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8/16/2019 Técnicas de Contagem Em Placa
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Profª Fláia !uta
"lunos#
$uana Fafi%es
Mariana Magalh%es
&ac'el (ilestre
Thamiris Corr)a
&io de *aneiro+ ,- de Maio de ./,0
1. Objetivos
Quantifcar o número de colônias para dierentes diluições a
partir de uma suspensão de ermento biológico utilizando técnicas de
plaqueamento distintas e estimar o número de UF!m"#
2. Introdução
$#% "e&eduras
"e&eduras são micro'organismos cu(o crescimento dominante se
d) na orma unicelular* não possuem +agelos ou outros órgãos de
locomoção# , reprodução é asse-uada por brotamento multilateral e
polar ou por fssão* e se-uada por meio de esporos# ,s caracter.sticas
morológicas das le&eduras determinadas por microscopia mostram
ormas eséricas e o&óides* p/ra* cil.ndrica e mesmo alongadas em
pseudomicélio# 0m geral* as células de le&eduras são maiores do que
das bactérias* mas as menores le&eduras não são tão grandes como
as maiores bactérias# 0sses microrganismos &ariam
considera&elmente* no que se reere 1s suas dimensões* com limites
desde % a 2 3 de largura e 2 a 45 3 de comprimento# 67890:,9;
,""09; 8?>8?,; FU970; ,@0* $55$A#
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ada espécie tem uma orma caracter.stica* mas* mesmo em
culturas puras* B) consider)&eis &ariações de tamanBo e de orma
das células indi&iduais* dependendo da idade e do ambiente#
,presentam partes &is.&eis como parede celular* citoplasma*
&acúolos* glóbulos de gordura* grCnulos e núcleo 60,>8
,9>89D9D*$555A#
=e&ido 1 importCncia econômica dos processos biotecnológicos
en&ol&endo a le&edura Saccharomyces* na panifcação* produção de
cer&e(a* &inBo e outras bebidas alcoólicas* querem como no caso no
Erasil* na produção de um combust.&el alternati&o e reno&)&el* tal
organismo pode ser considerado o eucariótico mais estudado e cu(o
metabolismo é o mais conBecido entre a espécie 6,QU,?890; "D:,;
E8?,9D* $55%A#
>endo em &ista a importCncia apresentadas pelas le&eduras* as
linBagens desses micro'organismos oram sendo selecionadas
segundo caracter.sticas dese()&eis ao processo e ao produto# ,
produti&idade e a efci/ncia de ermentação* a tolerCncia ao etanol e
1 temperatura* a resist/ncia 1s altas concentrações de açúcares* a
Babilidade de +ocular e de produzir ou não certos componentes do
aroma das bebidas e a propriedade de produzir metabólitos anti'
contaminantes são constantes ontes de interesse 6G,::89=* %HH2A#
eccato',ntonini 6$55IA ad&erte que além da escolBa e da
preparação do ermento* algumas condições ótimas de&em ser
mantidas durante o processo industrial no sentido de obter
produti&idade m)-ima de etanol a partir dos açúcares
ermentesc.&eis# 0ntre os parCmetros a serem considerados* de&em
fgurar* o teor de ermento na dorna* a &iabilidade celular* a
ocorr/ncia de inecções* o pG* a temperatura e a concentração de
açúcares redutores totais no mosto# G)* dessa orma* necessidade de
um rigoroso controle do processo de ermentação* en&ol&endo a
a&aliação dos rendimentos pr)ticos e simultaneamente o
monitoramento microbiológico#
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8 estudo da reciclagem das le&eduras durante o processo
industrial torna'se de &ital importCncia quando da an)lise dos teores
de compostos tó-icos 1 ermentação* &isto que* se eles são
produzidos durante o processo e podem acumular'se no inóculo
promo&endo perdas de &iabilidade* abai-ando a efci/ncia e
comprometendo a produti&idade industrial 6878"8* %HJKA#
,lém do rendimento industrial* outro ponto a ser considerado na
manutenção da &iabilidade das le&eduras* assim como da qualidade
desses micro'organismos é a possibilidade de comercialização para
utilização na nutrição de animais#
,s le&eduras reúnem caracter.sticas a&or)&eis para seu
emprego como complemento nutricional animal principalmente pelo
alto conteúdo de nutrientes
acilmente assimilados pelo organismo e de alto &alor nutricional*
sendo um e-celente componente alimentar e de r)pido crescimento
68LM?DNG>* $552A#
@egundo dados da 0mbrapa 6%HH%A* a le&edura de destilaria de
)lcool de cana'de açúcar é um alimento rico em prote.na de alto &alor
biológico e uma boa onte de lisina* leucina* treonina* &itaminas do
comple-o E* carboidratos* lip.dios e minerais#
$#$ ontagem de "e&eduras
eccato',ntonini 6$55IA e-plica que a estimati&a de células
&i)&eis é importante também para estabelecer a tolerCncia da
le&edura ao seu produto#
Lara estimar a proporção de células &i)&eis* métodos baseados
no plaqueamento ou obser&ação microscópica t/m sido utilizados# 8s
métodos de contagem direta no microscópio são r)pidos e simples*
e-igem um m.nimo de equipamento* permitindo que se(a obser&ada*
simultaneamente* a morologia celular 60,>8',9>89D9D* $55IA#
$#4 ontagem por plaqueamento
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8 método de contagem de micro'organismos em placas é um
método geral e &ers)til que pode ser utilizado tanto para a contagem
de grandes grupos microbianos* como aeróbios mesóflos* aeróbios
psicrotróflos* bolores e le&eduras e clostr.dios sulfto redutores* como
também para a contagem de g/neros e espécies em particular* como
Staphylococcus aureus* Bacillus cereus e Clostridium perfringens#
Oariando o tipo de meio 6enriquecimento* seleti&o* seleti&o'
dierencialA e as condições de incubação 6temperatura e atmoseraA* é
poss.&el selecionar o grupo* g/nero ou espécie que se dese(a contar
6@D"O,;
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Figura 1: Esquema explicativo do procedimento para execução da tcnica de
diluiç!es seriada e plaqueamento em placas e contagem. Fonte: adaptado de
"omeiro #2$$2%.
8 método de microbiologia cl)ssico de contagem de
microrganismos &i)&eis é o da inoculação em placas de Letri
contendo meio de cultura adequado com incubação por um per.odo
de até K$ Boras* tempo que é necess)rio para conseguir contagem
mais precisa* mas em razão do tempo necess)rio para a leitura* esse
método não é usado nas usinas#
0m razão deste obst)culo* o método padronizado e adotado
pelas usinas é o descrito por "ee; ?obinson; Pang 6%HJ%A que utiliza
azul de metileno como corante seguido de contagem em cCmara de
9eubauer* usando um microscópio óptico* em aumento de I55#
$#I ontagem pela cCmara de 9eubauer
, Cmara de 9eubauer consiste de uma lCmina de microscopia*
bem mais alta do que uma lCmina normal* onde e-iste uma cCmara
gra&ada no &idro 6as duas partes indicadas por setas no centro da
Figura $ R cada lCmina contém geralmente duas cCmarasA# ,o lado da
cCmara e-istem dois suportes 6as duas barras cinza claras ao lado da
cCmara na Figura $A que mantém uma lam.nula especial de quartzo
e-atamente a %5'% mm acima da base da cCmara# Lortanto* quandose coloca uma solução na cCmara e se cobre a mesma com a
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lam.nula* a proundidade da solução é conBecida 6"U,?D9D; @D"O,;
ED,9GD* $55IA#
Figura 2& '(mara de )eubauer
9o centro desta lCmina e-istem &)rias linBas perpendiculares
com marcações em quadrantes# ,o analisar em microscópico com
aumento de %55-* pode'se perceber que e-istem tr/s tipos de
quadrantes* conorme ilustrado na Figura 4,* que (untos ormam um
quadrado maior# 9o caso de contagem de le&eduras os quadrantes
utilizados são os que estão dentro do c.rculo* de acordo apresentado
na Figura 4E# 0m lCminas padrão esses quadrantes centrais totalizam
$2# ada quadrante é composto por %S ret.culos* como mostrado na
Figura 4# 0stes quadrantes são utilizados para azer as contagens e
assim determinar a concentração de células em um determinado
&olume de amostra* e deste modo calcular a concentração total de
células de le&eduras#
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Figura *& Esquema do quadrante e ret+culos da '(mara de )eubauer
, técnica de coloração com azul de metileno consiste na misturade partes iguais da suspensão de le&eduras* se necess)rio dilu.da* e
da solução corante azul de metileno# ,s células com alta ati&idade
fsiológica não se colorem enquanto que as células inati&as
apresentar'se'ão coloridas de azul# , porcentagem ou o número de
células &i)&eis é determinado transerindo'se com uma pipeta de
Lasteur a amostra para cCmara de 9eubauer 60,>8',9>89D9D*
$55IA#9a literatura e-istem poucos trabalBos realizados com
comparação entre
métodos de contagens#
8s resultados apresentados por astro; ereda; Erasil 6%HJ$A que
compararam a contagem de le&eduras &i)&eis por plaqueamento em
,gar Eatata com o de corante &ital* usando azul de metileno e
eritrosina* em laboratório* com le&edura comercial* indicaram queBa&ia correlação entre o método de plaqueamento e as contagens
pelos dois corantes* pois não dieriram entre si# @egundo esses
autores a seleção do corante seria apenas uma questão de acuidade
&isual e preer/ncia pessoal#
>re&ors et al# 6%HJ4A* em trabalBo com quatro linBagens de
Saccharomyces culti&adas em meio :MNL 6e-trato de malte* peptona
e glicoseA e incubadas a $2T* utilizando oito métodos para a
contagem de células* relatam que a contagem de células de le&edura
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com o corante azul de metileno em cCmara de 9eubauer
proporcionou correlação aceit)&el* comparando'se com a técnica
padrão de contagem em placa# Lortanto esses mesmos autores
destacam que dependendo do ob(eti&o da utilização desses
microrganismos principalmente em ermentações em escala industrial
pode ser necess)rio usar uma técnica de contagem dierente para as
espécies ou &ariedades#
"ogo 7ocB et al# 6%HJSA ad&ertem que a contagem de células de
le&edura pela cCmara de 9eubauer em n.&eis mais bai-os de
contagens* apresenta alta de precisão#
,pesar da importCncia desta an)lise* ela tem sido eita de orma
manual e
demorada que causa cansaço &isual* podendo le&ar 1 imprecisão* e
ainda e-ige um técnico treinado# 0ntretanto essa técnica apresenta
bai-o rendimento e su(eito 1 interer/ncia por acuidade &isual#
8 rendimento das usinas na produção do etanol pode ser
incrementado de orma consider)&el* com o incremento de um
sistema para a contagem autom)tica de células de le&eduras &i)&eis
e in&i)&eis em imagens microscópicas digitalizadas#
$#2 :étodo pour plate
8 método pour plate* ou semeadura em proundidade* é
empregado para obter colônias isoladas pela mistura do inóculo com
)gar liqueeito resriado e distribu.do numa placa de Letri estéril
6L0",? et al#; %HHKA# 8 inóculo é realizado diretamente na placa deLetri# 8 meio nutriti&o é mantido em banBo maria a 25T para impedir
a solidifcação do )gar e é &ertido sobre a amostra* seguido por um
per.odo de agitação# 0sta metodologia permite o crescimento das
colônias dentro do )gar nutriente* assim como na super.cie da placa
de )gar nutriente 6>8?>8?, et al#; $555A#
$#S ontagem automatizada
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, automação () alcançou alguns setores da microbiologia
aplicada# @ão dispon.&eis no mercado equipamentos que possibilitam
a contagem de células de le&eduras de orma autom)tica* tais como o
%Nucleo Counter M'%55 V da
empresa Bemometec da =inamarca# 8 equipamento consta de um
microscópio de +uoresc/ncia integrada* pro(etado para detectar sinais
do corante +uorescente* iodeto de prop.dio que se liga ao =9, da
le&edura# Quando entra em contato com as células o iodeto de
prop.dio é dissol&ido e o =9, celular é corado# 8utro equipamento
dispon.&el é o $Vi-CELL um analisador de &iabilidade celular abricada
por EecWman oulter* situada nos 0stados Unidos# 8 Vi-CELL realiza
automaticamente a contagem utilizando o corante azul de tripan*
utilizando uma célula de +u-o cont.nuo e um sistema de an)lise de
imagem# Um terceiro equipamento o 4Nalco Yeast Activity Monitor
abricado pela empresa americana 9ational ,luminate orporation*
este equipamento e-trai sua energia de reação*atra&és da reação
entre enzimas da le&edura e das moléculas de emissão bioqu.mica# 8
equipamento é dotado de uma sonda que é colocada em contato
diretamente com a amostra preparada* proporcionando as ta-as de
ati&idade metabólica das le&eduras#
orr/a et al# 6%HH5A realizaram a an)lise de &iabilidade de células
úngicas em amostras coradas com solução de diacetato de
+uoresce.na e brometo de et.dio* posteriormente e-aminadas em
microscópio de +uoresc/ncia# 8s autores conclu.ram que o tempo de
coloração ideal oi de 45 minutos para que Bou&esse a pereita
dierenciação entre células &i)&eis e não &i)&eis* no entanto* o
método é oneroso* apesar de se mostrar sens.&el e simples#
, automação na an)lise de amostras biológicas oi tema do
trabalBo de "amprecBt; @abatini; arpenter 6$55KA que
desen&ol&eram um sotXare de código aberto que pode reconBecer
as part.culas por dierentes atributos das regiões de interesse 6?8DA*
tais como a morologia* cor* te-tura* entre outros* com dierentes
técnicas de &isão computacional#
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@Barma et al#* 6$55HA desen&ol&eram tecnologia para aplicações
laboratoriais na )rea armac/utica* que permitem a detecção e
reconBecimento de microorganismo dentro de +uidos#
*. ,ateriais
• ,utocla&e
• >ubos de 0nsaio
• Ealão Oolumétrico
• Ygua =estilada
• Fermento Eiológico
• Lipeta Nraduada
•
,lça de =rigalsWi
• Llaca de Letri
• Eico de EZnsen
• Ylcool 0t.lico K5[
• :eio Ygar @abouraud
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-. rocedimento Experimental
!"#" Lreparação de uma série de diluições decimais de uma
cultura da le&edura Saccharomyces cerevisiae
Lara preparação da diluição da cultura da le&edura* os tubos de
ensaio contendo H ml de )gua destilada* as pipetas e as placas de
petri utilizadas oram esterilizadas em autocla&e a uma temperatura
de %$5\ a % atm durante $5 minutos#
Lara uma diluição %]%55* pesou'se %*5 g de ermento biológico
que oi dilu.do em um bécBer contendo %55 ml de )gua estéril# om o
au-.lio de uma pipeta estéril oi retirado % ml da suspensão
microbiana* que então oi adicionado ao primeiro tubo de diluição 6%5 '
%A# , cada diluição a solução oi Bomogeneizada por agitação#
,pós a Bomogeneização* com uma no&a pipeta estéril* retirou'
se % ml da primeira diluição* %5'%* e a transeriu para outro tubo
contendo os H ml de )gua estéril para obtenção da diluição %5 '$# Foi
realizado o mesmo procedimento para as diluições seguintes até a
obtenção da diluição %5'S#
I#$# Dnoculação da cultura da le&edura Saccharomyces
cerevisiae por espalBamento em meio sólido
Lara inoculação da le&edura* oram selecionadas as tr/s últimasdiluições da suspensão de ermento biológico* %5'I* %5'2 e %5'S# ,s
suspensões oram Bomogeneizadas por &agarosa agitação* para
prosseguir com a inoculação#
>r/s placas de petri oram entreabertas e preencBidas com o
meio )gar sabouraud pró-imas a temperatura de cBama do bico de
Eunsen* que então oram colocadas na bancada ainda pró-imo 1
cBama até sua solidifcação# ,pós a solidifcação* da mesma orma*
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oram entreabertas e pipetadas com % ml de cada uma das tr/s
diluições#
Lara espalBamento da suspensão na super.cie do meio*
utilizou'se um espalBador esterilizado pela cBama do bico de Eunsen*
inicialmente introduzido em meio alcoólico# 0ntão* cuidadosamente* o
espalBador oi passado pela super.cie do meio até uma poss.&el
identifcação de resist/ncia a mo&imentação indicando a absorção do
inóculo pelo meio# ,pós o termino do espalBamento* as placas oram
incubadas 1 temperatura ambiente por % semana#
I#4# Dnoculação da cultura da le&edura Saccharomyces
cerevisiae por incorporação 6pour'plateA
Lara inoculação da cultura da le&edura por incorporação* as tr/s
últimas diluições* %5'I* %5'2 e %5'S da suspensão do ermento biológico
oram cuidadosamente agitadas e igualmente pipetadas* para tr/s
placas de petri entreabertas pró-imo a cBama do bico de Eunsen# 8
meio )gar sabouraud undido oi então adicionado 1s placas e
delicadamente misturados com mo&imentos giratórios em orma de J#
=a mesma maneira* as placas oram incubadas a temperatura
ambiente por % semana#
/. "esultados e 0iscuss!es
2#%# :étodos de ontagem
8 número de células totais podem ser contadas diretamente
com o uso de um microscópio a partir de amostras secas em lCminas
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ou amostras l.quidas# ,s amostras secas podem ser coradas* pelo
método de Nram* por e-emplo* para aumento de contraste* enquanto
que para as l.quidas são utilizadas cCmaras especiais ^%_#
,pesar do uso do microscópio proporcionar a obser&ação
morológica dos micro'organismos* a contagem microscópica
apresenta algumas limitações# @em o uso de corantes espec.fcos não
é poss.&el distinguir células mortas de células &i&as* cu(a &iabilidade
est) relacionada com a integridade da membrana citoplasm)tica# 0 se
amostra não esti&er corada é necess)rio o uso de microscópios de
contraste de ase* entre outras ^%_#
0m muitos casos* o ob(eti&o principal é somente a contagem do
número de células &i)&eis# ,ssim* o método da contagem em placa
pressupõe que cada célula é capaz de se multiplicar originando uma
colônia em um meio sólido adequado para o micro'organismo de
escolBa* sendo o número de colônias e o número de células
proporcionais ^$_#
=e acordo com o método* cada colônia de&e ser originada a
partir de uma única célula &i)&el* o que nem sempre acontece# 9as
próprias placas oram obser&adas colônias agregadas ormadas por
duas ou mais células e consequentemente de tamanBos
dierenciados#
Foram utilizados dois métodos para a contagem das colônias# 8
método de inoculação por espalBamento ou spread plate* no qual o
crescimento das colônias ocorre e-clusi&amente na super.cie* em
razão da amostra ser espalBada no meio de cultura () solidifcado#
8 tempo de solidifcação é importante* pois caso a super.cie
este(a muito úmida* a absorção da suspensão é difcultada e as
células acabam se deslocando# Oolumes de amostra superiores a 5*%
m" de&em ser e&itados* () que o e-cesso não é absor&ido pro&ocando
aglutinação das células e difcultando a contagem ^%_#
9o método de inoculação em proundidade ou pour plate* o
meio de cultura é &ertido ainda undido* e somente após a adição da
supensão na placa# Dsso permite que os micro'organismos cresçam na
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super.cie e abai-o desta# 8 meio e a suspensão de&em ser bem
misturados* porém com mo&imentos delicados para não comprometer
o crescimento das colônias* que assumem ormas não arredondadas*
o que oi também obser&ado em uma das placas#
