Post on 04-Jul-2015
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 0
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Universidade do Minho
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Teste de Actividade da Catalase em
Alimentos
Docente: Luís Abrunhosa
Data do início da elaboração do trabalho: 26 Outubro 2010
Data do fim do trabalho: 2 Novembro 2010
Data de entrega do relatório: 12 Novembro 2010
Autores:
Duarte Filipe da Silva Martins 52497
Paulo Jorge Teixeira Freitas 52516
Sofia Alexandra Araújo Pereira 52530
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 1
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Sumário
Este trabalho teve como objectivo principal a extracção de catalase da polpa da batata
vermelha e o estudo do efeito da concentração de catalase, do substrato peróxido de
hidrogénio, da temperatura e do tempo na actividade e estabilidade enzimática. A extracção
desta enzima foi efectuada por trituração do tecido da batata sendo o extracto-mãe obtido,
homogeneizado em tampão Tris-HCl, a uma temperatura de 4ºC durante 30 minutos e
preservado num banho frio de forma a minimizar a desnaturação da enzima em questão.
De forma a determinar os efeitos da concentração de enzima, da concentração de
substrato, da temperatura e do tempo na velocidade de reacção, utilizaram-se discos de papel
de filtro humedecidos em diferentes concentrações extracto-mãe (0%, 20%, 40%, 60%, 80% e
100% v/v) para a primeira situação, e com mesma concentração de extracto-mãe (100%) para
as restantes situações. Estes discos foram colocados no fundo de tubos de ensaio contendo
diferentes concentrações de substrato (0%, 0,2%, 0,5%, 0,8%, 1%, 3%, 6% e 10% v/v) quando
se pretendeu determinar o efeito da concentração de substrato e uma concentração fixa de
substrato de 3% v/v para a determinação dos outros efeitos pretendidos. Assim, a velocidade
de reacção do disco é equivalente à divisão da distância que o disco percorre pelo tempo que
este demora a percorrê-la.
Quanto ao efeito das concentrações de enzima e de substrato na actividade enzimática
da catalase concluiu-se que, com o aumento destas concentrações, a velocidade dos discos
aumenta. Concluiu-se precisamente o oposto para o efeito da temperatura de operação na
actividade da enzima, uma vez que, a sua actividade diminuiu com o aumento da temperatura.
Verificou-se ainda que o tempo que as amostras de extracto-mãe permaneceram a 4 e
20 ºC não teve uma influência significativa na actividade enzimática da catalase, ao contrário
do que aconteceu para a temperatura de 50 ºC, na qual, após um período de tempo definido, a
catalase foi inactivada.
Em relação aos parâmetros cinéticos da catalase obtiveram-se, pela linearização da
equação de Michaelis-Menten, valores de 0,55±0,52cm.s-1 e 3,16±3,83g.mL-1, para vmáx. e Km
respectivamente e, utilizando um ajuste não-linear um valor de vmáx. de 1,79±1,71cm.s-1 e de
Km 18,00±3,79g.mL-1.
Palavras-Chave: Catalase; Batata; Concentração; Temperatura; Tempo; Peróxido de
Hidrogénio; Cinética.
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 2
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Índice
1. Introdução ................................................................................................................................. 1
1.1 Enzima e cinética enzimática .............................................................................................. 1
1.2 Catalase: estrutura, propriedades e funções. ..................................................................... 3
1.2.1 Mecanismo Molecular .................................................................................................. 4
1.2.2 Decoberta e História .................................................................................................... 5
2. Materiais e Métodos ................................................................................................................. 6
3. Resultados e Discussão ............................................................................................................. 6
3.1 Factores que afectam a actividade da catalase .................................................................. 6
3.1.1 Efeito da concentração do substrato na actividade enzimática .................................. 6
3.1.2 Efeito da concentração da catalase na actividade enzimática ..................................... 8
3.1.3 Efeito da temperatura na actividade enzimática ......................................................... 9
3.1.4 Efeito do tempo de reacção na actividade enzimática .............................................. 12
3.2 Estudo da cinética enzimática ........................................................................................... 13
3.2.1 Parâmetros cinéticos .................................................................................................. 13
4. Conclusão e Recomendações .................................................................................................. 16
5. Bibliografia .............................................................................................................................. 17
6. Anexos ..................................................................................................................................... 19
6.1 Exemplos de Cálculo .......................................................................................................... 19
6.2 Tabelas de Valores ............................................................................................................ 20
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 1
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
1. Introdução
Este trabalho teve como objectivo principal a extracção de catalase da polpa
da batata vermelha e o estudo do efeito da concentração de catalase, do substrato
peróxido de hidrogénio, da temperatura e do tempo na actividade e estabilidade
enzimática. A batata foi escolhida como fonte de catalase devido ao facto de ser rica
nesta enzima e ser um material biológico de fácil aquisição.
1.1 Enzima e cinética enzimática
Enzimas são catalisadores biológicos formados por longas cadeias de pequenas
moléculas denominadas aminoácidos. São portanto, um tipo de proteína com
actividade catalítica, sendo encontradas na natureza em todos os seres vivos. A sua
função é viabilizar a actividade das células, quebrando moléculas ou juntando-as para
formar novos compostos. Entende-se por cinética enzimática a análise quantitativa do
efeito de cada um dos factores que influenciam a actividade enzimática avaliada
através do aumento ou redução da velocidade da reacção catalisada (Junior e Pereira,
2001). Como catalisadores, as enzimas têm propriedades características:
Aceleram as reacções químicas sem se consumirem no processo;
Não alteram a posição de equilíbrio das reacções, fazendo apenas com que ele
se atinja de forma mais rápida;
Uma pequena quantidade de enzima catalisa um grande número de reacções,
regenerando-se indefinidamente;
São específicas para cada reacção, ou seja, actuam sobre um substrato
específico.
A cinética enzimática foi estudada pela primeira vez por Leonor Michaelis e
Maud Menten, em 1913, e propuseram um mecanismo para as reacções catalisadas
enzimaticamente. As suas concepções foram baseadas nos factos observáveis quando
um substrato sofre uma transformação sob a acção catalítica de uma enzima.
Consideraram que a conversão de um substrato (S), não é directa mas mediada por um
primeiro passo reversível cujo equilíbrio está apresentado na figura 1.
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 2
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Figura 1. Etapas baseadas no mecanismo de Michaelis-Menten, segundo as quais se processa uma reacção enzimática (Cabral et al., 2003).
Esta reacção inicia-se com a ligação do substrato ao centro activo da enzima,
formando o complexo enzima-substrato (ES). No segundo passo, praticamente
irreversível e limitante da velocidade global, ocorre a dissociação deste complexo
intermediário em produto com a libertação da molécula de enzima . Pela análise
dos dois equilíbrios, Michaelis e Menten chegaram aos parâmetros cinéticos que lhes
permitiram caracterizar a reacção e obtenção de um modelo:
velocidade máxima da reacção que traduz a eficiência catalítica da
enzima;
constante de Michaelis-Menten que traduz a afinidade da enzima pelo
substrato;
turnover number que indica o número máximo de moléculas que
a enzima converte em produto por unidade de tempo (Cabral et al., 2003).
O modelo proposto por Michaelis-Menten pode ser caracterizado pela equação 1
cuja representação gráfica se encontra apresentada pela figura 2.
Equação 1. Equação proposta por Michaelis-Menten (Cabral et al., 2003).
Figura 2. Representação gráfica de Michaelis-Menten (Junior e Pereira, 2001).
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 3
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Nem sempre é possível encontrar a velocidade máxima de reacção no estudo
da cinética enzimática, pois poderiam ser exigidas concentrações de substrato muito
elavadas, o que dificultava a sua obtenção. Este problema pode ser resolvido através
da inversão da equação de Michaelis-Menten (equação 2) como formulado por
Lineweaver-Burk (Marzzoco e Torres, 1999).
Equação 2. Linearização da equação de Michaelis-Menten segundo Lineweaver-Burk (Marzzoco e Torres, 1999).
1.2 Catalase: estrutura, propriedades e funções.
As reacções enzimáticas são muito importantes em alimentos, podendo ser
tanto benéficas, quanto prejudiciais. As enzimas catalase são exemplos de enzimas de
grande interesse na área alimentar.
A catalase foi uma das primeiras enzimas a serem purificadas até á
homogeneidade e tem sido objecto de intensos estudos. Das enzimas conhecidas, a
catalase está entre as mais eficientes, com taxas na ordem dos 20000 ciclos de reacção
catalíticos por segundo, por subunidade (perto do limite de difusão controlada). A
estrutura de diversas espécies de catalase tem sido estudada por difracção de raios X.
Embora seja claro que todas as catalases compartilham uma estrutura geral,
diferenciando no número e na identidade dos domínios (Boon et al., 2001).
A catalase (EC 1.11.1.6) é uma enzima que pertence à classe das Oxirredutases,
(catalisam reacções de transferência de electrões, ou seja reacções de oxidação-
redução), que usam o peróxido de hidrogénio como aceitador de electrões e também
como dador electrónico (Dourado e Abrunhosa, 2010). A catalase encontra-se
presente nos perixossomas de quase todas as células aeróbias protegendo estas de
efeitos tóxicos do peróxido de hidrogénio, que por catálise, é decomposto em oxigénio
e água, sem a formação de radicais livres (Boon et al., 2001). Uma molécula de
catalase pode converter milhões de moléculas de peróxido de hidrogénio em água e
oxigénio em segundos. A proteína é composta por um tetrâmero com quatro
subunidades idênticas. Cada monómero (cadeia polipeptídica) contém um grupo heme
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 4
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
no centro catalítico. Este grupo protético consiste num átomo de ferro complexado
com uma profirina (hemoproteina). Os monómeros de catalase de certas espécies (por
exemplo vacas) contêm também uma ligação forte de NADP por subunidade. Este
NADP pode proteger a enzima da oxidação do substrato H2O2 (Boon et al., 2001;
Dourado e Abrunhosa, 2010). O pH óptimo da catalase é aproximadamente 7
(Reference, 2010).
1.2.1 Mecanismo Molecular
A reacção catalisada pela catalase é numa reacção de dismutação, ou seja, o
substrato actua tanto como redutor como oxidante. O mecanismo de acção da catálise
ainda não é totalmente conhecido. No entanto, pensa-se que a reacção de hidrólise do
peróxido ocorra em duas etapas fundamentais, estando estas apresentadas na figura
3.
H2O2 + → H do Fe (III) - E2O + O=Fe (IV) - E (. +)
H2O2 + O=Fe (IV) - E (. +) → H2O + Fe (III) - E + O2
2 H2O2 → 2 H2O2 + O2
Figura 3. Mecanismo de reacção da hidrólise do peróxido de hidrogénio (Dourado e Abrunhosa, 2010).
O Fe()-E representa o ferro do grupo heme ligado á enzima. Fe(IV)-E(.+)é uma
forma mesomérica de Fe(V)-E, o que significa que o ferro não é completamente
oxidado a V, mas recebe algum “apoio electrónico” do ligante heme. Como o peróxido
de hidrogénio entra no sítio activo, este interage com os aminoácidos Asn147
(asparagina na posição 147) e His74, originando um protão (ião hidrogénio) utilizado
na transferência entre os átomos de oxigénio. O átomo de oxigénio livre rearranja-se,
libertando a molécula de água recém-formada e o Fe(IV)=O. Este último reage com
uma segunda molécula de peróxido de hidrogénio para recompor Fe(III)-E produzindo
água e oxigénio. A reactividade do ferro pode ser melhorada pela presença ligante
fenolato de Tyr357 na posição 5 do ferro, que pode ajudar na oxidação do Fe(III) a
Fe(IV). A eficiência da reacção também pode ser melhorada através de interacções de
His74 e Asn147 com intermediários de reacção. Em geral, a taxa de reacção pode ser
determinada pela equação de Michaelis-Menten.
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 5
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
A catalase também pode oxidar toxinas diferentes, tais como formaldeídos,
ácidos fórmicos, fenóis e álcoois. O mecanismo exacto desta reacção também não é
conhecido. Qualquer ião de metais pesados irá actuar como um inibidor não-
competitivo da catalase (Reference, 2010).
1.2.2 Descoberta e História
A catalase foi primeiramente descoberta como uma substancia em 1811
quando, Louis Jacques Thénard, que descobriu o peróxido de hidrogénio, sugeriu que a
sua decomposição era causada por uma substância. A actividade enzimática da
catalase foi descoberta em 1818 (Aebi e Suter, 1996). Só em 1901, Oscar Loew foi o
primeiro a atribuir-lhe o nome de catalase detectando a sua presença em muitas
plantas e animais, e também sugerido, que a substancia catalase seria uma enzima que
possuía ferro na sua estrutura pois quando reagia com cianeto era inibida (Warburg,
1923). Em 1937 a catalase de fígado bovino foi cristalizada por James B. Sumner e o
seu peso molecular foi estudado em 1938. Em 1969 a sequência de aminoácidos da
catalase bovina foi estudada. Foi em 1981 que a estrutura da proteína foi revelada
(Reference, 2010).
1.2.3 Aplicações humanas
A catalase é usada na indústria alimentar como forma de remoção, por
exemplo, do peróxido de hidrogénio do leite na produção de queijo. Outro uso está
relacionado com a embalagem dos alimentos evitando deste modo a oxidação destes.
Também é usada na indústria têxtil na remoção do peróxido de hidrogénio de tecidos
com o intuito de garantir que o material seja isento de peróxidos. É utilizada na higiene
das lentes de contacto. As lentes são desinfectadas com produtos de limpeza que
contêm uma solução de peróxido de hidrogénio. Uma solução contendo catalase é
depois utilizada na decomposição deste antes que as lentes possam ser novamente
utilizadas. Recentemente, a catalase começou a ser utilizada na indústria estética em
tratamentos de máscara combinada com peróxido de hidrogénio sobre a face, com a
intenção de aumentar a oxigenação celular das camadas superiores da epiderme
(Reference, 2010)
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 6
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
2. Materiais e Métodos
A actividade experimental foi efectuada de acordo com o protocolo
experimental cedido pelos docentes, utilizando uma batata vermelha (Dourado e
Abrunhosa, 2010). De referir que durante toda a actividade foi utilizada como
referência, uma altura de 7cm e 10 mL de peróxido de hidrogénio, na determinação
dos tempos de emersão dos discos.
3. Resultados e Discussão
3.1 Factores que afectam a actividade da catalase
O objectivo era verificar se as diferentes condições metabólicas (concentração
do substrato, da concentração do extracto enzimático, da temperatura e do tempo de
reacção) em que o extracto de batata se encontrava provocariam alterações na
actividade de catalase. Todos os resultados apresentados nas figuras seguintes são a
média de dois ensaios em duplicado realizados, com os respectivos erros associados.
Note-se ainda que, durante a análise experimental, a actividade enzimática foi
avaliada através da velocidade média dos discos humedecidos em extracto de batata,
durante o seu regresso à superfície nas soluções de peróxido de hidrogénio.
3.1.1 Efeito da concentração do substrato na actividade enzimática
A principal função da catalase nas células é prevenir a acumulação de peróxido
de hidrogénio a níveis tóxicos. Na verdade, sempre que a catalase é adicionada ao
peróxido de hidrogénio, este é imediatamente degradado em água e oxigénio (Brito,
2006). Na figura 4 observa-se o resultado dessa acção catalítica da enzima em soluções
com diferentes concentrações desse substrato: 0%, 0,2%, 0,5%, 0,8%, 1%, 3%, 6% e
10%.
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 7
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Figura 4. Efeito da concentração percentual de peróxido de hidrogénio ([H2O2]) na velocidade de emersão dos discos (vdisco).
A representação gráfica apresenta um aspecto crescente no sentido em que a
velocidade de emersão dos discos humedecidos com extracto enzimático aumenta
com o aumento da concentração de substrato na solução, até um máximo de
0,82±0,03cm.s-1 correspondente à catalise de 10% substrato (tabela 4, anexos). Nota-
se ainda que, existe uma inflexão da curva para concentrações acima de 1% de
peróxido de hidrogénio.
O que aconteceu foi que a reacção catalítica terá sido mais lenta em
concentrações de substrato menores e, por isso, foi maior o tempo que os pequenos
discos demoraram a acumular oxigénio suficiente para flutuar, nesses casos. Na
solução onde existia apenas Tris-HCl (correspondente ao ponto 0% em peróxido de
hidrogénio na figura 4), não ocorreu reacção catalítica, precisamente devido à
inexistência de substrato em solução, não sendo por isso libertado oxigénio. Dessa
forma, o disco não flutuou e não foi registado qualquer valor de velocidade.
Os resultados encontram-se em conformidade com o esperado, uma vez que,
com o aumento da concentração de peróxido de hidrogénio, aumentam as hipóteses
as moléculas de substrato “encontrarem” uma molécula de catalase, no mesmo
espaço de tempo. Isto é provocado pelo movimento térmico aleatório de peróxido de
hidrogénio e, admitindo que todas as moléculas de substrato se movem a velocidades
semelhantes (Campos, 2002).
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 2 4 6 8 10 12
v dis
co(c
m.s
-1)
[H2O2] (% v/v)
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 8
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Além disso, sendo a catalase uma molécula tetramérica, constituída por quatro
cadeias polipeptídicas com quatro grupos prostéticos hema com Fe(III) nos locais
activos da enzima que se oxida a Fe(IV) (Kimbrough et al., 1997) então, é esperado que
a velocidade de reacção aumente com a concentração do substrato até ao momento
em que todos os locais activos da enzima se encontram ocupados (Brito, 2006).
Observa-se, por fim, que a concentração de peróxido de hidrogénio não chega
a ser inibitória para a catalase pois nunca se verifica a diminuição da velocidade de
degradação do peróxido.
Na literatura, foi estudado o mesmo factor a influenciar a actividade da
catalase. O autor obteve o extracto enzimático por homogeneização (50g
batata/250mL de tampão fosfato) e determinou a velocidade de reacção em função de
concentrações de peróxido de hidrogénio (0,1%, 0,2%, 0,5%, 0,8%, 1%, 5% e 10%)
semelhantes às utilizadas neste protocolo. Tal como neste trabalho, verificou-se um
aumento da actividade da enzima com o aumento da concentração do substrato
(Brito, 2006).
3.1.2 Efeito da concentração da catalase na actividade enzimática
A partir da concentração de enzima obtida após trituração de 100g de batata
foram realizadas várias diluições do extracto enzimático: 0%, 20%, 40%, 60%, 80% e
100%. Conforme se vê na figura 5, a velocidade da reacção pode também ser afectada
pela concentração de enzima no extracto.
Figura 5. Efeito da concentração do extracto enzimático ([Extracto-Mãe]) na velocidade de emersão dos discos (vdisco).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0 20 40 60 80 100 120
v dis
co(c
m.s
-1)
[Extrato-Mãe] (% v/v)
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 9
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
A curva apresentada na figura 5 permite constatar que a velocidade de reacção
aumenta com o aumento da concentração da enzima, até um valor máximo de
2,80±0,11cm.s-1 (tabela 3, anexos) correspondente à catalise com o extracto obtido
directamente da batata (100%).
O comportamento observado é lógico, visto que, quanto mais enzima estiver
presente nos discos, maior é a quantidade de substrato que pode ser degradado
enzimaticamente pois existem mais locais activos da enzima disponíveis para se
ligarem ao peróxido de hidrogénio e fazer a sua conversão em água e oxigénio (Brito,
2006).
Os maiores teores de enzima permitiram-lhe decompor mais peróxido de
hidrogénio, libertando mais oxigénio sob a forma de gás, e levando a uma flutuação
mais rápida dos discos. Consequentemente, a velocidade de reacção foi maior nesses
casos.
Durante este estudo, foi ainda usado um controlo: disco humedecido em Tris-
HCl sem catalase (correspondente ao ponto 0% em extracto-mãe na figura 5). Como
não havia enzima para degradar o substrato, não se formou oxigénio que fizesse com
que o disco de papel de filtro subisse, não sendo considerado valor de velocidade.
Na literatura, foi observada a mesma relação entre a actividade de catalase da
batata e a sua concentração, na medida em que uma aumenta com o aumento da
outra (Brito, 2006).
3.1.3 Efeito da temperatura na actividade enzimática
Amostras de extracto enzimático foram colocados às diferentes temperaturas a
testar (4ºC, 20ºC, 50ºC, 80ºC) e os resultados estão apresentados na figura 6.
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 10
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Figura 6. Efeito da temperatura (T) na velocidade de emersão dos discos (vdisco), em dois tempos diferentes de reacção.
De acordo com a figura 6, pode-se dizer que a velocidade média de emersão
dos discos diminuiu sempre com o aumento da temperatura de reacção, como está
evidente no aspecto decrescente das duas curvas.
Podem-se discutir três fases principais:
* no instante inicial da reacção (curva tracejada a preto), a velocidade dos
discos máxima foi atingida à temperatura de reacção mais baixa testada (4 ºC). Essa
velocidade de reacção mostrou-se ser muito superior relativamente ao ensaio à
temperatura ambiente (20ºC) e relativamente ao ensaio em que se aqueceu o ensaio
extracto enzimático até 50 ºC (tabela 5, anexos).
Foi ainda efectuado um ensaio a 80 ºC mas, depois de humedecer o disco com
catalase a essa temperatura, ele permaneceu imóvel na solução, não sendo detectada
velocidade.
* depois de o extracto enzimático permanecer durante 10 minutos à mesma
temperatura (curva tracejada a cinzento), a velocidade de reacção continuou a
apresentar o valor máximo para a temperatura de reacção igual a 4ºC, e, muito
superior à velocidade observada a 20ºC (tabela 5, anexos).
O disco voltou a não se deslocar na solução a 80ºC mas, ao contrário do ensaio
no instante inicial, o disco deixou de apresentar qualquer movimento de deslocação à
temperatura de 50ºC.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0 20 40 60 80
v dis
co(c
m.s
-1)
T (ºC)
tempo zero
após 10 minutos
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 11
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
* não se observaram diferenças significativas no efeito da temperatura na
actividade da catalase entre o instante inicial da estabilização da temperatura
pretendida e o fim dos 10 minutos a essa temperatura, com a excepção da perda de
acção catalítica depois de o extracto enzimático permanecer 10 minutos a 50ºC.
Na verdade, o que foi observado ficou muito aquém no esperado, uma vez que,
conforme foi observado por Marques (2004), a baixas temperaturas existe uma menor
cinética das moléculas, uma menor probabilidade de ocorrerem colisões devidamente
orientadas e também uma maior rigidez estrutural das unidades enzimáticas, pelo que
a decomposição do peróxido de hidrogénio seria mais lenta. A actividade máxima da
catalase a 4ºC obtida neste estudo, não se assemelha, de todo, ao publicado.
Além disso, deveria ter-se verificado que o aumento da temperatura
aumentaria a velocidade de reacção porque a energia livre das moléculas também
aumentaria, isto é, as moléculas (de enzima e de substrato) mover-se-iam mais
rapidamente e a probabilidade de se encontrarem aumentaria também (Brito, 2006).
Neste estudo, a constante diminuição da velocidade de reacção (vdisco) com a
temperatura é inesperada. De acordo com NZIFST (2010), a temperatura óptima de
acção da catalase da batata é 30ºC, a partir da qual a enzima começa a perder
actividade. Por isso, para temperaturas inferiores à temperatura óptima, a reacção
deveria ocorrer mais lentamente (menor temperatura implica um menor movimento
das moléculas e uma maior dificuldade para que a reacção ocorra).
Encontra-se ainda publicado na literatura, que a temperatura da completa
inactivação/desnaturação da catalase da batata é de 55ºC (NZIFST, 2010) pelo que é
confirmado o facto de a velocidade dos discos ser mais reduzida para a temperatura
de 50ºC em relação à temperatura de 20 ºC e de não haver qualquer resultado nos
testes para a temperatura de 80ºC. O que acontece é que o aumento da temperatura
acima do valor da temperatura de desnaturação afecta consideravelmente a estrutura
terciária da enzima, bem como a estabilidade do complexo enzima-substrato (Taipa et
al., 2003).
Note-se que apesar da temperatura de inactivação total da catalase ser, como
foi dito acima, de 55ºC, pode ter havido desnaturação desta ao longo dos 10 minutos à
temperatura de 50ºC ou até mesmo ter havido um descuido do operador permitindo
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 12
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
que a temperatura atingisse os 55ºC levando assim à desnaturação/inactivação da
enzima e, consequentemente, à ausência de movimento do disco quando colocado
numa solução de peróxido de hidrogénio.
De referir que para as temperaturas de 50 e 80ºC as amostras adquiriram uma
textura gelatinosa sendo este aspecto intensificado quando se mantiverem as
amostras expostas a estas temperaturas ao longo de 10 minutos. O aparecimento
desta textura pode ser um factor que confirme a existência de desnaturação das
proteínas presentes nas amostras.
3.1.4 Efeito do tempo de reacção na actividade enzimática
O extracto enzimático foi colocado a diferentes temperaturas durante 10
minutos para se avaliar o efeito que o tempo teria na velocidade de reacção. Foi
medida a actividade da catalase no instante inicial e ao fim de 10 minutos em repouso.
Os resultados estão apresentados na figura 7.
Figura 7. Efeito do tempo de reacção (t) na velocidade de emersão dos discos (vdisco), em duas temperaturas diferentes de reacção.
Na representação gráfica apresentada na figura 7, está evidente que 10
minutos de reacção pouco afectam a actividade da catalase na catálise do peróxido de
hidrogénio, tanto a 4 como a 20ºC. No entanto, se se tivesse considerado um maior
período de tempo, verificar-se-ia uma redução dessa actividade.
