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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
SILMARA MENDES HOEPERS
AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS DA AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA E
DO EFEITO CICATRIZANTE DO CREME CONTENDO EXTRATO
SECO DAS FOLHAS DE Aleurites moluccana L. WILLD
(EUPHORBIACEAE)
Itajaí (SC)
2014
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
SILMARA MENDES HOEPERS
AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS DA AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA E
DO EFEITO CICATRIZANTE DO CREME CONTENDO EXTRATO
SECO DAS FOLHAS DE Aleurites moluccana L. WILLD
(EUPHORBIACEAE)
Dissertação submetida à Universidade do Vale do
Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profª. Dra. Angélica Garcia Couto
Co-orientadora: Profª. Dra. Kathryn Ana Bortolini
Simão da Silva
Itajaí (SC)
Agosto de 2014
AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS DA AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA E DO EFEITO
CICATRIZANTE DO CREME CONTENDO EXTRATO SECO DAS FOLHAS DE
Aleurites moluccana L. WILLD (EUPHORBIACEAE)
Silmara Mendes Hoepers
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.
____________________________________ Angélica Garcia Couto, Dra.
Orientadora
__________________________________________________________ Tania Mari Bellé Bresolin, Dra.
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
____________________________________
Dra. Angélica Garcia Couto (Univali) Presidente
____________________________________ Dra. Kathryn Ana Bortolini Simão da Silva
(Univali) Co-orientadora
_____________________________________
Dra. Márcia Maria de Souza (Univali) Membro
______________________________________
Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva (Univali) Membro
____________________________________ Dra. Giselle Fazzioni Passos (UFRJ)
Membro
Itajaí (SC), 25 agosto, 2014.
Dedico ao meu esposo Eduardo, sem o qual
não teria conseguido chegar ao fim. Sempre
prestando toda a atenção e o tempo todo
cuidando de mim, era o primeiro a ter a certeza
que tudo daria certo. Sua compreensão e
confiança me fortaleceram. Palavras são
simples de mais para a eterna gratidão e
admiração que tenho por você.
AGRADECIMENTOS
... Um período da minha vida tão intenso e grandioso... acontecimentos e
pessoas jamais esquecidas, ficaram no meu coração...
Primeiramente, a Deus, tão sublime e presente em minha vida, sempre
conduziu tudo para ocorrer no momento certo, mesmo nos momentos mais incertos
que eu não via caminhos, logo Ele me mostrava as pessoas certas para que elas
pudessem ser Seu instrumento.
Aos meus pais, Dilte e Lucimar, que me ensinaram os primeiros e maiores
valores para um ser humano: humildade e amor ao próximo. Meus exemplos de
vida, pessoas as quais tenho extrema gratidão. Ao meu irmão, Luan, sempre me deu
força com suas palavras de carinho e incentivo.
Ao meu esposo, Eduardo, presente de Deus, essa é umas das provas que Ele
faz tudo do melhor modo possível para que o amor se concretize e se renove.
Agradecer com palavras é pouco diante do que você fez por mim desde o primeiro
instante que nos conhecemos. Com você eu aprendo a cada dia as coisas mais
simples e valiosas da vida.
À minha sogra e amiga, Eloisa, da qual tenho muita ternura e respeito.
À minha coordenadora, Juliana, que nunca mediu esforços para me ajudar a
crescer profissionalmente, bem como pessoa, pois você é um dos meus exemplos
de coragem e determinação. À professora Maria Enói, a qual foi coordenadora na
minha graduação e, em todo tempo, acreditou em mim.
Às professoras orientadoras deste estudo: à minha orientadora, professora
Angélica, que a cada conquista minha vibrava comigo, obrigada pela paciência,
dedicação e por conduzir tudo da melhor forma possível; à professora Nara, com o
seu amplo conhecimento na área da farmacologia me fez perceber que eu era capaz
de saber um pouquinho sobre essa área; à professora Kathryn, minha coorientadora,
o que falar dessa pessoa que tanto me ajudou?, tornou-se peça fundamental para a
realização deste trabalho, foi um dos principais alicerces, tenho imensa gratidão por
cada dia juntas no laboratório, idas e vindas de Florianópolis, sua barriguinha, pouco
a pouco, crescendo com o Pedrinho, mesmo assim, firme e forte.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, e, em especial, à coordenadora, professora Tânia, atenciosa nas
dificuldades, pessoa admirável. Às professoras Márcia e Ruth que acompanharam o
meu trabalho e dedicaram seu tempo tão precioso para melhorá-lo. Ao professor
José Roberto que, em toda solicitação, esteve disposto a me ensinar. À professora
Carolina, além de ter me ensinado um pouco do seu profundo conhecimento em
biologia molecular, tornou-se uma amiga.
Aos meus amigos.... nesse período pude descobrir verdadeiras amizades.
À minha amiga Denise Moser e família, lembrarei eternamente todo o carinho
que tiveram por mim, sempre estavam de portas abertas a me esperar e diziam que
a casa era minha, comida servida e cama pronta, era com esse cuidado que me
recebiam. O meu muito obrigada é pouco em relação ao quanto foram importantes
nessa minha caminhada.
À minha amiga Fabiola, sem hesitar me acolhia em sua casa e acordava na
madrugada comigo com um sorriso no rosto me desejando boa sorte.
Aos meus cientistas “maluquinhos”, como eu gosto desses dois..., a dupla
Hugo e Guto: ao Hugo Guilherme, meus sinceros agradecimentos, não tinha dia que
não se colocasse à disposição, sempre torcendo por mim e eu aprendendo muito
com ele; ao Gustavo, meu reconhecimento, sempre que possível me estendeu a
mão.
Às minhas amigas que, de um jeito ou de outro, estiveram presentes: Viviane
Arins, admirável pela dedicação; Liliane Thisen, obrigada pela sua paciência em
passar seu conhecimento; Ana Julia, minha eterna professora, colega do mestrado,
tornou-se uma amiga confidente e de todas as formas buscava me motivar; Gislaine,
solícita em me auxiliar; Juarana, juntas fomos descobrindo um pouco da
farmacologia dos processos inflamatórios; com essas amadas passei dias sem
poder respirar de tanta coisa para fazer, dos quais já sinto saudades – Que tal um
creme de hematoxilina? Tem gente que se apaixonou....
Às minhas colegas de trabalho do Laboratório de Cosmetologia e Estética da
Univali Campus Florianópolis, as quais me davam força para continuar, e, em
especial, a Léia, ajudo-me muito na organização das salas para aulas práticas das
quais sou ministrante, muito zelosa e dedicada.
Às equipes dos laboratórios, em particular, de farmacologia in vitro e da
Secretaria Acadêmica do Programa de Pós-Graduação.
Aos familiares, amigos, colegas de mestrado, alunas do curso de Tecnologia
em Cosmetologia e Estética e Bacharelado em Estética, clientes e a todos que, de
algum modo, puderam colaborar para o alcance dessa conquista.
“Se acredito que posso fazê-lo, provavelmente adquirirei a capacidade para isso, mesmo não a tendo no começo.”
Mahatma Gandhi
AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS DA AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA E DO EFEITO CICATRIZANTE DO CREME CONTENDO EXTRATO
SECO DAS FOLHAS DE Aleurites moluccana L. WILLD (EUPHORBIACEAE)
Silmara Mendes Hoepers Agosto/2014
Orientadora: Profª. Angélica Garcia Couto, Dra. Co-orientadora: Profª. Kathryn Ana Bortolini Simão da Silva, Dra. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas. Número de Páginas: 75 Os mecanismos da inflamação e da cicatrização de feridas cutâneas envolvem a participação de vários mediadores, e tem sido muito estudados, por sua complexidade e relevância para a saúde humana. Estudos pré-clínicos já comprovaram os efeitos anti-inflamatório, cicatrizante tópico e analgésico de preparações farmacêuticas contendo o extrato seco das folhas da A. moluccana (ESF). O objetivo do presente estudo foi avaliar os mecanismos acerca do efeito anti-inflamatório e o do reparo tecidual do creme contendo o ESF da A. moluccana 1%. Como modelo in vivo de inflamação cutânea, utilizou-se o edema de orelha induzido por óleo de cróton (2,5%), em camundongos, bem como a avaliação microscópica desses eventos e os ensaios in vitro para a dosagem dos mediadores pesquisados: o fator de necrose tumoral (TNF), a interleucina-1 β (IL-1β), a quimiocina derivada de queratinócitos (CXCL1/KC) e a migração de neutrófilos por meio da dosagem da enzima mieloperoxidase (MPO). Para avaliação do reparo tecidual, foi utilizado o modelo in vivo de cicatrização de ferida cutânea em camundongos, bem como uma análise microscópica desses eventos. Adicionalmente, para avaliar o grau de irritação cutânea, empregou-se o modelo in vitro de citotoxidade por difusão em gel. O tratamento tópico do creme contendo o ESF resultou em 36% de redução do edema, bem como a redução nos níveis de TNF em 61%, IL-1β em 46%, CXCL1/KC em 62% e MPO em 61%, quando comparados com o grupo controle. No modelo de cicatrização de ferida cutânea, o tratamento com o creme contendo ESF não reduziu o tempo do fechamento das feridas, em relação ao grupo controle, contudo a análise histológica sugere uma melhor reepitelização, considerando um aumento da matriz extracelular e da queratinização na epiderme. O ensaio in vitro no modelo de irritação cutânea resultou em ausência de formação de halo para o creme contendo o ESF. Em conclusão, a atividade anti-inflamatória do creme contendo ESF pode ser comprovada e explicada, em parte, pela redução nos mediadores da inflamação aguda, como as citocinas TNF, IL-1β, a quimiocina KC e pela inibição do influxo de neutrófilos. Em relação a ação cicatrizante do creme contendo ESF 1%, houve uma melhora nos eventos morfológicos. Com esses resultados, pode-se sugerir a aplicação dessa formulação semissólida contendo ESF nas doenças inflamatórias da pele, visto sua ação anti-inflamatória, com melhor reparo tecidual, e segurança comprovada para uso tópico. Palavras-chave: Aleurites moluccana. Inflamação. Cicatrização.
EVALUATION THE MECHANISMS OF ANTI-INFLAMMATORY ACTION AND HEALING EFFECT OF CREAM CONTAINING EXTRACT OF DRY LEAVES OF
Aleurites moluccana L. WILLD (EUPHORBIACEAE)
Silmara Mendes Hoepers
August/2014
Advisor: Profª. Angélica Garcia Couto, Dra. Co-advisor: Profª. Kathryn Ana Bortolini Simão da Silva, Dra. Area of Concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances. Number of Pages: 75 The mechanisms of inflammation and wound healing involve the participation of several mediators, and has been studied for its complexity and relevance to human health. Preclinical studies have demonstrated the anti-inflammatory, analgesic and wound healing effects of pharmaceutical preparations containing dry extract (DE) of A. moluccana leaves. The aim of this study was to evaluate the mechanisms of the anti-inflammatory effect and tissue repair of cream containing 1% DE. As a model of cutaneous inflammation in vivo, ear edema induced by croton oil (2.5%) was used in mice, followed by microscopic evaluation of these events, and in vitro determination of tumor necrosis factor (TNF), interleukin 1- β (IL-1β), the chemokine keratinocyte chemo attractant (CXCL1/KC) and neutrophil infiltration, through the measurement of myeloperoxidase (MPO). As a model of tissue repair, skin wound healing was used in mice followed by microscopic analysis of these events. In addition, the in vitro model of cytotoxicity by gel diffusion was used to assess the degree of irritation. The topical application of cream containing 1% DE resulted in a reduction of 35.6% for ear edema, followed by 60.7% for TNF, 45.8% for IL-1β, 62% for CXCL1/KC and 61% for MPO, when compared with the control group. In the model of cutaneous wound healing, treatment with cream containing 1% DE did not reduce the healing time, compared to the control group, however histological analysis suggests a better reepithelialization, considering the increase of the extracellular matrix and keratinization of the epidermis. The in vitro model of cytotoxicity resulted in the absence of halo formation in all samples containing 1% DE. In conclusion, the antiinflammatory activity of the cream containing 1% DE may be explained, in part, by the reduction in the acute inflammation mediators, such as cytokines TNF, IL-1β, and the chemokine KC inhibition of neutrophil influx. In relation to wound healing action of the cream containing DE 1%, there was an improvement in morphological events. These results may suggest the application of a semisolid formulation containing 1% DE in inflammatory skin diseases, due to its anti-inflammatory action, with improved tissue repair, and its proven safety for topical use. Keywords: Aleurites moluccana. Inflammation. Wound healing.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da pele humana ................................................................
18
Figura 2 Inflorescências, fruto e folha da A. moluccana.................................
34
Figura 3 Influência do pré-tratamento tópico com o creme contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1% sobre o edema de orelha induzido pela administração tópica de óleo de cróton......................
45
Figura 4 Efeito do pré-tratamento tópico do creme contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1% sobre os níveis de citocinas IL-1β (A), TNF (B) e quimiocina CXCL1 (KC) (C) após a indução do edema de orelha induzido pela administração tópica de óleo de cróton................................................................................................
47
Figura 5
Efeito da aplicação tópica do creme contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1% sobre a atividade da enzima mieloperoxidase 6 h após a aplicação de óleo de cróton................................................................................................
50
Figura 6 Avaliação microscópica do pré-tratamento tópico com creme contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1% sobre o edema de orelha induzido pela aplicação tópica de óleo de cróton................................................................................................
53
Figura 7 Efeito do tratamento com o creme contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1% sobre a evolução do fechamento da ferida cutânea em camundongos......................................................
55
Figura 8 Análise macroscópica do reparo tecidual das feridas cutâneas no 6º dia após a incisão.........................................................................
56
Figura 9 Avaliação microscópica da ação do creme contendo extrato seco
das folhas de A. moluccana (1%) sobre o reparo tecidual no modelo de ferida cutânea em camundongos....................................
58
Figura 10 Avaliação do teste de irritação cutânea através do método de citotoxidade por difusão em gel agarose overlay..............................
60
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – ácido araquidônico
ANOVA – Analysis of variance- Análise de variância
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AUC- area under the curve - área sob a curva
BSA – Bovine Serum Albumin
COX, COX-1 e COX-2 – ciclooxigenases, 1 e 2
CXC, CXCL1/KC – Quimiocina derivada de queratinócitos
CXC 2 – receptor de quimiocina
CINC (cytokine-induced neutrophil chemoattractant)
C3a, C5a – anafilatoxinas 3a e 5a
DCs- células dendríticas
DNA – ácido desoxirribonucleico
DMSO – dimetilsulfóxido
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ESF- extrato seco das folhas de Aleurites moluccana
HEPES – tampão de bicarbonato
HETEs - ácidos hidroxieicosatetraenóicos
IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL- 10 – interleucinas
IL-1 Ra – antagonista de receptor de interleucina 1
LTs – leucotrienos
LX - lipoxinas
MIP - macrophage inflammatory protein
MPO – mieloperoxidase
M1 – macrófago pró-inflamatório
M2 – macrófago anti-inflamatório
NF-kB – fator de transcrição nuclear kB
NIH - National Institutes of Health
NO – óxido nítrico
PAF – fator de agregação plaquetária
PBS – Phosphate-buffered saline
PKC – proteína quinase C
PDGF - platelet-derived growth factor
PFA – paraformaldeído
PGs – prostaglandinas
PGD2 – prostaglandina D2
PGE2 – prostaglandina E2
PGF2α – prostaglandina F2α
PLA2 – fosfolipase A2
PMSF - fluoreto de fenilmetilsulfonilo
SFB – soro fetal bovino
TGF-β - fator de transformação de crescimento
TNF – fator de necrose tumoral
TXs – tromboxanos
VEGF - vascular endothelial growth factor
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 16
2.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 16
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 16
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 17
3.1 Características anatomo-fisiológicas da pele ...................................... 17
3.2 Processo inflamatório e reparo tecidual cutâneo ................................ 21
3.3 Fitoterapia e o tratamento de lesões cutâneas .................................... 28
3.3.1 Aleurites moluccana (L.) Willd. (EUPHORBIACEAE) ................................... 32
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 37
4.1 Materiais ................................................................................................... 37
4.1.1 Extrato vegetal e creme ................................................................................. 37
4.1.2 Reagentes e outras soluções ........................................................................ 37
4.1.3 Equipamentos ................................................................................................. 38
4.2 Métodos .................................................................................................... 38
4.2.1 Animais ........................................................................................................... 39
4.2.2 Determinação da atividade da enzima Mieloperoxidase (MPO) ................. 40
4.2.3 Avaliação da ação cicatrizante tópica do creme contendo extrato seco
das folhas da A. moluccana (ESF) 1% ................................................................... 41
4.2.4 Análise histológica ......................................................................................... 42
4.2.5 Ensaio de citotoxidade pela difusão em gel de agarose (Agarose Overlay)
.................................................................................................................................. 43
4.3 Análise Estatística ................................................................................... 44
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 45
5.1 Avaliação da ação anti-inflamatória tópica do creme contendo extrato
seco de A. moluccana (ESF) 1% .................................................................. 45
5.2 Dosagem dos níveis das citocinas IL-1 β e TNF e da quimiocina
CXCL1 (KC) no modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton
......................................................................................................................... 46
5.3 Medida da atividade da enzima Mieloperoxidase (MPO) ..................... 49
5.4 Avaliação microscópica da ação anti-inflamatória tópica do
tratamento com creme contendo extrato seco das folhas de A.
moluccana (ESF) 1% ..................................................................................... 51
5.5 Avaliação da ação cicatrizante do creme contendo extrato seco de A.
moluccana (ESF) 1% ..................................................................................... 54
5.6 Ensaio de citotoxidade pela difusão em gel de agarose (Agarose
Overlay) .......................................................................................................... 59
6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 61
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 62
ANEXO A – PARECER DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS ........... 73
ANEXO B – PARECER DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS ........... 75
14
1 INTRODUÇÃO
Fisiologicamente, a pele é considerada um órgão imunológico ativo, mediado
por células como macrófagos, mastócitos, células T, células de Langerhans entre
outras, bem como regulado por mediadores como citocinas e lipídeos bioativos, que
podem iniciar as respostas imunes e a inflamação controlada, seguido de eficiente
resolução. Entretanto, há possibilidades de ocorrer um processo inflamatório
descontrolado, dificultando a resolução e resultando em quadros patológicos
(KENDALL; NICOLAOU, 2013).
A inflamação e a cicatrização cutânea são temas amplamente estudados nos
dias atuais por sua complexidade e relevância para a saúde humana, haja vista o
número expressivo, de pessoas que sofrem de feridas crônicas, estimado em cerca
de seis milhões no mundo (ALAM; SINGH; SINGH, 2011). A lesão cutânea advém
de diversos processos inflamatórios que ocorrem na pele, decorrentes de
queimaduras, ou doenças de cunho inflamatório como psoríase, dermatite de
contato, dermatite atópica, alérgica e irritativa, acne vulgar, feridas, entre outras
(GITTLER et al., 2012; HAERTEL; WERNER; SCHAFER, 2014; KENDALL;
NICOLAOU, 2013; WAGENER; CARELS; LUNDVIG, 2013).
Na maioria das vezes, as lesões cutâneas tornam-se feridas, que em sua
maioria evoluem normalmente para a cicatrização, caso contrário, as complicações
mais comuns incluem geração de cicatrizes hipertróficas, queloides, contraturas e a
cronificação das feridas agudas (DEALEY, 2008).
Para o tratamento ou atenuação de processos inflamatórios e reparo tecidual
de feridas é comum nos países em desenvolvimento o uso de plantas medicinais,
em sua maioria, embasado na medicina popular. No Brasil, esse emprego tem
recebido o incentivo da Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares
do Sistema Único de Saúde (PNPIC-SUS), a qual integra a Política Nacional de
Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF) (BRASIL, 2006a, 2006b).
Tradicionalmente, a fitoterapia pode ser utilizada no tratamento de feridas por meio
da aplicação tópica de cataplasmas; óleos essenciais, preparados com folhas e
flores; chás ou infusões (BRASIL, 2010). No estudo de Alam, Singh e Singh (2011),
destacam-se algumas plantas com potencial de cicatrização de feridas, como Rubia
cordifolia Linn, Aloe vera Linn, Allium cepa Linn, Carica papaya Linn, entre outras.
15
Aleurites moluccana (L.) Willd pertencente à família Euphobiaceae, conhecida
também como “nogueira-de-iguape” e “noz-da-Índia”, é uma árvore originária da
Índia e adaptada ao Brasil, encontrada desde São Paulo até o Rio Grande do Sul
(CORRÊA, 1984).
Esta planta vem sendo estudada há mais de dez anos pelo grupo de
pesquisadores do Núcleo de Investigações Químico-Farmacêutico (NIQFAR) da
Universidade do Vale do Itajaí (Univali) (CECHINEL-FILHO, 2000; CESCA et al.,
2012). Os estudos iniciaram-se com o isolamento do flavonóide swertisina-2”-O-
ramnosil a partir dos extratos das folhas da A. moluccana (MEYRE-SILVA et al.,
1997; 1998; 1999). As pesquisas na área farmacológica comprovaram a atividade
antinociceptiva de swertisina e de seu derivado swertisina-2”-O-ramnosil no modelo
de hipernocicepção induzida por carragenina quando administrado via oral, sendo
que somente o derivado foi capaz de reduzir a sensibilidade mecânica induzida por
adjuvante completo de Freund (CFA) ou PGE2 (QUINTÃO et al.; 2011).
Com base na ação de alguns constituintes fitoquímicos de A. moluccana,
iniciou-se o desenvolvimento de formas sólidas administrada via oral (CAMARGO et
al., 2010) e semissólidas administrada via tópica contendo o extrato seco de A.
moluccana, a qual demonstrou efeito anti-inflamatório através do modelo de edema
de orelha induzido por óleo de cróton (CESCA, 2012). Os resultados promissores
desses estudos resultaram no depósito de uma patente, em parceria com o
Laboratório Farmacêutica Eurofarma (EUROFARMA, 2008).
Cesca e colaboradores (2012) demonstraram a ação anti-inflamatória tópica
do extrato seco das folhas da A. moluccana, em creme através da redução do
edema de orelha induzido por óleo de cróton, em camundongos, e a ação
cicatrizante avaliada pela redução do tempo de fechamento da ferida em ratos.