,o utilizar esta técnica de&e'se saber de antemão se o micro'
organismo suporta a temperatura no qual o meio se liqueaz* e se
meio de cultura or &ertido na placa ainda muito quente as células
podem ser in&iabilizadas# 8 ideal é trabalBar com o meio em torno de
I2 a 25 \ ^$_#
@e(a qual or a metodologia utilizada* por espalBamento ou em
proundidade* os resultados são normalmente e-pressos em Unidades
Formadoras de olônias 6UFA#
2#$# =iluição da @uspensão
8 ponto mais cr.tico desta pr)tica est) relacionado com o
preparo da suspensão* ou se(a* o quanto de ermento de&e ser
solubilizado para uma dada quantidade de )gua* &isto que as
diluições são eitas com base na amostra a ser quantifcada antes de
realizar os plaqueamentos#
@e após o per.odo de incubação or obtido uma distribuição
uniorme das colônias* a contagem em placa oerece resultados mais
precisos quando comparado com a contagem miscroscópica# omo
erros e-perimentais estão en&ol&idos* o &alor de UF!m" calculado é
baseado em uma estimati&a* no qual o número de colônias não pode
ser muito ele&ado* pois as células sem agrupam induzindo erros de
contagem* e nem muito bai-o* pois a importCncia estat.stica da
contagem é reduzida# 8 ideal é selecionar placas que possuam entre
45 e 455 colônias buscando reduzir ao m)-imo os erros embutidos na
metodologia ^%*S_#
9o entanto* cBegar nessa ai-a de &alores é uma das maiores
difculdades do método# =urante a primeira pr)tica oram pesados %2
mg de ermento biológico para %55 m" de )gua estéril* o que
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impossibilitou a contagem e a repetição do e-perimento oi ine&it)&el#
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ada colônia que pode ser contada é cBamada de unidade
ormadora de colônia# Lor e-trapolação* este número pode ser usado
para calcular o número de UF na amostra original# =e maneira geral*
para encontrar o número de unidade ormadora de colônias por m"* o
número de colônias 6reerente 1 uma placa que contenBa entre 45 e
455 colôniasA é multiplicado pelo ator de diluição da placa escolBida#
omo o resultado é dado em mililitro* no caso de uma al.quota de 5*%
m"* é necess)rio multiplicar o resultado encontrado por %5 ^K_#
• @pread Llate]
UFC /mL=nº decolônias x 10 x Fator de diluição
Quando duas diluições consecuti&as apresentam contagem
dentro do padrão* calcula'se o número de UF para cada diluição* os
resultados de&em ser e-pressos com o mesmo e-ponte* e estes são
comparados# @e um dos resultados não ultrapassar o dobro do outro*
ambos os &alores são considerados e o resultado fnal é a média das
contagens# aso um dos resultados se(a maior que o dobro do outro*
é considerado apenas a menor contagem ^2_#
UFC
mL =161 x10 x10
5=1,61.10
8
UFC
mL =133 x10 x106
=13,3.108
13,3.108>1,61.10
8 x2=3,22.10
8
UFC /mL=1,33.109
• Lour Llate]
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UFC /mL=nº de colônias x Fator dediluição
@e a contagem oi eita em uma placa inoculada com diluição a
%5'% ou maior* e sem duplicata* escolBer a placa com número de
colônias entre 45 e 455 e eetuar o c)lculo# omo o &olume da
al.quota era de % m" não é necess)rio o ator de correrção ^2_#
UFC
mL =226 x 10
5=2,26. 10
7
Nota-se pelo quadro 1, e pelas figuras 4, 5 e 6, que para o plaqueamento em
superfície, o número de colônias diminui na medida em que o fator de diluição aumenta.
ssumindo que as diluiç!es foram feitas nas mel"ores condiç!es possí#eis e que a fonte
das alíquotas a serem inoculadas possuem a mesma proced$ncia, era esperado que essa
tend$ncia se repetisse para a m%todo por incorporação. &ontudo, este comportamento
num%rico não % constatado sugerindo uma possí#el contaminação.
