Post on 17-Dec-2018
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
SEGURANÇA E EFICÁCIA DE UM SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE
LIOFILIZADO EM ACIDENTES OFÍDICOS NA AMAZÔNIA BRASILEIRA: UM
ENSAIO CLÍNICO PROSPECTIVO, ABERTO, CONTROLADO, RANDOMIZADO
DE FASE IIb
IRAN MENDONÇA DA SILVA
MANAUS
2017
i
IRAN MENDONÇA DA SILVA
SEGURANÇA E EFICÁCIA DE UM SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE
LIOFILIZADO EM ACIDENTES OFÍDICOS NA AMAZÔNIA BRASILEIRA: UM
ENSAIO CLÍNICO PROSPECTIVO, ABERTO, CONTROLADO, RANDOMIZADO DE
FASE IIb
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas em
Convênio com a Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para
obtenção grau de Doutor em Doenças
Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Prof. Dr.Wuelton Marcelo Monteiro
MANAUS
2017
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
Ficha Catalográfica Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). Sistema Integrado de Bibliotecas da Universidade do Estado do
Amazonas.
I65s Silva, Iran Mendonça da
Segurança e eficácia de um soro antiofídico trivalente
liofilizado em acidentes ofídicos na Região Amazônica:
um ensaio clínico prospectivo, aberto, controlado,
randomizado de fase IIb / Iran Mendonça da Silva.
Manaus : [s.n], 2017.
185 f.: il., color.; 30 cm.
Tese - Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical - Universidade do Estado do Amazonas,
Manaus, 2017.
Inclui bibliografia
Orientador: Wuelton Marcelo Monteiro
1. Ofidismo. 2. Amazônia . 3. Soro antiofídico
liofilizado. 4. Segurança/eficácia. 5. Ensaio clínico. I.
Wuelton Marcelo Monteiro (Orient.). II. Universidade
do Estado do Amazonas. III. Segurança e eficácia de um
soro antiofídico trivalente liofilizado em acidentes
ofídicos na Região Amazônica: um ensaio clínico
prospectivo, aberto, controlado, randomizado de fase IIb
iii
FOLHA DE JULGAMENTO
TITULO DA TESE
SEGURANÇA E EFICÁCIA DE UM SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE
LIOFILIZADO EM ACIDENTES OFÍDICOS NA AMAZÔNIA BRASILEIRA: UM ENSAIO CLÍNICO PROSPECTIVO, ABERTO,
CONTROLADO, RANDOMIZADO DE FASE IIb
IRAN MENDONÇA DA SILVA
“Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de PósGraduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
______________________________________
Presidente
______________________________________
Membro
______________________________________
Membro
______________________________________
Membro
______________________________________
Membro
iv
DEDICATÓRIA
À minha amada filha Marselle Marmo do Nascimento Silva que, mesmo sem
perceber e distante, tem me estimulado ao crescimento e ao trabalho dignificante,
que tem compreendido a minha ausência fora de nossas origens na persistência
por uma causa humanitária.
Aos meus pais Domingos da Silva e Waldiria Mendonça da Silva, in memoriam, por
terem me dado a oportunidade de existir e ser produtivo.
Ao meu padrasto Alvary Ribeiro, in memoriam, que distante de mim, durante a
execução deste Projeto, partiu para outro plano tendo cumprido aqui sua missão e
me dando exemplo e força para prosseguir.
Ao meu sobrinho Anderson Carneiro Mendonça da Silva, in memoriam, que tão
jovem partiu para outro plano e me deixou a compreensão de manter a minha vida
produtiva por entender que estar vivo é uma dádiva divina.
v
AGRADECIMENTOS
Ao meu grande amigo e colega de trabalho, Dr. Antônio Magela Tavares, que
diuturnamente, até nos finais de semana, me apoiou nos trabalhos no hospital e no campo,
em distantes áreas rurais. Sua generosidade e a compreensão da importância deste
projeto fortaleceu uma grande amizade.
Aos pacientes que em mim depositaram confiança e permitiram a execução deste
trabalho.
À todas as vítimas de ofidismo na Região Amazônica, caboclo ribeirinho, indígena,
residentes de áreas rurais distantes, amazônidas esquecidos na Região Norte do país, que
me proporcionaram a oportunidade de servir ao próximo, me estimulando com suas
mazelas, na parceria em luta por melhores condições de sobrevivência.
Ao meu orientador Prof. Dr. Wuelton Marcelo Monteiro pela generosidade de
compartilhar seus conhecimentos e tempo com sábias orientações.
Aos ex-colegas de trabalho e amigos do Instituto de Biologia do Exército - RJ que me apoiaram na elaboração deste Projeto e que, mesmo distantes, torceram pelo sucesso deste trabalho.
Aos profissionais da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, do
Hospital Geral de Roraima Rubens de Sousa Bento e do Hospital Municipal de Borba, que
na época me apoiaram, seja nas enfermarias, laboratórios e até no trabalho de campo, em
uma incansável luta execução das diversificadas tarefas.
vi
DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS
Este estudo foi apoiado pelo Instituto de Biologia do Exército – RJ, Fundação de
Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado –AM eHospital Geral de Roraima-RR
através do CONVÊNIO/EME Nr 0404400 de 01 de julho de 2004, publicado no DOU Nr
150 de 05 de agosto de 2004; do TERMO ADITIVO Nr 0404401 de 07 de outubro de
2005, publicado no DOU Nr 21 de 30 de junho de 2006; do TERMO ADITIVO Nr
0404400 de 01 de outubro de 2007, publicado no DOU Nr 27 de 11 de fevereiro de
2008; CONVÊNIO DO ACORDO DE COOPERAÇÃO/EME Nr 0710700 de 01 de
outubro de 2007, publicado no DOU Nr 10 de 11 de fevereiro de 2008. Os convênios
tiveram a abrangência de 4 anos na totalidade para a execução do Projeto.
.
vii
EPÍGRAFE
“An individual has not started living until he can rise above the narrow confines of his individualistic
concerns to the broader concerns of all humanity”.
The words of Martin Luther King, Jr Selected by Coretta Scott King
“O que me assusta não são as ações e os gritos das pessoas más, mas a indiferença e o silêncio das pessoas
boas”. Martin Luther King, Jr
viii
RESUMO
Em áreas tropicais, uma grande preocupação a respeito da eficácia do
tratamento antiofídico está relacionada a falha na distribuição do soro antiofídico
líquido devido à falta de uma adequada rede de frios nas áreas remotas. Para
diminuir este problema, a liofilização tem sido sugerida para melhorar a estabilidade
do soro antiofídico. Este estudo compara a segurança e eficácia de um soro
antiofídico trivalente liofilizado (SATL) e o soro antiofídico líquido padronizado e
fornecido pelo Ministério da Saúde (SAMBL) para tratar os acidentes botrópicos,
laquéticos e crotálicos. Este foi um estudo prospectivo, randomizado, aberto, de
fase IIb, conduzido de junho de 2005 a maio de 2008 na Amazônia Brasileira. Os
desfechos primários de eficácia foram a supressão das manifestações clínicas e
retorno da hemostasia e marcadores de função renal aos níveis normais dentro das
primeiras 24 horas de seguimento. O desfecho primário de segurança foi a
presença de reações adversas precoces (RAP) nas primeiras 24 horas após o
tratamento. A termoestabilidade do SATL foi determinada pela estimativa da
potência antiveneno ao longo de uma ano a 56oC. Dos pacientes recrutados, 65 e
51 foram selecionados para os grupos SATL e SAMBL, respectivamente. Não
houve diferença entre os grupos tratados com SATL e SAMBL da admissão do
paciente até as 24 horas pós-admissão, para os valores de fibrinogênio (p=0,911)
e tempo de coagulação (p=0,982), ambos atingindo valores normais no seguimento
em acidentes por Bothrops. O tempo de coagulação, o fibrinogênio e o INR
apresentaram valores normais 24 horas após a soroterapia, para os dois
antivenenos. Além disso, a creatinina, as transaminases hepáticas, a
creatinofosfoquinase e os outros marcadores laboratoriais foram normais 24 horas
após a admissão nos grupos tratados com SATL e SAMBL. Para os acidentes
laquéticos, o fibrinogênio, tempo de coagulação e INR apresentaram valores
normais 24 horas após a soroterapia para ambos os antivenenos. Em relação aos
acidentes crotálicos, o fibrinogênio, tempo de coagulação, INR e
creatinofosfoquinase apresentaram valores normais 24 horas após a soroterapia
para ambos os grupos. A análise físico-química de SATL mostrou uma
concentração total de proteína de 4,63 g%, com 80% das imunoglobulinas F(ab’)2,
ix
que foi estéril, atóxico e apirogênico. A concentração de fenol foi <3,500 ppm. A
potência do antiveneno liofilizado para neutralizar as atividades de Bothrops,
Lachesis e Crotalus não mostrou diminuição significativa, quando comparada com
a linha de base ao longo de um ano de avaliações de termoestabilidade a 56°C.
Nenhuma alteração visual, como turvação e formação de agregados foram
observados durante todo o tempo e antes da administração do SATL. Considerando
que os resultados observados para eficácia, segurança e estabilidade foram
promissores, nossos resultados indicam que o SATL é adequado para um ensaio
clínico mais ampliado de fase III.
PalavrasChaves: 1. Acidente ofídico. 2. Soro liofilizado. 3. Segurança. 4. Eficácia.
5. Ensaio clínico. 6. Amazônia Brasileira.
x
ABSTRACT
In tropical areas, a major concern regarding snakebites treatment effectiveness
relates to the failure in liquid antivenom (AV) distribution due to the lack of an
adequate cold chain in remote areas. To minimize this problem, freeze-drying has
been suggested to improve AV stability. This study compares the safety and efficacy
of a freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV) and the standard liquid AV provided
by the Brazilian Ministry of Health (SLAV) to treat Bothrops, Lachesis and Crotalus
snakebites. This was a prospective, randomized, open, phase IIb trial, carried out
from June 2005 to May 2008 in the Brazilian Amazon. Primary efficacy endpoints
were the suppression of clinical manifestations and return of hemostasis and renal
function markers to normal ranges within the first 24 hours of follow-up. Primary
safety endpoint was the presence of early adverse reactions (EAR) in the first 24
hours after treatment. FDTAV thermal stability was determined by estimating AV
potency over one year at 56oC. Of the patients recruited, 65 and 51 were assigned
to FDTAVand SLAV groups, respectively. There were no differences between
FDTAV and MoH AV treated groups in the time until patient admission for fibrinogen
(p=0.911) and clotting time (p = 0.982), both reaching normal values over follow-up
in patients bitten by Bothrops snakes. Clotting time, fibrinogen and INR presented
normal values 24 hours after AV therapy, for both antivenoms. Moreover, creatinine,
liver transaminases, creatine phosphokinase and the other laboratorial markers
were normal 24 hours after admission in FDTAV and SLAV treated groups. For
Lachesis snakebites, fibrinogen, clotting time and INR presented normal values 24
hours after AV therapy for both antivenoms. Regarding Crotalus snakebites,
fibrinogen, clotting time, INR, and creatine phosphokinase presented normal values
24 hours after AV therapy in FDTAV and SLAV treated groups. FDTAV
physicochemical analysis showed a total protein concentration of 4.63g%, with 80%
of F(ab’)2 immunoglobulins. FDTAV was sterile, atoxic and apyrogenic. Phenol
concentration was <3,500 ppm. Antivenom potency for neutralizing Bothrops,
Lachesis and Crotalus activities showed no significant decrease compared to
baseline potency over one year of thermostability evaluations at 56°C. No visual
xi
alterations in turbidity and no aggregates were observed over time and before AV
administration. Since promising results were observed for efficacy, safety and
thermal stability, our results indicate that FDTAVissuitablefor a larger phase III trial.
PalavrasChaves: 1. Snakebite. 2. Freeze-dried antivenom. 3. Safety. 4. Efficacy.
5. Clinical trial. 6. Brazilian Amazon.
xii
RESUMO LEIGO
Em regiões de florestas ou em municípios mais distantes onde não tem
energia elétrica, a população encontra-se mais exposta as picadas de
serpentes (cobras), principalmente em áreas rurais e ribeirinhas, nas atividades
de plantação, criação de gado, extração de madeira, caça e pesca. As picadas
de cobras podem ocorrer inclusive no trajeto de casa para a lavoura, na
lavoura, no trajeto da lavoura para casa, ao redor e até dentro da própria casa.
A picada de cobra mais comum é por jararaca ou surucucurana, uma cobra
marrom escura que pode causar inflamação no local, sangramentos e até risco
de morte se não tratadas adequadamente. O único tratamento eficaz e usado
na medicina para neutralizar o veneno é um soro específico aplicado nas
Unidades de Saúde, que necessita de permanecer na geladeira para sua
conservação. Nas regiões onde ocorrem mais picadas de cobras, muitas vezes
não tem energia elétrica com frequência e o soro não pode ser conservado
onde mais é necessário. Baseado nesta premissa, o soro já existente, foi
transformado de líquido para um pó que não necessita de geladeira para sua
conservação, que depois de adicionado ao soro fisiológico existente no
hospital, volta a ser líquido podendo ser usado normalmente, sem ter sido
conservado em baixa temperatura. Esse estudo foi feito de modo a verificar se
este soro em pó funciona com segurança nas vítimas de picada de cobra. Foi
feita a comparação entre os dois soros (líquido e em pó) em 65 pessoas
picadas por jararaca ou surucucu ou cascavel que receberam o soro em pó e,
em 51 pessoas também picadas por jararaca, surucucu ou cascavel, que
receberam o soro líquido existente e já usado no tratamento de rotina. Houve
acompanhamento por 15 dias após o uso dos soros, com exames médicos e
vários exames de sangue, ficando constatado que não houve diferenças entre
os dois soros. Todos os pacientes melhoraram e foram liberados, todos os
exames de sangue alterados ficaram normais até a liberação e todos os efeitos
de possíveis alergias com o uso dos dois soros foram semelhantes e
controlados no atendimento médico. Assim, se concluiu que o soro em pó é tão
xiii
seguro e eficaz quanto o líquido e tem a grande vantagem de não precisar de
geladeira para sua conservação. Novos estudos devem ser feitos, em grupos
maiores, para justificar sua produção e distribuição nas regiões onde se faz
necessário.
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição regional das estimativas de mortes no mundo devido a picadas de
serpentes..................................................................................................................................02
Figura 2. Distribuição espacial dos acidentes ofídicos no Estado do Amazonas no período de
2007 a 2012..............................................................................................................................04
Figura 3. Sazonalidade (número mensal de acidentes relacionados ao período de chuvas) dos
acidentes ofídicos registrados no Estado do Amazonas de 2007 a 2012 ..................................05
Figura 4. Bacia amazônica, maior bacia hidrográfica do mundo (Secretaria Executiva do
Ministério dos Transportes) ......................................................................................................06
Figura 5. Precária condição de navegabilidade.......................................................................06
Figura 6. Atividade de pesca comprometida pela seca...........................................................06
Figura 7. Período de cheia e diversidade de transporte ..........................................................07
Figura 8. Rio de fácil navegabilidade no período da cheia........................................................07
Figura 9. Rio com condições de navegabilidade dificultada pela sinuosidade no período da
seca..........................................................................................................................................08
Figura 10. Variação dos níveis hidrográficos no Rio Negro.....................................................08
Figura 11. Cachoeira do El Dourado – maior cachoeira do Brasil localizada no Parque
Estadual Serra do Aracá -município de Barcelos – AM.............................................................08
Figura 12. Helicóptero Black Hawk da FAB utilizado na missào de resgate..............................12
Figura 13. Operação de resgate na aldeia Nova Esperança.....................................................12
Figura 14. Atendimento dentro do helicóptero Black Hawk.......................................................12
Figura 15. Distribuição espacial dos acidentes ofídicos no Estado do Amazonas no período de
2007 a 2012 relacionada com atividade laborativa e sequelas................................................13
Figura 16. Serpentes envolvidas nos acidentes em humanos na Amazônia Brasileira ............14
Figura 17. Bothrops brazili........................................................................................................14
Figura 18. Bothrops atrox adulta...............................................................................................16
Figura 19. Bothrops atrox filhote...............................................................................................16
Figura 20. Crotalus durissus marajoensis.................................................................................17
xv
Figura 21. Crotalus durissus terrificus......................................................................................17
Figura 22. Crotalus durissus ruruima.......................................................................................17
Figura 23. Lachesis muta.........................................................................................................18
Figura 24. Ferimentos puntiformes causados pelas presas de Bothrops atrox.........................27
Figura 25. Sangramento espontaneo na região da picada por Bothrops atrox..........................27
Figura 26. Sangramento por corte realizado por leigo na região da picada por Bothrops atrox..........................................................................................................................................27
Figura 27. Coloração violácea por equimose na região da picada por Bothrops atrox
..................................................................................................................................................27
Figura 28. Extensa área de equimose à distância (região dorso-lombar) causada por acidente com filhote de Bothrops atrox em membro superior esquerdo...................................................27
Figura 29. Bolhacausada pelo uso de torniquete na região cubital em acidente causado por Bothrops atrox em membro superior direito...............................................................................27
Figura 30. Hemorragia conjuntival e gengivorragia em paciente vítima de acidente por filhote de Bothrops atrox.....................................................................................................................29
Figura 31. Acidente vascular cerebral hemorrágico fronto-parietal e cortical em paciente vítima de acidente botrópico por filhote de Bothrops atrox...................................................................29
Figura 32. Celulite por infecção secundária em acidente botrópico, apresentando edema flogótico em membro inferior direito..........................................................................................30
Figura 33. Celulite por infecção secundária em acidente botrópico, apresentando edema flogótico e brilho na pele em membro inferior esquerdo............................................................30
Figura 34. Abscesso secundário após acidente botrópico, apresentando edema flogótico e elevação na pele em tornozelo esquerdo..................................................................................30
Figura 35. Abscesso após acidente botrópico em tornozelo direito, em fase de drenagem ..................................................................................................................................................30
Figura 36. Necrose em quarto quirodáctilo da mão esquerda em acidente botrópico com mais de 24 horas de evolução até o atendimento em menino de 11 anos do município de Canutama (AM)..........................................................................................................................................31
Figura 37. Procedimento cirúrgico de amputação do quarto quirodáctilo da mão esquerda no paciente da figura 36.................................................................................................................31
Figura 38. Amputação do quarto quirodáctilo da mão direita por necrose em acidente botrópico
com mais de 24 horas de evolução até o atendimento..............................................................31
Figura 39. Perda tecidual por necrose em quarto quirodáctilo da mão direita em acidente
botrópico com mais de 6 horas até o atendimento.....................................................................31
xvi
Figura 40. Fasciotomia para tratamento cirúrgico de síndrome compartimental no braço direito
em acidente botrópico com mais de 24 horas até atendimento .................................................32
Figura 41. Evolução pós-cirúrgica em fasciotomia por síndrome compartimental na perna
direita .......................................................................................................................................32
Figura 42. Acidente crotálico grave apresentando fáscies miastênica com ptose palpebral
bilateral.....................................................................................................................................35
Figura 43. Madeireiro com acidente ofídico em mata primária..................................................37
Figura 44. Comparação do número de “DALYs” perdidos devido a cada doença negligenciada
e custo por “DALY” evitáveis por várias intervenções terapêuticas...........................................46
Figura 45. Liofilizador industrial – Benchmark 1101 (Virtus – USA) ........................................50
Figura 46. Princípio de funcionamento de um liofilizador industrial (Kemolo)..........................50
Figura 47. Processo de liofilização............................................................................................51
Figura 48. Apresentação do soro antiofídico trivalente liofilizado usado no projeto...................54
Figura 49. Apresentação do soro antiofídico trivalente liofilizado usado no projeto após
diluição............................................................................................................................. .........54
Figura 50. Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.....................................55
Figura 51. Hospital Geral de Roraima Rubens Sousa Bento ..................................................55
Figura 52. Unidade Mista de Borba..........................................................................................55
xvii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Evacuação aeromédica em UTI móvel por acidentes ofídicos desde 2014 até
setembro de 2017.....................................................................................................................10
Tabela 2. Estimativa de custos com evacuação aeromédica de acordo com a procedência e o
destino.......................................................................................................................................11
xviii
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Atividade do veneno e patogenia.............................................................................35
Quadro 2. Classificação quanto à gravidade e tratamento no acidente botrópico.....................40
Quadro 3. Pré-soroterapia e tratamento das reações adversas..............................................41
Quadro 4. Número de ampolas de antiveneno indicadas para cada tipo de acidente de acordo
com a classificação da gravidade do envenenamento..............................................................43
Quadro 5. Sinais e sintomas da reação anafilática...................................................................44
xix
LISTA DE ANEXOS
ANEXO I. Laudo de Termoestabilidade do SATL..................................................................130
ANEXO II. Laudo de Análise Fisico-Química do SATL...........................................................131
ANEXO III. Protocolo de Registro de Caso............................................................................135
ANEXO IIIA. Formulário de Entrevista...................................................................................136
ANEXO IIIB. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido...................................................138
ANEXO IIIC. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Especial....................................139
ANEXO IIID. Ficha de Acompanhamento Clínico..................................................................140
ANEXO IIIE. Ficha de Acompanhamento para Coleta de Sangue.........................................147
ANEXO IIIF. Protocolo de Acompanhamento........................................................................149
ANEXO IIIG. Ficha de Investigação de Eventos Adversos....................................................152
ANEXO IV. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa..........................................................156
ANEXO V. Folha de rosto e envio ao CONEP......................................................................159
xx
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDAS
FMT-HVD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado
HGR-RS Hospital Geral de Roraima Rubens de Sousa Bento
HMB Hospital Municipal de Borba
IBEx Instituto de Biologia do Exército
RJ Rio de Janeiro
RR Roraima
EME Estado Maior do Exército
DOU Diário Oficial da União
SATL Soro Antiofídico Trivalente Liofilizado
SAMBL Soro Antiofídico Mono e Bivalente Líquido
p p-value (p-valor)
RAP Reação Adversa Precoce
AV Antivenom (Antiveneno)
FDTAV Freeze-drying Trivalent Antivenom
SLAV Standard Liquid Antivenom
EAR Early Adverse Reaction
IRA Insuficiência Reanal Aguda
OMS Organização Mundial da Saúde
WHO World Health Organization
St Saint
UK United Kingdom
GBD Global Burden Disease
CPK Creatinofosfoquinase
DHL Desidrogenase Láctica
LHF-I Lachesis Hemorrhagic Factor I
LHF-II Lachesis Hemorrhagic Factor II
Km2 Kilometro quadrado
xxi
L. m. m. Lachesis muta muta
UTI Unidade de Tratamento Intensivo
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FUNASA Fundação Nacional da Saúde
TFD Tratamento Fora do Domicílio CTA Companhia de Transporte Aéreo
FAB Força Aérea Brasileira
EB Exército Brasileiro
TC Tempo de Coagulação
Fig. Figura
B. Bothrops
LM-PLA2 Lachesis muta-Phospholipase A2
AST Aspartato Amino-Transferase
ALT Aspartato Alanino-Transferase
NASA National Aeronautics and Space Administration
SP São Paulo
F(ab7)2 Antigen-binding Fraction 2
EV Endovenoso
VO Via Oral
SC Subcutâneo
PDP Product Development Partnership
ml/Kg Mililitros por Kilograma
Km2 Quilômetro quadrado
PNI Programa Nacional de Imunização
SAB Soro Antibotrópico
SAC Soro Anticrotálico
SAL Soro Antilaquético
SABL Soro antibotrópico-laquético
SABC Soro antibrópico-crotálico
H1 Histamina 1
xxii
H2 Histamina 2
INCQS Instituto Nacional de Controle da Qualidade em Saúde
Fiocruz Fundação do Instituto Oswaldo Cruz
mg/mL Miligrama por mililitro
mg Miligrama
g Grama
mTorr milliTorr (unidade de pressão para medidas de elevado vácuo)
°C graus Celsius
FED Fundação Ezequiel Dias
IVB Instituto Vital Brasil
IB Instituto Butantan
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
PRC Protocolo de Registro de Caso
H4 Hora 4
H12 Hora 12
H24 Hora 24
D7 Dia 7
D15 Dia 15
TNF Fator de Necrose Tumoral
EAS Elementos Anormais e Sedimentoscopia
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CONEP Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
SUMÁRIO
1 - INTRODUÇÃO.................................................................................................... 1
1.1 ACIDENTES OFÍDICOS................................................................................... ...........1
1.1.1 EPIDEMIOLOGIA.......................................................................................... ...........1
1.1.2 TRANSPORTE DAS VÍTIMAS POR VIA FLUVIAL...................................................5
1.1.3 TRASNPORTE DAS VÍTIMAS POR VIA AÉREA......................................................8
1.1.4 ACIDENTE OFÍDICO COMO ACIDENTE OCUPACIONAL....................................12
1.1.5 GÊNEROS DOS OFÍDIOS RELACIONADOS AO PROJETO.................................13
1.1.5A GÊNERO BOTHROPS.........................................................................................14
1.1.5B GÊNERO CROTALUS.........................................................................................16
1.1.5C GÊNERO LACHESIS...........................................................................................17
1.1.6 CARACTERIZAÇÃO E AÇÃO DOS VENENOS......................................................18
1.1.6A BOTHROPS ATROX............................................................................................20
1.1.6B CROTALUS DURISSUS......................................................................................23
1.1.6C LACHESIS MUTA................................................................................................24
1.1.7 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS................................................................................25
1.1.7A ACIDENTE BOTRÓPICO.....................................................................................26
1.1.7A1 MANIFESTAÇÕES LOCAIS...............................................................................26
1.1.7A2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS......................................................................28
1.1.7A3 COMPLICAÇÕES..............................................................................................29
1.1.7B ACIDENTE CROTÁLICO.....................................................................................33
1.1.7B1 MANIFESTAÇÕES LOCAIS..............................................................................34
1.1.7B2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS.....................................................................34
1.1.7B3 COMPLICAÇÕES..............................................................................................35
1.1.7C ACIDENTE LAQUÉTICO.....................................................................................36
1.1.7C1 MANIFESTAÇÕES LOCAIS..............................................................................36
1.1.7C2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS.....................................................................36
1.1.7C3 COMPLICAÇÕES..............................................................................................37
1.1.8 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL..........................................................................38
1.1.9 TRATAMENTO............................................................................. ..........................39
1.1.10 SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE LIOFILIZADO..............................................44
1.1.10A HISTÓRICO.......................................................................................................44
1.1.10B LIOFILIZAÇÃO...................................................................................................47
2 - JUSTIFICATIVA.........................................................................................................51
3 - OBJETIVOS...............................................................................................................53
3.1 OBJETIVO GERAL....................................................................................................53
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................................53
4 - MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................... 53
4.1 OBTENÇÃO DO SATL.............................................................................................. 53
4.2 DESENHO DO ESTUDO E PARTICIPANTES.......................................................... 54
4.3 SELEÇÃO DE PACIENTES, INTERVENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA.......56
4.4 SEGUIMENTO DOS PACIENTES.............................................................................58
4.5 DESFECHO DA SEGURANÇA.................................................................................58
4.6 DESFECHO DA EFICÁCIA.......................................................................................58
4.7 CEGAMENTO............................................................................................................59
4.8 TESTE DE RECONSTITUIÇÃO................................................................................59
4.9 CONTROLE DE ESTABILIDADE E QUALIDADE.....................................................60
4.10 MÉTODOS ESTATÍSTICOS....................................................................................60
4.11 ÉTICA......................................................................................................................61
5 - RESULTADOS...........................................................................................................61
6 - DISCUSSÃO............................................................................................................109
6.1 ANÁLISE DA EFICÁCIA..........................................................................................109
6.2 ANÁLISE DA SEGURANÇA....................................................................................111
6.3 TESTE DE RECONSTITUIÇÃO..............................................................................112
6.4 RESULTADOS DA ESTABILIDADE........................................................................113
7 - CONCLUSÕES........................................................................................................113
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................115
9 - ANEXOS...................................................................................................................130
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 ACIDENTES OFÍDICOS
1.1.1 EPIDEMIOLOGIA
O acidente ofídico é um relevante problema de saúde pública nos países
tropicais pela frequência com que ocorrem e complicações locais e sistêmicas
que produzem. No mundo, cerca de 2.5 milhões pessoas são envenenadas
por ano, metade das quais requerem atendimento médico, e provavelmente
mais que 100.000 indivíduos sofrem severas sequelas. A América Latina
ocupa o terceiro lugar (Fig. 1) no ranking de óbitos por acidentes ofídicos só
sendo superada pelo Leste Asiático e África Subsaariana (1-6).
Segundo dados mais recentes apresentados pela OMS no “Oxford
Simposia - Venoms 2017 –St. Hilda’s College, Oxford University - UK”, os
acidentes ofídicos foram recentemente adicionados à lista da OMS como uma
das Doenças Negligenciadas (7); afetam as vidas de cerca de 4.5 milhões de
pessoas todos os anos no mundo, causando injúrias em 2.7 milhões de
homens, mulheres e crianças, e causam cerca de 125.000 mortes a cada ano,
sendo a maioria de crianças e trabalhadores da agricultura no período mais
produtivo de suas vidas. Cerca de 400.000 vítimas sofrem de incapacidade de
longa duração, constantes cuidados da saúde, amputações e seguimento por
sequelas psicológicas. Para aqueles que conseguem tratamento, os familiares
são forçados a decidir entre a vida e os anos de dívidas pelo alto custo dos
antivenenos, que nem sempre são disponíveis. Globalmente os maiores
agravos ocorrem nas regiões tropicais, onde muitos países permanecem em
subdesenvolvimento ou sofrem pela pobreza de governos, problemas sociais
e/ou políticos, conflitos, escassez na pesquisa, alto nível de agravos ou ainda,
insegurança alimentar. Decididamente o acidente ofídico não é uma doença
sem tratamento, mas infelizmente muitas centenas de milhares de vítimas não
são tratadas todos os anos. Os soros antiofídicos que foram desenvolvidos
primeiro na década de 1890, oferecem o potencial de salvar muitas vidas mas,
o alto custo, pouca disponibilidade, e em alguns casos, baixa qualidade dos
soros produzidos por inescrupulosos fabricantes tem diminuído a confiança na
2
imunoterapia e, muitos governos, simplesmente colocam este problema como
de difícil solução (8).
No Brasil, o Ministério da Saúde tornou obrigatória, a partir de 1986, a
notificação dos acidentes ofídicos. No período de janeiro de 1987 a dezembro
de 1993 foram notificados 143.836 casos, o que representava uma média de
20.000 casos/ano no país. No ano de 2000, de junho a dezembro, 8.574 casos
foram notificados, no mesmo ano em que foram produzidos os primeiros lotes
do soro antiofídico trivalente liofilizado para estudo. Os dados foram obtidos
do Sistema de Vigilância Epidemiológica, implantado na unidades federadas
do país, apesar de que constatávamos ainda uma evidente subnotificação, na
maioria dos estados brasileiros. A maioria das notificações procediam das
Regiões Sudeste e Sul, as mais populosas do país e que contam com melhor
organização de serviços de saúde e sistema de informação. Contudo esta
realidade vem se modificando nos últimos anos e tanto as notificações têm
Figura 1. Distribuição regional das estimativas de mortes no mundo devido a picadas de serpentes (Fonte: 3)
3
tido um progressivo aumento como as diferenças regionais vem sendo
modificadas em função de uma maior conscientização dos profissionais em
relação ao registro de casos, embora as subnotificações ainda expressem
uma indesejável realidade. No período de 2001 a 2006, a mortalidade na
Região Norte foi de 49 por 100.000 habitantes para 14 por 100.000 habitantes
no país (9-18). A taxa de morbidade anual notificada dos acidentes é de 15
por 100.000 habitantes e a incidência global de envenenamento é cerca de
20.000 casos por ano. Em 2012, foram registrados no país 28.983 casos de
vítimas de ofidismo e os gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis e Micrurus são
os principais causadores de agravos de importância médica. O Ministério da
Saúde registrou no ano de 2013 o número de 27.181 acidentes ofídicos no
Brasil (19) com um cenário mais compatível com a realidade, pois a maior
incidência foi observada na Região Norte (52,6 casos/100.000 habitantes),
seguido pelo Centro-Oeste (16,4/100.000) (20).
O Estado do Amazonas é o maior estado da federação brasileira em
extensão territorial, possuindo uma área de 1.577.820,2 km2, coberto em
grande parte pela vegetação da floresta tropical úmida. Somente no Estado
do Amazonas cabem mais de quatro Reinos Unidos dada a dimensão
continental do Estado que contém a maior floresta tropical do mundo. Esse
Estado está dividido em 62 municípios, os quais possuem baixa densidade
demográfica, variando de 0,095 a 100,9 habitantes/km2 (21). No Estado do
Amazonas a ocorrência é pelo menos seis vezes maior do que os valores
notificados, onde têm os maiores índices de morbidade, mortalidade e
fatalidade pelas dificuldades de acesso ao atendimento nas sedes dos
municípios. Esses números podem ser maiores ainda na Amazônia Brasileira
e podem ser subestimados pela persistente subnotificação (15). As principais
atividade econômicas, da maioria dos municípios do Estado do Amazonas,
são o extrativismo vegetal, como borracha, madeira, gomas nãoelásticas, óleo
de copaíba, castanha, dentre outras e a agricultura, o que favorece o contato
dos habitantes com animais peçonhentos (22). Trabalhadores rurais do sexo
masculino, sobretudo os que exercem a agricultura, caça e silvicultura (11, 12)
são os mais afetados, correlacionando nestes casos os acidentes ofídicos ao
risco ocupacional. Uma “autópsia” verbal em comunidades com população
indígena e seringueiros revelou que 13% desses indivíduos tinham sido
4
picados por serpente pelo menos uma vez na vida (11). Há uma correlação
entre a incidência dos acidentes com serpentes e os índices pluviométricos
mais elevados nos período chuvoso (15, 23-25), havendo uma grande
influência da sazonalidade na incidência ao longo do ano pois no período de
novembro a maio (período de maior índice pluviométrico) há uma maior
vulnerabilidade das comunidades amazônicas, sobretudo nos que vivem em
áreas ribeirinhas (Fig. 2 e Fig. 3), onde observa-se uma extensa área de
elevada incidência que se extende do nordeste para a região central do estado
onde a incidência alcança aproximadamente 150 casos/100.000
habitantes/ano (20, 26).
