o sinal luminoso em sinal eletrônico

2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula

METODOLOGIA

Linfócito TCD4

Anticorpos monoclonais marcados

Linfócito TCD8

Citometria de fluxo

Luz fluorescenteLaser

Contagem das células

METODOLOGIA

Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal)

Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro.Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente

E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmenteOs círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos

METODOLOGIA

Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência)

Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3-

Neste quadrante estão as células CD4- e CD3-

(células que não linfócitos)

Neste quadrante estão as células CD4- e CD3+

(outros linfócitos que não Th)

Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3+

(linfócitos Th)

METODOLOGIA

Metodologia para quantificação de linfócitos - Citometria

Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology

Metodologia para quantificação de linfócitos - Citometria

Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology

Vias de Transdução do Sinal -

Linf. T

Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal

• Western Blot – anticorpos específicos para cada molécula participante de cada cadeia de transdução de sinal

• Anticorpos específicos para mediadores fosforilados e não fosforilados

• Tempo dependentes e dose dependentes• Controles internos e externos importante

Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal

Andrade et al. 2004. The vaccinia virus-stimulated mitogen-activated protein kinase (MAPK)pathway is required for virus multiplication. Biochemistry Journal

Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal

Campos et al. 2004. Impaired production of proinflammatory cytokines and host resistance to acute infection with Trypanosoma cruzi in mice lacking functional myeloid differentiation factor 88.Journal of Immunology.

L-selectinas e adressinasdirigem os linfócitos para os tecidos linfoides

Integrinas são importantes na adesão

leucocitária

Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão

• Imunohistoquímica, Imunofluorescência Indireta – avaliação qualitativa e semi-quantitativa da expressão de moléculas de adesão em diferentes órgãos

• Avaliação in vivo, ex-vivo, biópsias, cortes histológicos

• Citometria de Fluxo – avaliação in vitro, células cultivadas, ex-vivo – marcadores específicos

Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão

Subranamian et al. 2012. Signaling through L-selectin mediates enhanced chemotaxis of lymphocyte subsets to secondary lymphoid tissue chemokine. Journal of Immunology.

Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão

Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver.Hepatology.

Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão

Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver.Hepatology.

Caracteristicas gerais

Métodos de dosagem de citocinas

• ELISA Sanduíche – a partir de sobrenadante de células em cultivo após diferentes estímulos – citocinas secretadas

• Citometria de Fluxo – beads contendo anticorpos específicos contra citocinas

• Citometria de Fluxo – citocinas intracitoplasmáticas, contagem do número de células produtoras – efeito celular

Métodos de dosagem de citocinas

• ELISPOT – metodologia que permite acompanhar a cinética de células estimuladas quanto à sua produção de citocinas específicas em cultivo

• Através de visualização em microscópio, conta-se o número de células marcadas.

ELISPOT

ELISPOT

Métodos de dosagem de citocinas

Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice and macaques. Vaccine

Métodos de dosagem de citocinas

Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice and macaques. Vaccine

Métodos de dosagem de citocinas

Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice and macaques. Vaccine

Detecção da Hipersensibilidade Tipo I

• O teste cutâneo determina a capacidade de diferentes alérgenos de produzirem uma reação de pápula e eritema .

aspecto de uma reação após 5 horas

aspecto de uma reação logo após injeção

alérgeno diluído de 1:10 até 1:1000

Teste Radioalergoadsorvente(RAST)Mede o nível sérico de anticorpos IgE específicos contra determinado

componente alergênico ao paciente.

discos com componente alergênico suspeito

soro do paciente contendo anti-alérgeno IgE lavagem

adição de anti IgE humana marcada

lavagem detecção

IMUNOFLUORESCÊNCIA DE REAÇÕES DE HIPERSENSIBILIDADE TIPOS II E III

TIPO III TIPO II

Os cortes de rim comparam o padrão de imunofluorescência de um paciente com Lupus Eritematoso Sistêmico (predomínio de hipersensibilidade tipo III) e um paciente com Síndrome de Goodpasture (predomínio de hipersensibilidade tipo II). No LES, os imunocomplexos formados no sangue são depositados no tecido renal, dando aspecto granular. No segundo caso, os anticorpos se depositam de forma linear sobre a membrana basal glomerular.

Detecção da Hipersensibilidade Tipo IV

Testes cutâneos No teste epicutâneo - aplica-se uma baixa dose do antígeno suspeito numa área da pele do paciente .

Pode haver desenvolvimento de eczema dentro de 48 a 72 h.

EPIDERME

DERME

GORDURA SUBCUTÂNEA

Antígeno

EPIDERME

DERME

GORDURA SUBCUTÂNEA

•Teste tuberculínico – o derivado protéico purificado de Mycobacterium tuberculosis, PPD, é injetado por via intradérmica. Nesse teste analisa-se o surgimento de vermelhidão e enduração no local da injeção, que podem surgir depois de 24 a 72h em indivíduos pré-sensibilizados.

APRESENTAÇÃO CLÍNICA E HISTOLÓGICA DO TESTE TUBERCULÍNICO

Resposta ao teste:1. nenhuma reação:

normal2. 5 a 10mm: repetir o

exame3. > 10mm: positivo para

tuberculose4. Paciente HIV +, >5mm:

positivo para tuberculose

Avaliação da produção de IFN-(por exemplo, em paciente suspeito de infeccão por Mybacterium tuberculosis)

Suspeito

Controlesnegativoe positivo

Cultura de

sangue total

Sangue +

PPD

Coleta do

sobrenadante

ELISA detecção de IFN-

24 h

Leitura de

densidade óptica

sangue

Avaliação dos resultados

Métodos de Avaliação da Resposta Imune Celular

ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS

ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS

Lim et al 2009.The Effects of Heat-Killed Wild-Type Lactobacillus casei Shirota on Allergic Immune Responses in an Allergy Mouse Model. International Archives of Allergy and Immunology,

ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS