Post on 10-Jul-2015
Universidade Federal do Triângulo MineiroInstituto de Ciências Biológicas e Naturais (ICBN)
Disciplina de Biologia Molecular Aplicada
Professor André Luiz Pedrosa
Mutações no gene NT5E e calcificações
arteriais
Juliana de Morais Palmieri da SilvaJuliana Mendes Junqueira
Lais de Melo Valente Verônica Nascimento Mendes
Curso de BiomedicinaUberaba - MG
Novembro/2014
Objetivo/justificativa do artigo
Tentar elucidar as bases genéticas e
moleculares das calcificações
arteriais, as quais estão associadas a
um risco cardiovascular aumentado
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Introdução MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
A calcificação arterial foi considerada uma doençadesconhecida até pouco tempo;
2008 - NIH (National Institutes of Health) – Programapara Doenças não diagnosticadas;
Inicialmente era considerada uma resposta passiva paraeventos degenerativos;
Em uma família, nenhum dos pais era afetado peladoença, somente os filhos.
Um depósito de cálcio nas artérias localizadas na metade
inferior do corpo e nas articulações das mãos e dos pés dos
pacientes;
Acomete a camada íntima ou média de vasos;
Associada a um risco excessivo de eventos
cardiovasculares;
Calcificação arterial infantil idiopática (calcificação arterial
generalizada da infância).
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
ALC
IFIC
AÇ
ÕE
S
AR
TE
RIA
IS
CALCIFICAÇÃO ARTERIAL:
Introdução
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
PARA REALIZAÇÃO DESSE ESTUDO:
Introdução
Primeiramente foi realizado esse estudo para avaliar o início da
doença em indivíduos adultos de três famílias;
Indivíduos das Famílias 1 e 3 – aprovadas do NIH pelo Programa
de doenças não Diagnosticadas;
Estudos genéticos para Família 2 foram aprovados pelo Comitê
de Ética da universidade Azienda Ospedaliera Universitaria San
Giovanni Battista (Universidade de Torino, na Itália);
Todos informados com consentimento escrito.
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Figura 1. Genealogia do estudo dos pacientes.
O painel A mostra a genealogia dos estudos das três famílias (família 1).
Símbolos abertos indicam membros não afetados na família, enquanto que os
símbolos vermelhos mostram membros afetados. Setas indicam os
probandos. □ sexo masculino/ o: sexo feminino/ Símbolos cortados:
falecidos/ Dupla linha horizontal: consanguinidade/◊: número desconhecido
de indivíduos/ △: gravidez perdida
Introdução
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
ISITB: Índice pressórico tornozelo-braquial
Introdução
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
ISManifestações clínicas
Extensa oclusão das artérias ilíaca, poplítea e tibiais, com
vasta colateralização;
Calcificação extensa com áreas de arteriomegalia (aumento
do diâmetro das artérias);
Revelou calcificação das cápsulas articulares justa-articulares
dos dedos , pulsos, tornozelos e pés.
Todos os 4 irmãos dessa paciente:
Diminuição da claudicação intermitente;
Diminuição hemodinamicamente significante da doença
arterial periférica obstrutiva das extremidades inferiores;
Oclusão da artéria poplítea;
Três dos cinco irmãos mostraram que as lesões obstrutivas
eram difusas e intensamente calcificadas;
Uma das irmãs tinha calcificações vasculares circunferenciais
periféricas proeminentes nas extremidades inferiores;
Obstrução vascular extensiva com calcificação difusa
Manifestações Clínicas – Família 1
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Família 3
Paciente II.1
Família 1
Paciente VI.1
Família 2
Paciente II.4 Família 1
Paciente VI.1
Família 1 - Paciente
VI.1
Manifestações clínicas
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
FAMÍLIA 2
Mulher 68 anos
Dor articular intensa nas mãos tratada com
glicocorticóides (tratamento sem efeito)
Manifestações clínicas
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Condrocalcinose;
Níveis séricos de eletrólitos, como cálcio e
colesterol, foram normais;
Duas irmãs, de 73 e 70 anos de idade, também
tiveram dor nas extremidades inferiores
e tiveram calcificações vasculares que
eram semelhantes àquelas do probando .
Manifestações Clínicas – Família 2Família 2
Paciente II.4
Manifestações clínicas
FAMÍLIA 3
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Mulher, 44 anos
Com 42 anos teve parestesia nas pernas, avaliaçõesreumatológicas negativas e isquemia na perna direita –procedimento cirúrgico bypass
Manifestações clínicas
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Extensas calcificações nas artérias distais, com preservação
das artérias carótidas, aorta e das
artérias coronárias;
Isquemia na perna direita, tendo
sido solicitado um desvio (bypass)
femoro-poplíteo;
Os níveis séricos de proteína
C-reativa, colesterol, lipídios,
cálcio, fosfato e vitamina D
estavam dentro da normalidade.
Manifestações Clínicas – Família 3
Família 3
Paciente II.1
Manifestações clínicas
Conceitos básicos:
Pontuação LOD : uma estimativa estatística para saber se dois
genes, ou um gene qualquer e um gene da doença, são susceptíveis
de serem localizados perto um do outro em um cromossomo e,
portanto, são susceptíveis de serem herdados juntos. Uma
pontuação LOD de 3 ou superior a 3 é geralmente entendida como
significando que dois genes estão localizados perto um do outro no
cromossomo.
Touchdown-PCR: pré ciclos de amplificações, onde há variação
na temperatura de anelamento que reduz o número de bandas
inespecíficas da reação.
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Materiais & Métodos + Resultados
1) CULTURA DE FIBROBASTOS
Foram preparadas a partir de uma biópsia por punção contendo 4
mm de amostra de pele;
Obtidas de cada paciente e cultivadas em meio Eagle modificado
por Dulbecco (DMEM);
Contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-
estreptomicina;
As células foram alimentadas a cada dois dias e divididas 1:2 até a
confluência.
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
2) ANÁLISE de POLIMORFISMOS de NUCLEOTÍDEO
ÚNICO (SNPs)
DNA genômico na Família 1 foi isolado a partir de leucócitos
periféricos e genotipados por genotipagem array;
Amostras de alelos homozigotos foram geradas com a utilização
de Software GenomeStudio;
Regiões anômalas de homozigose foram identificadas visualmente
e confirmadas por meio de imputação de haplótipo (ENT programa);
Uma pontuação LOD foi estabelecida mediante o uso de análise
paramétrica de ligação múltipla.
Materiais & Métodos + Resultados MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
3) ANÁLISE de MUTAÇÕES da CD73
Éxons codificantes e junções íntrons-éxons do gene NT5E foramamplificados por PCR-touchdown
• 50 ng de DNA genômico
• 3 μM de oligonucleotiótidos senso e antissenso
• 5 μL de HotStart Master Mix
• Em um volume final de 10 μL
Os produtos de PCR foram sequênciados em ambas as direçõescom o uso do Kit Big Dye terminator e um sequenciador capilarautomatizado;
Compararam as sequências derivadas de eletroferograma com sequências de referência para o gene NT5E;
Screening de 200 amostras de DNA de indivíduos-controles daraça branca foi realizado por meio de análise de discriminação alélica5’-nuclease(TaqMan)
Materiais & Métodos + ResultadosM
UT
AÇ
ÕE
SN
OG
EN
EN
T5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
SNPs - RESULTADOS
Foram identificadas mutações bialélicas do tipo nonsense, do tipo
missense e mutações com mudança de fase;
Devido a inserções de um único nucleotídeo na região da ecto-
5'nucleotidase do gene NT5E;
Gene que codifica a enzima CD73, a qual gera adenosina
extracelular, imediatamente a downstream ao gene da ENPP1 na via
extracelular de degradação do ATP.
Materiais & Métodos + Resultados
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
A linhagem consanguínea da família 1, com uma doença
confinada a uma geração, sugeriu herança autossômica recessiva;
Procuraram por uma região do genoma na qual todos os cinco
irmãos afetados eram homozigotos e idênticos por meio da
descendência, mas da qual ambos os pais eram heterozigotos;
Havia apenas uma dessas regiões em todo o genoma: uma região
de 22,4 Mb no cromossomo 6q14, contendo 7977 SNPs genotipados e
92 genes;
A pontuação na escala LOD para essa região nesta família, foi de
4,81.
Materiais & Métodos + Resultados
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Análise de mutações da CD73 - RESULTADOS
Dos 92 genes desta região, apenas três foram avaliados:
• Os genes ATG5 e CASP8AP2, porque estavam envolvidos em
processos celulares degenerativos que podem levar à calcificação;
• O gene NT5E, porque o seu substrato enzimático é o produto da
ENPP1, e que mutações nesse gene geram calcificações arteriais em
crianças.
O sequenciamento direto identificou uma mutação nonsense
homozigota (c.662C →A, resultando em p.S221X) no éxon 3 do gene
NT5E em todos os irmãos da família 1 e a mesma mutação nonsense
foi encontrada no estado heterozigoto em ambos os pais
Materiais & Métodos + Resultados
Materiais & Métodos + Resultados MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Figura 2. Resultados de estudos genéticos e enzimáticos na família
1.
O painel A mostra ensaios de polimorfismos de nucleotídeo único
(SNPs) das amostras homozigotas dos cinco irmãos afetados da
família 1 e também das amostras dos seus pais.
Região de homozigose
idêntica entre os pacientes
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Figura 2. Resultados de estudos genéticos e enzimáticos na família
1.
O painel B mostra sequências cromatográficas de um controle, um dos
pais de um membro afetado da família 1 e de um membro afetado; a
mutação sem sentido (p.S221X) é indicada
Materiais & Métodos + Resultados
4) ESTUDOS de EXPRESSÃO
RNA isolado culturas de fibroblastos (RNeasy kit ® - Qiagen);
cDNA gerado de amostras de 1μg de RNA (SuperScript ® II
Reverse Transcriptase – Invitrogen);
Ensaio de qPCR + tecnologia SYBR Green ® expressão do gene
NT5E
Método 2-ΔCt =2-(Ct de CD73 – Ct de 18S)
Primers
Materiais & Métodos + Resultados MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
4) Estudos de expressão - RESULTADOS
⇩ da expressão do mRNA do gene NT5E ⇨ pacientes VI.1 e VI.4(família 1);
Afetados da família 2 ⇨ homozigotos para mutação missensec.1073G→A (p.C358Y) no éxon 5 do gene NT5E;
Mãe dos afetados da família 2 ⇨ heterozigota para estavariante do aminoácido (conservado em 16 espécies);
Membro afetado da família 3 ⇨ heterozigoto para a mutaçãoc.662C→ A (família 1) + mutação nonsense c.1609dupA(V537fsX7) no éxon 9 do gene NT5E
- OBS.: 400 alelos-controle pareados etnicamente ⇨ nenhuma dasmutações relacionadas.
Materiais & Métodos + Resultados MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Figura 2. Resultados de estudos genéticos e enzimáticos na família
1.
O painel C mostra a expressão do mRNA (DNA complementar
[cDNA]) do gene NT5E nos pacientes VI.4 e VI.1 e a sua comparação
com os respectivos controles.
Materiais & Métodos + Resultados
Fig.1. (Apêndice Complementar) Mutações no gene NT5E nas
famílias 2 e 3
A. Sequência cromatográfica dos membros afetados da família 2,
mostrando a mutação missense (p.C358Y). Ao lado do cromatograma
está a comparação do aminoácido na posição 358 entre as espécies.
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
ISMateriais & Métodos + Resultados
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Fig.1. (Apêndice Complementar) Mutações no gene NT5E nas
famílias 2 e 3
B. Sequências cromatográficas da família 3, mostrando a mutação
p.S221X e uma inserção de nucleotídeo único (p.V537fsX7)7,
respectivamente, ao nível dos nucleotídeos.
Materiais & Métodos + Resultados
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
ISMateriais & Métodos + Resultados
5) TÉCNICA de WESTERN BLOTTING para CD73
Células cultivadas até a confluência
Tripsinizadas + sedimentadas + lisadas
Solução
50 mM de Tris-HCl a pH 7,4;
150 mM de NaCl;
2 mM de EDTA;
1% NP-40;
1% de SDS (tampão de RIPA)
Suplementação:
0,5% Triton-x
1x Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail ® - Roche
10 minutos no gelo ⇨ vórtice a 4ºC (5 minutos) + centrifugaçãoa 15.000 xg ⇨ quantificar a proteína sobrenadante
5) TÉCNICA de WESTERN BLOTTING para CD73
30 mg de proteína + solução SDS para corrida em gel
Gel de poliacrilamida (PAGE) de 4 a 20% + eletroforese (1,5 hora)
Transferência das proteínas ⇨ anticorpos anti-CD73 + actina
Resultados
⇩⇩⇩ expressão da proteína CD73
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Actina
Afetados Controles
Fig.2. (Apêndice Complementar) Western blot de fibroblastos
mostrando a proteína CD73 ausente nos pacientes VI.4 e VI.1,
comparados com controles. A actina foi utilizada como um controle
para garantir uma carga proteica igual.
Materiais & Métodos + Resultados
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
ISMateriais & Métodos + Resultados
6) ENSAIO ENZIMÁTICO da CD73
Fibroblastos ⇨ lavados com solução de:
2 mM de MgCl2
120 mM de NaCl
5mM de KCl
10 mM de glicose
20 mM de HEPES
Tampão de incubação: solução de lavagem + 2mM de AMP
Células encubadas a 37ºC, por 10 minutos
Medição de fosfato inorgânico (Pi) ⇨ SensoLyte MG Phosphate ®
- AnaSpec
- OBS.: medições do Pi ⇨ normalizadas para mg de proteína
Materiais & Métodos + Resultados
6) Ensaio enzimático da CD73 - RESULTADOS
Atividade da proteína CD73 quase ausente
Pais dos pacientes ⇨ ~72% do nível do controle
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Figura 2. Resultados de
estudos genéticos e
enzimáticos na família 1.
O painel D mostra uma
deficiência na atividade
enzimática da CD73
(representada pela produção
de fosfato inorgânico
dependentemente de AMP)
em culturas de fibroblastos
dos pacientes VI.4 e VI.1 da
família 1
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Fig. 3. Atividade enzimática da CD73 em fibroblastos dos controles, dos pais heterozigotos da família 1 e dos indivíduos afetados. Os dados
representam as médias ± os desvios padrões (standard deviations – SD) e foram analizados utilizando-se do One-way ANOVA com o teste t de
comparação múltipla de Dunnett. Controles X pais dos afetados e controles X afetados (***), com p<0,0001. Duas amostras coletadas em triplicata foram
descritas nos grupos dos controles e dos pais; três amostras coletadas em triplicada foram descritas no grupo dos afetados.
Materiais & Métodos + Resultados
Fo
sfat
o i
no
rgân
ico (μg
/μgde
pro
teín
a)
Controles Pais Afetados
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
ISMateriais & Métodos + Resultados
7) CLONAGEM de MUTAÇÕES e PRODUÇÃO de LENTIVÍRUS
Foram utilizadas sequências de primers em ambas as direções
Para a transdução:
Meio de crescimento contendo 6µg/mL de polibreno
Adicionado ao meio de blasticidina 4 dias depois
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
ISMateriais & Métodos + Resultados
8) TRANSFECÇÃO em CÉLULAS HEK293
A célula HEK293 cultivados em meio Eagle suplementado com
10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
1µg de pCMV-Sport 6 + cDNA mutado
para o gene NT5E
proteína verde fluorescente
Transfectados em células HEK293
Analise para a atividade de CD73 3 dias após a transecção
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
ISMateriais & Métodos + Resultados
9) ENSAIOS IN VITRO de FOSFATASE ALCALINA e CÁLCIO
Os fibroblastos dos pacientes coloração tripisinização
As culturas foram tratadas com
0,1µM de dexametazona
50µM de acido ascórbico-2-fosfato
10mM de β-glycerol fosfato
Meio com 10% de soro bovino fetal e 1% penicilina-estreptomicina
21 ͦ dia
Lavadas com tampão salino fosfato
Fixados com formalina a 10% por 10 minutos
Cristais fosfato de cálcio corados com alizarina vermelha Sa 2%; pH4,2
Fosfatase alcalina foi quantificada pela medição de p-nitrofenolproduzida, medida por absorção a 405nm
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
ISMateriais & Métodos + Resultados
Estudos Celulares - RESULTADOS
Fig.3. Estudos dos fibroblastos obtidos do paciente VI.4 da
família 1. O painel A mostra os resultados do aumento da
concentração da fosfatase alcalina tecido não-específica (TNAP) em
fibroblastos de um controle e do paciente VI.4 após a incubação por 3
dias em meio calcificante. O aumento exacerbado nas células do
paciente (imagem central) foi reduzido pela adição diária de 30 μM de
adenosina ao meio de incubação (imagem à direita).
Materiais & Métodos + ResultadosM
UT
AÇ
ÕE
SN
OG
EN
EN
T5
E&
CA
LC
IFIC
AÇ
ÕE
SA
RT
ER
IAIS
Fig.3. Estudos dos fibroblastos obtidos do paciente VI.4 da família 1.O painel B mostra a atividade da TNAP em fibroblastos de um controle e dopaciente VI.4 após a incubação por 3 dias em meio calcificante. A transduçãocom um vetor-controle expressando a β-galactosidase apresentou um efeitodiscreto na atividade da fosfatase alcalina, enquanto que a transdução comum vetor que codifica a CD73 reduziu significativamente a atividade dessaenzima; a incubação com 30μM de adenosina resultou em níveis da TNAPsimilares aos vistos nos controles. Os dados apresentados correspondem atrês experimentos que foram analisados pelo método de análise da variânciamediante comparação com o teste hoc do múltiplo de Dunnett’s. Os valoresde p foram apresentados para permitir a comparação com a ausência detratamento. As barras I indicam os desvios padrão.