Figura 2. Distribuição espacial dos acidentes ofídicos no Estado do Amazonas no período de 2007 a 2012. (Fonte: 20)
.
5
Figura 3. Sazonalidade (número mensal de acidentes relacionados ao período de chuvas) dos acidentes ofídicos registrados no Estado do Amazonas de 2007 a 2012. (Fonte: 26)
1.1.2 TRANSPORTE DAS VÍTIMAS POR VIA FLUVIAL
A distribuição sazonal dos casos para as Regiões Sul, Sudeste e CentroOeste,
mostra um incremento dos acidentes no período de março. Na Região Nordeste,
aumentam de janeiro a maio, enquanto que na Região Norte, principalmente no
estado do Amazonas, a ocorrência mostra-se maior no período das chuvas
(novembro a maio), particularmente na época de cheia dos rios em fevereiro. A Bacia
Amazônica é a maior bacia fluvial do mundo (Fig. 4) e os índices pluviométricos
variáveis fazem com que ocorram períodos de cheia e seca nos rios (Fig. 5, 8 e 10),
isto causa deslocamento dos trabalhadores das áreas ribeirinhas modificando o
cenário epidemiológico dos acidentes ofídicos.
6
Figura 4. Bacia Amazônica, maior bacia hidrográfica do mundo. (Fonte: Secretaria Executiva do Ministério dos Transportes).
No período de cheia, as serpentes, ao procurarem lugares mais secos, se
aproximam das comunidades rurais e ribeirinhas. No período de seca ocorre o
inverso pois os trabalhadores rurais e ribeirinhos se aproximam das serpentes para
o plantio, pescaria, pecuária e extrativismo nas áreas férteis. Estas variações
afetam sobretudo a navegabilidade dos rios e quando, no período de seca, o
transporte fluvial para socorro dos doentes fica inviável (Figs. 5 e 6).
Figura 5. Precária condição de navegabilidade ((Fonte: https://sandcarioca.wordpress.com/2010/10/26/seca-e -cheia-umfenomeno-natural-na-amazonia/).
Figura 6. Atividade de pesca comprometida pela seca (Fonte:https://sandcarioca.wordpress.com/2010/10/ 26/seca-e-cheia-umfenomeno-natural-na-amazonia/)
7
Figura 7. Período de cheia e diversidade de transporte. (Fonte:https://sandcarioca.wordpress.com/2010/10/26/ seca-e-cheia-umfenomeno-natural-na-amazonia/).
O percurso na navegação fluvial é extremamente variável assim como o
tempo no transporte das vítimas, dependendo diretamente da alternância de
período de cheia ou seca. (Figs. 7, 8 e 9). Assim, se em uma época esse
transporte é facilitado por caminhos mais curtos pelos braços do rios no
período de cheias, pode-se ter um caminho longo e dificultado pela
sinuosidade dos rios e obstáculos de troncos e árvores ao longo do trajeto.
Por vezes, a sinuosidade é tão grande que um longo trecho é percorrido ao
se fazero trajeto oposto ao já percorrido, o que demanda tempo e mais gasto
de combustível (Fig. 9). Por vezes os navegadores carregam a canoa pelo
interior da selva para ganharem tempo, denominando este encurtamento da
rota com o termo “furo”. Não raras as vezes, se utilizam de facas longas
popularmente conhecidas como “terçados” e até serra elétrica para abrirem
caminho cortando árvores e troncos ao longo dos próprios rios, desobstruindo
assim o caminho. É importante ressaltar que existem muitas cachoeiras na
Amazônia que dificultam a navegabilidade, tendo a maior cachoeira do Brasil
no Parque Estadual Serra do Aracá (com 18.187 km²), localizada no município
de Barcelos, segundo maior município do Brasil (com 122.475,728 km2), e
medindo 365 metros de altura (Fig. 11).
Figura 8. Rio de fácil navegabilidade em período de cheia. (Fonte: http://www1.folha.uol.com.br/ciencia /2017/09/ 1915243-seres-humanos-alteram-florestas-ha-45-mil-anos-mostra-estudo.shtml).
8
1.1.3 TRANSPORTE DAS VÍTIMAS POR VIA AÉREA
A evacuação aeromédica se torna necessária em virtude da urgência em
aplicar a soroterapia antiveneno e, além de ser perigosa com relatos de
quedas de aeronaves, é extremamente dependente das variações climáticas
e período do dia. Há regiões em que não se voa com instrumentos de controle
de tráfego aéreo e os vôos em sua maioria são realizado por controle visual
pelo próprio piloto. Isto causa uma grande interferência na navegação aérea
de emergência, pois em períodos de chuvas há uma determinante redução da
visibilidade, perdendo-se as referências do sobrevoo dos rios a noite. Deve se
considerar que muitos acidentes ofídicos são causados no fim do período
vespertino e noturno, em que as serpentes peçonhentas circulam em busca
Figura 9. Rio com condições de navegabilidade dificultada pela sinuosidade no período da seca (uma longa volta para retornar a uma posição paralela). Fonte: (http://www.oeco.org.br/oeco amazonia/majestosos-rios-amazonia/).
Figura 10. Variação dos níveis hidrográficos no rio Negro. (Fonte:http://d.emtempo.com.br/DIA-A-DIA/18121/nivel-das-aguas-do-rio-negro-permanece-estavel-nesta-sexta).
Figura 11. Cachoeira do El Dourado, a maior cachoeira do Brasil, localizada no Parque Estadual Serra do Aracá, município de Barcelos - AM. (Fonte: https://manauspramim.com.br/ 2011/09/21/amaior-cachoeira-do-brasil-araca-amazonas/).
9
de alimentos e os nativos se dirigem a mata para caçar ou retornam de suas
atividades de agricultura ou pesca de subsistência. Os custos com o
transporte aéreo, nem sempre viáveis, são elevados e oneram bastante os
cofres públicos.Todavia, são necessários devido as condições do acidente e
necessidade do uso da soroterapia em curto prazo de tempo. Usam-se dois
tipos de transportes em dois momentos diferentes, sendo o primeiro das
aldeias e lugares sem campo de pouso adequado, havendo acesso muitas
vezes apenas para helicópteros após a abertura de clareiras. Este transporte
é feito do local do acidente nas comunidades até as Unidades de Saúde dos
municípios onde, havendo o soro (o que nem sempre acontece pelas crises
de desabastecimento), o paciente recebe a primeira abordagem terapêutica.
Das Unidades de Saúde Municipais, as vítimas são evacuadas para
Manaus chegando a FMT-HVD (hospital de referência para vítimas de animais
peçonhentos), isto se deve a evolução com gravidade nas vítimas,
considerando que a maioria recebe o soro após seis horas do acidente. O
soro antiveneno utilizado é apresentado na forma líquida e necessita de
refrigeração constante entre 2 e 8 graus Celsius. Nos locais dos acidentes,
quando existe energia, esta é fornecida por geradores que ficam ligados por
12 horas no período noturno, inviabilizando a conservação adequada do soro
na forma líquida. Segundo dados fornecidos pela Direção Aeromédica da
empresa Manaus Aerotáxi que é responsável pelo transporte em UTI aérea
do Estado do Amazonas, este transporte é feito por aeronaves modelo
Caravan terrestre e anfíbio tipo Bandeirantes bem como pequenos jatos. Este
transporte é feito pelo contrato 007/2011 entre a empresa e o Estado do
Amazonas. A Tabela 1 mostra dados de alguns transportes nos últimos três
anos. Há uma outra empresa denominada Heringer com contrato com a
FUNASA que faz também o transporte dos indígenas, ficando difícil
contabilizar os gastos totais nos transporte destes pacientes. Ainda existem
municípios que fretam suas próprias aeronaves para o transporte de pacientes
incluindo também as vítimas de acidentes ofídicos que não necessitam de
UTI, esta condição é denominada Tratamento Fora do Domicílio (TFD).
Após o primeiro atendimento no município de origem, havendo
necessidade devido a gravidade e/ou sequelas, o que geralmente acontece
pela demora no uso do soro antiveneno, o paciente é transportado para
10
Manaus através das diversas Companhias Aéreas como CTA, Rico, Two e
Amazon Naves. Os pacientes são aerotransportados para Manaus, onde
existe mais recursos nos centros de referência como a FMT-HVD, uma
instituição de atendimento em nível terciário que está destinada a
desempenhar três funções básicas: prestar assistência médica e prevenção
de doenças infecciosas e parasitárias; gerar, absorver e difundir
conhecimentos científicos e tecnológicos na área de doenças tropicais
infecciosas e parasitárias; e contribuir para a formação dos recursos humanos
nas áreas de doenças tropicais. Diante do exposto, percebe-se a magnitude
e variabilidade da evacuação aeromédica na região, sendo difícil dimensionar
os relevantes gastos com transporte de vítimas de acidentes ofídicos.
Algumas informações financeiras obtidas através da Direção Aeromédica da
empresa Manaus Aerotáxi (contrato 007/2011 entre a empresa e o governo
do Amazonas), são apresentadas na Tabela 2.
Tabela 1. Evacuação aeromédica de pacientes vítimas de acidentes ofídicos em Unidade de Terapia
Intensiva móvel, para Manaus, de 2014 a setembro de 2017.
Data Idade (anos) Sexo Origem do caso
25/09/2014 21 Feminino São Gabriel da Cachoeira
27/11/2014 38 Masculino Tabatinga
29/01/2015 20 Masculino Eirunepé
30/01/2015 26 Masculino São Gabriel da Cachoeira
24/03/2015 24 Masculino Eirunepé
27/11/2015 65 Feminino São Gabriel da Cachoeira
12/12/2015 85 Masculino São Gabriel da Cachoeira
28/03/2016 37 Masculino Apuí
05/04/2016 69 Masculino São Gabriel da Cachoeira
05/08/2016 50 Masculino São Gabriel da Cachoeira
30/12/2016 20 Masculino São Gabriel da Cachoeira
12/09/2017 52 Masculino Tabatinga
11/10/2017 77 Feminino São Gabriel da Cachoeira
Fonte: Direção Aeromédica da empresa Manaus Aerotáxi.
11
Tabela 2. Custos estimados de evacuação aeromédica de pacientes vítimas de acidentes ofídicos em
Unidade de Terapia Intensiva móvel, para Manaus, a partir de diferentes origens.
Origem Destino Custo estimado (R$)
São Gabriel da Cachoeira Manaus 34.476,00
Tabatinga Manaus 47.476,00
Eirunepé Manaus 49.335,00
Apuí Manaus 18.798,00
Tefé Manaus 16.000,00
Parintins Manaus 16.000,00
Ipixuna Manaus 44.000,00
Fonte: Direção Aeromédica da empresa Manaus Aerotáxi.
Existe ainda um custo operacional de resgate não repassado para os
municípios, que é suprido pelos recursos federais através de missões
humanitárias. Estes valores não foram computados neste trabalho, mas sem
dúvida são relevantes assim como a atuação das Forças Armadas (Exército
Brasileiro - EB e Força Aérea Brasileira - FAB) no atendimento às vítimas de
acidentes ofídicos. Um dos muitos exemplos é recente: uma criança indígena
de 5 anos, da tribo Mayuruna, resgatada pelo helicóptero Black Hawk, onde
não existe campo de pouso para aeronaves de asa fixa e a navegação nos
rios para efetuar o socorro ficaria inviável pelo tempo de navegação e
possíveis obstáculos. A criança foi picada por uma serpente do gênero
Bothrops como relatado pela FAB: “antes do amanhecer, o Esquadrão Harpia
decolou de São Gabriel da Cachoeira (856 km de Manaus) com direção à
aldeia Nova Esperança, localizada na região de Palmeira do Javari (1.437 km
da capital amazonense). Do local, o helicóptero H-60 Black Hawk voou para
Tabatinga (1.110 km de Manaus), para que o menino recebesse o
atendimento necessário” (27). O relato mostra a importância de um soro que
possa ser administrado mais próximo onde ocorrem os acidentes, os registros
fotográficos desta evacuação são apresentados abaixo (Fig.12, 13 e 14).
12
1.1.4 ACIDENTE OFÍDICO COMO ACIDENTE OCUPACIONAL
A ocorrência do acidente ofídico está geralmente relacionada à fatores
climáticos e ao aumento das atividades no setor agropecuário (preparo da
terra, plantio e colheita). Essas observações parecem reforçar a idéia de que
o acidente ofídico é um acidente de trabalho, uma vez que a sua incidência
coincide com o deslocamento do trabalhador rural para as suas atividades.
Além disso, esses indivíduos não utilizam de maneira adequada, a
indumentária protetora, como sapatos, botas, perneiras e luvas. Em cerca de
53% das notificações, a faixa etária acometida situa-se entre 15-49 anos, o
que corresponde ao grupo de idade onde mais concentra a força de trabalho.
Aproximadamente 70% dos pacientes acometidos são do sexo masculino, o
que é justificado pelo fato do homem desempenhar, com mais frequência,
atividades de trabalho fora da moradia, onde os acidentes ofídicos
habitualmente ocorrem. No Estado do Amazonas existe uma relação de
algumas atividades laborativas relacionadas a alguns municípios com mais
Figura 12. Helicóptero Black Hawk da FAB utilizado na missão de resgate. (Fonte:http:// www.fab.br/noticias/mostra/).
Figura 13. Operação de resgate na aldeia Nova Esperança. (Fonte: http://www.fab.mil.br /noticias/mostra/).
Figura 14. Atendimento dentro do helicóptero Black Hawk. (Fonte: http://www.fab.mil.br /noticias/mostra/).
13
elevada incidência de acidentes ofídicos, como por exemplo: plantio de
mandioca para a produção de farinha em Uarini, plantio do guaraná em
Maués, plantio da laranja e indústria madeireira em Rio Preto da Eva, e
ecoturismo em Noivo Airão (Fig. 15).
1.1.4 GÊNEROS DOS OFÍDIOS RELACIONADOS AO PROJETO
No Amazonas, de acordo com a distribuição geográfica, existem sete
viperídeos: Bothrops atrox (Fig.16A), Bothrops brazili (Fig. 17), Bothrops
bilineatus (Fig. 16B e 16C) Crotalus durissus (Fig. 16F), Lachesis muta (Fig.
16E) e Bothrocophias hyoprora (Fig. 16D). Existe ainda três gêneros da
família Colubridae que podem causar envenenamento em humanos que são:
Philodryas sp, Clelia clelia e Erythrolampus aesculapii e ainda o registro de
onze elapídeos como: Micrurus averyi, Micrurus collaris, Micrurus filiformis,
Micrurus hemprichii (Fig. 16G), Micrurus karlschimidti, Micrurus langsdorff,
ESTADO DO AMAZONAS – ACIDENTES RELACIONADOS À ATIVIDADE LABORATIVA
MANAUS
MUNICÍPIOS PERIFÉRICOS
31 - MAUÉS – guaraná 10 - RIO PRETO DA EVA - laranja e indústria madeireira 16 - UARINI - mandioca 6 - NOVO AIRÃO - ecoturismo
4
Figura 15. Distribuição espacial dos acidentes ofídicos no Estado do Amazonas no período de 2007 a 2012, relacionada com atividades laborativas e sequelas (Fonte: adaptado da referência bibliográfica 20).
14
Micrurus lemniscatus (Fig. 16H), Micrurus narducii, Micrurus putumayensis,
Micrurus spixii e Micrurus surinamensis (6, 21).
Figura 16. Serpentes e nvolvidas nos acidentes em humanos na Amazônia Brasileira. Imagens das oito principais espécies de serpentes responsáveis por envenenamentos são mostradas (A-H): Jararaca-do-norte (A) está implicado na maioria das picadas de serpentes em humanos registrados na região da Amazônia brasileira (80% -90%), seguido por Lachesis muta (E). (Fonte: 6).
Como o objetivo deste estudo envolve um soro antiofídico trivalente liofilizado
para os gêneros Bothrops, Lachesis e Crotalus, descreveremos sobre esses
principais gêneros a seguir.
1.1.5A GÊNERO BOTHROPS
Os acidentes pelo gênero Bothrops são os de maior importância
epidemiológica no país, responsável por mais de 90% dos acidentes por
ofídios peçonhentos. Existem cerca de 30 espécies, distribuídas por todo o
território nacional, tendo como habitat preferencial, ambientes úmidos das
matas e áreas cultivadas. Na Amazônia podem ser encontradas até 4
espécies diferentes do gênero Bothrops, porém no Estado do Amazonas
Figura 17. Bothrops brazili. (Foto: M. Martins).
15
podemos encontrar mais frequentemente a Bothrops atrox e a Bothrops
brazili, sendo a primeira a maior causa dos acidentes. Também podem ser
encontradas a Bothrops bilineatus e a Bothrops taeniatus, adicionalmente a
um outro viperídeo, reconhecido como uma quinta espécie de jararaca,
denominado Bothrocophias hyoprora (6, 21).
A Bothrops atrox (Fig. 18), espécie estudada neste trabalho, recebe
denominações populares como jararaca e jararaca do norte, na região
amazônica, principalmente nos interiores também é chamada de
surucucurana, o sufixo “rana” significa “parecida com”, portanto há que se ter
cuidado para que o profissional de saúde não entenda que a vítima possa
estar se referindo a “surucucu pico-de-jaca” ou “bico-de-jaca” que seria a
Lachesis. Muitas vezes os nativos dizem que foram picados pela surucucu
mas, quando observamos na anamnese dirigida, verificamos que pela
descrição da serpente e pelo local onde ocorreu o acidente, se trata de uma
Bothrops atrox. Trata-se de uma serpente ágil e ativa, que pode superar 1,5
metros de comprimento, de colorido muito variável, que frequenta as beiras
dos córregos e igarapés (28), quando filhote pode ter uma coloração mais
clara, embora isto seja extremamente variável podendo até ter um marrom
mais escuro, apresenta a cauda branca para simular uma larva e atrair os
predadores que se transformam em presas numa fração de segundos, esta
característica ardilosa é denominada de engodo caudal, por esta razão os
nativos a chamam de “jararaquinha do rabo branco” (Fig. 19). Embora seja
terrícola, pode ser encontrada nos galhos de árvores, principalmente no
período de cheias dos rios amazônicos, o que se considera uma adaptação
transitória e circunstancial para sobrevivência. A coloração marrom a faz se
camuflar entre as folhagens caídas no chão e em decomposição pela umidade
das matas amazônicas. Costuma causar acidentes em regiões rurais e
periurbanas, mas temos observado também em região urbana onde se
concentram roedores pelo lixo acumulado e sem destinação própria. Esta
serpente tem uma ampla capacidade de adaptação e nos sítios tem adentrado
aos domicílios causando também acidentes intradomiciliares.
16
1.1.5B GÊNERO CROTALUS
Os acidentes pelo gênero Crotalus, ocorrem em cerca de 8% entre
os acidentes no país, variando de acordo com a região. Há apenas uma
espécie (Crotalus durissus) encontrada em todo o país, à exceção de áreas
florestais e zona litorânea. São encontradas em campos, áreas secas,
arenosas e pedregosas. Na Amazônia são encontradas em algumas regiões
onde existem áreas de campos como na Ilha de Marajó, Santarém, norte do
Pará, Humaitá, norte do Amapá e Roraima, onde recebe o nome de
subespécie Crotalus durissus ruruima (descrita por Hoge em 1966) em alusão
as savanas de Roraima onde é encontrada com frequência. Popularmente
recebem a denominação de boicininga, maracambóia, boiçununga, boiquira,
maracá, cascavel-de-quatroventas ou simplesmente cascavel por que em seu
extremo caudal apresentam um chocalho, guizo ou cascavel, utilizado para
alertar os predadores e evitar o confronto, portanto fazem um ruído
característico quando em estresse antes do ataque. A espécie Crotalus
durissus tem ampla distribuição geográfica mas na Região Amazônica podem
ser encontradas as subespécies Crotalus durissus marajoensis (descrita por
Hoge em 1966) na Ilha de Marajó e no Pará (Fig. 20) e a Crotalus durissus
terrificus, descrita por Laurenti em 1768 (Fig. 21), mais divulgada e encontrada
no Mato Grosso, Rondônia, Amazonas e Pará (em campos abertos de
Humaitá, Serra do Cachimbo e Santarém). A Crotalus durissus ruruima (Fig.
22) possui uma peçonha com atividades farmacológicas próprias e,
aparentemente, seu veneno não é bem neutralizado pelo soro anticrotálico no
país (28).
Figura 18. Bothrops atrox adulta. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 19. Bothrops atrox filhote, nota-se a cauda com coloração branca para o engodo caudal. (Fonte: arquivo próprio)
17
1.1.5C GÊNERO LACHESIS
Os acidentes pelo gênero Lachesis (Fig. 23) ocorrem em torno de 1,5%
dos acidentes ofídicos no Brasil. Há uma única espécie habitando
principalmente áreas florestais da Amazônia, Mata Atlântica e alguns enclaves
de matas úmidas do Nordeste. A letalidade no Brasil está próxima de 0,5%,
sendo que a causa da maioria dos óbitos ocorre no grupo de pacientes
atendidos com seis horas ou mais do acidente. Portanto, o tempo entre o
acidente e a administração do soro, sobretudo neste gênero, é sem dúvida
alguma, o fator mais importante para o prognóstico do caso. Popularmente é
conhecida como surucucu, surucutinga, pico-de-jaca ou bico-de-jaca devido a
sua superfície tegumentar ser semelhante a casca da jaca. Há uma tendência
de classificá-la como monotípica, ou seja, como tendo uma única espécie
(Lachesis muta) sem subespécies, com base na análise filogenética e
estatística. São extremamente temidas, vista pelos caboclos como muito
agressivas apesar deste comportamento não ser observado em cativeiro.
Podem chegar até 3,5 metros de comprimento sendo considerada a maior
serpente peçonhenta das Américas (28). Habitam principalmente as florestas
Figura 20. Crotalus durissus marajoensis. (Fonte: http://www.studioe venaar.nl/dierenpark/abc/cascavel.php).
Figura 21. Crotalus durissus terrificus. (Fonte: http://www.serpentario.edu.uy/ expolaura/3.html).
Figura 22. Crotalus durissus ruruima. (Fonte:https://cobrasserpentes.blogspot.com.br/2012/09/cascavel.html).
18
primárias da Região Amazônica, são umbrófilas e preferem as matas úmidas,
com pouca claridade gerada pela extensa copa de árvores frondosas e
seculares. Causam mais acidentes em indígenas, caçadores, lenhadores e
madeireiros, entre os quais é bastante temida. Seu bote é desferido após uma
retração da metade superior do corpo em um duplo “S” que, com a
compressão lateral desta parte do corpo, semelhante as serpentes
arborícolas, a faz atingir distâncias maiores para picar suas vítimas, se
lançando a uma distância de cerca de metade do comprimento de seu corpo.
São extremamente ágeis em seu deslocamento, principalmente no
crepúsculo, se diferenciando de outros viperídeos. Outra diferença deste
gênero e os outros viperídeos consiste no fato da Lachesis ser ovípara, ou
seja, se reproduz por deposição de ovos em ninhadas, enquanto os outros
são vivíparos, se reproduzindo com geração de placenta (28).
1.1.6 CARACTERIZAÇÃO E AÇÃO DOS VENENOS
As peçonhas de serpentes contêm vinte ou mais componentes diferentes,
mais de 90% do peso seco do veneno é constituído por proteínas,
compreendendo grande variedade de enzimas, toxinas não-enzimáticas e
proteínas não tóxicas. Uma única fração do veneno pode liberar várias
substâncias com ação inflamatória e o estudo dos venenos de serpentes tem
propiciado a elucidação do mecanismo do processo inflamatório. As
serpentes peçonhentas da família viperidae secretam peçonhas que são
misturas complexas de substâncias orgânicas e inorgânicas. Entre os
componentes orgânicos, destacam-se as proteínas (algumas biologicamente
ativas), nucleotídeos, aminoácidos e peptídeos que também podem ser
Figura 23. Lachesis muta. (Fonte: arquivo próprio).
19
encontrados. Já entre os componentes inorgânicos, os mais frequentemente
encontrados são cálcio, cobre, ferro, potássio, magnésio, sódio, fósforo,
cobalto e zinco. Alguns exercem a função de manter a estabilidade estrutural
das metaloproteínas, tais como nos fatores hemorrágicos. Outros
componentes inorgânicos exercem funções catalisadoras, em determinadas
reações enzimáticas.
O veneno de Bothriopsis taeniata (jararaca estrela) (Fig. 16D),
experimentalmente em camundongos, possui atividade anticoagulante, forte
atividade hemorrágica e fraca atividade proteolítica. A atividade
anticoagulante se manifesta impedindo a ativação do fator X ou inibindo o fator
X ativado ou, ainda, agindo diretamente sobre a trombina. Com relação à
sintomatologia e aos sinais observados em humanos, nada foi encontrado na
literatura. Quanto ao veneno de bilineata bilineata (jararaca verde) e Bothrops
bilineata smaragdina (Fig. 16B e Fig. 16C), não foram encontrados dados na
literatura.
Os venenos botrópicos já estudados apresentam variações ontogênicas
(que ocorrem durante o desenvolvimento do indivíduo) e interpopulacionais.
O veneno dos filhotes possui perfil eletroforético diferente e maiores
concentrações de proteínas quando comparado o veneno da serpente adulta.
Essa diferença tem efeito nos sintomas e sinais apresentados por pacientes
picados por serpentes jovens de B. jararaca e B. moojeni, nos quais a
incoagulabilidade sangüínea se manifesta com maior frequência que nos
acidentes causados por serpentes adultas. Variação interpopulacional foi
observada para o veneno de B. atrox (Fig. 16A) no qual a toxicidade variou
entre os venenos das serpentes coletadas no Estado de Tocantins, em
Manaus - AM e em Balbina - AM (39, 42), há também variações no hábito
alimentar pois os filhotes de Bothrops (Fig. 19) têm preferência por anfíbios e
lagartos. Com relação à composição química dos venenos botrópicos,
algumas proteínas já foram isoladas e caracterizadas quanto às atividades
farmacológicas. Do veneno de Bothrops atrox, de exemplares procedentes do
Maranhão, foi isolada uma enzima denominada Batroxobin, que atua sobre o
fibrinogênio transformando-o em fibrina (ação trombina símile), e uma
proteína ativadora da protrombina. Referente ao mesmo assunto, nada foi
20
encontrado na literatura para o veneno de B.brazili (Fig. 17). É importante
lembrar que até 1978 diferentes espécies de Bothrops eram classificadas
como B. atrox e consideradas como raças (ou subespécies) desta. Por este
motivo, quando se encontrar na literatura referência a outras proteínas
isoladas do veneno de B. atrox, a data da publicação deve ser verificada, pois
pode tratar-se de outra espécie (29, 30).
1.1.6A BOTHROPS ATROX
São descritas três atividades fisiopatológicas do veneno botrópico:
proteolítica (inflamatória aguda), coagulante e hemorrágica (13, 32-36). Os
venenos de Bothrops são caracterizados como pertencentes ao grupo das
enzimas e mostram atividade biológica letal, porém há diferenças de acordo
com a espécie e o veneno da Bothrops atrox (16A), apesar de considerado
um dos menos tóxicos para atividade letal, foi um dos mais ativos para a ação
coagulante tipo trombina e com intensa atividade iniciadora de lesões locais.
Isto tem sido observado nas apresentações clínicas desses acidentes pela
intensa e progressiva reação inflamatória local (15, 31, 37, 38).
Apesar do veneno de Bothrops atrox não estar incluído no pool de
venenos utilizados para a produção nacional do soro antibotrópico
poliespecífico, há variações na composição do veneno e as atividades
biológicas dos venenos de uma mesma espécie de serpente, apresentando
variações ontogenética, sexual ou geográfica. Apesar dos achados
demonstrarem que a variação geográfica constitui um fator importante a ser
considerado no veneno de B. atrox não tem sido observado ineficácia
terapêutica do soro padronizado em acidentes de Bothrops atrox no
Amazonas, em particular na FMT-HVD. No mesmo estudo foram
caracterizados o perfil eletroforético e as atividades coagulante, fosfolipásica,
fibrino(geno)lítica, agregante plaquetária, desfibrinogenante, edematogênica
e hemorrágica do veneno de Bothrops atrox. Ficaram caracterizadas as
atividades desfibrinogenante, edematogênica e hemorrágica com capacidade
de induzir migração celular. O soro antibotrópico padronizado pelo Ministério
da Saúde neutralizou as atividades coagulante e desfibrinogenante do veneno
e ficou sugerido que a elevada atividade coagulante do veneno de B. atrox
21
sobre o plasma parece estar relacionada à sua capacidade de causar hidrólise
do fibrinogênio (atividade trombina-símile) e ativar os fatores II e X da
coagulação (atividade procoagulante) (43, 44).
O veneno de Bothrops tem basicamente três atividades em função de
sua composição:
1. Atividade inflamatória aguda causada por um conjunto de frações
bioquimicamente heterogêneas e com especificidades diversas causando os
fenômenos locais. Essas frações são aminas biogênicas pré-formadas do
tipo histamina, pequenos peptídeos ou proteínas como a fosfolipase A2,
estearases, proteases, as calicreínas e cininogenases que são enzimas
liberadoras de cininas e, as lectinas. As frações do veneno, frequentemente,
têm atividade indireta, induzindo ou liberando potentes autacóides como:
bradicina, prostaglandinas, leucotrienos e prostaciclinas, que atuam de
forma complexa e inter-relacionada. Uma única fração pode liberar várias
substâncias com atividade inflamatória, porém esta mesma atividade
inflamatória ao mesmo tempo é multifatorial (45). O processo inflamatório é
multifatorial e os sinais locais como rubor, edema, bolhas e necrose,
provocados pelo veneno das serpentes, não são atribuídos exclusivamente
à sua ação proteolítica inespecífica. Estudos recentes mostram que os
efeitos locais são decorrentes das ações específicas de determinadas
enzimas (hialuronidase, fosfolipases, colagenases etc.) sobre o seu
substrato. O termo "atividade proteolítica" não constitui, a forma adequada
para denominar as reações que ocorrem para a formação do quadro local.
Além das reações enzimáticas específicas, as alterações locais também
podem ser induzidas por infecções secundárias (46). Na indução do
processo inflamatório local agudo há participação da atividade coagulante
desencadeando a formação de trombo na microvasculatura, com
consequente hipóxia, agravamento do edema e necrose tecidual; e que a
atividade hemorrágica, determinada por hemorraginas, pode ampliar o
quadro inflamatório, através de sua atividade sobre o TNF pré-formado,
liberando a citocina ativa que tem potente atividade inflamatória (47).
2. Atividade coagulante sobre o fibrinogênio em que, qualquer que seja o
mecanismo (direto ou indireto) de ativação da cascata de coagulação, o
22
efeito resultante será, principalmente, a transformação do fibrinogênio
circulante em fibrina, resultando na incoagulabilidade do sangue. O termo
"coagulante" está relacionado à clivagem do fibrinogênio, indiretamente,
pelas proteases séricas, ativadas por componentes dos venenos, ou
diretamente por enzimas presentes nos venenos. A incoagulabilidade
sanguínea ocorre por atividade coagulante direta e atividade coagulante
indireta. A atividade direta ocorre devido à presença de enzimas que atuam
diretamente sobre o fibrinogênio, transformando-o em fibrina (ação trombina
símile). A composição química dos sítios ativos dessas enzimas pode variar,
dependendo do veneno do qual foram isoladas. Essas enzimas atuam em
diferentes posições das cadeias da molécula de fibrinogênio, levando à
formação de coágulos de consistências variadas (coágulo frouxo, coágulo
denso, etc.). A atividade coagulante indireta ocorre pela presença de
enzimas que atuam sobre o fator X ou o fator II da cascata de coagulação,
levando ao consumo de fibrinogênio (fator I). Nos venenos botrópicos, que
possuem componentes ativadores do fator X, ocorre também o consumo de
plaquetas e dos fatores V e VIII, que leva à produção de um quadro de
coagulação intravascular disseminada, com a formação e a deposição de
microtrombos na rede capilar, o que pode contribuir para a instalação de um
quadro de insuficiência renal aguda (46). Ocorre ativação dos fatores de
coagulação sanguínea, ocasionando consumo de fibrinogênio e formação de
fibrina intravascular, induzindo frequentemente, incoagulabilidade
sanguínea. A maioria das serpentes do gênero Bothrops possui, isolada ou
simultaneamente, substâncias capazes de ativar complemento, protrombina
e fator X. Há variações na intensidade da atividade coagulante em diferentes
espécies e subespécies(48).
3. Atividade hemorrágica que se deve à presença de metaloproteínas, como
fatores hemorrágicos ou hemorraginas, que atuam sobre a membrana basal
dos vasos sanguíneos, causando sua ruptura. Este fenômeno promove a
necrose de fibras musculares (miotoxidade indireta) em torno de duas horas
após o acidente, devido a lesões na microcirculação. Obviamente as ações
dos venenos sobre a cascata de coagulação podem agravar a ação
hemorrágica final (46). A atividade hemorrágica é atribuída
fundamentalmente às hemorraginas, metaloproteinases que contem zinco,
que podem romper a integridade do endotélio vascular e têm atividade
23
desintegrina que degradam vários componentes da matriz extracelular,
como o colágeno tipo 4, fibronectina e laminina, sendo ainda potentes
inibidoras da agregação plaquetária, ocorrendo ainda potente inibição da
agregação plaquetária (49). São possíveis mecanismos de ação, a digestão
enzimática da lâmina basal da microvasculatura e a ruptura completa das
células endoteliais com formação de gaps, clivagens específicas em pontos-
chave poderiam desencadear mecanismos endógenos amplificadores,
sendo que, atualmente, há clara evidência de ataque proteolítico à lâmina
basal vascular (50-53).
4. Atividade edematogênica que se origina das ações combinadas de toxinas
que atuam diretamente sobre os vasos sanguíneos com outras que liberam
autacóides, tais como prostaglandinas, histamina e bradicinina. As enzimas
como fosfolipase A2, presente na maioria dos venenos, e outras proteases
podem estar envolvidas na formação do edema, por ação direta sobre
células endoteliais ou por ativar a cascata do complemento (46).