'ntretanto, #isualmente, % nítido a redução do número de colônias de uma placa
para outra, como pode ser #isto nas figuras (, ) e *. ssim, não pode ser descartada a
possi+ilidade de in#ersão na "ora de nomear as placas. e isto de fato ocorreu, o quadro
1 de#e ser apresentado conforme o quadro
Quadro . 1 Quadro , corrigido
0iluição'ontagem #'ol3nia5laca%
Spread $late $our $late%-%5'I %#%4$ %5SJ%-%5'2 %S% I5K%-%5'S %44 $SS
Lor conseguinte* o c)lculo para determinação do número de
UF!m" também ser) alterado para o método pour plate#
UFC mL
=226 x 106=2,26.108
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Figura - & 6pread late 0iluição 1$&-
Figura / & 6pread late 0iluição 1$&/
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Figura 7 & 6pread late 0iluição 1$&7
Figura 8 & our late 0iluição 1$&7
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Figura 9 & our late 0iluição 1$&-
Figura & our late 0iluição 1$&/
2#I# omparação entre os :étodos Quanto ao rescimento das
"e&eduras#
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8s meios de cultura sólidos imobilizam as células* que crescem
originando massas isoladas e &.si&eis* permitindo que a pureza da
cultura se(a obser&ada ^%_#
,s colônias podem e-ibir &)rias ormas e tamanBos* podendo
ser coloridas de&ido 1 produção de pigmentos# 8s ungos
flamentosos ormam colônias rugosas dierentemente das le&eduras*
que apesar de eucariontes são unicelulares* assim como as bactérias*
dando origem 1 colônias lisas brilBantes e de bordas regulares ^$_# ,s
colônias de @accBarom`ces cere&isiae apresentaram as
caracter.sticas macroscópicas citadas na literatura* além de uma
coloração esbranquiçada#
8s micro'organismos podem ser classifcados quanto a
presença de o-ig/nio# 8s aeróbios requerem o-ig/nio para
crescimento* podendo crescer mais lentamente se este or limitado#
8s acultati&os são aqueles que crescem na presença de ar
atmosérico* porém crescem também em anaerobiose# 8s anaeróbios
estritos podem ser mortos na presença de 8$* não crescem na
presença do ar e não utilizam o-ig/nio para as reações de produção
de energia# ,naeróbios aerotolerantes* que toleram pequanas
quantidade de o-ig/no* porém sem utiliz)'lo# 0 os microaeróflos* que
utilizam o o-ig/nio* mas o contr)rio dos aeróbios* não resistem aos
n.&eis de 8$ presentes na atmosera ^$_#
=e posse dessas inormações pressupõe'se que o método de
inoculação em super.cie pode ser utilizado para micro'organismos
aeróbios e acultati&os* equanto que o método em proundidade pode
ser utilizado para os micro'organismos microaeróflos* pois abai-o da
super.cie é ornecido um ambiente defciente em o-ig/nio* porém
isso não impede que micro'organismos aeróbios ou acultati&os
cresçam na super.cie onde B) maior disponibilidade de 8$#
8s micro'organismos anaeróbios* por sua &ez* precisam de uma
atmosera li&re de o-ig/nio# Lara isso* são utilizadas incubadoras
especiais cBamada de camCra de anaerobiose# , atmosera no
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interior da camCra é uma mistura de Bidrog/nio* dió-ido de carbono e
nitrog/nio# Qualquer res.duo de 8$ é remo&ido pela reação com o G$
na presença do pal)dio como catalisador ^$_#
, @accBarom`ces cere&isiae é uma le&edura acultati&a* ou
se(a* possui a capacidade de se a(ustar metabolicamente tanto em
condições de aerobiose quanto de anaerobiose# ,pós a glicólise* as
moléculas de glicose são transormadas em piru&ato atra&és de uma
série de reações catalisadas por enzimas# 9a presença de o-ig/nio* a
