Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Métodos Celulares.

Prof.Doutor José Cabeda Imunologia

Métodos Celulares


Células Sanguíneas

Prof. Doutor José Cabeda Imunologia

MacrofagosMonócitos

NeutrófilosPMN

Eosinófilos

Basófilos

Linfócitos

plaquetas

eritrócitos

Células do S.I.

Outras células do Sangue

T

B

NK

CD4

CD8


Purificação de células do sistema Imunológico


Cell Separation Technologies

CentrifugationCentrifugation : Density : Density FiltrationFiltration : Size : Size Flow Cytometry (FACS)Flow Cytometry (FACS)

SizeSize Granularity Granularity Fluorescence Fluorescence

Batch affinity systemsBatch affinity systems : antibody, avidin-biotin : antibody, avidin-biotin Batch magnetic systemsBatch magnetic systems

Paramagnetic differenceParamagnetic difference


Separação em gradiente de densidade

Numa centrifugação sedimentam primeiro as Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas mais densas, que por sua vez impedem partículas mais densas, que por sua vez impedem as menos densas de sedimentaras menos densas de sedimentar

Ficol: polisacarideo Ficol: polisacarideo Agrega eritrócitos tornando-os mais densosAgrega eritrócitos tornando-os mais densos

Metrizamida (composto denso contendo iodo)Metrizamida (composto denso contendo iodo) Densidade ajustável em função da concentraçãoDensidade ajustável em função da concentração


Separação em Gradiente descontínuo de densidade

density

Ficoll-hypaque

PBMC

Soroplaquetas


Separação em gradiente contínuo de densidade (II)


Separação Imunomagnética


Two-StepLabeling

One-StepLabeling

Immunomagnetic Labeling of Cells

Cell

Magnetic bead

Target antigen

FITC

Antibody (IgG)

Cell

PBL

HER-2/neu


Paramagnetic particles Large sizeLarge size

1 to 5 um in diameter1 to 5 um in diameter

Magnetic susceptibility Magnetic susceptibility of a cell: High of a cell: High

Small number of beads Small number of beads per cellper cell 1- 10 beads/cell1- 10 beads/cell

Commercially availableCommercially available


Paramagnetic colloidal beads

Colloidal sizeColloidal size 50 to 200 nm50 to 200 nm Spread in solution Spread in solution

(Brownian Motion)(Brownian Motion)

Magnetic susceptibility of a Magnetic susceptibility of a cell: Low cell: Low

Large number of beads per cellLarge number of beads per cell 100 - 100,000 beads/cell100 - 100,000 beads/cell


Molecular Magnetic Labeling Erbium ion (ErErbium ion (Er3+3+))

Paramagnetic ionParamagnetic ion High atomic magnetic dipole momentHigh atomic magnetic dipole moment Ionic binding to the cell surfaceIonic binding to the cell surface

Ferritin Ferritin Paramagnetic proteinParamagnetic protein Hollow protein shell (13 nm)Hollow protein shell (13 nm) Deposition of FeDeposition of Fe22OO3 3 the cavity (7 nm)the cavity (7 nm)


Magnetic Labeling

Paramagnetic

particle

Paramagnetic

colloidal beads

Molecular

magnetic labels

Size 1 – 5 µm 50-200 nm < 15 nm

Cell's magnetic

susceptibilityHigh Medium Low

Labeling

methodImmunological Immunological

Ionic

Immunological

Number per cell 1 - 10 100 - 100,000 > 100,000 ?

Commercially

availableYes Yes No


Cell Separation Based on Antigen Expression Level

Antigen Expression LevelF

ract

ion

(-)

Antigen Expression Level

Fra

ctio

n (

-)


MACS® Cell separation system

Magnet

magnetic cellnon-magnetic cell

Plunger

Remove the magnet

Unlabeled cells

Immunomagnetically labeled cells

Separationcolumn


HG4100® Cell Separation system

ResuspensionAspirationIncubation

magnetic cellnon-magnetic cell


Quadrupole Magnetic Flow Sorter (QMS)

Cell feed CarrierCarrier

QMS

ba

Waste

a’ b’

NS

a’b’

ab

v

Outlet flow splitter

Inlet flow splitter

Core rod

Ma

gn

et

Ma

gn

et

Unlabeled cellLabeled cell

Cell feed CarrierCarrier

QMS

ba

Waste

a’ b’

NS

a’b’

ab

v

Outlet flow splitter

Inlet flow splitter

Core rod

Ma

gn

et

Ma

gn

et

Unlabeled cellLabeled cell


High Gradient Magnetic Separator (HGMS)

Separator MACS HG4100 QMS

OperationSemi-flow-

throughBatch Flow-through

Holding

material

Iron spheres

or wiresTest tube wall N/A

Cell

accumulationYes Yes No

Applicable

cell size

Narrow

(small cells)Middle Wide

Flow control No N/A Yes


Cell Separation by the QMS

-

-

--

-

--

--

----

--

--

-

+

+ ----

--

++

++

--

-

+

+

----

--

+

+

+ +

+

+ +

+

Fm

a' b'

a bA

xial

Sym

met

ry

MA

GN

ETFm

a' b'

a bA

xial

Sym

met

ry

MA

GN

ET


Lymphocyte cell separation by the QMS

6%

38%

96%

CD4+ cells

38%26%

6%12% 99%

CD8+ cells

a b a b

Feed Feed


CD34 cell isolation by the QMS

0.67%

0.02%

88.5%

Feed

b

a

Total cell load = 2 x108 cells; CD34 cell recovery = 81%; Throughput = 1.75 x 105 cells/s