1.1.6B CROTALUS DURISSUS
A atividade miotóxica é uma das principais ações dos venenos de
serpentes do gênero Crotalus encontradas no Brasil. A mionecrose resulta da
ação direta de miotoxinas sobre as fibras musculares ou, indiretamente, da
isquemia que se desenvolve no músculo, devido possivelmenmte às
alterações vasculares (46). A ação miotóxica tem sido atribuída à crotamina e
a crotoxina com capacidade de produzir lesões no tecido muscular
esquelético, porém os estudos se referem a Crotalus durissus terrificus e a
Crotalus durissus collilineatus e não à Crotalus durissus ruruima (67).
A atividade coagulante é do tipo trombina e semelhante ao que ocorre
nos acidentes botrópicos e laquéticos em que o tempo de coagulação se
prolonga tornando o sangue incoagulável pelo consumo de fibrinogênio
transformando-o em fibrina e podendo levar a afibrinogenemia (68).
Em Crotalus durissus terrificus já foram isoladas as seguintes proteínas:
girotoxina, crotoxina, proteases coagulantes de fibrinogênio, convulxina e
crotamina. A crotoxina é responsável pelas atividades neurotóxica e
miotóxica, tratando-se de um complexo proteico iônico composto por uma
24
unidade básica denominada fosfolipase A2 e outra ácida denominada
crotapotina, havendo um efeito sinérgico e letal quando injetadas em conjunto.
A crotapotina age como um carreador evitando a adsorção inespecífica da
fosfolipase A2. Já a crotoxina foi isolada tanto de Crotalus durissus terrificus
quanto da Crotalus durissus ruruima e, em camundongos, induz necrose
coagulativa, homogeneização e acidofilia, perda das estriações transversais,
miólise, edema intersticial, congestão e infiltrado leucocitário de
polimorfonucleraes neutrófilos. A crotamina age sobre as estruturas do canal
de sódio da musculatura esquelética alterando a permeabilidade celular aos
íons de sódio. Na Crotalus durissus ruruima com veneno de coloração
amarela, foi demonstrada algumas características diferenciadas como uma
proteína semelhante à crotamina no veneno de coloração amarela, sendo
denominada crotamina IIe-19 que, quando injetada em altas doses na
musculatura esquelética induz vacuolização citoplasmática intensa,
favorecendo maior retenção de água na célula possivelmente pelo aumento
da concentração intracelular de íons sódio e uma outra proteína denominada
fator hemorrágico. A Crotalus durissus terrificus e a Crotalus durissus ruruima
(com veneno de coloração branca) apresentam atividades miotóxica,
neurotóxica e coagulante. O veneno de Crotalus durissus ruruima também
apresenta ações hemorrágica e proteolítica com atividade caseinolítica
(testada sobre a caseína). Embora experimentalmente o veneno de Crotalus
durissus terrificus apresente atividade coagulante de pequena intensidade,
em humanos esta atividade só é observada em torno de 30% dos acidentes
e é atribuída a proteína trombina-símile (protease coagulante de fibrinogênio)
que hidrolisa a cadeia alfa do hidrogênio (46, 50).
1.1.3C LACHESIS MUTA
Algumas das proteínas do veneno de Lachesis muta muta já foram
isoladas e caracterizadas quanto à atividade biológica, dentre as quais
podemos destacar: a "trombina-símile" ("protease coagulante de
fibrinogênio"), dois fatores hemorrágicos (LHF-I e LHF-II), a giroxina, L-
aminoácido oxidase e a cininogenina. Dos venenos das serpentes da região
amazônica, este foi o mais estudado quanto à composição química. O veneno
de L. m. muta apresenta as seguintes atividades biológicas semelhantes às
25
dos venenos das serpentes do gênero Bothrops, ou seja, proteolítica,
coagulante, hemorrágica e ainda uma atividade neurotóxica (vagomimética).
Difere também quanto à ação coagulante, sendo esta atividade bem mais
intensa. Os sintomas e sinais são pouco conhecidos devido à escassez de
casos relatados, mas no geral apresentam dor intensa, edema e hemorragia
de pequeno volume no local, lipotímia, bradicardia, hipotensão arterial e
taquipnéia. Os efeitos hipotensivos induzidos pelo veneno de L. m. muta
provavelmente estão relacionados à ação da cininogenina, que atua sobre a
cascata das cininas, especificamente sobre o cininogênio (46).Tem sido
relatadas várias atividades do veneno de Lachesis como: atividade
inflamatória, coagulante e hemorrágica, uma atividade cininogenase que
explica em parte as alterações neurotóxicas, uma atividade tipo trombina com
similaridade com a giroxina crotálica e ainda uma ação de ativar
plasminogênio (54-59). Foram isoladas várias substâncias como: fosfolipase
A2 (LM-PLA2) com atividade inibidora de ativação plaquetária e atividade
miocárdica, duas metaloproteinases (LHF-I e LHF-II) com atividade
hemorrágica, as quais se atribuem ainda atividade inflamatória local (a LHF-II
teria atividade formadora de e dema e degradação de componentes da matrix
extracelular) quando se trata da Lachesis muta muta, todavia na Lachesis
muta rhombeata o edema também pode ser aparentemente provocado por
histamina, serotonina, metabólitos do aracdônico e óxido nítrico (60-66).
1.1.7 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
O edema do acidente botrópico e laquético é precoce, inicialmente
circunscrito, tenso (ou firme), muitas vezes de tonalidade violácea em
decorrência de sangramento subcutâneo. A equimose pode acometer porção
extensa do membro e o quadro doloroso acompanha, muitas vezes, a região
ou membro acometido, sendo proporcional ao edema. Ocorre eritema,
hemorragia local, flictena, equimose e podem ocorrer manifestações
sistêmicas como gengivorragia, epistaxe, hematêmese e hematúria, e ainda
insuficiência renal, infecção secundária, necrose e síndrome compartimental
como complicações. O veneno laquético apresenta atividade coagulante,
hemorrágica, inflamatória aguda e ainda uma atividade cininogenase que
26
poderia explicar, em parte, algumas das alterações clínicas denominadas de
“neurotóxicas”, como a síndrome vagal (2, 13, 15, 53, 69-77).
No acidente crotálico, os sinais e sintomas geralmente relatados se
referem a Crotalus durissus terrificus por ser o gênero mais comum no país
enquanto que não temos encontrado relatos clínicos em acidentes de número
suficiente na Crotalus durissus ruruima, embora haja um índice de 14% de
acidentes. Outro fator importante é a descrição de dois tipos de venenos,
amarelo e branco, possivelmente com composições e repercursões clínicas
que podem ser diferentes (46).
1.1.7A ACIDENTE BOTRÓPICO
As manifestações clínicas dos acidentes por Bothrops podem ser
didaticamente divididas em locais e sistêmicas e dentro do contexto de que o
acidente pode ser evidenciado por dados clínicos e epidemiológicos que
devem ser sempre individualizados. Apesar de ser o acidente botrópico mais
comum dentre todos, cada paciente deve ser abordado com a observância de
características particularizadas para o acidente do momento, que dependem
das circunstâncias de sua ocorrência e peculiaridades do agravo na vítima.
1.1.7A1 MANIFESTAÇÕES LOCAIS
Deve-se observar se há marcas de presas, no local da picada, que
geralmente são puntiformes (Fig. 24) e apresentam ou não sangramento local
que, quando no início, tem como causa o trauma vascular por sangramento
espontâneo (Fig. 25) causado pelas presas do ofídio ou manipulação como
incisões domésticas (Fig. 26) causadas pelo paciente ou atendentes leigos,
mas com o passar do tempo pode refletir alterações na coagulação
sanguínea. O edema se desenvolve de forma rápida e progressivamente
ascendente o que ajuda na classificação de gravidade. O edema é tenso se
diferenciando um pouco dos sinais flogísticos de processos puramente
infecciosos, pois sua coloração pode ser violácea pelo hematoma e cianose
local (Fig. 27). A equimose pode acometer todo o membro acometido e não
raras vezes se extende até regiões distantes do local da picada (Fig. 28),
27
temos observado isto principalmente com acidentes por filhotes de Bothrops
atrox, observação que carece de mais estudos. A dor e o edema podem ser
intensos e causar limitação de movimentos nas articulações mais próximas
ao local da picada.
Figura 24. Ferimentos puntiformes causados pelas presas de Bothrops atrox (sinalizados pela seta vermelha). (Fonte: arquivo próprio).
Figura 25. Sangramento por lesão causada pelas presas de Bothrops atrox. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 26. Sangramento causado por corte realizado por leigo na região da picada por Bothrops atrox. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 27. Coloração violácea por equimose na região da picada por Bothrops atrox. Fonte: arquivo próprio).
Figura 28. Extensa área de equimose à distância (região dorso-lombar) causada no acidente por filhote de Bothrops atrox em membro superior esquerdo. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 29. Bolha causada pelo uso de torniquete na região cubital, em acidente causado por Bothrops atrox no membro superior direito. (Fonte: arquivo próprio).
28
O edema se extende progressivamente por todo o membro acometido
determinando inclusive classificação de gravidade para decisão sobre a
quantidade de veneno a ser neutralizado. Com a evolução podem ocorrer
linfoadenomegalias regionais que são dolorosas à palpação e ainda, com o
passar das horas, podem surgir bolhas com conteúdo seroso, hemorrágico ou
necrótico. Quando o uso do torniquete é usado indevidamente, o veneno se
concentra em uma área muito estrita do segmento acometido e o resultado
pode ser também a evolução com bolhas, síndrome compartimental e extensa
necrose (Fig. 29).
1.1.7A2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS
Os acidentes botrópicos tanto podem se apresentar com
comprometimento sistêmico no início de sua evolução como podem, durante
o seguimento, evoluir com maior gravidade, sendo assim necessário o
conhecimento dos sinais e sintomas de gravidade para a adequada
administração da quantidade de soro antiveneneno. Podem ocorrer
sangramentos de pequena quantidade como gengivorragia, epistaxes,
hematúria microscópica, púrpuras à distância e sangramentos em feridas pre-
existentes e recentes. Pode ainda ocorrer hematúria macroscópica, epistaxes,
hematêmese, melena, otorragia, hemorragia conjuntival (Fig. 30),
hipermetrorragia e sangramento do sistema nervoso central (Fig. 31).
Pode haver sangramentos em qualquer área do corpo como aparelho
digestivo, rins e principalmente do sistema nervoso central, podendo deixar
Figura 30. Hemorragia conjuntival e gengivorragia em paciente vítima de acidente por filhote de Bothrops atrox. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 31. Acidente vascular hemorrágico fronto-parietal e cortical em vítima de acidente por filhote de Bothrops atrox (assinalado com seta vermelha). (Fonte: arquivo próprio).
29
ou não sequelas de gravidade variável, há relatos de insuficiência hipofisária
crônica (semelhante à síndrome de Sheehan) em paciente com possível
sangramento da hipófise (78-80). Os sangramentos parecem ser atribuídos
às hemorraginas mas o estado de incoagulabilidade sanguínea pode
prolongar e/ou intensificar as manifestações hemorrágicas (81, 82). Ocorre
hemólise pela ação mecânica do coágulo sobre as hemácias, pela hidrólise
de fosfolipídeos da membrana, ou indiretamente, através da liberação de
lisolectina da lecitina plasmática. O choque, embora raro e de instalação
precoce, parece estar relacionado com a quantidade de veneno inoculado na
vítima além de fatores como: liberação de mediadores inflamatórios e/ou
substâncias vasoativas, sangramento sistêmico abundante e/ou sequestração
de líquidos para o compartimento acometido (44).
1.1.7A3 COMPLICAÇÕES
As complicações locais geralmente são definidas como Infecção
Secundária (celulite, abscesso), Necrose, Síndrome Compartimental e Déficit
Funcional. As infecções secundárias devem ser criteriosamente identificadas
e tratadas adequadamente com antibioticoterapia, todavia o diagnóstico
muitas vezes se encontra dificultado porque os sinais flogísticos tais como
eritema, edema, dor, rubor, calor local e limitação de movimento podem
ocorrer tanto na atividade inflamatória aguda causada pelo veneno da
Bothrops como também pela infecção no local da picada e, por este motivo,
devem ser avaliados em função do tempo entre a picada e o exame clínico.
Algumas características, entretanto, podem orientar o diagnóstico de uma
infecção secundária incipiente: reativação dos sinais inflamatórios em
paciente com quadro local estabilizado ou em regressão, com ressurgimento
ou acentuação da dor; início súbito de picos febris ou presença de febre alta;
acentuação do infartamento ganglionar regional e presença de sinais de
flutuação à palpação local (44). A infecção secundária em acidente ofídico tem
sido relatada em até 38,5% como infecção local em estudos na Colômbia (83).
A celulite, por vezes, é de difícil identificação na fase inicial em indivíduos
de pele mais escurecida, todavia nestes casos, além dos sinais flogísticos, já
definidos em extensa literatura, podemos verificar um brilho na pele do
30
membro acometido que se apresenta diferente do membro contralateral não
acometido (Fig. 32 e Fig. 33).
Os abscessos também são muito frequentes, sendo necessária a
intervenção cirúrgica (drenagem) além de adequada antibioticoterapia. É
importante ressaltar que as infecções secundárias dos acidentes botrópicos
tem como etiologia, na maioria das vezes, os microrganismos anaeróbios e
gram negativos sendo descritos os seguintes microrganismos: Morganella
morganii, Escherichia coli, Providencia sp e Streptococo do grupo D (Fig. 34
e Fig. 35).
Outra complicação não menos comum, que pode evoluir com
sequelas mutilantes, é a necrose tecidual que pode levar ao Déficit Funcional.
Esta complicação quase sempre necessita de procedimento cirúrgico tanto
para retirada dos tecidos necróticos e desvitalizados como para reparação ou
Figura 32. Celulite por infecção secundária em acidente por Bothrops atrox apresentando edema flogótico em membro inferior direito. (Fonte:arquivo próprio).
Figura 33. Celulite por infecção secundária em acidente por Bothrops atrox apresentando edema flogótico com brilho na pele em em membro inferior esquerdo. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 34. Abscesso secundário após acidente por Bothrops atrox, apresentando edema e tumoração em tornozelo esquerdo. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 35. Abscesso secundário após acidente por Bothrops atrox, em fase de drenagem no tornozelo direito. (Fonte: arquivo próprio).
31
reconstituição tecidual (Figs. 36, 37, 38 e 39). Outra grave complicação é a
Síndrome Compartimental que via de regra leva o paciente ao procedimento
cirúrgico de Fasciotomia (Fig. 40 e Fig. 41). Caso a soroterapia seja
administrada muito tempo depois do acidente pode haver o caso de extensas
amputações gerando incapacidades físicas e psicológicas diversas e, também
incompatibilidade com a sobrevivência da vítima. Quando o tempo entre o
acidente botrópico e a soroterapia específica ultrapassa o tempo de 6 horas,
há uma probabilidade elevada de complicações e entre e elas, a mais comum
é a necrose progressiva.
Figura 36. Necrose em quarto quirodáctilo da mão esquerda em acidente por Bothrops atrox com mais de 24 horas de evolução até o atendimento em menino de 11 anos do município de Canutama - AM. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 37. Procedimento cirúrgico de amputação do quarto quirodáctilo da mão esquerda no paciente da figura 35. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 38. Amputação do quarto quirodáctilo da mão esquerda do paciente da figura 35. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 39. Perda tecidual por necrose em quarto quirodáctilo da mão direita em acidente por Bothrops atrox com mais de 6 horas entre o acidente e o atendimento. (Fonte: arquivo próprio).
32
As complicações sistêmicas são menos frequentes que as locais, porém
com o atraso na administração do soro elas são mais observadas e muitas
vezes podem levar a vítima ao tratamento intensivo ou ao tratamento dialítico.
Isto se torna difícil porque os acidentes que mais demoram para o tratamento
antiveneno específico são os mais distantes dos grandes centros de
atendimento hospitalar onde se concentram tais recursos.
Dentre as complicações sistêmicas pode ocorrer a Insuficiência Renal
Aguda (IRA), que muitas vezes leva o paciente à diálise ou pode ainda, ocorrer
choque ou estado de coma por motivos variados. A insuficiência renal aguda
tem sido descrita em 0,5 a 13,8% nos acidentes botrópicos e tem causas
multifatoriais que podem ser descritas a seguir: coagulação intravascular
disseminada com depósito intraglomerular de fibrina pode contribuir para a
necrose tubular aguda por interrupção do suprimento sanguíneo tubular;
alterações hemodinâmicas por sequestramento de fluidos na região da
picada, hemorragias, liberação de substâncias vasoativas, vômitos intensos e
repetidos e até hidratação inadequada podem levar a hipotensão com
consequente hipoperfusão renal. Um outro fator seria a administração do
próprio soro antiveneno que pode precipitar a hipotensão e o choque por
reação de hiperesensinilidade imediata, ou seja, o choque anafilático. A ação
nefrotóxica direta do veneno de Bothrops ainda é controversa, não havendo
estudos determinantes sobre isto. A hemólise pode ocorrer com mais
frequência e intensidade nos casos de IRA. Eventualmente outros fatores
podem contribuir para a IRA, são eles: consumo de complemento,
Figura 40. Fasciotomia em Síndrome Compartimental no paciente da figura 35. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 41. Evolução pós-cirúrgica em Fasciotomia por Síndrome Compartimental na perna direita (acidente por Bothrops atrox com mais de 6 horas entre o acidente e uso do soro antiofídico. (Fonte: arquivo próprio).
33
hipersensibilidade a proteínas do antiveneno, septicemia e antibioticoterapia.
O que se observa é que quando ocorre IRA geralmente é por necrose tubular
aguda e menos frequentemente por necrose cortical e nefrite instersticial
(29,44).
Outra complicação sistêmica importante é quando a hemorragia à
distância acomete órgãos vitais como sistema nervoso central, coração,
pulmões e rins. Têm sido descritos óbitos por hemorragia intracraniana
levando o paciente ao coma, quando sobrevive tem grande possibilidade de
sequela limitante que o torna incapaz. É importante ressaltar que pode ocorrer
tanto trombose com posterior isquemia como também hemorragia
intracraniana, como no caso de uma paciente que procedeu de uma
comunidade próxima ao Rio Xié e Alto Rio Negro, resgatada de helicóptero
para o Hospital de São Gabriel da Cachoeira, que recebeu o soro antiveneno
depois de 12 horas do acidente. Estes acidentes ofídicos ocorrem muitas
vezes no período noturno sendo inviável a evacuação aeromédica durante a
noite (Figs. 12, 13 e 14).
1.1.7B ACIDENTE CROTÁLICO
No local da picada observam-se edema discreto e parestesia persistente,
enquanto sistemicamente há sintomas de envolvimento de ações
neurológicas e miotóxicas como "fácies miastênica" (ptose palpebral uni- ou
bilateral e paralisia da musculatura facial), oftalmoplegia, dificuldade de
acomodação visual, dores musculares (mialgias), mioglobinúria (que pode ser
avaliada pela tonalidade da urina do avermelhado ao marrom e é
manifestação evidente da intensidade da rabdomiólise) e elevação dos níveis
séricos de creatinofosfoquinase (CPK) e da desidrogenase lática (DHL).
Além dos sintomas e sinais descritos acima, os pacientes também podem
apresentar manifestações sistêmicas gerais, como prostração, sudorese,
náuseas, vômitos, mal-estar, sonolência ou inquietação. Os sinais menos
freqüentes nos acidentes crotálicos são: paralisia da musculatura dos
membros; paralisia da musculatura respiratória, com possibilidade de
insuficiência respiratória aguda e, paralisia velopalatina (19).
34
1.1.7B1MANIFESTAÇÕES LOCAIS
São pouco importantes, diferindo dos acidentes botrópico e laquético. Não
há dor, ou esta pode ser de pequena intensidade. Há parestesia local ou
regional, que pode persistir por tempo variável, podendo ser acompanhada de
edema discreto ou eritema no ponto da picada.
1.1.7B2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS
Manifestações gerais como mal-estar, prostração, sudorese, náuseas,
vômitos, sonolência ou inquietação e secura da boca podem aparecer
precocemente e estar relacionadas a estímulos de origem diversas, nos quais
devem atuar o medo e a tensão emocional desencadeados pelo acidente.
Manifestações neurológicas decorrentes da ação neurotóxica do veneno,
surgem nas primeiras horas após a picada, e caracterizam o fácies miastênica
(fácies neurotóxica de Rosenfeld) evidenciadas por ptose palpebral uni ou
bilateral, flacidez da musculatura da face, alteração do diâmetro pupilar,
incapacidade de movimentação do globo ocular (oftalmoplegia), podendo
existir dificuldade de acomodação (visão turva) e/ou visão dupla (diplopia)
(Fig. 42). Como manifestações menos freqüentes, pode-se encontrar paralisia
venopalatina, com dificuldade à deglutição, diminuição do reflexo do vômito,
alterações do paladar e olfato.
Manifestações musculares com a ação miotóxica provocando dores
musculares generalizadas (mialgias) que podem aparecer precocemente. A
fibra muscular esquelética lesada libera quantidades variáveis de mioglobina
que é excretada pela urina (mioglobinúria), conferindo-lhe uma cor
avermelhada ou de tonalidade mais escura, até o marrom. A mioglobinúria
constitui a manifestação clínica mais evidente da necrose da musculatura
esquelética (rabdomiólise).
Manifestações hematológicas podendo haver incoagulabilidade
sangüínea ou aumento do Tempo de Coagulação (TC), em aproximadamente
40% dos pacientes, observando-se raramente sangramentos restritos às
gengivas (gengivorragia). Outras manifestações clínicas pouco frequentes
como insuficiência respiratória aguda, fasciculações e paralisia de grupos
35
musculares têm sido relatadas. Tais fenômenos são interpretados como
decorrentes da atividade neurotóxica e/ou da ação miotóxica do veneno (19).
1.1.7B3 COMPLICAÇÕES
Podem ser locais com raros pacientes evoluindo com parestesias locais
duradouras, porém reversíveis após algumas semanas, e sistêmicas sendo a
principal complicação do acidente crotálico, em nosso meio, é a insuficiência
renal aguda (IRA), com necrose tubular geralmente de instalação nas
primeiras 48 horas. Um quadro resumido das manifestações clínicas
relacionadas com os principais gêneros de importância médica é apresentado
abaixo (Quadro 1).
Quadro 1. Atividade do veneno e patogenia (6)
Fonte: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/guia_vigilancia_epidemiologica_7ed.pdf
Figura 42. Acidente crotálico grave apresentando fácies miastênica com ptose palpebral bilateral. (Fonte: F Bucaretchi).
36
1.1.7C ACIDENTE LAQUÉTICO
Por se tratar de serpentes encontradas em áreas florestais, onde a
densidade populacional é baixa e o sistema de notificação não é tão eficiente,
as informações disponíveis sobre esses acidentes são escassas. Estudos
preliminares realizados com imunodiagnóstico (ELISA) sugerem que os
acidentes por Lachesis são raros, mesmo na região Amazônica (29). As
manifestações clínicas dos acidentes laquéticos são bastante semelhantes
aos dos acidentes botrópicos, sendo acrescidas apenas das manifestações
neurológicas próprias destes acidentes.
1.1.7C1 MANIFESTAÇÕES LOCAIS
Ocorre dor e edema local de progressiva intensidade, podendo evoluir
com vesículas e bolhas de conteúdo seroso ou sero-hemorrágico. Em alguns
casos os sinais e sintomas parecem ser mais intensos que nos acidentes
botrópicos, talvez por serem serpentes maiores e produzirem maior
quantidade de veneno e por isto também injetarem maior quantidade em cada
picada. Os sangramentos, embora mais frequentes no local da picada, em
ferimentos pre-existentes e nos locais de venopunção, ocorrem também,
como nos acidentes botrópicos, em qualquer região do corpo (29). Podem
surgir vesículas e bolhas de conteúdo seroso ou sero-hemorrágico nas
primeiras horas após o acidente. As manifestações hemorrágicas limitam-se
ao local da picada na maioria dos casos e a gravidade é avaliada segundo os
sinais locais e pela intensidade das manifestações sistêmicas (19).
1.1.7C2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS
Dentre as manifestações sistêmicas, as de origem neurotóxica
caracterizam e ajudam na diferenciação entre os acidentes laquéticos e
botrópicos. São elas geradas pela ativação do sistema nervoso autônomo
parassimpático, caracterizadas principalmente pela hipotensão arterial grave
e precoce nos primeiros minutos do acidente, ocorrendo também ao mesmo
37
tempo náuseas, sudorese, vômitos, cólicas abdominais, diarréia e bradicardia.
Com o agravamento destas alterações ocorre choque, bradicardia de intensa
gravidade e óbito. A bradicardia é um importante sinal que ajuda na
diferenciação entre os acidentes botrópicos e laquéticos, o que se espera na
vítima de envenenamento pela maioria dos animais peçonhentos é a
taquicardia pela descarga adrenérgica sendo também assim no acidente
botrópico e, portanto, quando ocorre a bradicardia sem nenhuma arritmia
prévia, a suspeita se direciona para o acidente laquético (44). Os acidentes
botrópicos e laquéticos são muito semelhantes do ponto de vista clínico,
sendo, na maioria das vezes, difícil o diagnóstico diferencial. As
manifestações da “síndrome vagal” poderiam auxiliar na distinção entre o
acidente laquético e o botrópico (19).
Segundo relato deste autor, um madeireiro após acidente ofídico na mata
primária e tratamento com soro antibotrópico para acidente grave, teve piora
do quadro e só evoluiu satisfatoriamente com o soro antibotrópico-laquético.
Chama a atenção a grande extensão da equimose e a hipotensão arterial
apresentada, como não foi apresentado o ofídio, pode ter sido uma serpente
do gênero Lachesis, considerando as características epidemiológicas, clínicas
e de resposta terapêutica (Fig. 43).
1.1.7C3 COMPLICAÇÕES
Figura 43. Madeireiro vítima de acidente ofídico em mata primária, com grande área de equimose em membro inferior direito, hipotensão e evolução favorável após o uso de soro antibotrópico-laquético. (Fonte: arquivo próprio).
38
As complicações locais descritas no acidente botrópico (síndrome
compartimental, necrose, infecção secundária, abscesso, déficit funcional)
também podem estar presentes no acidente laquético.
1.1.8 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O diagnóstico de acidente ofídico é basicamente epidemiológico e clínico,
ou seja, diante da história e exame físico, conhecendo-se previamente a
distribuição e hábitos da serpente e o efeito de sua peçonha no organismo
humano, é possível deduzir com grande margem de acerto sobre o gênero e
até espécie da serpente. Apesar disto, é possível a utilização dos exames
laboratoriais para, de forma indireta, ajudar na identificação do gênero do
ofídio causador, avaliando a gravidade do acidente e procedendo com a
identificação e seguimento de complicações, como veremos a seguir.
No acidente botrópico, o tempo de coagulação (TC) é de fácil execução,
sua determinação é importante para elucidação diagnóstica e para o
acompanhamento dos casos. O hemograma geralmente revela leucocitose
com neutrofilia e desvio à esquerda, hemossedimentação elevada nas
primeiras horas do acidente e plaquetopenia de intensidade variável. No EAS
(sumário de urina) pode haver proteinúria, hematúria e leucocitúria. Outros
exames laboratoriais poderão ser solicitados, dependendo da evolução clínica
do paciente, com especial atenção aos eletrólitos, uréia e creatinina, visando
à possibilidade de detecção da insuficiência renal aguda. Os métodos de
imunodiagnóstico, em que antígenos do veneno botrópico podem ser
detectados no sangue ou outros líquidos corporais, podem ser realizados por
meio da técnica de ELISA (19).
No acidente laquético, também a determinação do Tempo de Coagulação
(TC) é importante medida auxiliar no diagnóstico do envenenamento e
acompanhamento dos casos. Dependendo da evolução, outros exames
laboratoriais podem estar indicados (hemograma, dosagens de uréia,
creatinina e eletrólitos). O imunodiagnóstico vem sendo utilizado em caráter
experimental, não estando disponível na rotina dos atendimentos (19).
39
No acidente crotálico, como resultado da miólise, há liberação de
mioglobina e enzimas, podendo-se observar valores séricos elevados de
creatinofosfoquinase (CPK), desidrogenase lática (DHL), aspartase-
aminotransferase (AST), aspartase-alanino-transferase (ALT) e aldolase. O
aumento da CPK é precoce, com pico de máxima elevação dentro das
primeiras 24 horas após o acidente. O aumento da DHL é mais lento e gradual,
constituindo-se, pois, em exame laboratorial complementar para diagnóstico
tardio do envenenamento crotálico. Na fase oligúrica da IRA, são observadas
elevação dos níveis de uréia, creatinina, ácido úrico, fósforo, potássio e
diminuição da calcemia. O Tempo de Coagulação (TC) freqüentemente está
prolongado. O hemograma pode mostrar leucocitose, com neutrofilia e desvio
à esquerda, às vezes com presença de granulações tóxicas. O exame do
sedimento urinário geralmente é normal quando não há IRA. Pode haver
proteinúria discreta, com ausência de hematúria. Há presença de mioglobina,
que pode ser detectável pelo teste de benzidina ou pelas tiras reagentes para
uroanálise ou por métodos específicos imunoquímicos como
imunoeletroforese, imunodifusão e o teste de aglutinação de mioglobina em
látex (19).
1.1.9 TRATAMENTO
É possível classificar a gravidade do acidente e consequentemente optar
pelo número de frascos ou ampolas a ser administrado. Como medidas gerais
no acidente botrópico é importante manter a vítima em repouso e tranquila
pois a sensação de envenenamento é estressante pela possibilidade do risco
de morte. O garroteamento (torniquete) do membro afetado é contraindicado
pelo risco de gangrena, assim também como estão contraindicados a sucção
labial e incisão local. Deve-se apenas limpar e lavar cuidadosamente o local
com água e sabão, monitorar os sinais vitais e volume urinário e, remover a
vítima para onde haja o soro antiofídico.
No tratamento geral é importante manter o paciente hidratado, deve-se
evitar o uso de drogas depressoras do sistema nervoso central, sendo muitas
vezes necessário o uso de analgésicos para o controle da dor. O membro
acometido deve ser mantido em elevação, evitando-se a deambulação e os
40
cuidados com o ferimento devem ser realizados de acordo com sua
característica.
No tratamento específico do acidente botrópico, o soro antiofídico é
utilizado de acordo com o Quadro 2 apresentado abaixo, onde a quantificação
da segmentação do membro acometido é usada para definir a classificação e
a quantidade de soro antiofídico a ser utilizada (45).
Na terapia específica com o soro antiofídico tem sido utilizada uma pre-
soroterapia com inibidores de receptores H1 e H2 e corticoide antecedendo
o soro específico em 30 a 45 minutos na tentativa de evitar ou minorar as
reações adversas. O soro antiofídico é feito de acordo com o Quadro 3 e,
durante o tempo de 30 a 45 minutos diluído ou não em soro fisiológico 0,9%
ou glicosado 5%. Na FMT-HVD o soro não tem sido diluído pois há o
entendimento que o efeito benéfico não deve ser retardado em hipótese
alguma e considerando que os pacientes chegam ao hospital depois de um
tempo muito longo após o acidente ofídico.
Quadro 2 . Classificação quanto à gravidade e tratamento no acidente botrópico(45)
41
Quadro 3. Pré-soroterapia e tratamento das reações adversas.
Medicamentos na Pré-soroterapia Medicamentos nas Reações Adversas (na
dependência da reação apresentada) Hidrocortisona EV 500 mg (adultos) Para crianças – de acordo com o peso e/ou
idade.
Adrenalina 1:1000 SC, se choque anafilático (adultos)
Ranitidina EV 50 mg (adultos)
OU Cimetidina EV 300 mg (adultos) Para crianças – de acordo com o peso e/ou
idade.
Aminofilina EV 1 ampola diluído, gota a gota, se dispnéia. Para crianças – de acordo com o peso e/ou idade.
Dexclorfeniramina VO 2 mg (adultos) Para crianças – de acordo com o peso e/ou idade.
Prometazina EV 1 ampola, se reação alérgica intensa, observar limite de dose com a dexclorfeniramina para evitar overdose Para crianças – de acordo com o peso e/ou idade.
Intubação ou traqueostomia, se necessárias. Elevação de decúbito
Obs1. Sempre utilizar equipo em Y (duas vias Obs2. Paciente sempre em dieta zero antes
da pré-soroterapia até o término da
soroterapia específica
Oxigenioterapia sob máscara, intubação ou
traqueostomia, se necessário e de acordo com a
evolução e gravidade de cada caso.
Obs3. Iniciar o gotejamento do Soro
Especifico 30 a 45 minutos após o término da
Pré-soroterapia e correr em 30 a 45 minutos.
Obs1. Sempre interromper a administração do SAV fechando a sua via de administração e aplicar o medicamento necessário.
No tratamento geral do acidente laquético, além dos cuidados gerais
semelhantes ao acidente botrópico, na presença de bradicardia com
instabilidade hemodinâmica está indicado o uso de sulfato de atropina, em
caso de hipotensão e/ou choque estão indicados hidratação vigorosa e
drogas vasoativas (quando necessário). O tratamento das complicações
são os mesmos do acidente botrópico, ou seja, antibioticoterapia em caso
de celulite, drenagem cirúrgica e antibioticoterapia em caso de abscesso,
42
debridamento cirúrgico ou químico em caso de necrose e diálise em caso
de IRA (quando necessário) (44).
No tratamento específico do acidente laquético deve-se avaliar as
alterações locais na região da picada e a intensidade das manifestações
vagais. Após a correta classificação e a pre-soroterapia, o soro antilaquético
(SAL) ou antibotrópico laquético (SABL) deve ser usado de acordo com o
Quadro 4, aconselhando-se a usar a mesma classificação das
manifestações locais em segmentação utilizada no acidente botrópico
(Quadro 2)
No tratamento geral do acidente crotálico, a hidratação adequada é de
fundamental importância na prevenção da IRA e será satisfatória se o
paciente mantiver o fluxo urinário de 1 ml a 2 ml/kg/hora na criança e 30 a
40 ml/hora no adulto. A diurese osmótica pode ser induzida com o emprego
de solução de manitol a 20% (5 ml/kg na criança e 100 ml no adulto). Caso
persista a oligúria, indica-se o uso de diuréticos de alça tipo furosemida por
via intravenosa (1 mg/kg/ dose na criança e 40mg/dose no adulto). O pH
urinário deve ser mantido acima de 6,5 pois a urina ácida propicia a
precipitação intratubular de mioglobina. Assim, a alcalinação da urina deve
ser feita pela administração parenteral de bicarbonato de sódio,
monitorizada por controle gasométrico (29).
No tratamento específico, o soro anticrotálico (SAC) deve ser
administrado intravenosamente, segundo as especificações incluídas no
capítulo Soroterapia. A dose varia de acordo com a gravidade do caso,
devendo-se ressaltar que a quantidade a ser ministrada à criança é a
mesma do adulto. Poderá ser utilizado o soro antibotrópico-crotálico
(SABC). Com base nas manifestações clínicas, o envenenamento crotálico
pode ser classificado em: a) Leve: caracteriza-se pela presença de sinais e
sintomas neurotóxicos discretos, de aparecimento tardio, sem mialgia ou
alteração da cor da urina ou mialgia discreta. b) Moderado: caracteriza-se
pela presença de sinais e sintomas neurotóxicos discretos, de instalação
precoce, mialgia discreta e a urina pode apresentar coloração alterada. c)
Grave: os sinais e sintomas neurotóxicos são evidentes e intensos (fácies
43
miastênica, fraqueza muscular), a mialgia é intensa e generalizada, a urina
é escura, podendo haver oligúria ou anúria (29, 44).
De acordo com a classificação de gravidade, se faz necessária a
administração da soroterapia específica como resumido no Quadro 4,
pertinente aos principais gêneros de importância médica no Brasil.
Quadro 4.Número de ampolas de antiveneno por tipo de acidente e gravidade.
Há que se observar a possibilidade de reações adversas como reação
anafilática (85), com sinais e sintomas descritos a seguir por ordem de
frequência, podendo levar ao choque e ainda podem ocorrer reações
anafilactóides e doença do soro. Todas estas reações devem ser
identificadas e tratadas adequadamente (Quadro 5). As condutas diante
destas situações de anafilaxia estão também descritas junto com a pre-
soroterapia no Quadro 4.
44
Quadro 5.Sinais e sintomas da reação anafilática.
Urticária, prurido, angioedema 88%
Edema de vias aéreas superiores 56%
Dispnéia, chiado e tosse 47%
“Rush cutâneo” 46%
Tontura, síncope, hipotensão, taquicardia 33%
Náuseas, vômitos, diarréia, cólica 30%
Rinite 16%
Cefaléia 15%
Dor subesternal 6%
Prurido cutâneo sem “rush” 4,5%
Convulsão 1,5%
Fonte: Handout of American Academy of Allergy and Immunology 2006 Annual Meeting.
1.1.10 SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE LIOFILIZADO
1.1.10A HISTÓRICO
As pesquisas de Sewal, de Kaufmann, de Physalix, de Bertrand e
principalmente as de Calmette estabeleceram em bases científicas a noção
de imunidade, em relação ao veneno ofídico. Mais do que isto, estes últimos
pesquisadores, trabalhando em 1894, quando já eram conhecidos os
trabalhos de Behring e Kitasato que firmaram as bases da soroterapia em
relação à difteria e ao tétano, provaram que o soro dos animais vacinados
contra a peçonha possuía também uma substância antitóxica capaz de
neutralizar os efeitos do veneno e de transmitir imunidade passiva aos animais
não preparados. Calmette conseguiu hiperimunizar grandes animais para o
preparo do soro antiofídico, servindo-se principalmente do veneno de cobra
indiana (Naja tripudians). Vital Brazil foi o primeiro a demonstrar a
especificidade dos antivenenos. A partir desta descoberta, Vital Brazil iniciou
em 1901, no Instituto Butantan, o preparo de antivenenos mono e
poliespecíficos, os soros anticrotálico e antibotrópico para uso no Brasil. Esta
sua orientação de preparação dos soros mono e poliespecíficos, para uso em
uma determinada região, é adotada no mundo inteiro nos dias atuais.
45
Embora a metodologia do preparo dos soros antiofídicos não tenha
avançado muito desde a sua descoberta, procedimentos de purificação e
modos de utilização foram modificados consideravelmente. Os soros
heterólogos são concentrações de imunoglobulinas obtidas através de soros
de cavalos imunizados com o veneno. Os antivenenos são utilizados com o
objetivo de neutralizar as atividades sistêmicas e locais dos venenos. A
soroterapia antiveneno é a única medida específica para o tratamento
adequado dos pacientes picados pela maioria dos animais peçonhentos.
Quanto a mistura de diversos gêneros de ofídios para a confecção de um soro
polivalente liofilizado, há um entendimento de que isto reduz o custo-
efetividade considerando que trata-se um produto nobre que deve ter o
máximo de aproveitamento após a sua produção.
O soro antiveneno é produzido através da inoculação dos venenos em
equinos, situação que traz um sofrimento necessário aos animais de
produção. Diante desta condição, atualmente se concebe um soro para as
condições de precariedade de recursos na África, o mesmo processo de
produção e distribuição pode ser aplicado para os impasses de conservação
e logística no Brasil. A população pobre da África sofre as consequências dos
acidentes ofídicos, mas a pobreza nega o acesso ao tratamento e esperança
de um bom desfecho para as vítimas. Um novo antiveneno polivalente
denominado “Antivenom AID Product Development Partnership–
AntivenomAID PDP)” reduzirá substancialmente a atual mortalidade
(atualmente acima de 32.473 mortes/ano) e a incapacidade física de longa
duração (incluindo cerca de 8.000 amputações/ano) e as incapacidades
psicológicas sofridas por muitas vítimas de acidentes ofídico. Essa medida,
nas comunidades pobres, melhorará a qualidade de vida e aumentará a
produtividade para os agricultores de subsistência. Na África, quando se
avalia o benefício do soro antiofídico em comparação com o tratamento de
outras doenças negligenciadas, torna-se visível a melhora dos índices de
complicações atribuídas a perda da qualidade de vida das vítimas (Fig. 44). O
novo soro polivante panafricano a ser desenvolvido com o agrupamento
“Antivenom AID PDP” será uma intervenção muito custo-efetiva comparada
com outras doenças negligenciadas (85).
46
Atualmente o soro antiofídico brasileiro é distribuído no país inteiro pelo
Programa Nacional de Imunizações (PNI) do Ministério da Saúde, após as
notificações geradas por um processo alimentado pelos Serviços de
Epidemiologia de Unidades de Atendimento de Referência. Com base nestas
notificações o Ministério da Saúde fornece o soro antiofídico líquido através
de uma cadeia de suprimento descentralizada até chegar o mais próximo
possível onde ocorrem os acidentes e onde os pacientes são atendidos.
Contudo há que se considerar que o atual soro líquido utilizado necessita de
refrigeração entre 2 a 8 oC, sendo desta maneira, necessário o uso de
refrigeradores que por sua vez necessitam de eletricidade para o
funcionamento. Baseado neste impasse o Instituto de Biologia do Exército
(IBEx-RJ), que já fornece plasma hiperimune para a industrialização no
Instituto Butantan, fez um acordo com aquele Instituto para que produzissem
o soro na forma liofilizada e trivalente, o primeiro de produção nacional,
assumindo assim a realização de um ensaio clínico para análise de viabilidade
de produção em uma escala maior que viesse a atender às regiões mais
Figura 44. Comparação do número de "DALYs" perdidos devido a cada doença negligenciada e custo por "DALYs" evitáveis por várias intervenções terapêuticas. (Fonte: 85).
47
distantes e desprovidas de recursos no país. Os municípios mais distantes na
Amazônia passaram a ser o alvo deste estratégico estudo, o que passa a ter
seus resultados agora apresentados neste trabalho descrito a seguir. Questão
científica que precisa ser elucidada é a impressão de que “quanto mais
complexo o soro em termos de mistura de imunoglobulinas, mais eventos
adversos poderiam ocorrer”. Agregando valor ao presente estudo, deixamos
também uma impressão inicial sobre esta questão que tecnicamente dentro
de parâmetros científicos de análise, é apresentada neste trabalho. Assim de
forma didática separamos a análise em avaliação comparativa da segurança
e eficácia de ambos os soros (líquido e liofilizado), considerando
separadamente cada um dos três principais gêneros de ofídios. Para um
melhor entendimento deste trabalho, usamos o termo mono e bivalente em
referência ao gênero do ofídio e não a espécie, o que consideramos como
mono e poliespecífico.
1.1.10B LIOFILIZAÇÃO
Em uma pesquisa histórica verifica-se que o primeiro produto liofilizado
surgiu em 1911, com o vírus da raiva (86). O produto só atingiu a escala
industrial durante a Segunda Guerra Mundial (1939-1945), devido à
demanda por plasma sanguíneo em ferimentos de guerra. Nesta época já
havia a comercialização de café em pó, surgindo em 1938, através da
companhia Nestlé (87). Como havia uma grande demanda por sangue
durante a Segunda Guerra Mundial, os Estados Unidos da América
investiram centenas de milhões de dólares em inúmeras novas
possibilidades de desenvolvimento de substitutos do sangue e de plasma
sanguíneo, para o tratamento dos soldados feridos nos campos de batalha
e que requeriam transfusões de sangue, pois não havia quantidade
suficiente de sangue fresco disponível (88). A primeira tentativa da
preservação do plasma sanguíneo foi relatada e realizada por Greaves em
1944 (89). A aplicação do processo de liofilização focou-se, posteriormente,
no campo da indústria farmacêutica, ocorrendo durante a década de 1950 o
surgimento de medicamentos liofilizados como antibióticos à base de
penicilina (89). Paralelo ao surgimento das penicilinas liofilizadas, pesquisas
acerca da liofilização de peptídeos, proteínas, anticorpos, enzimas e
48
hormônios foram sendo aprofundadas, e posteriormente comercializadas
com fins terapêuticos. A partir disso, surgiram as vacinas liofilizadas, os
antibióticos e também as vitaminas (86).
Na década de 1960, passaram a surgir vários alimentos liofilizados no
mercado, inclusive alimentos fornecidos aos astronautas em missão no
espaço, ganhando grande destaque durante o programa Apollo da NASA. O
primeiro alimento liofilizado a ser comercializado foi o Nescafe®, em 1938.
Este projeto da Nestlé surgiu em meio a crise que o mercado do café vinha
enfrentando, e devido à necessidade de suprir a grande demanda mundial
de café da época. O produto Nescafe® foi inicialmente comercializado na
Suíça, mas logo expandiu seu mercado para o mundo (90). Atualmente, além
de café, há muitos produtos liofilizados sendo comercializados, como ervas,
frutas, produtos lácteos (91). A revolução da biotecnologia, na década de
1990, levou ao aumento da demanda por produtos liofilizados, bem como de
pesquisas mais especializadas no campo da liofilização (89). E a partir desta
época, a técnica foi se expandindo para outros campos de pesquisa, como
o da reprodução. Designa-se por liofilização uma técnica especial de
dessecação, que permite a secagem de um corpo após prévio
congelamento, removendo-se a água congelada por sublimação à custa de
vácuo, de modo a dar-se, diretamente, a passagem do estado sólido ao
gasoso, sem que em qualquer momento da operação o gelo formado retome
o estado líquido (92). O princípio da liofilização consiste na remoção de água
de uma amostra congelada por sublimação e dessorção sob vácuo. Esse
processo é dividido em três etapas: primeiro ocorre o congelamento da
amostra, depois faz-se a sublimação e, finalmente, faz-se a dessorção da
água não congelada (92).
Essa técnica permitiu a secagem de substâncias alteráveis,
principalmente os produtos de origem biológica, os quais, na sua maioria,
são destruídos em sua totalidade ou parcialmente quando submetidos aos
processos convencionais de dessecação. Atualmente, a liofilização é
considerada como sendo o método ideal para secagem de produtos
termolábeis ou de natureza complexa em que figurem constituintes
excessivamente sujeitos a alterações por vários agentes, como o calor, o
oxigênio, a umidade e tantos outros. A congelação brusca e intensa a que
49
as substâncias (ou corpo), a liofilizar são submetidas, permite conservar
todas as propriedades que possuíam no momento da congelação,
mantendo-as integralmente uma vez secas por sublimação do gelo formado
(92).
A conservação de nanopartículas tem sido um dos exemplos de
vantagens da liofilização. (93, 94). Um dos exemplos mais demonstrativo do
que é possível conseguirse com a liofilização quanto à preservação das
características de um corpo é a conservação dos microorganismos. Neste
caso, além de mantê-los vivos, após a reconstituição, são mantidos os
mesmos caracteres morfológicos, culturais, bioquímicos e biológicos (92).
Podemos citar uma lista de vantagens em relação ao processo de liofilização
(91):
1 - A baixa temperatura a que se opera evita qualquer alteração química
das substâncias decomponíveis pelo calor. Por isso, um produto seco por esta
técnica mantém inalterável a sua composição química original, a sua atividade
terapêutica e outras propriedades características. Se for acondicionado e
armazenado convenientemente, poderá manter-se sem alteração durante um
longo período.
2 - A perda de constituintes voláteis está reduzida ao mínimo.
3 - Os produtos liofilizados apresentam uma estrutura que contribui para
sua rápida dissolução, assegurando-se, assim, a reprodução fiel do produto
original uma vez posto o liofilizado em contato com a fase líquida primitiva.
4 - Durante a secagem o desenvolvimento de microrganismos e as
reações enzimáticas são inibidos pelas baixas temperaturas a que se opera,
o mesmo acontecendo nos produtos secos, pois seu teor de água mínimo
impossibilita qualquer manifestação vital.
5 - A tendência de certos produtos coagularem quando dessecados por
outras técnicas está reduzida quando utilizado este processo.
A biotecnologia resultou na produção de várias proteínas para propósitos
farmacêuticos. Porém, proteínas são quimicamente instáveis, o que causa
problemas durante sua purificação, formulação e armazenamento. A
liofilização é frequentemente utilizada para que formulações de proteínas
alcancem uma estabilidade desejada a longo prazo (95, 97, 98, 99, 100).
50
Com estas vantagens, não é de se estranhar, que os produtos submetidos
à liofilização estejam aumentando a cada dia. Entre eles, podemos citar, por
exemplo: certos antibióticos (penicilina), substâncias contendo proteínas
termolábeis, bactérias, vírus, tecidos humanos para enxertos, alimentos,
plasma sanguíneo, soros, vacinas, hormônios, etc. No mercado temos vários
modelos de liofilizadores industriais e neste projeto foi utilizado o liofilizador
Benchmark 1100, Virtis – USA (Fig. 45). Abaixo é apresentado o princípio de
funcionamento de um liofilizador e processo de liofilização (Fig. 46 e Fig. 47).
Figura 45. Liofilizador - Benchmark 1100 (Virtis, USA). (Fonte: http://www.tsaohsin. com.tw/html/ProductPage/virtis/virtis1.1.htm)
Figura 46. Princípio de funcionamento de um liofilizador. (Fonte: http://www.liofilizador.com/ products/showproduct.php?lang=es&id=37)
51
2. JUSTIFICATIVA
No Brasil, os laboratórios que produzem esses imunoderivados são o
Instituto Butantan (São Paulo), Fundação Ezequiel Dias (Minas Gerais),
Instituto Vital Brazil (Rio de Janeiro) e o Centro de Produção e Pesquisa de
Imunobiológicos (Paraná). Os soros são produzidos em formulação líquida,
envasadas em ampolas, com apresentações mono- ou bivalentes, devendo
ser armazenados à temperatura de 2 a 8 graus Celsius positivos, sendo sua
validade em geral, de 2 a 3 anos. Entretanto para os países tropicais, a
Organização Mundial de Saúde recomenda que os soros sejam apresentados
na forma liofilizada. O soro liofilizado torna-se extremamente útil e prático para
aplicação em pontos estratégicos do território nacional, principalmente na
Região Amazônica, atendendo às tropas militares operacionais que realizam
manobras, exercícios no terreno e acampamentos, bem como populações
indígenas, ribeirinhas e trabalhadores rurais, distantes dos centros de
atendimento médico.
Como amplamente explanado na Introdução deste estudo, o atendimento
de vítimas em lugares distantes do recurso de energia elétrica, ocorre depois
de muitas horas após o acidente, ficando a vítima exposta à complicações que
Figura 47. Processo de liofilização. (Fonte: http://www. liofilizador.com/products/ showproduct.php?lang=es&id=37).
52
a levam a incapacidade pelas inúmeras sequelas, onerando o Estado com
aposentadorias e sobretudo causando sofrimento nas comunidades mais
pobres da Região Amazônica. Há que se ressaltar que estes atendimentos
requerem evacuação aeromédica gerando despesas imprevisíveis para os
governos municipais, estadual e até federal, através das Forças Armadas,
como exemplificado na Introdução deste estudo. Outro fator de extrema
relevância são as despesas nas Unidades de Tratamento Intensivo da capital,
causadas pela gravidade destes casos que demoram para terem acesso ao
soro antiofídico líquido atual.
Baseado neste contexto, o Instituto Butantan em parceria com o Instituto
de Biologia do Exército iniciou a produção no ano de 2000, dos primeiros lotes
de soro antiofídico liofilizado trivalente (botrópico-laquético-crotálico),
apresentados em caixas com 5 frascos contendo cada um, duas doses,
suficientes para neutralizar no mínimo, 100 mg, 60 mg, e 30 mg dos venenos
de referência de Bothrops jararaca, Lachesis muta e Crotalus durissus
terrificus, respectivamente (soroneutralização em camundongos).
Acompanhando o produto, 5 ampolas de 20 ml de diluente para soro (Fig. 38).
De acordo com experimentos realizados pelo Instituto Butantan o produto
liofilizado possui excelente termoestabilidade em ambientes de elevadas
temperaturas (56 graus Celsius), por um período de 12 meses (Anexo I),
sendo assim dispensada a necessidade de cuidados com refrigeração, tal
como ocorre com o soro líquido convencional.
Após a liofilização do produto foram realizados testes de controle interno
de qualidade (esterilidade, pirogênico, inocuidade, potência e de
características físico-químicas) e externo no INCQS/Fiocruz, ambos com
resultados satisfatórios (Anexo II). Em uma segunda etapa foram realizados
testes em humanos, propósito deste estudo, atendendo as normas da
Resolução nº196, de 10 de outubro de 1996 e da Resolução nº 251, de 07 de
agosto de 1997, ambas do Conselho Nacional de Saúde, por se tratar de nova
associação de substâncias (trivalente) e forma farmacêutica (liofilizada),
diferentes daquelas estabelecidas quando da autorização do registro.
53
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
• Avaliar a segurança e eficácia de um soro antiofídico trivalente liofilizado.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estimar a incidência de eventos adversos da administração do soro
antiofídico trivalente liofilizado;
Determinar a eficácia do soro antiofídico trivalente liofilizado em neutralizar os
principais efeitos tóxicos dos acidentes;
Determinar a estabilidade térmica do soro antiofídico trivalente liofilizado.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.2 OBTENÇÃO DO SATL
A partir da imunização de cavalos com veneno botrópico, laquético e
veneno crotálico, foram obtidos os respectivos plasmas que, após processos
físicos e químicos, deram origem aos soros purificados e concentrados.
Considerando a necessidade de um produto trivalente e liofilizado as
respectivas frações dos soros concentrados foram misturados conforme
formulação, obedecendo a normatização de liberação dos soros com as
respectivas potências:
• Fração botrópica - 5,0 mg/mL
• Fração laquética - 3,0 mg/ml
• Fração crotálica - 1,5 mg/mL
Este produto então foi testado como produto final e aprovado, sendo então
envasado em frascos de 10,0 ml e 20,0 mL, e submetido ao processo de
liofilização, também testado e aprovado para uso. O soro foi produzido em
parceria entre o Instituto de Biologia do Exército (RJ) e Instituto Butantan (SP).
O soro é apresentado em frascos-ampola contendo fração F(ab7)2 de
imunoglobulinas, purificadas e liofilizadas, obtidas de plasma de eqüinos
hiperimunizados com venenos de serpentes dos gêneros Bothrops, Lachesis
54
e Crotalus. O produto acompanha 5 ampolas de 20 ml de diluente para soro
(Fig. 48 e Fig. 50). O soro tem a seguinte composição química:
4.2.1 Fração F(ab7)2 de imunoglobulinas que neutralizam, no mínimo 100
mg, 60 mg e 30 mg dos venenos de referência de Bothrops jararaca,
Lachesis muta e Crotalus durissus terrificus, respectivamente
(soroneutralização em camundongo)
4.2.2 Fenol............................... 35mg (máximo)
4.2.3 Sacarose.......................... 1g
4.2.4 Cloreto de Sódio............. 0,17g
Cada ampola de diluente contém 20ml de água purificada para injetáveis.
4.2 DESENHO DO ESTUDO E PARTICIPANTES
Trata-se de um ensaio clinico prospectivo, aberto, randomizado, de fase IIb,
conduzido de junho de 2005 a maio de 2008. Foram incluídos os acidentes
botrópicos atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado
(FMT-HVD), Manaus, Estado do Amazonas, Brasil (Fig. 50).
Figura 47. Soro antiofídico trivalente liofilizado utilizado no Projeto. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 48. Soro antiofídico trivalente liofilizado após reconstituição. (Fonte: arquivo próprio).
55
Para os acidentes laquéticos, foram incluídos pacientes do município de
Borba, atendidos na Unidade Mista de Borba, Estado do Amazonas, Brasil
(Fig. 52), municípios de Normandia e Pacaraima (Estado de Roraima, Brasil)
atendidos no Hospital Geral de Roraima Rubens de Sousa Bento – Boa Vista
(Fig. 51). Para os acidentes crotálicos, foram incluídos pacientes dos
municípios de Boa Vista e Cantá (Estado de Roraima, Brasil), também
atendidos no Hospital Geral de Roraima Rubens de Sousa Bento – Boa Vista.
Homens e mulheres entre 12 e 70 anos de idade eram elegíveis para o
estudo. Os acidentes botrópicos, laquéticos e crotálicos foram diagnosticados
com avaliações epidemiológicas, clínicas e laboratoriais. Os critérios de
exclusão foram gravidez, amamentação, doenças hematológicas prévias,
estado de imunodeficiência conhecida (infecção pelo HIV, neoplasias,
quimioterapia, terapia com corticoesteróides ou outros estados de
imunossupressão), tratamento prévio com soros antiofídicos e história de
reações alérgicas moderadas ou graves. Além disso, não foram incluídos os
pacientes apresentando gravidade, definidos como acidentes botrópicos e
Figura 50. Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado – Manaus- AM. (Fonte: Seção Técnica da FMT-HVD).
Figura 51. Hospital Geral de Roraima Rubens de Sousa Bento - Boa vista - Roraima. (Fonte: arquivo próprio).
Figura 52. Unidade Mista de Borba – AM. (Fonte: arquivo próprio).
56
laquéticos graves, os casos com grande hemorragia, hipotensão, choque e
insuficiência renal aguda, e os acidentes crotálicos com intensa rabdomiólise
e insuficiência renal aguda grave (100).
4.3 SELEÇÃO DE PACIENTES, INTERVENÇÕES E CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA
Após o diagnóstico de acidente com envenenamento, os pacientes que
preencheram os critérios de inclusão eram selecionados randomicamente
com alocação 1:1 para um dos seguintes grupos:
• Grupo A: Soro Antiofídico Trivalente Liofilizado (SATL), produzido de acordo
com as Boas Práticas de Produção pelo Instituto Butantan (São Paulo,
Brasil) em parceria com o Instituto de Biologia do Exército (Rio de
Janeiro, Brasil). Neste estudo, a liofilização foi realizada no Instituto
Butantan. Rapidamente, ampolas de 20 ml foram adicionadas com 5 ml de
cada formulação e inseridas em um Liofilizador Benchmark 1100 (Virtis,
USA). As amostras foram congeladas a -40oC e aneladas a -10oC por 4
horas. A primeira secagem foi conduzida a -20oC por 64 horas, e a secagem
secundária a 30oC por 4 horas e 200 mTorr.
• Grupo B: Os antivenenos avaliados foram o Soro Antibotrópico Líquido, o
Soro Antibotrópico-Laquético Líquido e o Soro Anticrotálico Líquido
disponibilizados pelo Ministério da Saúde. No Brasil, a produção do soro
antiofídico é padronizada e toda a produção de antiveneno dos três
laboratórios nacionais (IB, FED e IVB) é adquirida pelo Ministério da Saúde
para distribuição nacional gratuita.
A lista de randomização foi gerada por computador. Quando um
paciente era considerado condizente aos critérios de inclusão e dava seu
consentimento informado e esclarecido por meio de Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo IIIB) e do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido Especial para os menores de idade
(Anexo IIIC), ele era formalmente recrutado e alocado em um Protocolo de
Registro de Caso (PRC) (Anexo III) constituído de formulários, que se
iniciava com um Formulário de Entrevista (Anexo IIIA).
57
Após admissão, o PRC era preenchido com um único número de
identificação do paciente, sexo, área de ocorrência do acidente ofídico (rural
ou urbana), idade (em anos), etnia, educação (em anos), região anatômica
da picada e tempo entre a picada e a assistência médica (em horas). O
exame clínico se deu pela observação de manifestações locais e sistêmicas,
com o preenchimento do Formulário de Acompanhamento de Exame Clínico
(Anexo IIID) e encaminhamento para exames laboratoriais (Anexo IIIE).
Para o acidente botrópico, a caracterização laboratorial incluía as avaliações
de tempo de coagulação (TC), velocidade de hemossedimentação (VHS),
índice internacional normatizado (INR), hemoglobina, contagem de
leucócitos e plaquetas, níveis plasmáticos de fibrinogênio, creatinina, uréia,
desidrogenase láctica (DHL), aspartato aminotransferase (AST), alanino
aminotransferase (ALT) e creatinofosfoquinase (CPK) no plasma. Para
acidentes laquéticos e crotálicos, a caracterização laboratorial incluía TC,
INR e níveis plasmáticos de fibrinogênio, creatinina, uréia, e atividades de
AST, ALT e CPK no plasma.
Após a classificação do acidente em leve, moderado e grave (Anexo
IIIG), excluindo-se os acidentes graves, iniciava-se a soroterapia precedida
de randomização e pré-medicação. Vinte minutos após a pré-medicação
com hidrocortisona (500 mg) IV, cimetidina (300 mg) IV e dexclorfeniramina
(5 mg) VO (padronizado de acordo com o “guideline” local), a soroterapia
antiveneno era feita em todos os pacientes de ambos os grupos em uma
dose correspondente para acidente leve e moderado. Para informação
detalhada sobre a alocação de grupos e intervenções, verificar Tabela 3.
Antes da administração, cada ampola de SATL era reconstituída em 20 ml
de água destilada com posterior diluição em 100 ml de soro fisiológico. O
tempo de administração do soro antiofídico era de 30 a 45 minutos.
Paracetamol ou dipirona era administrado em caso de dor. O membro
acometido pela picada da serpente era elevado em posição confortável para
redução do edema, as bolhas eram aspiradas, os tecidos necrosados eram
debridados, os abscessos eram drenados, e a antibioticoterapia era usada
de acordo com a infecção.
58
4.4 SEGUIMENTO DOS PACIENTES
Após a soroterapia antiofídica, os pacientes permaneciam internados
durante 24 horas, no mínimo, para seguimento da evolução do caso. Os
mesmos testes laboratoriais referidos acima eram repetidos 4 horas (H4),
12 horas (H12) e 24 horas (H24) após o soro antiofídico. Os pacientes eram
solicitados a voltar ao hospital para avaliação com 7 dias (D7) e 15 dias
(D15) após a alta hospitalar. Nas consultas de seguimento, os exames
clínicos eram realizados e os exames laboratoriais acima mencionados
eram realizados para avaliar a evolução clínica dos acidentes ofídicos e a
ocorrência de reações adversas ao soro antiofídico. Se o paciente não
comparecesse na consulta de seguimento, o investigador planejava uma
consulta domiciliar para o dia seguinte. Pacientes que não compareciam à
consulta e nem eram encontrados na visita domiciliar eram considerados
como perda de seguimento.
4.5 DESFECHO DA SEGURANÇA
O desfecho de segurança primária foi definido como a presença de
sinais e sintomas de reações adversas precoces do soro antiofídico
representada por urticária, crise asmatiforme, edema de laringe e choque,
durante e após a infusão até 24 horas após o tratamento. Reações adversas
precoces foram tratadas com adrenalina subcutânea solução milesimal
(1:1000) 0,3 a 0,5 ml, e repetida após 10 minutos, se necessário. Após
remissão dos sinais e sintomas, a soroterapia antiofídica foi restabelecida.
O desfecho de segurança secundário foi definido como a presença de
sinais e sintomas de reações adversas tardias, como febre, urticária,
artralgia, adenomegalia, complicações neurológicas e renais, até o D15.
Após o D15, os pacientes eram avisados para retornarem para o hospital ou
fazerem contato por telefone com o médico do estudo, em caso de qualquer
sinal de complicações. Em caso de reações tardias, o tratamento consistia
de analgésicos, antihistamínicos e corticoterapia.
4.6 DESFECHO DA EFICÁCIA
59
Para os acidentes laquéticos e botrópicos, o desfecho de eficácia
primária foi definido como a recuperação de parâmetros de hemostasia aos
níveis normais dentro das primeiras 24 horas de seguimento. Para os
acidentes crotálicos, o desfecho de eficácia primária foi definido como a
supressão da coagulopatia e restabelecimento de creatinofosfoquinase
dentro das primeiras 24 horas de seguimento. O desfecho de eficácia
secundária foi definido como a supressão das manifestações neurológicas
e recuperação de outros parâmetros laboratoriais para níveis normais dentro
das primeiras 24 horas de seguimento como estimado em ambos os grupos.
Uma segunda dose equivalente a 4 ampolas de soro antiofídico foi
planejada para ser aplicada o sangue dos pacientes permanecesse
totalmente incoagulável 12 horas após a dose inicial, ou em caso de
recorrência da coagulopatia, novamente seguindo o guideline do Ministério
da Saúde (101). Os pacientes de acidentes laquéticos e crotálicos foram
recrutados em áreas remotas fora da cidade, sem resultados para algumas
análises laboratoriais usadas como desfechos secundários.
4.7 CEGAMENTO
Este foi um estudo aberto que se baseou exclusivamente em valores
laboratoriais para o estabelecimento de desfecho de eficácia primária.
Portanto, o cegamento do grupo do laboratório foi assegurado. A equipe de
laboratório não teve contato direto com os investigadores e nenhuma
informação relacionada à droga administrada ao paciente.
4.8 TESTE DE RECONSTITUIÇÃO
Antes da administração do soro antiofídico, a reconstituição do soro
liofilizado em 20 ml de água destilada estéril foi observada visualmente
quando os frascos do SATL foram levemente agitados de forma manual por
um minuto. A reconstituição bem sucedida foi considerada quando o soro
antiofídico liofilizado era dissolvido e se apresentava como uma solução
homogênea.
60
4.9 CONTROLE DE ESTABILIDADE E QUALIDADE
As amostras de SATL foram enviadas para o Instituto nacional de
Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), Fundação Oswaldo Cruz, Rio
de Janeiro, Brasil, para controle de qualidade e avaliação de estabilidade
(Anexo II). A concentração total de proteínas e proporcional de
imunoglobulina, toxicidade não específica, níveis de pirógenos,
parâmetros biológicos e concentração de fenóis foram avaliados usando
métodos padronizados (Anexo II). As potências antibotrópica, antilaquética
e anticrotálica (mg/ml) foram estimadas através do cálculo do volume de
SATL que neutraliza 1 mg de veneno em camundongo. A estabilidade
térmica do SATL foi determinada pela estimativa da potência do soro
estocado por 15 dias, 1 mês, 3 meses e 1 ano na temperatura de 560C,
comparada com uma linha de base de potência. Os métodos empregados
para estimar a potência do soro antiofídico (102) são apresentados no
arquivo S1 do artigo publicado. A turbidez e a presença de agregados
foram observadas pelo exame visual para o controle de qualidade sobre o
tempo em paralelo com a potência e antes da administração do soro
antiofídico.
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os pacientes foram distribuídos em dois grupos de acordo o tipo de
soro antiofídico recebido. As características de base epidemiológica,
laboratorial e clínica dos pacientes acidentados por Bothrops foram
comparadas pelo teste de Fisher ou Q-quadrado, usando 5% de nível de
significância. O teste de t de student foi usado para comparação de
médias. Para pacientes acidentados por Lachesis e Crotalus, somente
análise descritiva foi conduzida por causa do pequeno número de casos.
A análise da eficácia primária foi feita de todos os pacientes
randomicamente selecionados terminando o seguimento (por protocolo
populacional). O desfecho de eficácia primária para acidentes botrópicos
(ausência de coagulopatia em 48 horas), foi analisado usando curvas de
sobrevivência de Kaplan-Meier. O teste de Log-rank bicaudal foi feito sobre
61
o período de tempo usando o nível de significância de 5%. Todos os
outros desfechos de eficácia foram analisados com estatística
descritiva. As frequências de desfecho de segurança primária entre os
grupos de intervenção e controle foram testadas pelo teste de Fisher
ou teste do Q-quadrado, usando o intervalo de confiança de 95%,
conjugando todos os tipos de acidentes ofídicos. Onde os zeros
causaram problemas com computação de p-valor, 0.5 foi adicionado
para todas as células (103, 104). As análises estatísticas foram
realizadas usando o pacote estatístico STATA versão 13 (Stata Corp,
College Station, Estados Unidos).
4.11. ÉTICA
Pacientes elegíveis participavam de uma entrevista com o
investigador, que dava uma explanação detalhada do protocolo de
tratamento para o paciente de acordo com as informações contidas no
TCLE. O consentimento escrito através do TCLE (Anexos IIIB e IIIC)
era solicitado do paciente e/ou de seu parente/guardião para menores.
O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
do Instituto de Biologia do Exército (IBEX), Rio de Janeiro, e do
Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (aprovação número 001-
03/2003) (Anexos IV e V).
5. RESULTADOS
Os resultados da presente tese são apresentados conforme a versão
final do manuscrito publicado na revista Plos Neglected Tropical
Diseases.
Safety and efficacy of a freeze-dried trivalent antivenom
for snakebites in the Brazilian Amazon: an open
randomized controlled phase IIb clinical trial
Efficacy and safety of freeze-dried trivalent antivenom
62
Iran Mendonça-da-Silva1,2,3, Antônio Magela Tavares2, Jacqueline
Sachett1,2, José Felipe Sardinha2, Lilian Zaparolli3, Maria Fátima Gomes
Santos4, Marcus Lacerda1,2,5, Wuelton Marcelo Monteiro1,2,*
1. Escola Superior de Saúde, Universidade do Estado do Amazonas,
Manaus, Amazonas, Brazil
2. Departamento de Ensino e Pesquisa, Fundação de Medicina Tropical
Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, Amazonas, Brazil
3. Instituto de Biologia do Exército, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
4. Laboratório Químico e Farmacêutico do Exército, Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro, Brazil
5. Instituto Leônidas & Maria Deane, Fundação Oswaldo Cruz, Manaus,
Amazonas, Brazil
* wueltonmm@gmail.com
Abstract
Background
In tropical areas, a major concern regarding snakebites treatment
effectiveness relates to the failure in liquid antivenom (AV) distribution due
to the lack of an adequate cold chain in remote areas. To minimize this
problem, freeze-drying has been sugested to improve AV stability.
Methods and findings
This study compares the safety and efficacy of a freeze-dried trivalent
antivenom (FDTAV) and the standard liquid AV provided by the Brazilian
Ministry of Health (SLAV) to treat Bothrops, Lachesis and Crotalus
snakebites. This was a prospective, randomized, open, phase IIb trial,
63
carried out from June 2005 to May 2008 in the Brazilian Amazon. Primary
efficacy endpoints were the suppression of clinical manifestations, return of
hemostasis and renal function markers to normal ranges within the first 24
hours of follow-up. Primary safety endpoint was the presence of early
adverse reactions (EAR) in the first 24 hours after treatment. FDTAV
thermal stability was determined by estimating AV potency over one year at
56oC. Of the patients recruited, 65 and 51 were assigned to FDTAV and
SLAV groups, respectively. Only mild EARs were reported, and they were
not different between groups.There were no differences in fibrinogen
(p=0.911) and clotting time (p=0.982) recovery between FDTAV and SLAV
treated groups for Bothrops snakebites. For Lachesis and Crotalus
snakebites, coagulation parameters and creatine phosphokinase presented
normal values 24 hours after AV therapy for both antivenoms.
Conclusions/Significance
Since promising results were observed for efficacy, safety and thermal
stability, our results indicate that FDTAV is suitablefor a larger phase III trial.
Trial registration
ISRCTNregistry: ISRCTN12845255; DOI: 10.1186/ISRCTN12845255
(http://www.isrctn.com/ISRCTN12845255).
Author summary
Antivenoms (AV) are included in the WHO List of Essential Medicines, being
the only treatment available for snakebites envenomings. In Brazil, five
types of liquid snake AVs are distributed by the Ministry of Health for
national use free of charge to patients. In remote areas, lack of an adequate
cold chain impairs AV distribution to health facilities resulting in delay in
patient care and, ultimately, in higher complication and case fatality rate. To
minimize this problem, a freeze-drying process has been suggested to
improve the stability of AVs, but freeze-dried AVs efficacy and safety
64
evidence obtained from clinical trials is still verylimited. Freezedrying is a
process by which water is removed from a sample without the need to apply
heat. Benefits of lyophilization are: a) Samples are processed in aseptic
conditions; b) Process does not use heat, ensuring formulation stability; c)
Increases shelf life; d) Samples can be stored at room temperature for a
long time; and e) Reduces weight and volume of samples, which is ideal for
distribution. In this study, a freeze-dryed formulation is presented as a good
alternative for a more stable trivalent antivenom in regions of the Amazon
where high temperaturesare common and the cold chain is poor. Our results
suggest that such a product is adequate for a phase III trial.
Introduction
Snakebites are a serious public health problem in tropical countries, with
higher morbidity and case fatality rates in poor, underdeveloped, rural and
remote rainforest areas. At least 421,000 envenomings and 20,000 deaths
occur each year due to snakebites globally, but these figures may be as
high as 1,841,000 envenomings and 94,000 deaths [1]. Additionally,
400,000 amputations and other severe health consequences such as
infection, tetanus, scarring, contractures, and psychological sequelae have
been recorded [2]. In Brazil, from 2000 to 2015, a total of 416,109
snakebites were recorded by the Brazilian official surveillance system, with
26,000 cases on average per year. Snakebites incidence is higher in the
Brazilian Amazon states, with a rate of 55.4 cases/100,000 inhabitants in
2015 and, it is considered an occupational health problem of rural and
riverine populations [3]. However, the true burden of snakebites is probably
higher and difficult to estimate since only a few countries have a reliable
system for epidemiological surveillance of these events [4]. In the Brazilian
Amazon, the case fatality rate has been estimated to be 0.6% and
associated with older age and delayed medical assistance [5].
The Bothrops genus is responsible for 80-90% of snakebites in the
Brazilian Amazon [5,6,7]. In this region, Bothrops envenoming results in
pain, swelling, regional lymphadenopathy, ecchymosis, blistering, and
65
necrosis as the most common local manifestations [6,8,9]. Systemic
bleeding and acute renal failure are common systemic complications after
Bothrops envenomings [6,9]. Clinical manifestations at the Bothrops and
Lachesisbite sites are similar, with an intense tissue damage evidenced by
pain, edema, blisters, bleeding, and ecchymosis [10]. Bothrops and
Lachesis venoms are characterized by three main pathophysiological
activities: coagulant, hemorrhagic, and proteolytic or acute inflammatory
effects [11-14]. Signs and symptoms of vagal stimulation, such as dizziness,
blurred vision, diarrhea, abdominal cramps, sinus bradycardia, severe
hypotension and shock, may occur after Lachesis bites [10,15].Crotalus
venom has neurotoxic, myotoxic and coagulant activities and its systemic
manifestations include drowsiness, ptosis, ophthalmoplegia, sagging face
muscles, blurred vision, diplopia, myalgia, arthralgia and myoglobinuria,
with mild clinical manifestations at the bite site generally [12].
Currently, antivenom (AV) immunoglobulins, included in the WHO List
of Essential Medicines, are the only treatment available for snakebites
envenomings [16]. In Brazil, the Ministry of Health implemented the National
Program for Snakebites Control in 1986 [17]. Since then, AV production has
been carried out by national laboratories and distributed by the Ministry of
Health for national use free of charge to patients. Five types of snake liquid
AVs are currently available: Bothrops AV, Crotalus AV, Bothrops-Crotalus
AV, Bothrops-Lachesis AV, and Micrurus AV [4]. In the Amazon and other
tropical areas, a major concern regarding snakebites treatment
effectiveness relates to the impossibility of wide and timely liquid AV
distribution. The lack of an adequate cold chain impairs AV distribution to
health facilities available in remote areas and may result in delayed patient
care and, ultimately, in higher complications and case fatality rates [5]. In
additon, inadequate storage and transportation may result in loss of material
[4]. To minimize this problem, it has been suggested freeze-drying to
improve the stability of AV immunoglobulins. This additional step and
addition of different stabilizers lead to AVs with a higher stability compared
to liquid formulations, especially in tropical regions where high temperatures
could affect the activity of immunoglobulins [18-20]. Physicochemical
66
characterization studies of commercial freeze-dried AVs from India, Mexico,
Thailand and Costa Rica showing good quality standards are available in
the literature [18,20]. However, knowledge about freeze-dried AVs efficacy
and safety obtained from clinical trials is still very limited.
This study was performed to compare the safety and efficacy of a
freeze-dried trivalent antivenom with those of the available AV provided by
the Brazilian Ministry of Health (MoH), to treat Bothrops, Lachesis and
Crotalus snakebites in the Brazilian Amazon.
Material and Methods
Study design and participants
This was a prospective, randomized, open, phase IIb trial, carried out
from June 2005 to May 2008. Bothrops snakebites from the Tropical
Medicine Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Manaus,
Amazonas state, Brazil were included. Lachesis snakebites included were
from the local hospitals at Borba (Amazonas state, Brazil), Normandia and
Pacaraima (Roraima state, Brazil). Crotalus snakebites were included from
the local hospitals of Boa Vista and Cantá (Roraima state, Brazil). Eligible
patients were male and female subjects aged between 12 and 70 years old.
Bothrops, Lachesis and Crotalus snakebites were diagnosed using clinical,
epidemiological and laboratorial evaluations. Exclusion criteria were
pregnancy or breastfeeding, previous hematological disorders, known
immunodeficiencies (HIV, malignancies, chemotherapy or other
immunosuppressive treatments), previous treatment with snake AVs and
history of any moderate/severe allergic reactions. Moreover, patients
presenting with severe snake envenomings, defined for Bothrops and
Lachesis as life-threatening snakebites with severe bleeding, hypotension,
shock and acute renal failure, and for Crotalus as intense rhabdomyolisis
and severe acute renal failure [21], were not included.
67
Patients’ selection, interventions and baseline clinical
characterization
After snakebite envenoming diagnosis, patients that fulfilled all inclusion
criteria were randomly assigned with allocation ratio 1:1 to one of the
following groups:
i) Group A: Freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV), produced under
GMP conditions by Butantan Institute (São Paulo, Brazil) in partnership with
Instituto de Biologia do Exército (Rio de Janeiro, Brazil). In this study,
freeze-drying was performed at the Butantan Institute. Briefly, 20 mL vials
were filled with 5 mL of each formulation and loaded on a freeze-dryer
Benchmark 1100 (Virtis, USA). The samples were frozen at -40oC and
annealed at -10oC for 4 h. The primary drying was conducted at -20oC for
64 h, and the secondary drying at 30oC for 4 h and 200 mTorr.
ii) Group B: available Bothrops, Bothrops-Lachesis and Bothrops-
Crotalus AVs provided by the MoH (SLAV). In Brazil, snake AV production
is standardized and all the AV production from the three national
laboratories (Butantan Institute, Ezequiel Dias Foundation and Vital Brazil
Institute) is acquired by the MoH for national distribution free of charge.
A randomization list was computer-generated. When a patient was
considered to meet the inclusion criteria and had given her/his informed
consent, he/she was formally recruited and a unique ID number was
allocated in the Case Report Form (CRF). After admission, a CRF was filled
with the patient's unique ID number, gender, area of occurrence of the
snakebite (rural or urban), age (in years), ethnicity, education (in years),
anatomical region of the bite, and time from bite to medical assistance (in
hours). Clinical examination included the observation of local and systemic
manifestations. For Bothrops snakebites, laboratorial characterization
included clotting time, erythrocyte sedimentation rate,International
Normalized Ratio (INR), hemoglobin, leucocyte and platelet counts and
plasma levels of fibrinogen, creatinine, urea, lactate dehydrogenase,
68
aspartate transaminase, alanine transaminase and creatine phosphokinase
in the plasma. For Lachesis and Crotalus snakebites, laboratorial
characterization included clotting time, INR and plasma levels of fibrinogen,
creatinine, urea, and activities of aspartate transaminase, alanine
transaminase and creatine phosphokinase in the plasma.
Twenty minutes after pre-medication with IV hydrocortisone (500 mg),
IV cimetidine (300 mg) and oral dexchlorpheniramine (5 mg) (standardized
according to local guidelines), AV therapy was given to all patients from both
groups in a dosage corresponding to mild or moderate envenomation. For
detailed information about the allocation groups and interventions, see
Table 1. Before administration, each FDTAV vial was reconstituted in 20 mL
of sterile saline solution (0.9%) with a further dilution in 100 mL before
administration. Each SLAV vial was diluted in 100 mL of saline solution
0.9%. Antivenom administration time ranged from 30 to 45 minutes.
Intravenous paracetamol was given on demand for pain. The bitten limb
was nursed in the most comfortable position, blisters were aspirated,
necrotic tissue was surgically debrided, abscesses were drained, and
antibiotic treatment was given accordingly.
Patients’ follow-up
After AV therapy, patients were admitted to the hospital ward for close
monitoring during 24 hours. The same laboratorial tests referred above
were repeated 4 hours (H4), 12 hours (H12) and 24 hours (H24) after AV
therapy. Patients were asked to attend the hospital seven (D7) and fifteen
days (D15) after discharge. At follow-up visits, clinical examination was
carried out and the above mentioned laboratorial tests were performed in
order to investigate clinical evolution of the envenomations and occurrence
of late adverse reactions to AV therapy. If the patient did not present for the
follow-up visits, the investigator planned a domiciliary visit the following day.
69
Patients who did not present to hospital visits and were not found at
domiciliary visits were considered lost to follow-up.
Safety endpoints
Primary safety outcome was defined as the presence of signs and
symptoms of early adverse reactions of AV therapy represented by urticaria,
asthma-like crisis, laryngeal edema and shock, shortly after infusionuntil the
first 24 hours after treatment. Early reactions were treated with
intramuscular or subcutaneous adrenaline (1:1000, 0.3-0.5 mL), and
repeated after 10 minutes if needed. After the symptoms ofreaction had
subsided, AV therapy was restarted.
Secondary safety outcome was defined as the presence of late adverse
events, namely fever, urticarial, arthralgia, adenomegaly, neurological and
renal complications, until D15. After D15, patients were advised to return to
the hospital or to contact the study physician by phone in case of any signs
of complications. In case of late reactions, treatment consisted of
analgesics, anti-histamines and corticotherapy.
Efficacy endpoints
For Bothrops and Lachesis snakebites, primary efficacy outcome was
defined as the recovery of hemostasis parameters to normal ranges within
the first 24 hours of follow-up. For Crotalus snakebites, primary efficacy
outcome was defined as the suppression of coagulopathy and improvement
of creatine phosphokinase activity within the first 24 hours of follow-up.
Secondarily, suppression of neurological manifestations and recovery of
other laboratorial parameters to normal ranges within the first 24 hours of
follow-up was estimated in both groups. A second dose of four vials of AV
was planned to be given if the patient’s blood remained totally incoagulable
12 hours after the initial dose, or in case of coagulopathy recurrence, again
following the Brazilian Ministry of Health’sguidelines [21]. Lachesis and
70
Crotalus patients were recruited in remote countryside areas, unfortunately
with no availability to some laboratorial analysis used as secondary
endpoints.
Blinding
This was an open label trial that exclusively relied on laboratorial values
for theassessment of the primary efficacy outcome, therefore blinding of
laboratorystaff was ensured. The laboratory personnel performing the
analyses had nodirect contact with the investigators and no information
regarding the drugadministered to the patient.
Reconstitution test
Before administration, AV dissolution in 20 mL of sterile saline solution
(0.9%) was observed visually as the FDTAV vials were gently agitated by
hand for one minute. Successful reconstitution was considered when the
dry AV was dissolved into a homogeneous solution.
Quality control and stability
Samples of the FDTAV were sent to the Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Saúde (INCQS), Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro,
Brazil, for quality control and stability evaluation. Total protein concentration
and proportion of immunoglobulins, nonspecific toxicity, pyrogen levels,
microbiological parameters and phenol concentrations were evaluated using
standard methods. Anti-Bothrops, Lachesis and Crotaluspotencies (mg/mL)
were estimated by calculating the volume of FDTAV that neutralizes 1 mg of
venom in mice. The FDTAV thermal stability was determined by estimating
AV potency kept 15 days, one month, three months and one year at 56oC,
compared to baseline potency. Methods employed for estimating AV potency
[22] are presented in S1 File. Turbidity and presence of aggregates were
71
observed by visual examination for quality control over time in parallel with
potency and before AV administration.
Statistical methods
Patients were distributed in two groups according the type of AV received.
Baseline epidemiological, laboratorial and clinical characteristics of patients
bitten by Bothrops were compared by Fisher test or chi-square test, using a
5% significance level. Student's t-test was used for comparison of means.
For Lachesis and Crotalus patients, only a descriptive analysis was
conducted because of the small number of cases. The primary efficacy
analysis was done on all randomly selected patients finishing the follow-up
(per protocol population). The primary efficacy endpoint for Bothrops bites,
coagulopathy-free efficacy at 48 hours, was analysed using Kaplan-Meier
estimates. A two-sided log-rank test was done over the time period using a
5% significance level. All other efficacy endpointswere analyzed with
descriptive statistics.Primary safety endpoint frequencies between
intervention and control groups were tested by Fisher test or chi-square test,
using a 5% significance level, pooling all types of snakebites. Where zeros
caused problems with computation of p values, 0.5 was added to all cells
[23,24]. Statistical analyses were performed using the STATA statistical
package version 13 (Stata Corp. 2013).
Ethics
Eligible patients were asked to meet the study investigator, who gave
detailed explanation of the study protocol according to the patient information
sheet. Written consent was requested from the patient or from their
parents/guardians for minors. The study protocol was approved by the
Research Ethics Committee of the Instituto de Biologia do Exército (IBEx),
Rio de Janeiro, Brazil, and by the National Ethical Committee (approval
number 001-03/2003).
Results
72
Patients inclusion
The assessment and enrollment of ptients in this study is shown in a flow
diagram (Fig 1). Briefly, out of 244 patients initially screened, 116 were
eligible for inclusion: 102 cases of Bothrops, 6 cases of Lachesis and 8 cases
of Crotalus snakebites. Of the patients recruited, 65 were assigned to Group
A (FDTAV) (58 Bothrops, three Lachesis and four Crotalus bites) and 51 to
the Group B (SLAV) (44 Bothrops, three Lachesis and four Crotalus bites).
No patient was lost to follow-up.
Baseline characterization
Bothrops snakebites were more frequent in males (88.2%), and mostly
occurred in rural areas (68.6%). The most affected age group was the 16-30
years old (43.1%) followed by the 31-60 years old (42.2%). Admixed ethnicity
was recorded for 95.1% of the included patients. A total of 50.0% of the
patients presented 1-4 years of education. The most affected anatomical
sites were the lower limbs (93.1%). Time elapsed from bite to medical
assistance was higher than 6 hours in 34.3% of the cases. Lachesis and
Crotalus bites showed the same general epidemiological characteristics
(Table 2). Baseline laboratorial characteristics were similar in both groups
(Table 3 and S2 File).The most frequent manifestations observed at
admission in Bothrops snakebites were pain (96.1%), edema (96.1%) and
local bleeding (30.4%). The most frequent systemic manifestations were
nausea (11.8%), acute renal failure (6.9%) and bleeding (6.9%). Vagal
manifestations, such as vomiting, bradycardia, hypotension, abdominal pain
and blurred vision, were observed in Lachesis bites. Myalgia and neurological
manifestations, namely palpebral ptosis, diplopia, ophtalmoplegia and
dizziness, were recorded for Crotalus bite cases (Table 4). There were no
deaths or permanent sequelae in the study.
73
In general, epidemiological, clinical and laboratorial characteristics were
similarly distributed in the two study groups within Bothrops, Lachesis and
Crotalus bitten groups.
Efficacy endpoints analysis
There were no differences between FDTAV and MoH AV treated groups
in the time until patient admission for fibrinogen (p=0.911) and clotting time
(p=0.982), both reaching normal values over follow-up in patients bitten by
Bothrops snakes (Fig 2). Clotting time, fibrinogen and INR presented normal
values 24 hours after AV therapy, for both antivenoms (Fig 3). Moreover,
creatinine, liver transaminases, creatine phosphokinase and the other
laboratorial markers were normal 24 hours after admission in FDTAV and
SLAV treated groups.
For Lachesis snakebites, fibrinogen, clotting time and INR presented
normal values 24 hours after AV therapy for both antivenoms (S3 File).
Regarding Crotalus snakebites, fibrinogen, clotting time, INR, and
creatine phosphokinase presented normal values 24 hours after AV therapy
in FDTAV and SLAV treated groups (S4 File). Signs and symptoms such as
blurred vision, palpebral ptosis, diplopia and ophtalmoplegia disappeared
within the first 24 hours of follow-up. The other laboratorial parameters also
returned to normal ranges within the first 24 hours of follow-up for both
groups. Renal failure was not seen in this group of patients.
No patient required a second AV dose afterthe initial dose because of
persistent coagulopathy and no local or coagulopathy recurrence was
recorded among the patients. All clinical, both locally and systemically, and
laboratorial evaluations remained normal at D7 and D15 in both treatment
groups.
Safety endpoint analysis
74
A total of 23 patients presented early adverse events after AV therapy
(19.8%). The most common were urticaria (13.8%), pruritus (11.2%), facial
flushing (3.4%) and vomiting (3.4%). There was no significant difference in
the frequency of early adverse events between patients treated with FDTAV
and SLAV (Table 5). All adverse events were mild and all signs and
symptoms of early adverse reactions ceased within 48 hours from
management. Late adverse events were not observed at D7 and D15 clinical
evaluations. Patients were advised to report these after D15, however no
patient returned to the hospital or contacted the study physician by phone
complaining about possible late adverse events after that day.
Quality control and stability results
FDTAV physicochemical analysis showed a total protein concentration
of 4.63g%, with 80% of F(ab’)2 immunoglobulins. FDTAV was sterile, atoxic
and apyrogenic. Phenol concentration was <3,500 ppm.Antivenom potency
for neutralizing Bothrops, Lachesis and Crotalus activities showed no
significant decrease compared to baseline potency over one year of
thermostability evaluations at 56oC (Fig 4). No visual alterations in turbidity
and no aggregates were observed over time and before AV administration.
Discussion
Antivenoms are the only specific treatment for treating most of the
snakebite envenomings effects, and play a crucial role in minimizing mortality
and morbidity. However, to be part of the primary health care package where
snakebites occur, there is an urgent need to ensure availability of safe,
effective and affordable AVs, namely in developing countries [16]. Moreover,
innovation in the logistics of AV distribution is also a priority. In Brazil, for
instance, current AVs require conservation in adequate facilities (2° to 8°C),
which are not always available in remote settings [4]. Although freeze-dried
formulations maybecome a good alternative for the production of more stable
AVs in regions of theworldwhere high temperaturesare common and the cold
75
chain is poor, such in the Brazilian Amazon, there is a verylimited body of
published literature on stability, clinical efficacy and safety for freeze-dried
AVs. A main concern is the conservation of the freeze-dried AV
pharmacokinetic propertiesand further neutralizing potency of the antibodies
submitted to lyophilization [25]. Although positive results from thermal
characterization of the effect of freeze-drying on equine antibodies and
theeffectiveness of stabilizers in freeze-dried AVs have been reported
[18,19], to the best of our knowledge this is the first clinical trial aiming to
compare the safety and efficacy of a freeze-dried AV with a liquid formulation.
This study did not include data on the possible increase in the cost of AV
production due to the freeze-drying process. Future cost studies to address
thiswill be essential.
Efficacy analysis
Our results showed that in both groups neutralization of venom-induced
bleeding and coagulopathy invariably ceased, and blood coagulability was
restoredover 24 hours of follow-up of all patients. Since hemostasis disorders
have been related to severity and deaths in viperid envenomations,
restoration of blood coagulability has been proposed as a relevant target
endpoint in snakebite clinical trials [26,27]. Actually, systemic manifestations
of viperid snakebites are characterized by bleeding, coagulopathy associated
with defibrinogenation and incoagulability, with the potential of evolving to
hypovolemia and further potentially life-threatening conditions such as
hypotension, cardiovascular shock and acute kidney injury in severe cases
[5, 28-30]. Our results indicate that an improvement in coagulation status
might be expected within 6-12 hours in most patients and within 24 hours in
nearly all patients receiving a single dose of AV [6,31-33]. Blood coagulability
should be monitored after the initial AV dose and further doses of AV should
be administered, if necessary, until coagulability is restored [31,33,34].
Abnormal renal function is also fairly common in viperid envenomings
[5,35,36]. Both study groups presented serum creatinine concentrations that
restored to normal values within the first 24 hours of follow-up of Bothrops
snakebites. However, some patients admitted with renal failure may evolve
76
without improvement of kidney injury even after AV administration, as injury
was triggered before AV administration [35, 36]. This needs to be taken in
consideration in the interpretation of renal failure as an endpoint in Bothrops
bites.
Crotalus venom may cause systemic myotoxicity, increasing serum levels
of creatine kinase [12]. In addition, the levels of muscle enzymes increase
even after proper AV therapy [12, 37, 38]. Likewise, even patients who
receive proper amounts of antivenom can progress with renal damage
because the mechanisms of injury are triggered after snakebite and before
the antivenom administration. In this study, however, no patient presented
renal failure at admission and normal creatine kinase levels were seen at 24
hours of follow-up of Crotalus snakebites. All patients recovered from
coagulopathy within 24 hours after therapy with FDTAV or SLAV. Although
some neurological manifestations observed in Crotalus envenomation do not
usually improve rapidly after AV administration [12], in this trial signs and
symptoms such as blurred vision, palpebral ptosis, diplopia and
ophtalmoplegia were suppressed within the first 24 hours of follow-up.
In this study, a second dose of AV was not necessary, since no patient
presented the blood totally incoagulable 12 hours after the initial dose or
coagulopathy recurrences. Indeed, persistent or recurrent venom
antigenemia and even recurrent coagulopathy may be present within 12-48
hours in severe envenoming [39, 40], but severe cases were not included in
this trial. Moreover, differences in the efficacy of the available antivenom also
explain dissimilar rates of resolution of venom-induced coagulopathy, as
observed using AVs from different Latin American countries [41-44].
Furthermore, venom composition is known to vary significantly among
snakes of different species further reflecting in AV efficacy [14, 45]. Data
concerning Lachesis and Crotalus species have limitations in terms of
efficacy because of the small number due to the rarity of these cases in the
Amazon.
Safety analysis
77
Although the literature suggests that the amount of heterologous proteins
is related to the frequency and intensity of adverse reactions [46], we did not
observe a significant increase in the incidence of adverse events in FDTAV
compared to SLAV. Although both AVs were manufactured from the same
pool of hyperimmune plasma, one concern of this study is the possible
formation of insoluble aggregates during the freeze-drying process with
further incomplete reconstitution, which has been associated with the
development of adverse events during administration [47]. One hypothesis
for the negligible insoluble aggregates formation in the FDTAV is the use of
sucrosein the stabilization of the lyophilized AV.The protective effect of
polyols like sorbitol andmannitol in the development of turbidity in liquid AVs
has already been reported [48-50]. More recently, the use of sucrosein the
stabilization of liquid or freeze-dried AVs has been described as a better
stabilizer than mannitol and sorbitol in the FDTAV formulation [18,19].
Early AV reactions were mild and were promptly reversed by treatment
with adrenaline and antihistamines.The incidence of early adverse reactions,
all mild and not life-threatening, was similar to two other trials from Brazil and
Colombia [6,39]. However, generally this frequency was lower than the
results from other trials carried out in South America with Bothrops bitten
patients, which reported incidences ranging from 25 to 87% [31-33, 40, 43,
51]. Although antihistamines appear to be of no obvious benefit in preventing
acute reactions from antivenoms [52-54], the pre-sorotherapy regimen used
in this study (IV hydrocortisone, IV cimetidine and oral dexchlorpheniramine)
may have also contributed to the low incidence of early adverse reactions.
Late adverse events were not observed in this trial, in agreement with
previous studies showing their absence [8, 31, 33, 40, 43, 51] or low
incidence [55]. Although no patient returned to the hospital or contacted the
study physician complaining about possible late adverse events after D15,
patients treated with snake AVs may present adverse reactions after this day.
On-site follow-up completion on this day may represent a limitation of this
study that may underestimate the frequency of reactions. A concern for the
use of AVs formulated with sucrose has been the possibility of complicating
or producing some renal damage [56], but renal function was normal for all
78
patients after 24 hours of follow-up, indicating that the dosage employed was
safe.
Reconstitution test
Previous studies reported prolonged reconstitution times of 30 and 90
minutes for some lyophilized AVs [57,58], delaying the time of AV
administration, wich is a factor related to poor prognosis of snakebites
envenomation [5].In this study, however, a complete dissolution was
observed visually as the FDTAV vials were gently agitated by hand for one
minute, in agreement with previous studies where other freeze-dried proteins
showed short reconstitution times (lower than 5 minutes) [18,59,60],
suggesting maintenance of the stability and neutralizing activity [60,61].
Stability results
Successful freeze-drying of AVsalready used routinely in some
continents (despite the lack of published clinical trials) requires the
conservation of the physicochemical stability and neutralizing potency of the
antibodies over time at room temperature [18]. In this study, AV potency for
neutralizing Bothrops, Lachesis and Crotalus venom activities showed no
significant decrease comparing to baseline over one year of thermostability
evaluations at 56oC. Osmolytes such as sucrose or sorbitol are capable of
stabilizing antibodies at high temperatures with no significant perturbation in
their secondary structure or in their affinity to snake venoms [48,49]. Liquid
AVs with sorbitol prevent the appearance of turbidity after one year storage
at 37oC, but show a partial loss in neutralizing potency in these conditions
[50]. When tested, anti-α-cobratoxin single domain antibodies added with
disulfide bonds at 1 mg/mL at a range of elevated temperatures for an hour
retainednearly 100% of their initial binding activity [62].
Final remarks
In this study, FDTAV and SLAVs presented the same efficacy based
on clinically relevant outcomes in Bothrops, Lachesis and Crotalus bites.
79
Furthermore, there was no significant difference in the incidence of early
adverse reactions between patients treated with FDTAV and SLAVs. Only
mild early adverse reactions were reported. This freeze-dryed formulation
may become a good alternative for the production of more stable AVs in
regions of the Amazon where high temperatures are common and the cold
chain is poor. Our results indicate such a product should be attainable for a
phase III trial.
Acknowledgements
We acknowledge all those individuals from the Army Institute of Biology
and Tropical Medicine Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado, who provided
help during the research. We acknowledge the Butantan Institute staff
involved in the freezedried trivalent antivenom production, as well as the staff
from the hospitals at Borba, Normandia, Pacaraima, Boa Vista and Cantá
municipalities for the help during the research.
References
1. Kasturiratne A, Wickremasinghe AR, Silva N, Gunawardena NK,
Pathmeswaran A, Premaratna R, et al.(2008) The Global Burden of
Snakebite: A Literature Analysis and Modelling Based on Regional Estimates
of Envenoming and Deaths. PLoS Med 5: 1591–1604.
2. WHO. World Health Organization, 2016. Epidemiology
[WWWDocument]. World Heal. Organ. http://www.who.int/topics/
epidemiology/en/.
3. Brazilian Ministry of Health (2017) Ofidismo: Situação Epidemiológica
– Dados [WWW Document]. Minist. da Saúde. URL
http://portalsaude.saude. gov.br/index.php/o-ministerio/principal/leia-mais-
oministerio/1025-secretaria-svs/vigilancia-de-a-a-z/animais-peconhentos
80
serpentes/l2-animais-peconhentos-serpentes/13712-situacao-
epidemiologicadados. (Accessed 1.10.17).
4. Wen FH, Monteiro WM, Silva AMM, Tambourgi DV, Silva IM, Sampaio
VS, et al. (2015) Snakebites and Scorpion Stings in the Brazilian Amazon:
Identifying Research Priorities for a Largely Neglected Problem. PLoS Negl
Trop Dis 9: e0003701.
5. Feitosa EL, Sampaio VS, Salinas JL, Queiroz AM, Silva IM, Gomes
AA, et al.(2015) Older Age and Time to Medical Assistance Are Associated
with Severity and Mortality of Snakebites in the Brazilian Amazon: A Case-
Control Study. PLoS One 10: e0132237.
6. Pardal PPO, Souza SM, Monteiro MRCC, Fan HW, Cardoso JLC,
França FOS, et al.(2004) Clinical trial of two antivenoms for the treatment of
Bothrops andLachesis bites in the north eastern Amazon region of Brazil.
Trans R Soc Trop Med Hyg 98: 28–42.
7. Pierini SV, Warrell DA, Paulo A, Theakston RD (1996) High incidence
of bites and stings by snakes and other animals among rubber tappers and
Amazonian Indians of the Juruá Valley, Acre State, Brazil. Toxicon 34: 225–
236.
8. Otero R, Gutiérrez JM, Núñez V, Robles A, Estrada R, Segura E, et
al.(1996) A randomized double-blind clinical trial of two antivenoms in
patients bitten by Bothrops atrox in Colombia. Trans R Soc Trop Med Hyg
90: 696–700.
9. Souza ARB (2002) Snakebite by Bothrops atrox (Lin. 1758) in the
State of Amazonas—Brazil: Study of 212 cases with identified snake. Rev
Patol Trop 31: 259–268.
10. Torres J, Torres M, Arroyo-Parejo M (1995) Coagulation disorders in
bushmaster envenomation. Lancet 346: 449–450.
81
11. Assakura MT, Furtado MF, Mandelbaum FR (1992) Biochemical and
biological differentiation of the venoms of the lancehead vipers (Bothrops
atrox, Bothrops asper, Bothrops marajoensis and Bothrops moojeni). Comp.
Biochem. Physiol. Part B Comp. Biochem 102: 727–732.
12. Azevedo-Marques M, Hering S, Cupo P (2009) Acidente Crotálico. In:
Sarvier (Ed.), Cardoso JLC, Haddad-Jr V, França FS, Málaque CMS, Wen
FH. Animais Peçonhentos no Brasil. Sarvier, São Paulo, pp. 108–115.
13. Freitas-De-Sousa LA, Amazonas DR, Sousa LF, Sant’Anna SS,
Nishiyama MY, Serrano SMT, et al.(2015) Comparison of venoms from wild
and long-term captive Bothrops atrox snakes and characterization of
batroxrhagin, the predominant class PIII metalloproteinase from the venom
of this species. Biochimie 118: 60–70.
14. Sousa LF, Nicolau CA, Peixoto PS, Bernardoni JL, Oliveira SS,
Portes-Junior JA, et al (2013) Comparison of Phylogeny, Venom
Composition and Neutralization by Antivenom in Diverse Species of
Bothrops Complex. PLoS Negl Trop Dis 7: e2442.
15. Souza RCG, Nogueira APB, Lima T, Cardoso JLC (2007) The Enigma
of the North Margin of the Amazon River: Proven Lachesis Bites in Brazil,
Report of Two Cases, General Considerations about the Genus and
Bibliographic Review. Bull Chicago Herpetol Soc 42: 105–115.
16. WHO (2010) Guidelines for the Production Control and Regulation ol
Snake Antivenom Immunoglobulins. WHO, Geneva.
17. Feitosa ES, Sampaio V, Sachett J, Castro DB, Noronha MDN, Lozano
JLL, et al.(2015) Snakebites as a largely neglected problem in the Brazilian
Amazon: highlights of the epidemiological trends in the States of Amazonas.
Rev Soc Bras Med Trop 48: 34–41.
