Prof.Doutor José Cabeda

Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica

Preparação de Ácidos NucleicosPreparação de Ácidos Nucleicos

Preparação das células:pulverização pós congelação

Preparação das células:homogeneização

MagnaLyser

Magna Lyser WorkFlow

FastPrep

Sonicação

Principio de funcionamento semelhante ao Principio de funcionamento semelhante ao MagnaLyserMagnaLyser

Fonte de agitação são ultrasonsFonte de agitação são ultrasons

Preparação das células do sangue:Centrifugação em gradiente de densidade (Ficoll)

Preparação das células do sangue:Lise dos eritrócitos

PREPARAÇÃO DE DNA E RNA

DNA e RNA :DNA e RNA : Lise suave e solubilização do DNA/RNALise suave e solubilização do DNA/RNA Destruição enzimática das proteínas (proteases)Destruição enzimática das proteínas (proteases) Destrição e precipitação química das proteínas Destrição e precipitação química das proteínas

(fenol/clorofómio/álcool isoamilico)(fenol/clorofómio/álcool isoamilico) Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de

amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio)amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio) Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia

remoção de sais)remoção de sais)

Método do fenol/ clorofórmio

Método do salting-out

Libertação dos ácidos Nucleicos

Para alguns procedimentos os ácidos Para alguns procedimentos os ácidos nucleicos podem não ser purosnucleicos podem não ser puros Remover a hemoglobina com choque Remover a hemoglobina com choque

osmóticoosmótico Utilizar o pellet celular Utilizar o pellet celular

Libertar ácidos nucleicos com choque Libertar ácidos nucleicos com choque térmico (ex PCR)térmico (ex PCR)

Adsorpção A Silica

Em 1979 Vogelstein & Em 1979 Vogelstein & Gillespie descobrem que o DNA adsorve a pó de vidro (silica) na presença de NaI

Posteriormente verificou-se que outros agentes caotrópicos como guadinida isotiocianato tem a mesma propriedade que o NaI

Diferentes espécies de Ácidos nucleicos adsorvem diferentemente em função da força iónica e pH

Separação de ácidos nucleicos por cromatografia de troca iónica

Eluição dos vários ácidos nucleicos em função do pH

Colunas de sílica (ex. Qiagen)

Formato de 96 poços

Vacuo Versus Centrifugação

Qiagen Biorobot 9604

Sample + Lysis buffer GuSCN

Nucleic acid

Proteins and Lipids

Silica

Elution buffer

Centrifugation

Purified Nucleic acid

Wash

processing time10 samples/1.5h

Método de Boom

Full BloodFull Blood Serum/plasmaSerum/plasma PBMC/PBLPBMC/PBL SputumSputum UrineUrine Brain tissueBrain tissue Spleen tissueSpleen tissue Liver tissueLiver tissue

FaecesFaeces Throat swabsThroat swabs Dermal lesions Dermal lesions

swabsswabs Cerebro spinal Cerebro spinal

fluidsfluids Cervical smearsCervical smears Pus samplesPus samples FoodmatricesFoodmatrices

Ref. Boom et al. J. Clin. Microbiol. (28), 495-503, 1990

“Boom” compatible Sample Types

NuclisensExtractor

Unidade Principal

Baía dos reagentes

Cartridge modules

As cartridges

MagnaPure (Roche)

EZ1

EZ1

Magna Compact

Outros sistemas automáticos