Colony Formation from CD34+ Cells

CFU-GMBFU-E

CFU-Mix

CD34+ cells

(immature)


PANNING

Aderência celular a uma superfície sólidaAderência celular a uma superfície sólida Monócitos e macrófagos são naturalmente Monócitos e macrófagos são naturalmente

aderentesaderentes Outras células podem aderir se a superfície Outras células podem aderir se a superfície

estiver conjugada com anticorpos estiver conjugada com anticorpos apropriadosapropriadosPanning directoPanning directoPanning indirectoPanning indirecto


Purificação positiva e negativa

Purificação PositivaPurificação Positiva PanningPanning Imuno-separação magnéticaImuno-separação magnética Centrifugação gradiente densidadeCentrifugação gradiente densidade Centrifugal elutriationCentrifugal elutriation Formação de rosetasFormação de rosetas Citometria de FluxoCitometria de Fluxo

Purificação NegativaPurificação Negativa Todos os anterioresTodos os anteriores Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complementoCitotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento


Rosetas

Nos anos 70Nos anos 70 Linfócitos T formam rosetas com SRBCLinfócitos T formam rosetas com SRBC

Melhor rendimento se:Melhor rendimento se:• SRBC tratados c/ neuraminidaseSRBC tratados c/ neuraminidase• SRBC tratados c/ AET SRBC tratados c/ AET

(2-aminoethylisothiouronium bromide)(2-aminoethylisothiouronium bromide) Método barato mas pouco prático e de baixo Método barato mas pouco prático e de baixo

rendimentorendimento


Método de lise mediada pelo complemento

Selecção negativa de célulasSelecção negativa de células Passos:Passos:

Marcação das células a eliminar c/ anticorposMarcação das células a eliminar c/ anticorpos Indução da lise celular c/ complemento de Indução da lise celular c/ complemento de

coelhocoelho


Selecção negativa c/ L-LME

L-Leucine methyl Ester (L-LME) é metabolizado L-Leucine methyl Ester (L-LME) é metabolizado nos lisosomas originando um metabolito tóxiconos lisosomas originando um metabolito tóxico

Colocando as células em contacto c/ L-LME, os Colocando as células em contacto c/ L-LME, os monócitos e NK são destruídosmonócitos e NK são destruídos

Separar as células mortas com lymphoprepSeparar as células mortas com lymphoprep


Isolamento de linfócitos de orgãos linfóides secundários As células estão fracamente agregadasAs células estão fracamente agregadas São separáveis por acção mecânicaSão separáveis por acção mecânica

Forçar o tecido a passar repetidamente Forçar o tecido a passar repetidamente por uma malha de aço finopor uma malha de aço fino

Utilizar a suspensão celular obtida, Utilizar a suspensão celular obtida, depois de purificada por lymphoprepdepois de purificada por lymphoprep

Descartar os restos de tecido Descartar os restos de tecido


Análise de Células


Estudo de populações celulares por Citometria de fluxo

Utilização de CD14/CD45 para definir a Utilização de CD14/CD45 para definir a população de linfócitospopulação de linfócitos


Efeito de um “gating” correcto


Estudo de activação linfocitária (I) Método de ActivaçãoMétodo de Activação

Antigénio especifico Antigénio especifico pouco útil para culturas de linfócitos humanospouco útil para culturas de linfócitos humanos Requer activação in vitro para enriquecimento prévioRequer activação in vitro para enriquecimento prévio

MitogénioMitogénio Concanavalina A (ConA)Concanavalina A (ConA) Phytohemaglutinina (PHA)Phytohemaglutinina (PHA) Proteina A de staphylococcusProteina A de staphylococcus Pokweed mitogenPokweed mitogen

Anticorpos / InterleuquinasAnticorpos / InterleuquinasCélulas T• CD3• CD2• CD28• TCR

Células B• IgM• CD20

T+B•Ionoforo A23187•Ionomicina•Ester de forbol•IL-2•IL-4


Estudo de activação linfocitária (II)

RadioactividadeRadioactividade 33H-dTTP (H-dTTP (Incorpora-se no DNA em cada divisão)Incorpora-se no DNA em cada divisão)

Bromo desoxi-uridina (BrdU)Bromo desoxi-uridina (BrdU) Incorpora-se no DNA em cada divisãoIncorpora-se no DNA em cada divisão É Fluorescente É Fluorescente Detectável por Citometria de fluxo Detectável por Citometria de fluxo

Medida da [CaMedida da [Ca2+2+] intracelular] intracelular O Ca é um dos primeiros mensageiros secundários da O Ca é um dos primeiros mensageiros secundários da

activação celularactivação celular


Medida da actividade citotoxica Incubação das células alvo (linhas tumorais) com Incubação das células alvo (linhas tumorais) com

5151CrCr Se o estudo for de ADCC (antibody dependent cell Se o estudo for de ADCC (antibody dependent cell

mediated citotoxicity) as células alvo devem estar mediated citotoxicity) as células alvo devem estar sensitizadas com anticorposensitizadas com anticorpo

Incubação das células alvo com as NK/LAKIncubação das células alvo com as NK/LAK Medida da radioactividade libertada no Medida da radioactividade libertada no

sobrenadante da culturasobrenadante da cultura

%100% xbc

balise

a=lise experimental cpm (efector + alvo)b=lise espontânea cpm (meio+alvo)c=lise máxima (SDS+alvo)

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