18. Herrera M, Tattini-Junior V, Pitombo R, Gutiérrez J, Borgognoni C,
Baudrit J, et al. (2014) Freeze-dried snake antivenoms formulated with
82
sorbitol, sucrose or mannitol: comparison of their stability in an accelerated
test. Toxicon 90: 56–63.
19. Herrera M, Solano D, Gómez A, Villalta M, Vargas M, Sánchez A, et
al. (2017). Physicochemical characterization of commercial freeze-dried
snake antivenoms. Toxicon126:32–37.
20. Rojas G, Espinoza M, Lomonte B, Gutiérrez JM (1990) Effect of
storage temperature on the stability of the liquid polyvalent antivenom
produced in Costa Rica. Toxicon 28: 101–105.
21. Brazilian Ministry of Health (2016) Guia de Vigilância em Saúde, 1st
ed, Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento
de Vigilância das Doenças Transmissíveis. Brasilia.
22. Brazilian Ministry of Health (2000) Farmacopeia Brasileira, 4th ed.
Anvisa. Brasília.
23. Deeks J, Higgings J (2010) Statistical algorithms in Review Manager
5.
24. Pagano M, Gauvreau K (2000) Principles of Biostatistics, 2nd ed.
Brooks /Cole, Belmont.
25. Sarciaux J-M, Mansour S, Hageman MJ, Nail SL (1999) Effects of
Buffer Composition and Processing Conditions on Aggregation of Bovine
IgG during Freeze-Drying. J Pharm Sci 88: 1354–1361.
26. Ho M, Warrell MJ, Warrell DA, Bidwell D, Voller A (1986) A critical
reappraisal of the use of enzyme-linked immunosorbent assays in the study
of snake bite. Toxicon 24: 211–221.
27. Sano-Martins IS, Wen FH, Castro SCB, Tomy SC, França FOS, Jorge
MT, et al. (1994) Reliability of the simple 20 minute whole blood clotting test
(WBCT20) as an indicator of low plasma fibrinogen concentration in patients
envenomed by Bothrops snakes. Toxicon 32: 1045–1050.
83
28. Cardoso JLC, França FOS, Wen FH, Málaque CMS, Haddad-Jr V
(2003) Venomous animals in Brazil: biology, clinic and therapeutics of
envenomations. São Paulo, Sarvier; FAPESP. 468 p.
29. Otero-Patiño R (2009) Epidemiological, clinical and therapeutic
aspects of Bothrops asper bites. Toxicon 54: 998–1011.
30. Warrell DA (2004) Epidemiology, Clinical Features and Management
of Snake Bites in Central and South America, in: Cornell University Press
(Ed.), Campbell, J., Lamar, W. W. (Eds.), Venomous Reptiles of the Western
Hemisphere. Cornell University Press, Ithaca, pp. 709–761.
31. Cardoso JLC, Wen FH, França FOS, Jorge MT, Leite RP, Nishioka
SA, et al. (1993) Randomized comparative trial of three antivenoms in the
treatment of envenoming by lance-headed vipers (Bothrops jararaca) in São
Paulo, Brazil. QJ Med 85: 315–325.
32. Otero-Patiño R, Segura Á, Herrera M, Angulo Y, León G, Gutiérrez
JM, et al.(2012) Comparative study of the efficacy and safety of two
polyvalent, caprylic acid fractionated [IgG and F(ab’)2] antivenoms, in
Bothrops asper bites in Colombia. Toxicon 59: 344–355.
33. Otero-Patiño R, Cardoso J, Higashi H, Nunez V, Diaz A, Toro M, et
al.(1998) A randomized, blinded, comparative trial of one pepsin-digested
and two whole IgG antivenoms for Bothrops snake bites in Uraba, Colombia.
The Regional Group on Antivenom Therapy Research (REGATHER). Am J
Trop Med Hyg 58: 183 –189.
34. Jorge MT, Cardoso JLC, Castro SCB, Ribeiro L, Franca FOS, Sbrogio
de Almeida ME, et al (1995) A randomized “blinded” comparison of two
doses of antivenom in the treatment of Bothrops envenoming in Sao Paulo,
Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 89: 111–114.
35. Amaral CFS, Rezende NA, Silva OA, Ribeiro MMF, Magalhães RA,
Reis RJ, et al.(1986) Insuficiência renal aguda secundária a acidentes
84
ofídicos botrópico e crotálico. Análise de 63 casos. Rev Inst Med Trop Sao
Paulo 28: 220–227.
36. Otero R, Gutiérrez J, Beatriz Mesa M, Duque E, Rodríguez O, Luis
Arango J, et al.(2002) Complications of Bothrops, Porthidium, and
Bothriechis snakebites in Colombia. A clinical and epidemiological study of
39 cases attended in a university hospital. Toxicon 40: 1107–1114.
37. Azevedo-Marques MM, Hering SE, Cupo P (1987) Evidence that
Crotalus durissus terrificus (South American rattlesnake) envenomation in
human causes myolysis rather than hemolysis. Toxicon 11: 1163–1168.
38. Cupo P, Azevedo-Marques MM, Hering SE (1990) Acute myocardial
infarctionlike enzyme profile in human victims of Crotalus durissus terrificus
envenoming. Trans R Soc Trop Med Hyg 84: 447–451.
39. Otero R, León G, Gutiérrez J, Rojas G, Toro MJB, Rodríguez V, et
al.(2006) Efficacy and safety of two whole IgG polyvalent antivenoms,
refined by caprylic acid fractionation with or without beta-propiolactone, in
the treatment of Bothrops asper bites in Colombia. Trans R Soc Trop Med
Hyg 100: 1173–1182.
40. Otero R, Gutiérrez J, Rojas G, Núñez V, Dı́az A, Miranda E, et
al.(1999) A randomized blinded clinical trial of two antivenoms, prepared by
caprylic acid or ammonium sulphate fractionation of IgG, in Bothrops and
Porthidium snake bites in Colombia: correlation between safety and
biochemical characteristics of antivenoms. Toxicon 37: 895–908.
41. Laing GD, Yarleque A, Marcelo A, Rodriguez E, Warrell DA,
Theakston RDG (2004) Preclinical testing of three south American
antivenoms against the venoms of five medically-important Peruvian snake
venoms. Toxicon 44: 103–106.
42. Rojas E, Quesada L, Arce V, Lomonte B, Rojas G, Gutiérrez JM
(2005) Neutralization of four Peruvian Bothrops sp. snake venoms by
polyvalent antivenoms produced in Perú and Costa Rica: Preclinical
assessment. Acta Trop 93: 85–95.
85
43. Smalligan R, Cole J, Brito N, Laing GD, Mertz BL, Manock S, et al.
(2004) Crotaline snakebite in the Ecuadorian Amazon: randomised double
blind comparative trial of three South American polyspecific antivenoms.
BMJ 329: 1129.
44. Theakston R, Laing G, Fielding C, Lascano A, Touzet J-M, Vallejo F,
et al. (1995) Treatment of snake bites by Bothrops species and Lachesis
muta in Ecuador: laboratory screening of candidate antivenoms. Trans R
Soc Trop Med Hyg 89: 550–554.
45. Furtado MFD, Maruyama M, Kamiguti AS, Antonio LC (1991)
Comparative study of nine Bothrops snake venoms from adult female
snakes and their offspring. Toxicon 29: 219–226.
46. Wingert WA, Chan L (1988) Rattlesnake bites in southern California
and rationale for recommended treatment. West J Med 148: 37-44.
47. Cromwell MEM, Hilario E, Jacobson F (2006) Protein aggregation and
bioprocessing. AAPS J 8: E572–E579.
48. Rodrigues-Silva R, Antunes GFC, Velarde DT, Santoro MM (1999)
Thermal stability studies of hyperimmune horse antivenoms. Toxicon 37:
33–45.
49. Rodrigues-Silva R, Martins MS, Magalhães A, Santoro MM (1997)
Purification and stability studies of immunoglobulins from Lachesis muta
muta antivenom. Toxicon 35: 1229–1238.
50. Segura A, Herrera M, González E, Vargas M, Solano G, Gutiérrez JM,
et al.(2009) Stability of equine IgG antivenoms obtained by caprylic acid
precipitation: Towards a liquid formulation stable at tropical room
temperature. Toxicon 53: 609–615.
51. Wen FH, Marcopito L, Cardoso J, França F, Malaque C, Ferrari R, et
al.(1999) Sequential randomised and double blind trial of promethazine
prophylaxis against early anaphylactic reactions to antivenom for bothrops
snake bites. BMJ 318: 1451–1453.
86
52. Bucaretchi F, Douglas JL, Fonseca MRCC, Zambrone FAD, Vieira RJ
(1994) Snakebites in children: antivenom early reaction frequency in
patients pretreated with histamine antagonists H1 and H2 and
hydrocortisone. Rev Inst Med Trop São Paulo 36: 451–457.
53. Habib AG (2011) Effect of pre-medication on early adverse reactions
following antivenom use in snakebite: A systematic review and meta-
analysis. Drug Saf 34: 869–880.
54. Thomas L, Tyburn B, Bucher B, Pecout F, Ketterle J, Rieux D, et al.
(1995) Prevention of thromboses in human patients with Bothrops
lanceolatus envenoming in Martinique: failure of anticoagulants and efficacy
of a monospecific antivenom. Research Group on Snake Bites in Martinique.
Am J Trop Med Hyg 52: 419–426.
55. Itkin YM, Trujillo TC (2005) Intravenous immunoglobulin-associated
acute renal failure: case series and literature review. Pharmacother 25: 886–
892.
56. Hill RE, Bogdan GM, Dart RC (2001) Time to reconstitution: Purified
Fab antivenom vs. unpurified IgG antivenom. Toxicon 39: 729–731.
57. Quan AN, Quan D, Curry SC (2010) Improving Crotalidae polyvalent
immune Fab reconstitution times. Am J Emerg Med 28: 593–595.
58. Schersch K, Betz O, Garidel P, Muehlau S, Bassarab S, Winter G
(2010) Systematic Investigation of the Effect of Lyophilizate Collapse on
Pharmaceutically Relevant Proteins I: Stability after Freeze-Drying. J Pharm
Sci 99: 2256–2278.
59. Searles JA, Carpenter JF, Randolph TW (2001). Annealing to optimize
the primary drying rate, reduce freezing-induced drying rate heterogeneity,
and determine T(g)' pharmaceutical lyophilization. J Pharm Sci 90: 872–887.
87
60. Gerring D, King TR, Branton R (2013) Validating a faster method for
reconstitution of Crotalidae Polyvalent Immune Fab (ovine). Toxicon 69: 42–
49.
61. Theakston RDG, Warrell DA, Griffiths E (2003) Report of a WHO
workshop on the standardization and control of antivenoms. Toxicon 41:
541–557.
62. Anderson GP, Liu JH, Zabetakis D, Liu JL, Goldman ER (2017)
Thermal stabilization of anti-α-cobratoxin single domain antibodies. Toxicon
129: 68–73.
Figures
Fig 1. Flow chart of inclusion in the clinical trial.
89
Fig 2. Survival analysis of the primary efficacy endpoint.Time until fibrinogen
and clotting time reaching normal values over follow-up of patients bitten by
Bothrops snakes presented no significant difference between freeze-dried
trivalent antivenom (FDTAV) and Ministry of Health standard liquid antivenoms
(SLAVs) treated groups.
90
Fig 3. Primary efficacy endpoint analysis in Bothrops snakebites. Clotting time,
fibrinogen and INR levels 24 hours after AV therapy infreeze-dried trivalent
antivenom (FDTAV) and Ministry of Health standard liquid antivenoms (SLAVs)
treated groups.
91
Fig 4. Thermostability evaluations of the freeze-dried trivalent antivenom
(FDTAV) at 56oC over one year. Antivenom potency for neutralizing Bothrops,
Lachesis and Crotalus activities showed no significant decrease compared to
baseline over one year of thermostability evaluations at 56oC.
92
Table 1. Description of the study allocation groups.
Study group Intervention Description of the interventional product Venoms used for production Dosage
Group A Freeze-dried trivalent antivenom (AV) (FDTAV)
Each vial of FDTAV contains heterologous horse F(ab’)2, neutralizing at least 100 mg, 60 mg and 30 mg of the reference venoms of Bothrops jararaca, Lachesis muta and Crotalus durissus terrificus, respectively, in mice, sucrose (1 g), NaCl (0.17 g) and phenol (35 mg maximum). Each vial is accompanied by an ampoule containing 20 mL of sterile saline solution (0.9%)
Bothrops genus (B. jararaca 50.0%, B. alternatus 12.5%, B. jararacuçu 12.5%, B. moojeni 12.5% and B. neuweidi 12.5%), Lachesis genus (L. muta 100.0%), Crotalus genus (C. durissus terrificus 50.0% and C. d. collilineatus 50.0%)
Bothrops bites: 2 vials to mild cases and 4 vials to moderate cases Lachesis bites: 5 vials to non-severe cases Crotalus bites: 2,5 vials to mild cases and 5 vials to moderate cases
Group B [1]
Bothrops bites Bothrops AV provided by the MoH (SLAV)
Each vial contains heterologous horse F(ab’)2, neutralizing at least 50 mg of the reference venom of Bothrops jararaca in mice, phenol (35 mg maximum) and physiological solution 0.85% q.s. 10 mL
Bothrops jararaca (50.0%), B. alternatus (12.5%), B. jararacuçu (12.5%), B. moojeni (12.5%) and B. neuweidi (12.5%)
4 vials to mild cases and 8 vials to moderate cases
Lachesis bites Bothrops-Lachesis AV provided by the MoH (BLMoHA)
Each vial contains heterologous horse F(ab’)2, neutralizing at least 50 mg and 30 mg of the reference venoms of Bothrops jararaca and Lachesis muta, respectively, in mice, phenol (35 mg maximum) and physiological solution 0.85% q.s. 10 mL
Bothrops genus (B. jararaca 50.0%, B. alternatus 12.5%, B. jararacuçu 12.5%, B. moojeni 12.5% and B. neuweidi 12.5%), Lachesis genus (L. muta 100.0%)
10 vials to non-severe cases
Crotalus bites Bothrops-Crotalus AV provided by the MoH (BCMoHA)
Each vial contains heterologous horse F(ab’)2, neutralizing at least 50 mg and 15 mg of the reference venoms of Bothrops jararaca and Crotalus durissus terrificus, respectively, in mice, phenol (35 mg maximum) and physiological solution 0.85% q.s. 10 mL
Bothrops genus (B. jararaca 50.0%, B. alternatus 12.5%, B. jararacuçu 12.5%, B. moojeni 12.5% and B. neuweidi 12.5%), Crotalus genus (C. durissus terrificus 50.0% and C. d. collilineatus 50.0%)
5 vials to mild cases and 10 vials to moderate cases
[1] Brazilian Ministry of Health (2001). Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Brasília: Brazilian Ministry of Health. 120 p.
93
Table 2. Epidemiological characteristics of the patients and comparison between experimental groups.
Variable Bothrops bites (number, %) Lachesis bites (number, %) Crotalus bites (number, %)
Total Group A Group B p Total Group A Group B Total Group A Group B
Sex Male 90 (88.2) 53 (91.4) 37 (84.0) 0.258 5 (83.3) 3 (100.0) 2 (66.7) 7 (87.5) 3 (75.0) 4 (100.0) Female 12 (11.8) 5 (8.6) 7 (16.0) 1 (16.7) 0 (0.0) 1 (33.3) 1 (12.5) 1 (25.0) 0 (0.0) Area of occurrence Rural 70 (68.6) 42 (72.4) 28 (63.6) 0.344 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 4 (50.0) 3 (75.0) 1 (25.0) Urban/Periurban 32 (31.4) 16 (27.6) 16 (36.4) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 4 (50.0) 1 (25.0) 3 (75.0) Age group (in years) 0-15 12 (11.8) 4 (6.9) 8 (18.2) 1 2 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 16-30 44 (43.1) 24 (41.4) 20 (45.4) 0.193 3 (50.0) 1 (33.3) 2 (66.7) 5 (62.5) 3 (75.0) 2 (50.0) 31-60 43 (42.2) 28 (48.3) 15 (34.1) 0.051 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (25.0) 0 (0.0) 2 (50.0) ≥61 3 (2.9) 2 (3.4) 1 (2.3) 0.292 1 (16.7) 1 (33.3) 0 (0.0) 1 (12.5) 1 (25.0) 0 (0.0) Ethnicity Admixed 97 (95.1) 53 (91.4) 43 (97.7) 0.210 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) Others 5 (4.9) 5 (8.6) 1 (2.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Education (in years) Illiterate 12 (12.8) 7 (13.5) 5 (11.9) 1 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1-4 47 (50.0) 28 (53.8) 19 (45.2) 0.938 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 7 (87.5) 3 (75.0) 4 (100.0) 5-8 13 (13.8) 6 (11.5) 7 (16.7) 0.543 4 (66.7) 2 (66.7) 2 (66.7) 1 (12.5) 1 (25.0) 0 (0.0) ≥8 22 (23.4) 11 (21.2) 11 (26.2) 0.642 2 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Anatomical region of the bite Upper limbs 7 (6.9) 3 (5.2) 4 (9.1) 0.438 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Lower limbs 95 (93.1) 55 (94.8) 40 (90.9) 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) Time from bite to medical assistance (in hours)
≤1 8 (11.4) 3 (6.8) 5 (19.2) 1 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
94
1-6 38 (54.3) 23 (52.3) 15 (57.7) 0.268 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) >6 24 (34.3) 18 (18.2) 6 (19.2) 0.078 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
Legend: Group A is the freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV); Group B is available Bothrops, Bothrops-Lachesis and Bothrops-Crotalus AVs provided by the MoH
(MoHA).
Table 3. Baseline laboratorial features of the included patients and comparison between experimental groups.
Variable Bothrops bites (number, %) Lachesis bites (number, %) Crotalus bites (number, %) Total Group A Group B p Total Group A Group B Total Group A Group B
Clotting time Normal (0-10 min) 36 (35.3) 17 (29.3) 19 (43.2) 0.146 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (37.5) 2 (50.0) 1 (25.0) Abnormal (>10 min) 66 (64.7) 41 (70.7) 25 (56.8) 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 5 (62.5) 2 (50.0) 3 (75.0) Urea Normal (15-40 mg/dL) 56 (54.9) 29 (50.0) 27 (61.4) 0.253 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 5 (62.5) 2 (50.0) 3 (75.0) High (>40 mg/dL) 46 (45.1) 29 (50.0) 17 (38.6) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (37.5) 2 (50.0) 1 (25.0) Creatinine Normal (0.5-1.2 mg/dL) 95 (93.1) 54 (91.4) 41 (95.5) 0.682 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) High (>1.2 mg/dL) 7 (6.9) 5 (8.6) 2 (4.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) K+ Normal (3.6-5.2 mmol/L) 83 (81.4) 48 (82.8) 35 (79.6) 0.700 …/* …/* …/* …/* …/* …/* Low (<3.6 mmol/L) 19 (18.6) 10 (17.2) 9 (20.4) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Na2+ Normal (135-145 mmol/L) 81 (79.4) 45 (77.6) 36 (81.8) 0.609 …/* …/* …/* …/* …/* …/* High (>145 mmol/L) 21 (20.6) 13 (22.4) 8 (18.2) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Lactate dehydrogenase Normal (211-423 mg/dL) 3 (2.9) 2 (3.4) 1 (2.3) 0.728 …/* …/* …/* …/* …/* …/* High (>423 mg/dL) 99 (97.1) 56 (96.6) 43 (97.7) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Leucocytes
95
Normal (4,000-10,000 mm3) 48 (47.0) 13 (22.4) 35 (79.5) <0.001 …/* …/* …/* …/* …/* …/* High (>10,000 mm3) 54 (53.0) 45 (77.6) 9 (20.5) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Hemoglobin Normal (female: 12-16 g/dL; male: 13-18 g/dL)
43 (42.2) 26 (44.8) 17 (38.6) 0.511 …/* …/* …/* …/* …/* …/*
Low (female: <12 g/dL; male: <13 g/dL) 59 (57.8) 32 (55.2) 27 (61.4) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Aspartate transaminase Normal (2-38 mg/dL) 53 (52.0) 25 (43.1) 27 (61.4) 0.073 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 6 (75.0) 3 (75.0) 3 (75.0) High (>38 mg/dL) 49 (48.0) 33 (56.9) 17 (39.6) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (25.0) 1 (25.0) 1 (25.0) Alanine transaminase Normal (2-44 mg/dL) 56 (54.9) 29 (50.0) 27 (61.4) 0.253 …/* …/* …/* …/* …/* …/* High (>44 mg/dL) 46 (45.1) 29 (50.0) 17 (38.6) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Creatine phosphokinase Normal (24-190 U/L) 49 (48.0) 28 (48.3) 21 (47.7) 0.956 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 5 (62.5) 2 (50.0) 3 (75.0) High (>190 U/L) 53 (52.0) 30 (51.7) 23 (52.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (37.5) 2 (50.0) 1 (25.0) Fibrinogen Normal (150-370 mg/dL) 25 (24.5) 14 (24.1) 11 (25.0) 0.920 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 4 (50.0) 3 (75.0) 1 (25.0) Low (<150 mg/dL) 77 (75.5) 44 (75.9) 33 (75.0) 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 4 (50.0) 1 (25.0) 3 (75.0) Platelets Normal (150.000-450.000/mm3) 85 (83.3) 49 (84.5) 36 (81.8) 0.721 …/* …/* …/* …/* …/* …/* Low (<150.000 mm3) 17 (16.7) 9 (15.5) 8 (18.2) …/* …/* …/* …/* …/* …/* International Normalized Ratio Normal (1) 35 (34.3) 22 (37.9) 13 (29.5) 0.377 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 4 (50.0) 3 (75.0) 1 (25.0) High (>1) 67 (65.7) 36 (62.1) 31 (70.5) 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 4 (50.0) 1 (25.0) 3 (75.0) Erythrocyte sedimentation rate Normal (≤6 mm in the first hour) 2 (2.0) 0 (0.0) 2 (4.5) 0.109 …/* …/* …/* …/* …/* …/* Abnormal (>6 mm in the first hour) 100 (98.0) 58 (100.0) 42 (95.5) …/* …/* …/* …/* …/* …/*
Legend: Group A is the freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV); Group B is available Bothrops, Bothrops-Lachesis and Bothrops-Crotalus AVs provided by the MoH
(SLAV); …/*: Test not performed.
96
Table 4. Baseline clinical features of the included patients and comparison between experimental groups.
Variable Bothrops bites (number, %) Lachesis bites (number, %) Crotalus bites (number, %) Total Group A Group B p Total Group A Group B Total Group A Group B
Local manifestations Local pain 98 (96.1) 56 (96.6) 42 (95.5) 0.777 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) Edema 98 (96.1) 54 (93.1) 44 (100.0) 0.076 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) Local bleeding 31 (30.4) 16 (27.6) 15 (34.1) 0.479 2 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0) Erythema 38 (37.3) 25 (43.1) 13 (29.5) 0.161 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Necrosis 2 (1.9) 2 (3.4) 0 (0.0) 0.213 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Secondary infection 37 (36.3) 20 (34.5) 17 (38.6) 0.665 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Blistering 3 (2.9) 2 (3.4) 1 (2.3) 0.728 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Paresthesia 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) ... 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0) Systemic manifestations Bleeding 7 (6.9) 3 (5.2) 4 (9.1) 0.438 1 (16.7) 0 (0.0) 1 (33.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Vomiting 2 (2.0) 1 (1.7) 1 (2.3) 0.843 3 (50.0) 1 (33.3) 2 (66.7) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0) Myalgia 6 (5.9) 1 (1.7) 5 (11.4) 0.040 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (25.0) 1 (25.0) 1 (25.0) Nausea 12 (11.8) 6 (10.3) 6 (13.6) 0.609 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Acute renal failure 7 (6.9) 5 (8.6) 2 (4.5) 0.420 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Oliguria 4 (3.9) 3 (5.2) 1 (2.3) 0.455 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0) Hematuria 4 (3.9) 2 (3.4) 2 (4.5) 0.777 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Headache 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 3 (50.0) 1 (33.3) 2 (66.7) 1 (12.5) 1 (25.0) 0 (0.0) Bradycardia 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 3 (50.0) 2 (66.7) 1 (33.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Hypotension 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 4 (66.7) 2 (66.7) 2 (66.7) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Abdominal pain 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 2 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Blurred vision 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 2 (33.3) 0 (0.0) 2 (66.7) 5 (62.5) 1 (25.0) 4 (100.0) Palpebral ptosis 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 4 (50.0) 2 (50.0) 2 (50.0) Diplopia 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6 (75.0) 3 (75.0) 3 (75.0) Ophtalmoplegia 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0) Dizziness 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0)
Legend: Group A is the freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV); Group B is available Bothrops, Bothrops-Lachesis and Bothrops-Crotalus AVs provided by the MoH
(SLAV).
97
Table 5. Adverse events reported in the safety study and comparison between the experimental groups.
Adverse event Total (n=116) Group A (n=65) Group B (n=51) p Number % Number % Number %
Any adverse event 23 19.8 11 16.9 12 23.5 0.388 Urticaria 16 13.8 11 16.9 5 9.8 0.286 Pruritus 13 11.2 8 12.3 5 9.8 0.691 Facial flushing 4 3.4 3 4.6 1 2.0 0.811 Vomiting 4 3.4 2 3.1 2 3.9 >0.999 Headache 2 1.7 0 0.0 2 3.9 0.821 Dyspnea 2 1.7 1 1.5 1 2.0 >0.999 Chills 2 1.7 1 1.5 1 2.0 >0.999 Nasal congestion 2 1.7 1 1.5 1 2.0 >0.999 Nausea 1 0.9 1 1.5 0 0.0 0.632 Conjunctival hyperemia 1 0.9 1 1.5 0 0.0 0.632 Pharyngeal irritation 1 0.9 1 1.5 0 0.0 0.632
Legend: Group A is the freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV); Group B is available Bothrops, Bothrops-Lachesis and Bothrops-Crotalus AVs provided by the MoH
(SLAV).
98
Supporting information legends
S1 Checklist. CONSORT Checklist.
99
100
S1 Dataset. Study database.
Apresentado apenas na versão online do manuscrito.
101
S1 Appendix. Ethics Approval Document.
Vide Anexos.
102
S2 Appendix. Original study protocol.
Vide Anexo.
103
S1 File. Methods employed for estimating AV potency.
Determination of anti-Bothrops, Lachesis and Crotalus
antivenom potencies
Determination of antivenom potencies used official standard methods
recommended by the Brazilian Pharmacopeia [1].
1. Bothrops antivenom potency assay
The potency assay aims at determining the required neutralizing dose (Effective
Dose 50%) to protect susceptible animals against the lethal effects of a fixed
dose of a reference venom.
The reference venom is a homogeneous mixture of venoms that represent the
geographical distribution of B. jararaca species. It should be lyophilized and
maintained at -20°C. The venom is standardized by the determination of the 50%
Lethal Dose (LD50).
Determination of the LD50 of the venom: Firstly, reconstitute the lyophilized
venom at a determined concentration by volume with 0.85% saline(w/v). Make
dilutions in geometric progression with the same diluent, using a constant dilution
factor of not more than 1.5 and equalize the final volumes. Inoculate, by
intraperitoneal route, a volume of 0.5 ml per mouse of each dilution in groups of
at least 10 Swiss albino mice from 18 g to 22 g. Observe the animals up to 48
hours after inoculation and record the number of deaths at each dilution.
Calculate the LD50 using a proven statistical method. In this study a Probit
analysis was used [2]. The response range (percentage of deaths) should be
between the highest and the lowest dilution used, forming the regression curve
that must present a linear correlation. Confidence intervals should not be large,
indicating better accuracy of the test, the smaller the limits. Express the result in
micrograms of venom per 0.5 mL.
Determination of antivenom potency: Carry out progressive dilutions of the
sample in saline at 0.85% (w/v) using a constant dilution factor of not more than
1.5, so that the final volume after mixing with the challenge dose is identical
across all test tubes. Reconstitute and dilute the reference venom with 0.85%
(w/v) saline solution and add constant volume to each tube so that each dose to
be inoculated per animal contains 5xLD50. Homogenize and incubate the
104
mixture at 37°C for 60 minutes. Inoculate intraperitoneally with a volume of 0.5
ml per mouse of each mixture in groups of at least eight Swiss albino mice of 18
g to 22 g. Observe the animals up to 48 hours after inoculation and record the
number of live in each mixture. Calculate the 50% Effective Dose (ED50) in
microliters, using a proven statistical method.In this study a Probit analysis was
used [2]. The response range produced (percentage of survival) should be
between the highest and the lowest dilution used, forming the regression curve
that should present a linear correlation. Confidence intervals should not be large,
indicating better accuracy of the test, the smaller the limits. Calculate the power
in milligrams per milliliter, according to the expression:
Antivenom Potency (mg/ml): (Tv-1/ED50) x venom DL50
on what
Tv=number of LD50 used per mouse in the venom test dose.
Antivenom potency was expressed in milligrams of venom neutralized by 1 mL
of the sample. It is accepted a 10% coefficient of variation.
The minimum Bothrops antivenom potencycan vary up to 4.5 mg/mL.
2. Lachesis antivenom potency assay
The reference venom is a homogeneous mixture of venoms that represent the
geographical distribution of L. muta species. It should be lyophilized and
maintained at -20°C. The venom is standardized by the determination of the 50%
Lethal Dose (LD50).
Determination of the LD50 of the venom: Use the same procedures presented
for Bothrops venom.
Determination of antivenom potency:Use the same procedures presented for
Bothrops antivenom.
The minimum Lachesisantivenom potencycan vary up to 2.7 mg/mL.
3. Crotalus antivenom potency assay
105
The reference venom is a homogeneous mixture of venoms that represent the
geographical distribution of C. durissus species. It should be lyophilized and
maintained at -20°C. The venom is standardized by the determination of the
50% Lethal Dose (LD50).
Determination of the LD50 of the venom: Use the same procedures
presented for Bothrops venom.
Determination of antivenom potency:Use the same procedures presented
for Bothrops antivenom.
The minimum Crotalusantivenom potencycan vary up to 1.35 mg/mL.
Reference
1. Brazilian Ministry of Health (2000) Farmacopeia Brasileira, 4th ed.
Anvisa, Brasília.
2. Finney DJ (1971) Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press,
Cambridge.
106
S2 File. Baseline laboratorial features of the included patients and comparison of
means between experimental groups in Bothrops snakebites.
Variable BothropsGroup A bites (Mean (SD)/n (%))Group B p
rate(mm/hour) Legend: Group A is the freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV); Group B is available
Bothrops, Bothrops-Lachesis and Bothrops-Crotalus AVs provided by the MoH
(SLAV).
Reference values: Urea (High: >40 mg/dL), Creatinine (High: >1.2 mg/dL), K+ (Low:
<3.6 mmol/L), Na2+ (High: >145 mmol/L), Lactate dehydrogenase (High: >423
mg/dL), Leucocytes (High: >10,000 mm3), Hemoglobin (Low (female: <12 g/dL;
male: <13 g/dL), Aspartate transaminase (High: >38 mg/dL), Alanine transaminase
(High: >44 mg/dL), Creatine phosphokinase (High: >190 U/L), Fibrinogen (Low:
<150 mg/dL), Platelets (Low: <150.000 mm3), International Normalized Ratio (High:
>1), Erythrocyte sedimentation rate (High: >6 mm in the first hour).
Urea (mg/dL) 33.8 (11.1) 32.5 (10.6) 0.213
Creatinine (mg/dL) K+ (mmol/L) Na2+(mmol/L)
1.1 (0.3) 4.5 (1.4) 140 (3.2)
1.0 (0.2) 4.3 (1.3) 138 (2.0)
0.602 0.677 0.741
Lactate dehydrogenase (mg/dL) Leucocytes (mm3)
438 (50.8)
11.700 (4,900)
431 (40.2)
8.700 (3,700)
0.678
0.093
Hemoglobin (g/dL) 11.5 (1.3) 10.6 (1.5) 0.452
Aspartate transaminase (mg/dL) 35.2 (13.5) 34.0 (15.1) 0.096
Alanine transaminase (mg/dL) 32.2 (16.4) 29.2 (19.9) 0.188
Creatine phosphokinase (IU/L)
187.8 (59.4) 179.2 (89.4) 0.852
Fibrinogen (mg/dL) Platelets
(mm3)
134.0 (64.2) 249,500 (72,400)
128.4 (54.3) 235,300 (75,200)
0.956 0.723
International Normalized Ratio 0.9 (0.3) 0.8 (0.2) 0.255
Erythrocyte sedimentation 14.6 (10.1) 15.6 (10.9) 0.146
107
S3 File. Primary efficacy endpoint analysis in Lachesis snakebites. For Lachesis
snakebites, fibrinogen, clotting time and INR presented normal values 24 hours after
AV therapy, for freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV) and Ministry of Health
standard liquid antivenoms (SLAV) treated groups. Creatinine levels were normal since
the admission.
108
S4 file. Primary efficacy endpoint analysis in Crotalus snakebites. For Crotalus
snakebites, fibrinogen, clotting time, INR, and creatine phosphokinase presented
normal values 24 hours after AV therapy in FDTAV and Ministry of Health standard
liquid antivenoms (SLAV) treated groups.
109
6. DISCUSSÃO
O soro antiofídico é o único tratamento específico para tratar a maioria
dos efeitos de envenenamento dos acidentes ofídicos, e tem um papel
crucial em minimizar a mortalidade e a morbidade. Contudo, para ser parte
de um conjunto de cuidados primários da saúde onde os acidentes ofídicos
ocorrem há uma urgente necessidade de assegurar a disponibilidade de
segurança, eficácia e soros antiofídicos acessíveis, principalmente em
países em desenvolvimento (105). Além disso, inovação na logística de
distribuição do soro antiofídico é também uma prioridade. No Brasil, no
momento, os soros antiofídicos usados requerem equipamentos para
conservação sob refrigeração (20 a 80C), os quais não são possíveis em
áreas remotas sem eletricidade (5). Portanto as formulações liofilizadas
podem transformar-se em uma boa alternativa para a produção de soros
antivenenos mais estáveis em regiões do mundo onde altas temperaturas
são comuns e a cadeia de refrigeração é deficiente, tal como na Amazônia
Brasileira. Há uma limitada quantidade de publicações sobre estabilidade,
eficácia clínica e segurança dos soros antivenenos liofilizados. Uma
principal preocupação é a conservação das propriedades farmacocinéticas
dos soros liofilizados e da potência de neutralização dos anticorpos
submetidos à liofilização (106). Portanto resultados positivos de
caracterização térmica do efeito da liofilização em anticorpos equinos e
eficácia de estabilizadores em soros antivenenos liofilizados tem sido
reportados (107,108). Para melhorar o nosso conhecimento este é o
primeiro ensaio clínico objetivando comparar a segurança e eficácia de um
soro antiveneno liofilizado com uma formulação líquida. Este estudo não
incluiu dados do possível aumento de custo da produção do soro antiofídico
devido ao processo de liofilização. Estudos futuros para avaliar custos
serão essenciais.