A julgar por sua ação farmacológica comprovada, a presente pesquisa teve
por objetivo investigar os possíveis mecanismos da ação anti-inflamatória do creme
contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1%, por meio dos níveis de
mediadores inflamatórios e das alterações morfológicas a respeito desta ação.
Adicionalmente, este estudo se propôs a avaliar o efeito cicatrizante do mesmo
creme, bem como a análise histológica das feridas, ao final da cicatrização,
buscando uma melhor compreensão em nível microscópico, dos eventos
relacionados a reparação tecidual.
16
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Investigar os possíveis mecanismos envolvidos na ação anti-inflamatória e no
efeito cicatrizante do creme contendo extrato seco das folhas de Aleurites
moluccana 1%, bem como as alterações morfológicas dessas ações.
2.2 Objetivos Específicos
- Comprovar a ação anti-inflamatória do creme contendo extrato seco das
folhas de A. moluccana a 1% (ESF), através do modelo de edema de orelha
induzido por óleo de cróton em camundongos, bem como as alterações morfológicas
a respeito deste efeito;
- Investigar a ação do creme contendo ESF sobre mediadores inflamatórios
como o fator de necrose tumoral (TNF), a interleucina-1 β (IL-1β), a quimiocina
derivada de queratinócitos (KC), bem como o influxo de neutrófilos através da
dosagem da enzima mieloperoxidase (MPO) através de ensaios bioquímicos no
modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton;
- Avaliar o efeito do creme contendo ESF sobre a cicatrização cutânea em
camundongos, mediante a determinação do tempo de cicatrização das feridas e sua
análise histológica no período final da cicatrização;
- Determinar o grau de irritação cutânea do creme contendo ESF em células
de fibroblastos (L929) através do modelo de citotoxidade por difusão em gel
(agarose overlay).
17
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Características anatomo-fisiológicas da pele
Uma das funções mais importantes da pele, o maior órgão do corpo, é
proporcionar a ele uma barreira protetora entre o meio interno e externo. Este órgão
é amplamente estudado como via de permeação tópica, em decorrência da elevada
ocorrência de doenças e problemas de pele (FIEL; PAESE; GUTERRES, 2009).
Grande parte das pesquisas que estudam patologias cutâneas em prol do
tratamento e da cura utilizam modelos animais que se assemelham com a pele
humana. Processos inflamatórios cutâneos e de cicatrização são reproduzidos na
maioria das vezes em camundongos e ratos (BOLLER et al., 2010; GAUTAM et al.,
2014; KIM et al., 2014; UPADHYAY et al., 2014).
A estrutura da pele de um camundongo e da pele humana possuem algumas
características em comum. Conforme demonstrado na figura 1, pode-se observar
que ambas são compostas por três estratos principais, a epiderme, derme e
hipoderme, possuem células de defesas, vasos sanguíneos entre outros. Diferenças
significativas também são encontradas, como uma epiderme mais fina e mais
folículos pilosos na pele de camundongo, o que pode facilitar a permeação e a
absorção de bioativos (PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014).
A pele humana é constituída por três camadas, compostas pela epiderme,
derme e hipoderme (Figura 1). No geral, as camadas da pele formam o tecido
tegumentar, acrescida dos seus anexos tais como glândulas sudoríparas e
sebáceas, receptores sensoriais, pelos e unhas (GERSON et al., 2011).
A epiderme apresenta-se com sua estrutura estratificada, composta por
aproximadamente 95% de camadas de queratinócitos e 5% por melanócitos e
células de Langerhans, as quais desempenham função imunológica, e células de
Merkel, responsáveis pela percepção sensorial ao tato (PÓVOA; DINIZ, 2011). A
formação da epiderme compreende o estrato córneo, estrato granuloso, estrato
espinhoso e camada basal (Figura 1). Os queratinócitos são considerados o tipo
celular mais numeroso presente neste epitélio (PASPARAKIS; HAASE; NESTLE,
2014), aos quais se atribui importante função na resposta imunitária da pele, além
de formar e renovar o epitélio (AINSWORTH, 2013).
18
Figura 1 – Estrutura da pele animal e humana
Fonte: Adaptado de PASPARAKIS; HAASE; NESTLE (2014)
Juntamente com os queratinócitos, que desempenham uma função muito
relevante para o início da resposta inflamatória, como a liberação de mediadores
pró-inflamatórios como a quimiocina derivada de queratinócitos (KC) (TIAN et al.,
2013), estão presentes também os lipídios compostos por três classes: ceramidas,
colesterol e ácidos graxos livres (MOJUMDAR et al, 2014). Muitos dos lipídeos
presentes na pele possuem propriedades antimicrobianas (KENDALL; NICOLLAOU,
2013).
