Prof.Doutor José Cabeda

Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica

Técnicas de estudo de mutações Técnicas de estudo de mutações desconhecidasdesconhecidas

Técnicas de estudo de mutações desconhecidas

Métodos Baseados No TmMétodos Baseados No Tm Melting Profiles and GC clampsMelting Profiles and GC clamps DGGEDGGE

• PerpendicularPerpendicular• ParaleloParalelo

CDGECDGE TTGETTGE

Métodos Baseados na conformaçãoMétodos Baseados na conformação SSCPSSCP HAHA CSGECSGE

“Melting Profiles”

Vários domínios de fusãoVários domínios de fusão As moléculas de DNA fundem por etapasAs moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gelMoléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu PmMoléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão totalPodem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Gradiente de desnaturaçãoGradiente de desnaturação QuímicoQuímico TemperaturaTemperatura

O gradiente pode ser:O gradiente pode ser: Perpendicular ao Perpendicular ao

campo eléctricocampo eléctrico Paralelo ao campo Paralelo ao campo

eléctricoeléctrico

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

heteroduplexes

homoduplexes

Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)

Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)

Não existe um gradiente no gel, Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corridaem cada momento da corrida

Existe uma temperatura Existe uma temperatura crescente ao longo da corridacrescente ao longo da corrida

Em cada momento, a migração Em cada momento, a migração em cada molécula depende de em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não esta já ter atingido ou não algum domínio de fusãoalgum domínio de fusão

Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)

VantagensVantagens

Mais fácil de fazer os Mais fácil de fazer os geisgeis

Mais reprodutível de Mais reprodutível de gel para gelgel para gel

DesvantagensDesvantagens

Mais difícil de acertar Mais difícil de acertar a gama de Tma gama de Tm

HR-1

High Resolution MelterHigh Resolution Melter 0.01ºC/s a 1ºC/s0.01ºC/s a 1ºC/s Tambiente a 100ºCTambiente a 100ºC 24bit Fluorescence24bit Fluorescence 24bit Temperature24bit Temperature 5-20µL Volume5-20µL Volume 40-45 amostras/h (0.3ºC/s)40-45 amostras/h (0.3ºC/s)

LCGreen ILCGreen I Excitação a 440-470nm Excitação a 440-470nm Emissão a 470-520 nmEmissão a 470-520 nm

HR-1

Métodos baseados na conformação Conformação do dsDNAConformação do dsDNA

não depende da sequêncianão depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da A conformação de homodupletos é diferente da

dos heterodupletosdos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da A conformação dos heterodupletos depende da

sequencia de “mismatch”sequencia de “mismatch” Conformação do ssDNA Conformação do ssDNA

depende da sequência (forma zonas de dupleto depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)intramolécular, dependentes da sequência)

Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) dsDNA é desnaturadodsDNA é desnaturado dsDNA é diluidodsDNA é diluido Renaturação rápidaRenaturação rápida Corrida em condições semi-Corrida em condições semi-

desnaturantes e a temperaturas desnaturantes e a temperaturas fixasfixas

Resultado depende muito de:Resultado depende muito de: Temperatura de corridaTemperatura de corrida Concentração de desnaturanteConcentração de desnaturante Presença de certos químicos Presença de certos químicos

(ex: glicerol, etc)(ex: glicerol, etc)

WT1

WT2

mutantes

Heteroduplex Analysis (HA)

Heterodupletos causam Heterodupletos causam Distorção na conformaçãoDistorção na conformação Migração no gel mais lentaMigração no gel mais lenta

Heterodupletos podem existir por:Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotosCo-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCRIntrodução de DNA WT e M no mesmo PCR

Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+MWT+M

Heteroduplex Analysis (HA)

Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp)Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou

DEM) aumenta a sensibilidade da HADEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente

semi-desnaturante que aumenta a resolução do semi-desnaturante que aumenta a resolução do HAHA

Conformation Sensitive Gel Electrophoresis Principio:Principio:

Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais.conformacionais.

Método:Método: Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina

e 100% PEG e 15% formamida (desnaturante)e 100% PEG e 15% formamida (desnaturante) Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”, Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”,

aumentando a força do gel e tamanho dos seus porosaumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Utilizar fragmentos com 300-800 bpUtilizar fragmentos com 300-800 bp

DHPLC

Coluna HidrofóbicaColuna Hidrofóbica Interacção entre coluna e DNA efectuado pelo Interacção entre coluna e DNA efectuado pelo

Acetato de Trietilamónio (TEEA)Acetato de Trietilamónio (TEEA) Libertação da retenção efectuada por um gradiente Libertação da retenção efectuada por um gradiente

crescente de Acetonitrilo (ACN)crescente de Acetonitrilo (ACN) ssDNA menos retido que dsDNAssDNA menos retido que dsDNA

DHPLC

Perfil de utilização dos Tampões

BRCA1

Transgenomics DHPLC Wave Systems

3500 4000Plus

3500HTMicrobial

Hibridização

desnaturar

Hibridização

Adicionar sonda

Hibridização

Hibridização

Dot-Blot

Variações

Hibridização em microplacaHibridização em microplaca hibridização reversahibridização reversa

DEIA

(hibridização reversa em microplaca)(detecção com anti-dsDNA)

Inno-Lippa

Hibridização em filtroHibridização em filtro Várias sondas por filtro dispostas em tiras Várias sondas por filtro dispostas em tiras

(tipo código de barras)(tipo código de barras) Hibridização reversaHibridização reversa Marcação no produto do PCRMarcação no produto do PCR

Resultados do INNO-LIPA

MEIA

MEIA

                                        

                

                                        

        

Southern Blot

Northern Blot

Semelhante ao SouthernSemelhante ao Southern Utiliza RNA e não DNAUtiliza RNA e não DNA Não utiliza reacções de restriçãoNão utiliza reacções de restrição

Hibridização em microchip

Miniaturização de um Miniaturização de um dot-blotdot-blot

Densidade variávelDensidade variável Hibridização Hibridização

automáticaautomática Leitura automáticaLeitura automática

Hibridização em microchip:procedimento

Hibridização em Microchip:Staph-A (1)

Hibridização em Microchip:Staph-A (II)

Hibridização em Microchip:Coagucheck

Marcadores para factores de risco de tromboseMarcadores para factores de risco de trombose