Como já foi referido, no início da reacção as moléculas de enzima têm os seus
locais activos livres pelo que a reacção com o substrato é muito rápida e directamente
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
0 2 4 6 8 10
v dis
co(c
m.s
-1)
t (min)
4 ºC
20 ºC
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 13
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
proporcional à quantidade de enzima disponível (reacção de 1º ordem). Contudo,
conforme a enzima começa a estar com os seus centros activos ocupados pelo
substrato a velocidade de reacção começa a diminuir o que corresponde a uma
situação de saturação da enzima, e onde a velocidade de degradação de H2O2 por
unidade de tempo diminui e se torna constante – reacção de ordem zero (Brito, 2006).
Na literatura, Brito (2006) considerou 10 minutos de reacção. Em concordância
com a teoria mas contrariamente ao que foi obtido neste trabalho, ele verificou que,
para uma determinada quantidade de enzima e de substrato, a velocidade de emersão
dos discos aumentava com o aumento do tempo. Contudo esse aumento não foi
linear! A velocidade de reacção aumentou durante os primeiros minutos vindo a
decrescer a partir daí.
3.2 Estudo da cinética enzimática
Tirando partido de uma metodologia mais elaborada pretendeu-se chegar a
dados que experimentalmente comprovassem o que vem descrito classicamente nos
livros. Nomeadamente, pretendeu-se fazer um estudo da cinética enzimática com
determinação de parâmetros como o vmáx e o Km.
3.2.1 Parâmetros cinéticos
Através dos valores experimentais obtidos da velocidade de emersão dos discos
para diversas concentrações de peróxido de hidrogénio (figura 4), efectuou-se a
transformação da equação de Michaelis-Menten (equação 1) para uma forma linear
(recta do tipo y= ax+b), permitindo a determinação matamética dos parâmetros Km e
vmáx característicos da catalase. Esta inversão directa dos termos da equação de
Michaelis-Menten traduz a equação de Lineweaver-Burk (equação 2), cuja
representação gráfica está apresentada na figura 8.
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 14
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Figura 8. Linearização de Lineweaver-Burk relativa à actividade da catalase
A recta apresentada na figura 8 tem uma ordenada na origem igual a 1/vmáx e
um declive Km/vmáx. Esta representação permite uma boa estimativa de vmáx mas não
de Km; tem, ainda, a desvantagem de comprimir os pontos experimentais
correspondentes a concentrações elevadas de substrato numa pequena parte do
gráfico e dar ênfase aos pontos relativos a concentrações mais baixas (Taipa et al.,
2003).
Para ultrapassar as limitações provocadas pela linearização de Lineweaver-Burk
(compressão dos pontos referentes às concentrações mais elevadas de substrato)
recorreu-se a um ajuste não linear do modelo de Michaelis-Menten através do método
dos mínimos quadrados (figura 9), de forma a conseguir-se calcular valores de Km e
vMáx, semelhantes aos valores dos verdadeiros parâmetros cinéticos característicos da
catalase.
y = 5,7151x + 1,8079R² = 0,9406
0
5
10
15
20
25
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
1/v
0(s
.cm
-1)
1/[H2O2] (mL.g-1)
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 15
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Figura 9. Curva experimental (linha preta tracejada) das velocidades de reacção (vdisco) em função da concentração de substrato ([H2O2]) e ajuste não linear (linha cinzenta contínua) do
modelo de Michaelis-Menten pelo método dos mínimos quadrados.
O modelo de Michaelis-Menten mostrou-se eficiente para descrever o
comportamento cinético da catalase, visto que as curvas prática e teórica das figura 9
se encontram praticamente sobrepostas.
Os resultados da determinação dos parâmetros cinéticos através dos dois
métodos matemáticos encontram-se apresentados na tabela 1.
Tabela 1. Parâmetros cinéticos (vmáx e Km) da catalase obtidos pelo ajuste linear (Lineweaver-burk) e pelo ajuste não linear (mínimos quadrados) do método de Michaelis-Menten.
vmáx Km
(cm.s-1) ([H2O2] % v/v)
Ajuste linear Michaelis-Menten
Lineweaver-burk 0,55 ± 0,52 3,16 ± 3,83
Ajuste não linear Michaelis-Menten
Mínimos Quadrados 1,79 ± 1,71 18,00 ± 3,79
Por razões já mencionadas, os valores obtidos pelo ajuste dos mínimos
quadrados suportam menos erros associados e, por isso, tornam-se mais semelhantes
com a realidade. A partir dos resultados obtidos através dos dois modelos, pode
discutir-se que:
* o valor da velocidade máxima (vmáx) da reacção é inferior quando obtido pelo
ajuste linear de Lineweaver-burk. Curiosamente, ao visualizar a curva experimental da
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0
v dis
co(c
m.s
-1)
[H2O2] (g.mL-1)
Experimental
Michaelis-Menten
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 16
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
velocidade de emersão dos discos consoante a concentração de substrato
representada na figura 9, tem-se a percepção de que a velocidade máxima não
ultrapassa 0,9cm.s-1 mas, o valor obtido pelo ajuste não linear para vmáx é muito
superior e igual a 1,79 ± 1,71cm.s-1. Isto porque, a velocidade máxima desta reacção
traduz a eficiência catalítica da enzima catalase para o peróxido de hidrogénio, e
então, diz-se que este parâmetro cinético é uma característica própria da enzima para
aquele determinado substrato (Cabral et al., 2003). Independentemente de nesta
actividade experimental não se ter observado a velocidade máxima de reacção, ela
existe e é única. Se fossem considerados maiores concentrações de substrato, ter-se-ia
verificado esse valor de velocidade máxima com que a catalase degrada o peróxido de
hidrogénio.