6.1 ANÁLISE DA EFICÁCIA
Nossos resultados mostraram que em ambos os grupos, o
sangramento induzido pelo veneno e a coagulopatia invariavelmente
cessaram, e a coagulabilidade sanguínea foi restabelecida dentro de 24
110
horas de seguimento de todos os pacientes. Como as alterações
hemostáticas têm sido relacionadas à gravidade e óbitos em acidentes por
viperídeos, a resolução da coagulabilidade sanguínea tem sido proposta
como um relevante alvo em ensaios clínicos em acidentes ofídicos (109,
110). Atualmente, as manifestações sistêmicas de acidentes por viperídeos
são caracterizadas por sangramentos, coagulopatia associada com
desfibrinogênese e incoagulabilidade, com a potencial evolução para
hipovolemia, choque cardiovascular e insuficiência renal aguda em casos
graves (12,19,110). Nossos resultados indicam que uma melhora no estado
de coagulação foi observada dentro de 6-12 horas na maioria dos pacientes
e dentro de 24 horas em manter todos os pacientes recebendo uma única
dose de soro antiofídico (111, 112, 113). A coagulabilidade sanguínea
deveria ser monitorada após a dose inicial do soro antiofídico e doses
posteriores deveriam ser administradas, se necessário, até a
coagulabilidade ser restabelecida (112, 113, 114). A função renal anormal
é bastante comum em envenenamentos por viperídeos (19, 79,116).
Ambos os grupos de estudo apresentaram concentrações de creatinina
sérica que retornaram para valores normais dentro das primeiras 24 horas
de seguimento dos acidentes botrópicos. Contudo, alguns pacientes
admitidos com insuficiência renal podem evoluir sem melhora da lesão
renal mesmo após a administração do soro antiofídico, quando a lesão foi
iniciada antes da administração do soro antiofídico (78, 115). Isto precisa
ser levado em consideração na interpretação de insuficiência renal em
acidentes botrópicos.
O veneno de Crotalus pode causar miotoxicidade sistêmica,
aumentando os níveis séricos de cretinofosfoquinase (24). Além disso, os
níveis de enzimas musculares aumentam mesmo após a soroterapia
antiofídica adequada (116, 117, 118). Do mesmo modo, mesmo os
pacientes que receberam quantidades próprias de antiveneno podem
progredir com danos renais porque os mecanismos de lesão são iniciados
após o acidente ofídico e antes da administração do antiveneno. Neste
estudo, contudo, nenhum paciente apresentou insuficiência renal na
admissão e níveis de CPK normais foram vistos até 24 horas de seguimento
dos acidentes crotálicos. Todos os pacientes se recuperaram da
111
coagulopatia dentro de 24 horas após a terapia com SATL e SAMBL.
Embora algumas manifestações neurológicas observadas nos acidentes
crotálicos usualmente não melhorem rapidamente após a administração do
soro antiofídico (116), neste estudo os sinais e sintomas tais como turvação
da visão, ptose palpebral, diplopia e oftalmoplegia foram suprimidos dentro
de 24 horas de seguimento.
Neste estudo, uma segunda dose de antiveneno não foi necessária,
devido ao fato de que nenhum paciente apresentou sangue totalmente
incoagulável 12 horas após a dose inicial ou recorrências de coagulopatias.
De fato, a persistência ou recorrência de antigenemia do veneno e mesmo
a coagulopatia recorrente podem estar presentes dentro de 12-48 horas em
casos graves (119, 120), que não foram incluídos neste estudo. Além disso,
diferenças na eficácia do soro avaliado pode explicar níveis desiguais de
resolução na coagulopatia induzida pelo veneno, como observado no uso
de antivenenos de diferentes países da América Latina (121,122). Mesmo
ainda porque, a composição do veneno pode variar significativamente entre
serpentes de diferentes espécies refletindo na eficácia do soro (32, 123).
Os dados computados para as espécies de Lachesis e Crotalus tem
limitações em termos de eficácia por causa do pequeno número incluído no
estudo devido a raridade de casos na Amazônia.
6.2 ANÁLISE DA SEGURANÇA
Embora a literatura sugira que a quantidade de proteínas heterólogas
está relacionada com a frequência e intensidade de reações adversas (124),
nós não observamos um significante aumento na incidência de reações
adversas no SATL comparado com os SAMBL. Apesar de ambos os soros
terem sido produzidos do mesmo pool de plasma hiperimune, um conceito
deste estudo é a possível formação de agregados insolúveis durante o
processo de liofilização com posterior reconstituição incompleta, a qual tem
sido associado com o desenvolvimento de reações adversas durante a sua
administração (125). Uma hipótese para a indesejável formação de
agregados insolúveis no SATL é o uso de sucrose na estabilização do soro
liofilizado. O efeito protetor de polióis como sorbitol e manitol no
desenvolvimento de turbidez nos soros líquidos tem sido reportado
112
(126,127). Mais recentemente, o uso de sucrose na estabilização de
antiveneno líquido ou liofilizado tem sido descrito como melhor estabilizador
do que o manitol e o sorbitol na formulação do SATL (107,108).
As reações adversas precoces foram leves e foram prontamente
revertidas pelo tratamento com adrenalina e anti-histamínicos. A incidência de
reações adversas precoces, todas leves e sem fatalidades, foram similares
para os dois estudos do Brasil e Colômbia (6,83). Embora a frequência fosse
menor do que os resultados de outros estudos conduzidos na América do Sul
com vítimas de acidentes botrópicos, os quais reportaram níveis de incidência
de 25% a 87% (113, 128, 114, 120, 129, 130). Apesar dos anti-histamínicos
aparentarem não ser de óbvio benefício em prevenir reações agudas dos
antivenenos (131-133), o regime de pré-soroterapia usado neste estudo
(hidrocortisona IV, cimetidina IV e dexclorfeniramina VO) pode também ter
contribuído para a baixa incidência de reações adversas precoces. Eventos
adversos tardios não foram observados neste estudo, em acordo com estudos
prévios mostrando sua ausência (24,113,114,128130,134) ou baixa incidência
(135). Apesar de nenhum paciente ter retornado ao hospital ou ter feito contato
com o médico do estudo queixando-se de possíveis efeitos adversos tardios
após o D15, pacientes tratados com soro antiveneno podem apresentar
reações adversas após este tempo. O não seguimento dos pacientes após
este dia configura uma limitação deste estudo que pode subestimar a
frequência das reações tardias. Uma preocupação com os soros antivenenos
formulados com sucrose tem sido a possibilidade de complicação ou produção
de algum dano renal (136). Entretanto a função renal estava normal para todos
os pacientes após 24 horas de seguimento, indicando que a dose empregada
foi segura.
6.3 TESTE DE RECONSTITUIÇÃO
Estudos prévios reportaram prolongados tempos de reconstituição de 30
a 90 minutos para alguns soros liofilizados (137, 138), adiando o tempo de
administração do antiveneno, o que é um fator relacionado ao precário
prognóstico dos acidentes ofídicos (20). Neste estudo, contudo, uma completa
dissolução foi observada visualmente quando os frascos de SATL foram
113
delicadamente agitados de forma manual por um minuto, de acordo com
estudos prévios onde outras proteínas liofilizadas mostraram tempos curtos
de reconstituição (menos que 5 minutos) (107, 139,140), sugerindo
manutenção da estabilidade e atividade neutralizante (140,141).
6.4 RESULTADOS DE ESTABILIDADE
O êxito dos soros antivenenos liofilizados já utilizados na rotina em alguns
continentes (apesar da falta de estudos clínicos publicados) requer a
conservação da estabilidade fisicoquímica e potência de neutralização dos
anticorpos ao longo do tempo em temperatura ambiente (107). Neste estudo,
a potência do soro em neutralizar as atividades dos venenos de Bothrops,
Lachesis e Crotalus não mostrou significativa diminuição comparada com
linha de base para referência ao longo de um ano de avaliações de
termoestabilidade a 560C. Osmolitos como a sucrose e o sorbitol são capazes
de estabilizar anticorpos em altas temperaturas sem significante perturbação
em suas estruturas secundárias ou em sua afinidade com o veneno de
serpentes (126,142). Os antivenenos líquidos com sorbitol previnem o
aparecimento de turbidez após estocagem por um ano a 370C, mas mostra
uma parcial perda da potência de neutralização nestas condições (127).
Quando testados, os anticorpos de único domínio anti-alfa-cobratoxina
adicionados com ligações de dissulfeto em 1 mg/ml em elevadas
temperaturas por uma hora reteve próximo de 100% de sua atividade ligante
inicial (143).
7. CONCLUSÕES
• Neste estudo, o SATL e os SAMBL apresentaram a mesma eficácia
baseada em desfechos clínicos relevantes em acidentes botrópicos,
laquéticos e crotálicos.
• Não houve diferenças significativas na incidência de reações adversas
agudas entre pacientes combinados com SATL e os SAMBL.
114
• Só foram observadas reações adversas leves e com o uso de ambos os
soros.
• Comprovou-se a estabilidade térmica do SATL, sugerindo que a formulação
é uma boa alternativa para a produção de soros antivenenos mais estáveis
em regiões da Amazônia onde altas temperaturas são comuns e a cadeia
de refrigeração é precária.
• Nossos resultados indicam que o produto liofilizado poderia ser viabilizado
para um estudo de Fase III.
115
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Chippaux JP. Snake bites: Appraisal of the global situation. Bull WHO.
76: 515524, 1998.
2. Warrell D. Snake bite. Lancet; 2010; 375:77–88.
3. Kasturiratne A, Wickremasinghe A, De Silva N, Gunawardena N,
Pathmeswaran A, Premaratna R, et al. The global burden of snakebite: A
literature analysis and modelling based on regional estimates of
envenoming and deaths. PLoS Med. 2008; 5(11):1591– 604.
4. Gutiérrez JM, Theakston RDG, Warrell DA. Confronting the neglected
problem of snakebite envenoming: the need for a global partnership. PLoS
Med. 2006; 3:e150.
5. Chippaux JP. Epidemiology of envenomations by terrestrial venomous
animals in Brazil based on case reporting: from obvious facts to
contingencies. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical
Diseases 2015; 21:13.
6. Wen F, Monteiro W, Moura da Silva A, Tambourgi D, Mendonça da Silva
I, Sampaio V, et al. Snakebites and Scorpion Stings in the Brazilian
Amazon: Identifying Research Priorities for a Largely Neglected Problem.
PLoS Negl Trop Dis. 2015; 9:1–11.
7. VENOMS 2017. St Hilda’s College, Oxford University – UK.
http://lpmhealthcare.com/venoms-2017.Available: http://jvenomres.co.uk.
8. The Global Burden of Snakebite from Lillian Lincoln Foundation on
Vimeo. http://www. snakebiteinitiative.org/?page_id=287).
9. Acidentes por Animais Peçonhentos - Notificações registradas no
Sistema de Informação de Agravos do Sinan Net.
http://tabnet.datasus.gov. br/cgi/dh.exe?pacto/2012/ cnv/ pactam. def.
10. Sistema de Informação de Agravos de Notificação - SINAN. In:
Ministério da Saúde [Internet]. 2016 [cited 12 Nov 2016].
Available:http://portalsaude. saude. gov. br/ images /pdf/2016/ janeiro/
20/1-Casos-Ofidismo-2000-2015.pdf
116
11. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Guia de
vigilância em saúde. Ministério da Saúde, editor. Guia de vigilância em
saúde. Brasília; 2014. Available: http://portalsaude.saude.gov.br.
12. Moreno E, Queiroz-Andrade M, Lira-da-silva RM, Tavares-Neto J.
Clinical and epidemiological characteristics of snakebites in Rio Branco,
Acre. Rev Soc Bras Med Trop 2005; 38:15–21.
13. Cardoso JLC, França FOS, WenFH, Málaque CMS Málaque CMS,
Haddad Jr V Animais Peçonhentos no Brasil- Biologia, Clínica e
Terapêutica dos Acidentes - Editora Sarvier 2003.
14. Chippaux JP, Goyffon M. Venoms, antivenoms and imunotherapy.
Toxicon 1998; 36 (6):823-46
15. Borges CC, Sadahiro M, Dos-Santos MC. Epidemiological and clinical
aspects of snake accidents in the municipalities of the State of Amazonas,
Brazil. Rev Soc Bras Med Trop 1999; 32: 637–646.
16. Bochner R, CJ S. Acidentes por animais peçonhentos e sistemas
nacionais de informação: Recording of venomous bites and stings by
National Information Systems in Brazil. Cad Saúde Pública.
2002;18(3):735–746.
17. Bochner R & Struchiner CJ. Epidemiologia dos acidentes ofídicos nos
últimos 100 anos no Brasil: uma revisão. Cad. Saúde Pública, Rio de
Janeiro. 2003; 19:7-16.
18. Bochner R. The international view of envenoming in Brazil: myths and
realities. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical
Diseases. 2013; 19:29.
19. Brasil. Acidentes por Animais Peçonhentos. In: Saúde M da SS de V
em, editor. Guia deVigilância em Saúde [Internet]. 1a ed. Brasília; 2014. p.
720–3. Available from: <www.saude.gov.br/bvs>
20. Feitosa E, Sampaio V, Salinas J, Queiroz A, da Silva I, Gomes A, et al.
Older age and time to medical assistance are associated with severity and
mortality of snakebites in the Brazilian Amazon: A Case-Control Study.
PLoS One. 2015; 10 (7):1–15.
117
21. Brasil, IBGE. Censo demográfico de 1991. Rio de Janeiro:1991:1-150;
Brasil, IBGE. Anuário Estatístico do Brasil 1994. Rio de Janeiro: 1994:1-8-
32.
22. Dos Santos MC – Serpentes Peçonhentas e Ofidismo no Amazonas
(pag. 115125). In:Animais Peçonhentos no Brasil- Biologia, Clínica e
Terapêutica dos Acidentes - Cardoso JLC, França FOS, WuenFH, Málaque
CMS Malaque CMS, Haddad Jr V. Editora Sarvier 2003.
23. Saraiva MG, Oliveira DDS, Filho GMCF, Coutinho LASDA, Guerreiro
JV. Epidemiological profile of snake bites in the State of Paraiba, Brazil,
2005 to 2010. Epidemiol Serviços Saúde. 2012; 21: 449–56.
24. Otero R, Gutiérrez J, Beatriz Mesa M, Duque E, Rodríguez O, Luis
Arango J, et al. Complications of Bothrops, Porthidium, and Bothriechis
snakebites in Colombia. A clinical and epidemiological study of 39 cases
attended in a university hospital. Toxicon. 2002; 40: 1107–14.
25. Saborio P, Gonza M, Cambronero M. Accidente Ofídico en Niños en
Costa Rica: Epidemiología y Deteccíon de Factores de Riesgo en el
Desarrollo de Absceso y Necrosis. Toxicon 1998; 36:359–66.
26. Feitosa ES, Sampaio V, Sachett J, Castro DB, Noronha MDN, Lozano
JLL, Muniz E, Ferreira LCL, Lacerda MVG, Monteiro WM. Snakebites as a
largely neglected problem in the Brazilian Amazon: highlights of the
epidemiological trends in the State of Amazonas. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical 2015; 48:34-41.
27. Agência Força Aérea. Esquadrão Harpia resgata criança indígena que
havia sido picada por cobra. http://www.fab.mil.br/noticias/mostra/ - por
Tenente Lorena Molter - Edição: por Tenente João Elias- publicado em
25/10/2017.
28. Melgarejo AR. Serpentes Peçonhentas do Brasil (pag. 33-61) in Animais
Peçonhentos no Brasil- Biologia, Clínica e Terapêutica dos Acidentes -
Cardoso JLC, França FOS, WuenFH, Málaque CMS Malaque CMS,
Haddad Jr V. Editora Sarvier 2003.
118
29. Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais
peçonhentos. 2OEd ed. Brasília: Fundação Nacional de Saúde, 2001. 120
1. Zoonose.
30. Dos Santos MC, Martins M, Boechat AL, Sá-Neto RP, Oliveira ME.
Serpentes de interesse médico na Amazônia: Biologia, Venenos e
Tratamento de Acidentes/Maria Cristina dos Santos [et al.]. Manaus:
UA/SESU, 1995.70 p.
31. Rosenfeld G. Symptomatology, pathology, and treatment of snakebites
in South America. In: Bucherl W, Buckley EE, Deulofeu V, editors.
Venomous animals and their venoms. New York: Academic Press. Nueva
York. 1971; 345-841
32. Damico D, Bueno L, Rodrigues-Simioni L, Maangoni S, Cruz-Hofling M,
Novello J. Functional characterization of a basic D49 phospholipase A 2 (
LmTX-I ) from the venom of the snake Lachesis muta muta (bushmaster).
Toxicon.2006; 47(1):759–65.
33. Sousa L, Nicolau C, Peixoto P, Bernardoni J, Oliveira S, Portes-Junior
J, et al. Comparison of Phylogeny, Venom Composition and Neutralization
by Antivenom in Diverse Species of Bothrops Complex. PLoS Negl Trop
Dis. 2013; 7(9):1–16.
34. Cunha E, Martins O. Principais compostos químicos presente nos
venenos de cobras dos gêneros Bothrops e Crotalus – Uma Revisão. Rev
Eletrônica Educ e Ciência. 2012; 02 (2):21.
35. Gutiérrez J, Rucavado A, Escalante T, Díaz C. Hemorrhage induced by
snake venom metalloproteinases: biochemical and biophysical
mechanisms involved in microvessel damage. Toxicon. 2005;45:997–11.
36. Furtado MF, Colleto GMDD, Dias-da-Silva W. Caracterização biológica
dos venenos botrópicos. Mem. Inst. Butantan 1991; 53:149-59.
37. Sanches EF, Freitas TV, Ferreira-Alves DL, Velarde DT, Diniz MR,
Cordeiro MN, Agostini-Cotta G, Diniz CR. Biological activities of venoms
from South American snakes. Toxicon 1992; 30(1):95-03.
119
38. Martins M, Gordo M. Bothrops atrox (CommomLance-head). Diet Herp
Rev 1993; 24:151-2.
39. Furtado MF, Maruyama M, Kamiguti AS, Antonio LC. Comparative study
of nine Bothrops snake venoms from adult female snakes and their
offspring. Toxicon 1991; 29(2):219-26.
40. Andrade D, Abe A, Dos-Santos MC. In the venom related to diet and tall
color during Bothrops moojeni ontogeny? J Herpetol 1996; 30(2):285-8.
41. Assakura MT, Furtado MF, Mandelbaumm FR. Biochemical and
Biological Differenciation of The Venoms of lanceheads Vipers (B. atrox, B.
asper, B. marajoens and B. moojeni). Comp Biochem Physiol B 1992;
102b:727-32.
42. Barreto GNLS, Oliveira SS, Anjos IV, Chalkidis HM, Mourão RHV,
Moura-da-Silva AM, Sano-Martins IS, Gonçalves LRC. Experimental
Bothrops atrox envenomation: Efficacy of antivenom therapy and the
combination of Bothrops antivenom with dexamethasone. PLOS Neglected
Tropical Diseases.
43. Sousa LF, Nicolau CA, Peixoto PS, Bernardoni JL, Oliveira SS, Portes-
Junior JA, et al. Comparison of phylogeny, venom composition and
neutralization by antivenom in diverse species of Bothrops complex. PLoS
Negl Trop Dis. 2013; 7: e2442.
44. França FOS & Málaque CMS. Acidente Botrópico in Animais
Peçonhentos no Brasil- Biologia, Clínica e Terapêutica dos Acidentes,
Sarvier 2003.
45. Dos Santos MC & Boechat AL. Venenos in Serpentes de Interesse
Médico da Amazônia: Biologia, Venenos e Tratamento de Acidentes. Dos
Santos MC, Martins M, Boechat AL, Sá-Neto RP, Oliveira ME.Manaus:
UA/SESU, 1995.70 p.: il. (color.) ISBN 85-85482-34-6).
46. Moura-da-Silva AM, Laing GD, Paine MJ, Dennison JM, Politi V,
Crampton JM, Theakston RD. Processing of pro-tumor necrosis factor-
alpha by venom metalloproteinases: a hypothesis explaining local tissue
damage following snakebite. European Journal of Immunology.1996; 26(9):
2000-05.
120
47. Nasha L, Kamiguti AS, Barros MAR. Thrombin-like and factor X-
activator components of Bothrops snake venoms. Thromb and Haemost
1979; 41 (2):31428.
48. Lomonte B. Tissue damage and inflammation induced by snake
venoms. Göteborg: Tryckt & Bunden, 1994.
49. Bjarnason JB, Fox JW. Hemorrhagic toxins from snake venoms. J
Toxicol Toxin Rev 1988/1989; 7(2):121-09.)
50. Gould RJ, Polokoff MA, Friedman PA, Huang TF, Holt JC, Cook JJ,
Niewiarowski S. Disintegrins: a family of integrin in inhibitory proteins from
viper venoms. Proc Soc Exp Biol Med 1990; 195(2):168-71.
51. Kamiguti AS, Rugman FP, Theakston RD, Franca PO, Ishii H, Hay CR.
The role of venom haemorrhagin in spontaneous bleeding in Bothrops
jararaca envenoming. Butantan Institute Antivenom Study Group. Thromb
Haemost 1992; 67(4):494-8.
52. Kamiguti AS, Slupsky JR, Zuzel M, Hay CR. Properties of fibrinogen
cleaved by jararhagin, a metalloproteinase from the venom of Bothrops
jararaca. Thromb Haemost 1994; 72(2):244-9.
53. Diniz MR e Oliveira EB. Purification and properties of a kininogenin from
the venom of Lachesis muta (bushmaster). Toxicon.1992; 30(3): 247-58.
54. Giovanni-De-Simone S, Aguiar AS, Gimenez AR, Novellino K, de Moura
RS. Purification, properties, and N-terminal amino acid sequence of
kalikrein-like enzyme from the venom of Lachesis muta rhombeata
(Bushmaster) J Proein Chem 1997;16(18):809-18
55. Silva LM, Diniz CR, Magalhães A. Purification and partial
characterization of an arginine ester hydrolase from the venom of Lachesis
muta rhombeata (Bushmaster snake, Lachesismuta noctivaga. Toxicon
1985; 23 (4):70-7-18.
56. Magalhães A, Da Fonseca BC, Diniz CR, Gilroy J, Richardson M. The
complete amino acid sequence of a thrombin-like enzyme/gyroxin analogue
from venom of the bushmaster snake (Lachesis muta muta). FEBS Left
1993; 329(1-2):11620.
121
57. Aguiar AS, Alves CR, Melgarejo A, Giovanni-de Simone. Purification
and partial characterization of a thrombin-like/gyroxin enzyme from
bushmaster (Lachesis mutarhombeata) venom. Toxicon 1996;34(5):555-
65.
58. Sanches EF, Santos CI, Magalhães A, Diniz CR, Figueiredo S, Gilroy J,
Richardson M. Isolation of a proteinase with plasminogen-activating activity
from Lachesis muta muta (bushmaster) snake venom. Arch Biochem
Biophys 2000; 378(1):131-41.
59. Fuly Al, Machado OL, Alves EW, Carlini CR. Mechanism of inhibitory
action on platelet activation of a phospholipase A2 isolated from Lachesis
muta (Bushmaster) snake venom. Thromb haemost 1997; 78 (5):1372-80.
60. Fuly AL, Calil-Elias S, Zingali RB, Guimarães JA, Melo PA. Myotoxic
activity of na acidic phospholipase A2 isolated from Lachesis muta
(Bushmaster) snake venom. Toxicon 2000; 38 (7):961-72.
61. Sanchez EF, Magalhães A, Diniz CR. Purification of a hemorrhagic
factor (LHFI) from the venom of the bushmaster snake, Lachesis muta
muta. Toxycon 1987; 25 (6):611-9.
62. Sanchez EF, Cordeiro MN, De Oliveira EB, Juliano L, Prado ES, Diniz
CR. Proteolytic specificity of two hemorrhagic factors, LHF-I and LHF-II,
isolated from the venom of the bushmaster snake (Lachesis muta muta).
Toxicon 1995a; 33(8):1061-9.
63. Sanchez EF, Costa MI, Chavez-Olortegui C, Assakura MT,
Mandelbaum FR, Diniz CR. Characterization of a hemorrhagic factor, LHF-
I, isolated from the bushmaster snake (Lachesis muta muta) venom.
Toxicon 1995b; 33(12):165367.
64. Rucavado A, Flores-Sanchez E, Franceschi A, Magalhães A, Gutierrez
JM. Characterization of the local tissue damage induced by LHF-II, a
metalloproteinase with weak hemorrhagic activity isolated from Lachesis
muta muta snake venom. Toxicon 1999; 37(9):1297-312.
65. Soares de Moura R, Aguiar AS, Melgarejo AR, de Carvalho LC.
Pharmacological aspects of mouse hind-paw oedema induced by Lachesis
muta rhombeata venom. Toxicon 1998;36(5):771-80.
122
66. Rossi MA, Peres LC, de Paola F, Cupo P, Hering SE, Azevedo-Marques
MM. Electron-microscopy study of systemic myonecrosis due to poisoning
by tropical rattlesnake (Crotalus durissus terrificus) in humans. Arch Pathol
Lab Med 1989; 113(2):169-73.
67. Prado-Franceschi J, Tavares DQ, Hertel R, Lobo de Araújo A. Effects
of convulxin, a toxin of rattlesnake venom, on platelets and leukocytes of
anesthetized rabtis. Toxicon 1981;19(5):661-6.
68. Franco F. Origem e Diversidade das Serpentes. In: Cardoso J, França
FOS, Wen FH, Málaque C, Haddad VJ, editors. Animais Peçonhentos no
Brasil: Biologia, Clínica e Terapêutica dos Acidentes. 2a ed. São Paulo:
Sarvier; 2009. p. 22–41.
69. Melgarejo A. Serpentes Peçonhentas do Brasil. In: Sarvier, editor.
Animais Peçonhentos no Brasil: Biologia, Clínica e Terapêutica dos
Acidentes. 2a ed. São Paulo; 2009. p. 43–70.
70. Caiaffa W, Vlahov D, Antunes C, de Oliveira H, Diniz C. Snake bite and
antivenom complications in Belo Horizonte, Brazil. Trans R Soc Trop Med
Hyg. 1994; 88(1):81–5.
71. Cruz L, Vargas R, Lopes A. Snakebite envenomation and death in the
developing world. Ethn Dis. 2009; 19(1):42–6.
72. Oliveira F, Brito M, De Morais I, Fook S, De Albuquerque H. Accidents
caused by Bothrops and Bothropoides in the State of Paraiba:
epidemiological and clinical aspects. Rev Soc Bras Med Trop. 2010;
43(6):662–7.
73. Ribeiro L, Jorge M. Acidente por serpentes do gênero Bothrops: série
de 3.139 casos. Rev Soc Bras Med Trop. 1997; 30(6):475–80.
74. Lima P, Haddad Junior V. Case Report - A snakebite caused by a
bushmaster (Lachesis muta): report of a confirmed case in State of
Pernambuco, Brazil. Rev Soc Bras Med Trop. 2015; 48(5):636–7.
75. Pardal P, Bezerra I, Rodrigues L, Pardal J, Farias P. Acidente por
Surucucu (Lachesis mutamuta) em Belém-Pará: Relato de Caso. Rev Para
Med. 2007;21(1):37–42.
123
76. Luciano P, Silva G, Azevedo-Marques M. Acidente botrópico fatal. Med
(Ribeirão Preto). 2009; 42(1):61–5.
77. Warrell D. Guideline for the management of snakebites. World Health
Organization - Regional Office for South-East Asia. 2010. 1-162 p.
78. Wolff H. Insuficiência hipofisária anterior por picada de ofídio. Arq Bras
Endocrin Metab 1958; 7:25-47.
79. Amaral CF, de Rezende NA, da Silva AO, Ribeiro MM, Magalhães RA,
dos Reis RJ, Carneiro JG, Castro JR. Insuficiência renal aguda secundária
a acidentes ofídicos botrópico e crotálico: análise de 63 casos. Re v Inst
Med Trop São Paulo 1986;28(4):220-7.
80. Burdmann EA. Insuficiência renal aguda por veneno do Bothrops
jararaca: modelo experimental [Tese Doutorado]. Universidade de São
Paulo, 1989.
81. Kamiguti AS, Sano-Martins IS. South American snake venoms affecting
haemostasis. J Toxicol Reviews 1995; 14:359-74.
82. Kamiguti AS, Hay CR, Theakston RD, Zuzel M. Insights into the
mechanism of haemorrhage caused by snake venom metalloproteinases.
Toxicon 1996;34(6):627-42.
83. Otero R, Gutiérrez J, Beatriz Mesa M, Duque E, Rodríguez O, Luis
Araújo J, Gómez F, Toro A, Cano F, María Rodríguez L, Caro E, Martinez
J, Cornejo W, Mariano Gómez L, Luis Uribe F, Cárdenas S, Núnez V,
Díaz A. Complications of Bothrops, Porthidium, and Bothriechis snakebites
in Colombia. A clinical and epidemiological study of 39 cases attended in a
university hospital. Toxicon. 2002; 40: 1107-1114.
84. Silva IM & Tavares AM. Comparative evaluation of adverse effects in
the use of powder trivalent antivenom and liquid antivenoms in Bothrops
snake bites. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. Vol.45 no.4 Uberaba July/Aug.
2012. ISSN 0037-8682.
85. Antivenom AID Product Development Partnership - AntivenomAID PDP.
(http://www.snakebiteinitiative.org/?page_id=287).
124
86. Terroni HC, De Jesus, JM, Artuzo LT, Ventura LV, Santos RF, Damy-
Benedetti P. Liofilização. Revista Cientifica UNILAGO, 2011.
87. Ward KR. The importance of vacuum and the control of pressure in
freezedrying. 3 rd Vacuum Symposium UK, Conventry, 2012.
88. Ayrosa AMIB. Liofilização: Ciência ou arte? Rev. Engenharia. São
Paulo. FAAF. 2003.
89. Kumar GP, Prashanth N, Kumari BC. Fundamentals and Applications
of Lyophilization. Journal of Advanced Pharmaceutical Research. 2011;
(2):157-69. 90. Adams D. Waking up to world coffee crisis. St. Petersburg
Times Latin America. August 11, 2002.
90. Macedo AB, Moritz DE. Desenvolvimento de uma formulação de
derivados lácteos com propriedades funcionais em pó (iogurte e leite
fermentado) corado com biopigmento monascus. Cadernos Acadêmicos,
Palhoça, SC, v.4. 2012.
91. Prista LN, Alves AC, Morgado RMR. 1981. Técnica farmacêutica e
farmácia galênica. 3 ed.: Calouste Gulbenkian. Lisboa. 1981; (1) 147pp
92. Vauthier C, Bouchemal K. Methods for the preparation and manufacture
of polymeric nanoparticles. Pharmaceutical Research. 2008; (6)5:1025-58.
93. Abdelwahed W, Degobert G, Stainmesse S, Fessi H. Freeze-drying of
nanoparticles: formulation, process and storage considerations. Adv. Drug.
Deliv. Rev.2006a; (58):1688-13.
94. Abdelwahed W, Degobert G, Fessi H. Freeze-drying of nanocapsules:
impact of annealing on the drying process. International Journal of
Pharmaceutics.2006b; (324):74-82.
95. Pitombo RNM. A liofilização como técnica de conservação de material
de Pesquisa, Ciência e Cultura. 1989: 41(5),427-31.
96. Manning MC, Patel K, Borcharddt RT. Stability of protein pharmaceutics.
Pharm Res.1989; 6:903-18.
97. Pikal MJ, Dellerman KM, Roy ML, Riggin RM. The effects of formulation
variables on the stability of freeze-dried human growth hormone. Pharm
Res. 1981; (8):427-36.
125
98. Pikal MJ. Freeze-drying of proteins, Part I: process design. Biopharm.
1990a (3):18-27.
99. Pikal MJ. Freeze-drying of proteins. Part II: Formulation selection of
protein pharmaceutics. Pharm Res. 1989; (6):903-18.
100. Ministério da Saúde. Guia de Vigilância em Saúde, Departamento de
Vigilância das Doenças Transmissíveis. Brasília, 1st ed, 2016. Ministério da
Saúde. Farmacopéia Brasileira, 4th ed. Anvisa, Brasília, 2000.
101. Deeks J, Higgings J. Statistical algorithms in Review Manager 5, 2010.
102. Pagano M, Gauvreau K. Principles of Biostatistics, 2nd ed. Brooks/Cole,
Belmont, 2000.
103. WHO. Guidelines for the Production Control and Regulation of Snake
Antivenom Immunoglobulins. WHO, Geneva, 2010.
104. Sarciaux J-M, Mansour S, Hageman MJ, Nail SL. Effects of Buffer
Composition and Processing Conditions on Aggregation of Bovine IgG
during Freeze-Drying. J. Pharm Sci. 1999; 88:1354-61.
105. Herrera M, Tattini-Junior V, Pitombo R, Gutiérrez J, Borgognoni C,
Baudrit J, et al. Freeze-dried snake antivenoms formulated with sorbitol,
sucrose or manitol: comparison of their stability in an accelerated test.
Toxicon. 2014; 90:56-63.
106. Herrera M, Solano D, Gómez A, Villalta M, Vargas M, Sánchez A, et
al. Physichemical characterization of comercial freeze-dried snake
antivenoms. Toxicon. 2017; 126:32-37.
107. Ho M, Warrell MJ, Warrell DA, Voller A. A critical reappraisal of the use
of enzyme-linked immunosorbent assays in the study of snakebite. Toxicon.