@accBarom`ces cere&isiae realiza respiração aeróbia e o produto fnal
é 8$ e G$8# 0m situação de Bipó-ia ou de total aus/ncia de o-ig/nio*
esta le&edura não é capaz de eeturar a respiração anaeróbia e como
alternati&a realizam ermentação alcoólica* e o piru&ato é con&ertido
em etanol e 8$ ^I_#
, capacidade da le&edura de ermentar o açúcar em etanol não
implica a capacidade de crescer em condições anaeróbicas# 9a
&erdade* a maioria das le&eduras acultati&as não crescem bem na
aus/ncia completa de o-ig/nio nem mesmo em meio comple-os#
"ogo* o o-ig/nio é um importante ator na regulação do metabolismo
do açúcar nos ermentos ^4_#
9a presença de altas concentrações de o-ig/nio* as le&eduras
crescem efcientemente* pois a produção de energia é muito maior e
no&as células são ormadas# 0ntretanto* em situações de Bipó-ia a
produção de no&as células é reduzida ^$_#
om este embasamento teórico* no método pour plate* era
pre&isto maiores quantidades de colônias na super.cie* &isto que
abai-o desta a quatidade de o-ig/nio dissol&ido no meio é limitado e
a multiplicação das células não é tão eeti&a# Lelas mesmas
(ustifcati&as* também era esperado um maior crescimento das
células de le&edura no método por espalBamento quando comparado
diretamente com o método anterior# Lorém* conorme o quadro %*
este não oi o resultado obtido#
7. 'onclusão
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, partir dos resultados encontrados* pode'se concluir que a
dierença identifcada no número de colônias* ou células &i)&eis* para
os métodos de inoculação por espalBamento e de inoculação em
proundidade não se de&e 1 erros de preparo da suspensão do
ermento biológico nem de suas diluições* pois para o método de
espalBamento em super.cie* o resultado se apresentou coerente com
relação 1s diluições* ou se(a* obte&e'se a diminuição do número de
colônias com o aumento da diluição#
Lor outro lado* o resultado para o método de inoculação em
proundidade se apresentou incoerente* que além de ter sido obtido o
aumento do número de colônias com o aumento da diluição* o
número se demonstrou aleatório# omo a dierença no número de
colônias nas tr/s placas pode ser obser&ado a olBo nú* o erro por
contagem não pode ser considerado# =essa orma* uma possibilidade
para tal erro est) no momento de identifcação das placas* um erro do
operador#
abe'se ressaltar* que ainda que osse gerado um resultado não
aleatório mas da mesma orma in&ertido para o método de inoculaçãoem proundidade* nada se pode concluir sobre tal método pois a
le&edura Saccharomyces cerevisiae é classifcada como anaeróbia
acultati&a* não sendo aetada pela quantidade de o-ig/nio*
permanecendo com um resultado não esperado para o e-perimento#
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8. "e;er
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%4# 0,>>8',9>89D9D* @#?# :étodos de an)lises emonitoramento microbiológico em laboratório de =estilaria# Dn]urso de treinamento ministrado a unidades pertencentes 1usina de açúcar @anta >eresinBa* Dguatemi* $55I# p#44
%I# 8LM?DNG>* Nlucos Dnternacional' , le&edura da cana#:anual >écnico* %'$ p* $552#
%2# 8??h,* E# et al# :étodo +uorescente 6diacetato de+uoresce.na e brometo de et.dioA para o estudo da &iabilidadede cr`ptococcus neoormans em liquor# Oer# Dnst# :ed# >rop# @ãoLaulo 4$* p#IS'25* %HH5#
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pesquisa e tecnologia F0D* @ão Eernardo do ampo* $S* p# 4S'I5* $55I#
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