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
ISMateriais & Métodos + Resultados
Fig.3. Estudos dos fibroblastos obtidos do paciente VI.4 da família 1.O painel C mostra os efeitos das intervenções na formação dos cristais defosfato em fibroblastos de um controle e do paciente VI.4. A coloração para ocálcio com vermelho de alizarina S mostrou uma cristalização abundante nascélulas do paciente, como é visível na comparação com a coloração dascélulas controle, após 21 dias em meio calcificante. A formação de cristais decálcio foi evitada/prevenida pela transdução com um vetor lentiviral quecodifica a CD73, mas não por um vetor-controle expressando a β-galactosidase, e pelo tratamento a cada 4dias com 1 mM de levamisol; otratamento diário com 30 μM de adenosina extinguiu parcialmente oprocesso de calcificação.
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Bisfosfanato análogo ao pirofosfato, inibidor da
calcificação tecidual
Dipiridamol fármaco antitrombotico, poderia promover o
salvamento da adenosina por inibir a recaptação celular da
mesma, onde seria degradada.
Outras possibilidades terapeêticas uso de antagonistas
dos receptores de adenosina ou um inibidor direto da fosfatase
alcalina, como o Lanzoprazol
Materiais & Métodos + Resultados
Discussão + Conclusão MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Fizeram várias revisões de literatura pra mostrar como essadoença já vinha sendo estudada e sem muito sucesso noresultado.
A calcificação arterial medial das extremidades inferiores comcalcificação periarticular foi descrita primeiramente porMagnus-Levy em 1914 e novamente por Levitin em 1945.
Sharp em 1954 fez um relato de dois irmãos que foramafetados e depois registrou na base de dados OMIM(Banco dedados Online sobre Herança Mendeliana em Humanos – númeroOMIM, 211800)
Nosaka e More com colaboradores descreveram casos isoladosficando um total de sete casos publicados até 2001.
Este trabalho descreveu as bases moleculares e enzimáticasdessa desordem em nove pacientes com três diferentes
Evidencias consideráveis apoiam a associação da doença vascular
dessas famílias com mutações no gene NT5E;
Os resultados das análises de segregação foram consistentes com os
observados nas famílias estudas, e a mutação nonsense (p.S221X) e a
inserção de um único nucleotídeo (p.V537fsX7) prevê proteínas CD73
truncadas;
A mutação missense (p.C358Y), prediz uma modificação patológica
em um aminoácido conservado ao longo da evolução e é localizada no
domínio crítico da nucleotidase da proteína CD73;
A mutação nonsense resultou em uma redução significativa nos
níveis de RNAm da CD73 e da própria proteína CD73 em células
cultivadas;
Cada uma das três diferentes mutações nas três famílias estudadas
produziu essencialmente a proteína CD73 não funcional.
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
ISDiscussão + Conclusão
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
AMPATP
ENPP1
Adenosina
PPi Pi
CD73
TNAP
Calcificação
Discussão + Conclusão
Panorama atual MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS
Nesse estudo foram identificadas mutações no gene NT5E emmembros de três famílias com calcificações sintomáticas, tantoarteriais quanto articulares (cápsulas articulares); O gene NT5E codifica a nucleotidase CD73, a qual atua naconversão do AMP em adenosina;
Os resultados apresentados apresentam papel importantepara essas vias metabólicas, permitindo a inibição da calcificaçãotissular ectópica.
ENPP1
CD73
2009 = 23
2010 = 322
2011 = 360
2012 = 424
2013 = 526
2014 = 335
Referências Bibliográficas
Disponível em:
<http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAsgEAK/tecido-osseo>.
Acesso em 16/11/2014, às 13h04min
Disponível em: <
http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/12713/000633516.p
df?sequence=1>. Acesso em 23/11/2014, às 10h45min
Disponível em: <
http://meriva.pucrs.br/dspace/handle/10923/1439>. Acesso em
23/11/2014, às 12h02min
Disponível em <http://www.biotec-
zone.net/?do=vernoticia&id=941 Acesso em 17/11/2014, 16h49min;
Disponível em
<http://gazetaweb.globo.com/noticia.php?c=227129&e=7 >Acesso
em 17/11/2014, 17h13min;
SKINNER, H.B; MCMAHON, P.J. CURRENT ortopedia:
diagnóstico e tratamento. 5 ed. Porto Alegre: Artmed-Mc Graw Hill,
2015. 672p. ISBN: 978-85-8055-436-6
MU
TA
ÇÕ
ES
NO
GE
NE
NT
5E
& C
AL
CIF
ICA
ÇÕ
ES
AR
TE
RIA
IS