Em razão dos queratinócitos se localizarem entre a camada mais externa da
pele e o ambiente extra corpóreo, eles recebem sinais do meio externo os quais são
transmitidos para as células do sistema imunológico da pele, por meio da expressão
de receptores e produção de citocinas e quimiocinas, incluindo a interleucina 1 (IL-
1), interleucina 10 (IL-10) e o fator de necrose tumoral (TNF) (PASPARAKIS;
HAASE; NESTLE, 2014).
A derme é rica em matriz extracelular, caracterizada pela presença de vasos
sanguíneos e linfáticos, folículos pilosos, glândulas sudoríparas e sebáceas,
fibroblastos, fibras de colágeno e elastina, estruturas sensoriais e células do sistema
imunológico, como as de Langerhans (Figura 1). Quando ocorre uma lesão cutânea,
19
os neutrófilos, células T e mastócitos migram para a derme quando ativados e
liberam histamina, que atua no processo inicial da inflamação (AINSWORTH, 2013;
KENDALL; NICOLAOU, 2013; PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014). Os
macrófagos residuais na derme regulam o equilíbrio da pele através do processo de
fagocitose de microrganismos e de restos celulares, sendo considerados como
sentinelas, pois respondem a alterações fisiológicas assim como patológicas
(WYNN; CHAWLA; POLLARD, 2013).
A derme é uma camada de tecido conjuntivo e representa um elemento de
sustentação e nutrição da epiderme e de seus anexos, tais como os pelos, as unhas
e as glândulas sudoríparas e sebáceas. É constituída, de forma ordenada, por
colágeno, elastina, glicosaminoglicanas e glicoproteínas, formadores da matriz
extracelular (MEC) (SCOTTI; VELASCO, 2003).
De acordo com Kendall e Nicolaou (2013) os lipídios são de extrema
importância para a manutenção da barreira cutânea e impedimento da perda de
água. Os mesmo autores citam ainda que em doenças inflamatórias da pele, como
dermatite atópica, os níveis de ácido linoleico e de ceramida se encontram inferiores
quando comparados a um indivíduo saudável.
A formação dérmica ocorre por fibroblastos, dendrócitos dérmicos,
mastócitos, macrófagos e linfócitos. A derme divide-se em duas porções: a mais fina,
conhecida como derme papilar, situada na parte superior, prendendo a derme à
epiderme, composta por colágeno frouxamente entrelaçado. Já na parte inferior,
mais espessa, está a derme reticular, de mesmo modo formado por colágeno, com a
diferença de possuir feixes mais grossos e que se dispõem no sentido horizontal à
superfície (GAWKRODGER, 2002). Além disso, nas microfibrilas de colágeno
dérmico são reconhecidas moléculas de tropocolágeno do tipo I e do tipo III
(BERNARD, 2000).
Por desempenhar o papel de barreira protetora do organismo, como qualquer
outro órgão, a pele é passível de ser atingida por fenômenos patológicos. Os
estados patológicos cutâneos mais comuns advêm de diversos processos
inflamatórios, decorrentes de queimaduras, psoríase, dermatite de contato, dermatite
atópica, alérgica e irritativa, acne vulgar, feridas, entre outras patologias
inflamatórias (GITTLER et al., 2012; HAERTEL; WERNER; SCHAFER, 2014;
KENDALL; NICOLAOU, 2013; WAGENER; CARELS; LUNDVIG, 2013).
20
Os quadros de inflamação cutânea aguda e/ou crônica semelhantes às
patologias citadas acima, quando produzidos em animais a fim da busca por novas
alternativas para o tratamento, são em sua maioria, realizadas em peles de
camundongos. Para o desenvolvimento de um quadro patológico cutâneo como a
dermatite, é comum utilizar o agente flogístico óleo de cróton aplicado na orelha do
animal. Imediatamente inicia-se um processo inflamatório agudo, ativando várias
vias de sinalização, como por exemplo a do ácido araquidônico, desencadeando
diversas cascatas do processo inflamatório (CABRINI et al, 2011; CALIXTO et al.,
2003; FABRI et al., 2013).
Na dermatite de contato irritante, ocorre uma resposta inflamatória aguda da
pele decorrente a vários estímulos externos, os quais causam danos a barreira da
pele, resultando a ativação do sistema imunológico inato com suas alterações
celulares juntamente com a produção de citocinas pró-inflamatórias como,
interleucina 1 alfa (IL-1α), interleucinas 1 beta (IL-1β) e do fator de necrose tumoral
(TNF) entre outras (LEE; STIEGER; KAKEDA, 2013).