* o valor da constante de Michaelis (Km) é igualmente superior quando obtido
pelo ajuste não linear. Este parâmetro relaciona-se com a constante de dissociação do
complexo intermediário ES e, quanto mais elevado é o seu valor, menor é a afinidade
enzima-substrato. Sabendo ainda que Km traduz o valor da concentração de substrato
necessário para que a catalase atinja metade da sua velocidade máxima de reacção, é
lógico aceitar que Km,MínimosQuadrados > Km,Lineweaver-burk porque vmáx,MínimosQuadrados >
vmáx,Lineweaver-burk.
4. Conclusão e Recomendações
Finalizada a actividade experimental, e a análise e discussão dos resultados
obtidos, conclui-se que a actividade da enzima aumenta com o aumento das
concentrações de substrato e enzima.
Conclui-se também que com o aumento da temperatura de operação, a actividade da
enzima diminui atingindo uma temperatura à qual esta desnatura não se verificando
qualquer actividade enzimática.
Para temperaturas reduzidas, o tempo não tem uma influência significativa na
actividade enzimática da catalase, ao contrário do que acontece para temperaturas
mais elevadas, que leva à perda da actividade da enzima.
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 17
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Os parâmetros cinéticos da catalase obtiveram-se pela linearização da equação
de Michaelis-Menten e pelo ajuste não-linear dos Mínimos Quadrados. Conclui-se que
o melhor método para obter a velocidade máxima da reacção foi o segundo.
Com vista à obtenção de resultados mais satisfatórios poder-se-ia proceder à
alteração de alguns aspectos protocolares nomeadamente no aumento da gama de
temperaturas utilizadas de modo a estudar o efeito da temperatura em intervalos mais
reduzidos; no aumento do tempo após a estabilização da temperatura pretendida
como forma de avaliar o seu efeito num período de tempo mais alargado; e no
aumento da concentração de peróxido de hidrogénio para permitir um estudo mais
correcto da cinética da reacção enzimática.
5. Bibliografia
Aebi, H., Suter, H., Acatalasemia, Electrophoresis, 17, 1710-1728, 1996.
Boon, E. M., Downs, A., Marcey, D., Catalase: H2O2 Oxiroreductase, 2001. Disponível
em.http://www.callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/cata
lase/frames/cattx.htm. Consultado em 1/11/2010.
Brito, A. M. R. C., O Oxigenio no Mundo Vivo: dos melhoramentos extraordinários aos
efeitos deletérios, Tese de Mestrado, Mestrado em Evolução e Origem da Vida, 2006.
Cabral, J. M. S., Aires-Barros, M. R., Gama, M., Engenharia Enzimática, Edições Lidel,
Lisboa, 2001.
Campos, L. S., Entender a Bioquímica, 3ª Edição, Escolar Editora, Lisboa, 2002.
Cantelli, C. L., Magoga, K. R., Seixas, F. A. V., Uma metodologia alternativa para as
aulas de cinética enzimática abordadas na disciplina de bioquímica, EDUCERE - Revista
da Educação, 7, 107-120, 2007.
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 18
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Dourado, F., Abrunhosa, L., Teste de actividade da catalase em alimentos, Protocolos
de Laboratórios de Tecnologias Alimentares – Trabalhos práticos, Departamento de
Engenharia Biológica, Universidade do Minho, 21-26, 2010.
Junior, A. F., Pereira, E. B., Enzimas e suas Aplicações: Cinética Enzimática,
Apontamentos de Engenharia Bioquímica, Departamento de Engenharia Química e
Engenharia Alimentar, Universidade Federal de Santa Catarina, 2001.
Kimbrough, D. R., Magoun, M. A., Langfur, M., A Laboratory Experiment Investigating
Different Aspects of Catalase Activity in an Inquiry – Based Approach, Journal of
Chemical Education, 74-210, 1997.
Marques, M., 14 Actividades Laboratoriais para o Ensino da Biologia, Porto Editora,
Porto, 2004.
Marzzoco, A., Torres, B. B., Bioquímica básica, Guanabara-Koogan, Rio de Janeiro,
1999.
NZIFST - New Zealand Institute of Food Science and Technology, 2010. Disponível em
http://www.nzifst.org.nz/careers/secondaryresources.asp. Consultado em
03/11/2010.
Reference, 2010. Disponível em http://www.reference.com/browse/catalase.
Consultado em 01/11/2010.
Taipa, M. A., Gama, M., Estrutura e função dos enzimas. In Cabral, J., Aires-Barros, M.
R., Gama, M., Engenharia enzimática, Edições Lidel, Lisboa, 13-66, 2003.
Warburg, O., Ueber die antikatalytische Wirkung der Blausaure, Biochem, 136, 266,
1923.
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 19
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
6. Anexos
6.1 Exemplos de Cálculo
Cálculo da Velocidade de Subida do Disco
Cálculo de vmáx. e Km – Ajuste não linear pelos Mínimos Quadrados
Para o cálculo das constantes cinéticas recorreu-se à ferramenta solver, do
programa Microsoft Excel 2007, fazendo-se um ajuste não linear com a utilização do
método dos mínimos quadrados.