1986; 24:211-21.
108. Sano-Martins IS, Wen FH, Castro SCB, Tomy SC, França FOS, Jorge
MT, et al. Reliability of the 20 minutes whole blood clotting test (WBCT20)
as an indicator of low plasma fibrinogen concentration in patients
envenomed by Bothrops snakes. Toxicon. 1994; 32:1045-50.
109. Warrell DA. Epidemiology, Clinical Features and Management of
Snake Bites in Central and South America, in: Cornell University Press
126
(Ed.), Campbell J, Lamar WW. (Eds.), Venomous Reptiles of the Western
Hemisphere. Cornell University Press, Ithaca, 2004:709-61.
110. Pardal PPO, Souza SM, Monteiro MRCC, Fan HW, Cardoso JLC,
França FOS, et al. Clinical trial of two antivenoms for the treatment of
Bothrops and Lachesis bites in the north eastern Amazon region of Brazil.
Trans R Soc Trop Med Hyg. 2004; 98:28-42.
111. Cardoso JLC, Wen FH, França FOS, Jorge MT, Leite RP, Nishioka SA,
et al. Randomized comparative trial of three antivenoms in the treatment of
envenoming by lance-headed vipers (Bothrops jararaca) in São Paulo,
Brazil. Q J Med. 1993; 85:315-25.
112. Otero-Patiño R, Cardoso J, Higashi H, Nunez V, Diaz A, Toro M, et al.
A randomized, blinded, comparative trial of one pepsin-digested and two
whole IgG antivenoms for Bothrops snake bites in Uraba, Colombia. The
Regional Group on Antivenom Therapy Research (REGATHER). Am J Trop
Med Hyg. 1998; 58:183-89.
113. Jorge MT, Cardoso JLC, Castro SCB, Ribeiro L, França FOS, Sbrogio
de Almeida ME, et al. A randomized “blinded” comparison of two doses of
antivenom in the treatment of Bothrops envenoming in São Paulo, Brazil.
Trans R Soc Trop Med Hyg. 1995;89:111-14
114. Azevedo-Marques M, Hering S, Cupo P. Acidente Crotálico. In: Sarvier
(Ed.), Cardoso JLC, Haddad-Jr V, França FS, Málaque CMS, Wen FH.
Animais Peçonhentos no Brasil. Sarvier, São Paulo; 2009;108-15.
115. Azevedo-Marques MM, Hering SE. Evidence that Crotalus durissus
terrificus (South American rattlesnake) envenomation in human causes
myolysis rather than hemolysis. Toxicon. 1987; 11: 1163-68.
116. Cupo P, Azevedo-Marques MM, Hering SE. Acute myocardial
infarction-like enzyme profile in human victims of Crotalus durissus terrificus
envenoming. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1990; 84:447-51.
117. Otero R, León G, Gutiérrez J, Rojas G, Toro MJB, Rodríguez V, et
al.Efficacy and safety of two whole polyvalent antivenoms, refined by
caprylic acid fractionation with or without beta-propiolactone, in the
127
treatment of Bothrops asper bites in Colombia. Trans R Soc Trop Med Hyg.
2006; 100:1173-82.
118. Otero R, Gutiérrez J, Rojas G, Núnez V, Díaz A, Miranda E, et al.A
randomized blinded clinical trial of two antivenoms, prepared by caprylic
acids or ammonium sulphate fractionation of IgG, in Bothrops and
Porthidium snake bites in Colombia: correlation between safety and
biochemical characteristics of antivenoms. Toxicon. 1999; 37:895-08.
119. Laing GD, Yarleque A, Marcelo A, Rodriguez E, Warrell DA, Theakston
RDG. Preclinical testing of three South American antivenoms against the
venoms of five medically- important Peruvian snake venoms. Toxicon.
2004; 44:103-06.
120. Theaskston R, Laing G, fielding C, Lascano A, Touzet J-M, Vallejo F,
et al. Treatment of snakebites by Bothrops species and Lachesis muta in
Ecuador: laboratory screening of candidate antivenoms. Trans R Soc Trop
Med Hyg 89:550-554.
121. Furtado MFD, Maruyama M, Kamiguti AS, Antônio LC. Comparative
study of nine Bothrops snake venoms from adult female snakes and their
offspring. Toxicon. 1991; 29:219-26.
122. Wingert WA, Chan L. Rattlesnake bites in southern California and
rationale for recommended treatment. West J Med. 1988; 148:37-44.
123. Cromwell MEM, Hilario E, Jacobson F. Protein aggregation and
bioprocessing. AAPS J. 2006; 8:572-79.
124. Rodrigues-Silva R, Antunes GFC, Velarde DT, Santoro MM. Thermal
stability studies of hyperimmune horse antivenoms. Toxicon. 1999; 37:33-
45.
125. Segura A, Herrera M, González E, Vargas M, Solano G, Gutiérrez JM,
et al. Stability of equine IgG Antivenoms obtained by caprylic acid
precipitation: Towards a liquid formulation stable at tropical room
temperature. Toxicon. 2009; 53:609-15.
126. Otero-Patiño R, Segura Á, Herrera M, Angulo Y, León G, Gutiérrez JM,
et al. Comparative study of the efficacy and safety of two polyvalent,
128
caprylic fractioned [IgG and F(ab’)2] antivenoms, Bothrops asper bites in
Colombia. Toxicon. 2012; 59:344-55.
127. Smalligan R, Cole J, Brito N, Laing GD, Mertz BL, Manock S, et al.
Crotaline snakebite in the Ecuadorian Amazon: randomized double blind
comparative trial of three South American polyspecific antivenom. BMJ.
2004; 329:1129.
128. Wen FH, Marcopito L, Cardoso J, França F, Málaque C, Ferrari R, et
al. Sequential randomized and double blind trial of promethazine
prophylaxis against early anaphylatic reactions to antivenom for Bothrops
snake bites. BMJ. 1999; 318:1451-53.
129. Bucaretchi F, Douglas JL, Fonseca MRCC, Zambrone FAD, Vieira RJ.
Snakes bites in children: antivenom early reaction frequency in patients
pretreated with histamine antagonists H1 and H2 and hydrocortisone. Rev
Inst Med Trop São Paulo. 1994; 36:451-57.
130. Habib AG. Effect of pre-medication on early adverse reactions
following antivenom use in snakebite: A systematic review and meta-
analysis. Drug Saf. 2011; 34:869-80.
131. Thomas L, Tyburn B, Bucher B, Pecout F, Ketterle J, Rieux D, et al.
Prevention of thrombosis in human patients with Bothrops lanceolatus
envenoming in Martinique: failure of anticoagulants and efficacy of a
monospecific. Research Group on Snake Bites in Martinique. Am J Trop
Med Hyg. 1995; 52:419-26.
132. Otero R, Gutiérrez JM, Núnez V, Robles A, Estrada R, segura E, et al.
A randomized double clinical trial of two antivenoms in patients bitten by
Bothrops atrox in Colombia. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1996; 90:696-00.
133. Itkin YM, Trujillo TC. Intravenous immunoglobulins-associated acute
renal failure: case series and literature review. Pharmacother. 2005; 25:886-
92.
134. Hill RE, Bogdan GM, Dart RC. Time to reconstitution: Purified Fab
antivenom vs. unpurified IgG antivenom. Toxicon. 2001; 39:729-31.
129
135. Quan AN, quan D, Curry SC. Improving Crotalidae polyvalent immnune
Fab reconstitution times. Am J Emerg Med. 2010; 28:593-95.
136. Schersch K, Betz O, Garidel P, Muehlau S, Bassarab S, Winter G.
Systematic Investigation of the Effect of Lyophilizate Collapse on
Pharmaceutically Relevant Proteins I: Stability after Freeze-Drying. J Pharm
Sci. 2010; 99:2256-78.
137. Searles JA, Carpenter JF, Randolph TW. Annealing to optimize the
primary drying rate, reduce freezing-induced drying rate heterogeneity, and
determine T(g)’ pharmaceutical lyophilization. J Pharm Sci. 2001; 90:872-
87.
138. Gerring D, King TR, Branton R. Validating a faster method for
reconstitution of Crotalidae Polyvalent Immune Fab (ovine). Toxicon. 2013;
69:42-49.
139. Theakston RDG, Warrell DA, Griffiths E (2003) Report of a WHO
workshop on the standardization and control of antivenoms. Toxicon. 2003;
41:541-57.
140. Rodrigues-Silva R, Martins MS, Magalhães A, Santoro MM.
Purification and stability studies of immunoglobulins from Lachesis muta
muta antivenom. Toxicon. 1997; 35:1229-38.
141. Anderson GP, Liu JH, Zabetakis D, Liu JL, Goldman ER. Thermal
stabilization of anti-alfa-cobratoxin single domain antibodies. Toxicon. 2017;
129:68-73.
142. Brasil. Caderno 14_ Acidentes por Animais Peçonhentos. In: Saude
Mda, Editor. Guia de Vigilância Epidemiológica [Internet]. 7th ed. Brasília:
Ministério da Saúde; 2009. P23. Available from:
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/guia_vigilancia_epidemiologica
_7ed.pdf
130
9. ANEXOS ANEXO I
LAUDO DE TERMOESTABILIDADE DO SATL
131
ANEXO II
LAUDO DE ANÁLISE FÍSICO - QUÍMIC A DO SATL
132
133
134
135
ANEXO III
PROTOCOLO DE REGISTRO DE CASO
136
ANEXO IIIA
FORMULÁRIO DE ENTREVISTA (DADOS GERAIS)
1 - IDENTIFICAÇÃO
1.1 Nº PROTOCOLO: 1.2 DATA: ______/______/_______
1.3 NOME: 1.4 SEXO:( ) Masc ( ) Fem
1.5 DATA NASC: _____/_____/_____ 1.6 NATURALIDADE:
1.7 END RES: 1.8 TEL RES:
1.9 BAIRRO: 1.10 CIDADE: 1.11 ESTADO:
1.12 END TRAB: 1.13 TEL TRAB:
1.14 OCUPAÇÃO:
1.15 ESCOLARIDADE:
[ ] 1. Analfabeto 2. 1º Grau 3. 2º Grau 4. Superior 5. Ignorado
Especifique:[ ] 1. Completo
2. Incompleto
2. OUTRAS INFORMAÇÕES
2.1 Preenchido ( ) antes ( ) durante ( ) depois da soroterapia
Responsável:
Data: Unidade:
137
MANUAL PARA APLICAÇÃO – ANEXO IIIA
O formulário deverá ser preenchido após a confirmação do paciente como voluntário para
o trabalho. Os dados poderão ser coletados diretamente com o voluntário ou
acompanhante, ou ainda, através do prontuário (ficha de entrada / cadastro, etc) do
paciente.
O preenchimento segue os seguintes passos:
1º Passo: Preenchimento do campo “1 – IDENTIFICAÇÃO”.
1– IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE: Preencher nº do protocolo do paciente na pesquisa,
data de atendimento, seu nome completo, sexo, data de nascimento (DD/MM/AAAA),
naturalidade, endereço residencial, bairro, cidade, estado, telefone da residência,
endereço do trabalho, telefone do trabalho, ocupação e escolaridade.
Após preencher a identificação do paciente realizar a avaliação clínica.
É muito importante que não ocorre um risco maior para o paciente que está participando
da pesquisa, logo o médico deve avaliar como e quando vai realizar a entrevista com o
paciente (ou responsável). O entrevistador deve preencher todas as lacunas do formulário.
2º Passo: Preenchimento do campo “2 – OUTRAS INFORMAÇÕES”.
Informar o momento do preenchimento da ficha: antes, durante ou depois da soroterapia.
3º Passo: Identificação do responsável pelo preenchimento (nome completo), data do preenchimento ou coleta dos dados e unidade (local do trabalho).
4º Passo: Após preenchimento enviar uma cópia legível para o IBEx.
138
ANEXO IIIB
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) Instituto de Biologia do Exército (RJ) – Instituto Butantan (SP) – Fundação de
Medicina Tropical do Amazonas
AVALIAÇÃO CLÍNICO-TERAPÊUTICA DO SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE ( BOTRÓPICO- LAQUÉTICO- CROTÁLICO ) LIOFILIZADO
Este documento visa dar ao senhor informações e pedir sua participação neste
trabalho, realizado em conjunto pelo Instituto de Biologia do Exército, Instituto
Butantan e Fundação de Medicina Tropical, cujo objetivo é analisar a eficácia e a
possível presença de eventos adversos ao tratamento com uma nova formulação do
soro antiofídico.
A nova formulação do soro antiofídico consiste em uma forma liofilizada (em pó) que
fornece maior estabilidade em ambientes quentes e é capaz de neutralizar três tipos
de venenos (antibotrópico-laquético-crotálico), isto é, atua nas picadas das serpentes:
jararaca, surucucu e cascavel.
Os testes em laboratório realizados com o novo soro apresentaram resultados
similares aos soros já produzidos pelo Instituto Butantan.
A participação na pesquisa consiste em: (1) utilizar o soro liofilizado trivalente ou o
soro líquido no tratamento; (2) realizar exames laboratoriais através da colheita de
urina e da retirada de sangue venoso por venopunção; (3) responder as perguntas
realizadas pelos pesquisadores.
Sua participação nesta pesquisa é muito importante, mas é uma escolha somente
sua. O senhor pode se recusar a participar, sem que isso o prejudique no tratamento.
Todas as informações sobre os participantes neste estudo são confidenciais. Não
serão divulgados nomes dos participantes em nenhuma hipótese. Os resultados dos
exames realizados serão disponibilizados ao senhor, permanecendo uma cópia com o
pesquisador para análise.
Declaro estar ciente das informações deste Termo de Consentimento, entendendo
que poderei pedir esclarecimentos a qualquer tempo. Declaro dar meu consentimento
para a participação nesta pesquisa, estando ciente de que uma outra cópia deste
termo permanecerá arquivada pelos organizadores da pesquisa. Participante:
___________________________________________________________________
Local e data: __________________,______/__________/ 200 .
________________________________________________________________
Assinatura do participante
________________________________________________________________
Assinatura do responsável pela pesquisa no local do Tratamento
Contato OMS / Hosp: _____________________________________ Tel:_____________________ Contatos (RJ): Cap Iran
Tel: 021 XX 3860-0442 ramal 228 (Instituto de Biologia do Exército)
139
ANEXO IIIC Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) Especial
Instituto de Biologia do Exército (RJ) – Instituto Butantan (SP) – Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
AVALIAÇÃO CLÍNICO-TERAPÊUTICA DO SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE ( BOTRÓPICO- LAQUÉTICO- CROTÁLICO )
LIOFILIZADO
Este documento visa dar ao Senhor, informações e pedir participação do menor acidentado,
através de sua autorização e do menor neste trabalho, realizado em conjunto pelo Instituto de
Biologia do Exército, Instituto Butantan e Fundação de Medicina Tropical, cujo objetivo é analisar a
eficácia e a possível presença de eventos adversos ao tratamento com uma nova formulação do
soro antiofídico.
A nova formulação do soro antiofídico consiste em uma forma liofilizada (em pó) que fornece
maior estabilidade em ambientes quentes e é capaz de neutralizar três tipos de venenos
(antibotrópico-laquéticocrotálico), isto é, atua nas picadas das serpentes: jararaca, surucucu e
cascavel.
Os testes em laboratório realizados com o novo soro apresentaram resultados similares aos
soros já produzidos pelo Instituto Butantan.
A participação na pesquisa consiste em: (1) utilizar o soro liofilizado trivalente ou o soro líquido
no tratamento; (2) realizar exames laboratoriais através da colheita de urina e da retirada de sangue
venoso por venopunção; (3) responder as perguntas realizadas pelos pesquisadores.
Sua participação e do acidentado nesta pesquisa é muito importante, mas é uma escolha
somente de ambos. Os senhores podem se recusar a participar, sem que isso prejudique o
tratamento. Todas as informações sobre os participantes neste estudo são confidenciais. Não serão
divulgados nomes dos participantes em nenhuma hipótese. Os resultados exames realizados serão
disponibilizados ao senhor e ao acidentado, permanecendo uma cópia com o pesquisador para
análise.
Declaro estar ciente das informações deste Termo de Consentimento, entendendo que poderei
pedir esclarecimentos a qualquer tempo. Declaro dar meu consentimento para a participação do
menor nesta pesquisa, estando ciente de que uma outra cópia deste termo permanecerá arquivada
pelos organizadores da pesquisa.
Participante:
___________________________________________________________________ Local e
data: __________________,_______/__________/ 200 .
________________________________________________________________
Assinatura do responsável pelo acidentado
________________________________________________________________
Assinatura do responsável pela pesquisa no local do Tratamento
Contato OMS / Hosp: ____________________________________ Tel:_____________________
Contatos (RJ): Cap Iran Tel: 021 XX 3860-0442 ramal 228 (Instituto de Biologia do Exército)
140
ANEXO IIID
FICHA DE ACOMPANHAMENTO CLÍNICO 1- IDENTIFICAÇÃO
1.1 Nº PROTOCOLO: 1.2 PRONTUÁRIO:
1.3 NOME: 1.4 DATA: _____/______/_______
2. AVALIAÇÃO CLÍNICA
2.1 Queixa Principal:
2.2 História do acidente:
2.2.a: Data do acidente:
2.2.b: Local de ocorrência do acidente:
2.2.c: Horário do acidente:
2.2.d: Identificação do ofídio:
2.2.e:Tamanho aproximado do ofídio (centímetros):
2.2.f: Região corporal picada pelo ofídio:
2.2.g. Descrição das alterações locais:
2.2.h: Descrição das alterações sistêmicas:
2.2.i: Outras informações:
2.3. História Patológica Pregressa:
2.3.a: Outros acidentes com ofídios? ( ) não ( ) sim Descrever (ofídio, data, tratamento, alergia, reações adversas) _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________
2.3.b: Uso de soro heterólogo anteriormente: ( ) sim ( ) não
2.3.c: Motivo do uso (2.3.d)/qual soro?
2.3.e: A quanto tempo?
2.3.f: Alergias (soro): ( ) não ( ) sim quais ?
_______________________________________________________________________
______________
2.3.f: Alergias (outras): ( ) não ( ) sim quais ?
141
3. EXAMES REALIZADOS E RESULTADOS Data: / / . ( )Admissão ( )4 horas ( )12 horas ( )24 horas ( )7 dias ( )15 dias
3.1 Material colhido antes da soroterapia: ( ) urina ( ) sangue
3.2 Exames realizados antes da soroterapia:
3.2.a Urina (EAS) pH:________________________________ Proteínas:___________________________ Hemoglobina:________________________ Piócitos:____________________________
Hemácias:___________________________
Cilindros:____________________________
Cristais:___________________________ Pigmentos biliares:__________________ Nitritos:____________________________Corpos cetônicos:___________________ Urobilinogênio:______________________ Glicose:___________________________ Bactérias:_________________________
_
3.2.b Sangue Hemograma Completo Hemácias:____________________________ Hemoglobina:_________________________ Hematócrito:___________________________Leucócitos totais:_______________________ Basófilos:_____________________________ Eosinófilos:____________________________ Mielócitos:_____________________________ Metamielócitos:_________________________ Bastonetes:____________________________ Segmentados:_________________________ Linfócitos:_____________________________ Monócitos:____________________________ Promielócitos:__________________________ Contagem de plaquetas:_________________
Provas de Função Hepática Alaninoaminotransferase (ALT):________ Aspartatoaminotransferase (AST):______ Fosfatase alcalina (FA):_____________ Desidrogenase láctica (DHL):__________ Bilirrubina total (Bt):_________________ Bilirrubina direta (Bd):______________ Bilirrubina indireta (Bi):______________ Provas de Função Renal Uréia:____________________________ Creatinina:________________________ Potássio:__________________________ Sódio:____________________________ Provas de Coagulação Sangüínea Tempo de Coagulação (TC):__________________ Tempo de Atividade da Protrombina (TAP):______ ________________________________ Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA): _____________ Fibrinogênio:______________________
Outros exames: _____________________________________ _____________________________________ _____________________________________ _____________________________________ _____________________________________ _____________________________________ ______________________________________
Creatinoquinase (CK):_______________
Cálcio:____________________________
Velocidade de hemossedimentação (VHS): ________________
3.3 Sorologia pela técnica ELISA (material colhido antes e depois da soroterapia -1
hora após), para avaliar a venenemia – neutralização: 1a colheita em / / .
2a colheita em / / .
142
3.4 Exames realizados durante a soroterapia 3.4.a Urina (caso não realizado colheita antes da soroterapia): colhido em / / . 3.4.b Sangue: colhido em / / . Descrever quais
exames:____________________________________________________________
3.5 Exames realizados depois da soroterapia 3.5.a Urina: colhido em / / .
3.5.b Sangue: colhido em / / . Descrever quais
exames:____________________________________________________________
Responsável:
Data: Unidade:
2.4. Manifestações Clínicas ( ) Dor ( ) Edema ( ) Eritema ( ) Bolhas ( ) Úlceras ( ) Abscesso ( ) Hemorragia local ( ) Gengivorragia ( ) Epistaxe ( ) Hemoptise ( ) Hemorragia digestiva ( ) Hematúria ( ) Hemorragia da pele ( ) Oligúria ( ) Anúria ( ) Náuseas ( ) Dor abdominal ( ) Vômitos ( ) Diarréia ( ) Lipotímia ( ) Visão turva ( ) Choque ( ) Ptose palpebral ( ) Insuficiência respiratória ( ) Diplopia ( ) Sialorréia ( ) Icterícia ( ) Paralisia dos membros superiores ( ) Disfagia ( ) Mialgias ( ) Oftalmoplegia ( ) Paralisia dos membros inferiores ( ) Outras 2.4a: Outras informações relevantes: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ 2.5. Exame Físico 2.5a: Ectoscopia: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________ 2.5b: Aparelho Respiratório: ________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________ 2.5c: Aparelho Cardiovascular:
143
________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ 2.5d: Aparelho Digestivo: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ 2.5e: Aparelho Geniturinário: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ 2.5f: Exame dos Membros: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ 2.6. Outras informações relevantes: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________ OBS1: A avaliação laboratorial seguirá o seguinte cronograma:
Distribuição Temporal
Coagulograma (inclui TAP e
PTTa)
Fibrinogênio
Bioquímica
Hemograma e Plaquetas
Urina (EAS)
Admissão X X X X X 4 horas X X X X X 12 horas X X X X X 24 horas X X X X X 7 dias X X X
15 dias X X X
OBS2: Os resultados dos exames serão transcritos para a folha nº 2 deste anexo, para
isto serão fornecidas 6 cópias destas folhas.
OBS3: Deverá ser aposto no início de cada folha nº 2, a data e a hora de cada colheita de
material para o exame.
144
MANUAL PARA APLICAÇÃO – ANEXO IIID
O formulário deverá ser preenchido pelo médico responsável pelo tratamento ou
profissional de saúde indicado por ele. Os dados serão coletados dos pacientes
voluntários.
Os dados serão registrados durante o tratamento até o 25 º dia após o início da soroterapia.
O preenchimento segue os seguintes passos:
1º Passo: O paciente se enquadra nos quesitos de elegibilidade.
IMPORTANTE:
a) Critérios de elegibilidade: Ter sido indicado para o uso do soro heterólogo por
ocasião de acidente ofídico; Ter idade entre 12 e 70 anos de idade; Indivíduos do sexo
feminino fora do estado de gravidez; Não ser classificado na avaliação médica como caso
grave; Não ter usado soro antiofídico antes da chegada ao hospital que realiza o estudo e
Ler e assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, o que poderá ser feito por
um responsável no caso de impedimento da vítima.
b) Critérios de exclusão: Gravidez no momento da aplicação da soroterapia; Ter
menos do que 12 e mais de 70 anos de idade; Ser classificado na avaliação médica como
caso grave ou Ter iniciado tratamento antiofídico antes da chegada ao hospital que realiza
o estudo.
2º Passo: Oferecer a opção do soro trivalente explicitando as vantagens (três espécies) e
informando sobre os possíveis eventos adversos (semelhantes ao utilizado na rotina de
tratamento). Esclarecer possíveis dúvidas e perguntar se poderia participar do projeto.
Caso a resposta seja negativa, agradecer e, continuar o tratamento de rotina. Sendo a
resposta positiva, realizar sorteio e iniciar tratamento.
O paciente não deverá saber se está utilizando o soro liofilizado.
3º Passo: Preenchimento da Ficha de Acompanhamento:
1– IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE: Preencher nº do protocolo do paciente na pesquisa,
nº do prontuário na Unidade que está atendendo, seu nome completo e a data de entrada
para o tratamento.
145
Após preencher a identificação do paciente realizar a avaliação clínica.
É muito importante que não ocorra um risco maior para o paciente que está participando
da pesquisa, logo o médico deve avaliar como e quando vai realizar a entrevista com o
paciente (ou responsável). O entrevistador deve preencher todas as lacunas do formulário.
2– AVALIAÇÃO CLÍNICA:
4º Passo:item “2.1”: Queixa principal: Descrever os sinais e sintomas apresentados
pelo acidentado no momento do atendimento médico.
5º Passo:item “2.2”: Relatar a história do acidente, para isso preencher os subitens:
2.2.a: Data do acidente: dia, mês, ano. Exemplo: 2/07/04 (dois de julho de dois mil e quatro).
2.2.b: Local de ocorrência do acidente: Descrever o local com suas características.
Ex.: residência, mata, lavoura, perto de rios, pedras, etc.
2.2.c: Horário do acidente: hora aproximada (utilizar escala de “0” a 23 horas) . Exemplo: 8h/20h, 12h/0h.
2.2.d: Identificação do ofídio: quando possível identificar o ofídio, para isso perguntar
ao acidentado ou acompanhante. Pode se utilizar a identificação local.
2.2.e: Tamanho aproximado do ofídio (centímetros): quando possível. Exemplo +/- 45 cm.
2.2.f: Região corporal picada pelo ofídio: Descrever por exemplo: região posterior da
perna direita, região lateral do tornozelo esquerdo, etc.
2.2g: Descrição das alterações locais: Descrever os sinais da picada e alterações
como: edema, sangramento local, etc.
2.2h: Descrição das alterações sistêmicas: Descrever os sinais e sintomas como:
hematúria, sangramento gengival, alterações pressóricas, alterações sensoriais, etc.
2.2i: Outras informações: Espaço reservado para qualquer informação que o
entrevistador ou médico ache relevante.
6º Passo: item “2.3” deverá ser descrito a história patológica pregressa, conforme os subitens descritos:
2.3.a: Outros acidentes com ofídios? ( ) não ( ) sim Descrever (ofídio, data,
tratamento, alergia, reações adversas).
2.3.b: Uso de soro heterólogo anteriormente: ( ) sim ( ) não.
2.3.c: Motivo do uso (2.3.b)/qual soro?
2.3.d: Anotar a data ou período. Exemplos: fevereiro de 2001, 1999, dois anos atrás, etc.
2.3.e: Anotar as manifestações alérgicas, possivelmente relacionadas ao uso do soro.
2.3.f: Anotar outras alergias relatadas pelo paciente.
146
7º Passo: Transcrever os exames realizados no paciente. Todos os exames listados
são importantes para a pesquisa. Não esquecer de preencher a data da realização
dos exames assim como assinalar o período de realização do exame na admissão e
em relação ao início da soroterapia (no início da folha 2 deste anexo).
8º Passo: Após preenchimento, enviar para o IBE
147
ANEXO IIIE
FICHA DE ACOMPANHAMENTO PARA COLETA DE SANGUE
IBEx – IB – FMTAM
Nº do Protocolo (Pesquisa) ______________
Nome: _________________________________________________________________
Idt nº : ___________________________
Data da entrada: ( / /200 ). Responsável: _____________________________
1a Coleta de sangue: ( / /200 ). Na admissão – Responsável: ________________
2a Coleta de sangue: ( / /200 ). 4 hs pós-soroterapia – Responsável: __________
3a Coleta de sangue: ( / /200 ). 12 hs pós-soroterapia – Responsável: _________
4a Coleta de sangue: ( / /200 ). 24 hs pós-soroterapia – Responsável: _________
5a Coleta de sangue: ( / /200 ). 7 dias pós-soroterapia – Responsável: _________
6a Coleta de sangue: ( / /200 ). 15 dias pós-soroterapia – Responsável: ________
148
MANUAL PARA APLICAÇÃO - ANEXO IIIE
Esta ficha deverá ser preenchida após a confirmação do paciente como voluntário para o trabalho.
Nesta ficha serão informadas as datas das coletas de sangue para avaliação
bioquímica e sorológica. O preenchimento segue os seguintes passos:
1º Passo: Anotar o número do protocolo de participação na pesquisa, o nome
completo e o número de identidade.
2º Passo: Anotar no campo “data de entrada” a data que o paciente iniciou o
tratamento (aplicação do soro antiofídico trivalente liofilizado).
3º Passo: Anotar a data AGENDADA para cada coleta de sangue.
4º Passo: Colocar entre parênteses a data REAL da coleta. Não esquecer de anotar
o nome do responsável pela coleta.
5º Passo: Após preenchimento enviar uma cópia legível para o IBEx.
149
ANEXO IIIF
150
151
152
ANEXO IIIG
FICHA DE INVESTIGAÇÃO DOS EVENTOS ADVERSOS PÓS-SOROTERAPIA (SATL-SAMBL)
IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE
1-NOME DO PACIENTE 2-DATA DO NASCIMENTO:
______/_________/_______
3-ENDEREÇO (Rua,Avenida, nº Aptº.)
4-BAIRRO OU LOCALIDADE: 5- MUNICÍPIO: 6-UF
7- TELEFONE PARA CONTATO: ( ) 8- PROFISSÃO:
DADOS COMPLEMENTARES DO CASO
9- Nº DE FRASCOS ADMINISTRADOS: _______ 10- VIA DE APLICAÇÃO: ______________________
11- DATA DA APLICAÇÃO: _____/____/_____ 12- LAB.PRODUTOR: IB-IBEx
13- Nº DO LOTE: 14- VALIDADE:
EVENTOS ADVERSOS – REAÇÕES PRECOCES (24 horas) E TARDIAS
15 - MARCAR COM UM “x””
MANIFESTAÇÕES: 1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º 13º 14º 15º 16º 17º 18º 19º 20º 21º 22º 23º 24º 25º URTICÁRIA
PRURIDO
RUBOR FACIAL
DISPNÉIA
SIBILOS
TOSSE
FEBRE (indicar T ºC)
TREMORES
NÁUSEAS
DOR ABDOMINAL
ANGIOEDEMA
EDEMA DE GLOTE
ARRITMIA CARDÍACA
HIPOTENSÃO
ARTERIAL
LINFOADENOMEGALIA
MIALGIA
153
NEFRITE
MONONEURITE
CEFALÉIA
VÔMITOS
OUTROS (especificar *):
OUTROS (especificar *):
OUTROS (especificar *):
OUTROS (especificar *):
* Especificar: ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 16 - Observações: ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________
ATENDIMENTO HOSPITALAR DO EVENTO ADVERSO 17- SIM 2- NÃO
18- DATA: ENTRADA: ____/____/_____ SAÍDA: _____/______/_____
19-
EMERGÊNCIA ENFERMARIA
20- HOSPITAL DE ATENDIMENTO:
EVOLUÇÃO DO CASO
21- ÓBITO 22- CURA SEM SEQÜELAS 23- CURA SEM SEQUELAS 24- IGNORADO
SINAIS E SINTOMAS ANTERIORES À SOROTERAPIA (ÚLTIMAS 72 HORAS)
25- FEBRE Tº C: ________
1-SIM 2-NÃO
26- OUTROS (especificar):
27- HÁ QUANTO TEMPO? _____dias ______horas ____ min.
ANTECEDENTES PESSOAIS
154
28- ALERGIAS (medicamentos, etc): SIM NÃO Descrever:_____________________________________________________________________________________________________________
29- IMUNODEFICIÊNCIAS (neoplasias, Aids, etc.):
30- USO CONCOMITANTE DE MEDICAMENTOS (corticóides, etc.):
31- APRESENTOU EVENTOS ADVERSOS EM SOROTERAPIA ANTERIOR ?: SIM NÃO
32 – ESPECIFICAR: ______________________________________________________________________________________________________________________
DADOS DO INVESTIGADOR
34- DATA: 33- INVESTIGADOR:______________________________________________________ ______/______/_______
____________________________________________________ ASSINATURA DO INVESTIGADOR/CARIMBO
Tel p/ contato:_________________________________ E-mail: ______________________________________
155
MANUAL PARA APLICAÇÃO – ANEXO IIIG
O formulário deverá ser preenchido pelo médico responsável pelo acompanhamento ou
profissional de saúde indicado por ele. Os dados serão coletados dos pacientes
voluntários.
Os dados serão coletados durante o tratamento até o 25 º dia após o início da soroterapia. O preenchimento segue os seguintes passos:
1º Passo: Preencher o quadro superior direito com o número de protocolo na pesquisa e
número de prontuário do paciente.
2º Passo: Preencher o módulo de Identificação do Paciente (itens 1 a 8). 3º Passo: Preencher o módulo correspondente aos “Dados Complementares do Caso” (itens 9 a 14). Item “9”: anotar o número total de frascos de soro utilizados no
tratamento. Item “10”: data do início do tratamento.
4º Passo: Preencher o módulo “Eventos Adversos – Reações Precoces (24 horas) e
Tardias” (itens 15 e 16). Marcar com um “X” a interseção da coluna (dia) e linha
(manifestações relatadas). O período de observação vai do 1º ao 25º dia de tratamento,
aplicação do soro liofilizado.
Se necessário relatar outra manifestação encontrada nos espaços “Especificar” e “Observações”. 5º Passo: Preencher o módulo “Atendimento Hospitalar do Evento Adverso” (itens 17 a 20). 6º Passo: Preencher o módulo “Evolução do Caso” (itens 21
a 24). Marcar com um “X” como o caso evoluiu.
7º Passo: Preencher o módulo “Sinais e Sintomas Anteriores à Soroterapia (últimas 72 horas)” (itens 25 a 27). 8º Passo: Preencher o módulo “Antecedentes Pessoais” (itens 28 a 32). 9º Passo: Preencher o módulo “Dados do Investigador” (itens 33 e 34). 10º Passo: Após preenchimento encaminhar para o IBEx
156
ANEXO IV
157
158
159
ANEXO V
FOLHA DE ROSTO - CONEP
160