O valor a ser minimizado neste método foi o resultado de
por alteração dos valores e .
em que, foi a velocidade obtida durante o
procedimento experimental e, é a velocidade dos discos estimada pela
equação de Michael-Menten (equação 1).
Note-se que os valores de foram expressos nas unidades ,
sendo para isso necessário multiplicar a percentagens de substrato
pela respectiva massa específica .
Cálculo de vmáx. e Km – Ajuste linear Lineweaver-burk
Para o cálculo destes parâmetros foi também necessária a multiplicação da
concentração de H2O2 pela sua massa específica, ρ, obtendo-se a concentração de
substrato em g.mL-1. Traçando um gráfico com os valores de 1/[H2O2] e 1/v0
representados na tabela 6, obtém-se uma recta que representa a equação 2, e está
apresentada na equação 3.
Equação 3. Equação da recta obtida pela representação dos valores de 1/v0 em função de 1/[H2O2].
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 20
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
6.2 Tabelas de Valores
Tabela 2. Valor da massa de batata utilizada na preparação do extracto-mãe rico em catalase e valor da distância percorrida pelos discos no interior dos tubos de ensaio.
mbatata (g) 100,13
dpercorrida pelos discos (cm) 7
Tabela 3. Valores dos tempos que os discos demoraram a percorrer a distância de 7 cm, para uma amostragem dupla, em função da concentração de extracto-mãe de catalase e
respectivos valores médios de tempo, valores de desvios-padrão e valores da velocidade dos discos no interior dos tubos de ensaio calculados através desses mesmos valores médios de tempo e valor de distância, sendo que para as concentrações de extracto-mãe nas quais os
discos não percorreram qualquer distância se representa por “-“.
tpara percorrer d (s)
[Extrato-Mãe]
(% v/v) Amostra 1 Amostra 2
tmédio,para
percorrer d (s)
Desvio Padrão do
Tempo (s)
Vo
(cm.s-1)
0 - - - - -
20 75 78 76,5 2,12 0,09
40 13 12 12,5 0,71 0,56
60 8 10 9 1,41 0,78
80 3 5 4 1,41 1,75
100 2 3 2,5 0,71 2,80
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 21
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Tabela 4. Valores dos tempos que os discos demoraram a percorrer a distância de 7 cm, para uma amostragem dupla, em função da concentração de substrato H2O2 e respectivos valores médios de tempo, valores de desvios-padrão e valores da velocidade dos discos no interior dos tubos de ensaio calculados através desses mesmos valores médios de tempo e valor de
distância sendo que para as concentrações de H2O2 nas quais os discos não percorreram qualquer distância se representa por “-“.
tpara percorrer d (s)
[H2O2] (% v/v) Amostra 1 Amostra 2
tmédio,para
percorrer d (s)
Desvio Padrão do
Tempo (s)
Vo
(cm.s-1)
0 - - - - -
0,2 94 180 137 60,81 0,05
0,5 95 73 84 15,56 0,08
0,8 40 64 52 16,97 0,13
1 65 44 55 14,85 0,13
3 19 20 20 0,71 0,36
6 12 12 12 0,00 0,58
10 10 7 9 2,12 0,82
Tabela 5. Valores dos tempos que os discos demoraram a percorrer a distância de 7 cm, para uma amostragem dupla, em função da temperatura para o instante inicial no qual as amostras
atingiram a temperatura desejada e para 10 minutos após esse tempo, mantendo as temperaturas constantes, e respectivos valores médios de tempo, valores de desvios-padrão e
valores da velocidade dos discos no interior dos tubos de ensaio calculados através desses mesmos valores médios de tempo e valor de distância, sendo que para as temperaturas nas
quais os discos não percorreram qualquer distância se representa por “-“.
tpara percorrer d (s)
Temperatura
(ºC) Amostra 1 Amostra 2
tmédio,para
percorrer d (s)
Desvio
Padrão do
Tempo (s)
Amostra 1
Instante
Inicial
(extracto mãe)
4 3 2 3 0,71 2,80
20 13 10 12 2,12 0,61
50 28 25 27 2,12 0,26
80 - - - - -
Após 10
minutos
(extracto mãe)
4 3 2 2,50 0,71 2,80
20 14 13 13,50 0,71 0,52
50 - - - - -
80 - - - - -
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 22
Laboratórios de Tecnologias Alimentares
Tabela 6. Valores das concentrações de [H2O2] (em v/v e em g.mL-1), do inverso das concentrações de [H2O2] (em mL.g-1), da velocidade (em cm.s-1), do inverso dos valores de
velocidade (em s.cm-1) e da massa específica da catalase a 25 ºC (em g.mL-1).
ρ (a 20 ºC)
(g/mL)
[H2O2]
(% v/v)
[H2O2]
(g.mL-1)
1/[H2O2]
(mL.g-1)
Vo
(cm.s-1)
1/ Vo
(s.cm-1)
1,48
0 0 0 0 0
0,2 0,296 3,38 0,05 19,57
0,5 0,74 1,35 0,08 12,00
0,8 1,184 0,84 0,13 7,43
1 1,48 0,68 0,13 7,79
3 4,44 0,23 0,36 2,79
6 8,88 0,11 0,58 1,71
10 14,8 0,07 0,82 1,21