Já a dermatite atópica, também é uma patologia cutânea, porém apresenta-se
como uma inflamação crônica, caracterizada por hiperatividade do sistema imune,
iniciando-se na infância. Nesta reação patológica também estão envolvidas as
citocinas como a IL-1β e TNF, encontradas em níveis elevados (NUTAN; KANWAR;
PARSAD, 2012).
No caso das lesões cutâneas, quando os estratos cutâneos são avaliados
microscopicamente, aparecem alterações na pele como aumento da espessura da
derme e aumento de infiltrados celulares (SAMPAIO; RIVITTI, 2008).
Em razão das constantes agressões que podem atingir a pele, como as
patologias já citadas, e com o auxilio do progresso tecnológico, pesquisas são
desenvolvidas com o propósito da cura de lesões cutâneas com atenção especial
para o processo reparo do tecido.
No caso das lesões cutâneas, quando os estratos cutâneos são avaliados
microscopicamente, aparecem alterações como aumento da espessura e aumento
de infiltrados celulares (SAMPAIO; RIVITTI, 2008).
Em razão das constantes agressões que podem atingir a pele, como as
patologias já citadas, e com o auxilio do progresso tecnológico, pesquisas são
desenvolvidas com o propósito da cura de lesões cutâneas com atenção especial
para o processo de cicatrização tecidual.
21
Os fármacos utilizados para tratamentos de lesões cutâneas devem conter
características específicas que permitem melhor a penetração e absorção cutânea,
como baixo peso molecular, coeficiente de partição óleo/água além da sua interação
com a forma farmacêutica a ser utilizada. Além disso, devem ser compatíveis com as
características fisiológicas envolvidas com a própria via de administração, como
espessura da pele, irrigação sanguínea local, grau de hidratação, assepsia local,
concentração de lipídios e número de folículos pilosos (SILVA et al., 2010;
WOKOVICH et al., 2006).
Atualmente, um dos tratamentos mais utilizados para quadros inflamatórios,
principalmente crônicos, são os anti-inflamatórios corticosteroides (SALIM;
KUMOLOSASI; JANTAN, 2014). Estes desempenham um bom efeito, entretanto,
junto com a redução do número de células inflamatórias nos tempos iniciais, esta
classe de fármacos desencadeia diversos efeitos secundários, entre eles, o que
pode levar a diminuição da resistência da cicatriz e baixa densidade do colágeno
total, conforme relatados em experimentos realizado com ratos (TENIUS; BIONDO-
SIMÕES; IOSHII, 2007). Por esses motivos, uma das alternativas de tratamentos
anti-inflamatórios são os medicamentos fitoterápicos.
3.2 Processo inflamatório e reparo tecidual cutâneo
A pele está constantemente exposta a agressões do meio externo as quais na
sua maioria podem causar lesões ao tecido. Por conseguinte, o sistema imunológico
cutâneo responde ao estímulo agressor e desencadeia uma resposta inflamatória do
organismo, a fim de reestabelecer a estrutura e a função do tecido, sendo este
regulado por mediadores tais como citocinas e lipídios bioativos (GILROY, 2010;
KENDALL; NICOLAOU, 2013).
Após lesão, iniciam-se imediatamente três fases compreendidas em
coagulação do sangue e inflamação, formação de um novo tecido através da
reepitelização e formação de tecido granuloso, e por fim, a remodelação do tecido
(HAERTEL; WERNER; SCHAFER, 2014; PILLAI et al., 2010).
Estímulos externos à pele humana desencadeiam respostas a partir de
queratinócitos, ao produzirem mediadores como a IL-1α, com subsequente estímulo
de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas, tais como a IL-1 β, o TNF, interleucina-
22
6 (IL-6), a interleucina CXCL8 (IL-8) e ativação dos fibroblastos para liberar outros
mediadores tais como a quimiocina KC (LEE et al., 2013; WILMER, 1994).
Logo após a lesão no tecido há outros eventos que são decorrentes da
resposta inflamatória inata, os quais têm a função de restaurar o tecido lesionado.
Na resposta inflamatória aguda desenvolvem-se inúmeros eventos, como: o
extravasamento de líquido plasmático, ativação de células endoteliais, adesão ao
endotélio vascular e recrutamento de leucócitos, ativação de macrófagos teciduais,
ativação e agregação de plaquetas, ativação do sistema complemento, coagulação e
sistemas fibrinolíticos e liberação de oxidantes e proteases de células fagocitárias.
Todos esses eventos mencionados são gerados a fim de promover a reparação
tecidual atuando de uma forma orquestral em prol da homeostasia do tecido
lesionado. Ressalta-se que o momento de inflamação aguda é marcado pela adesão
de neutrófilos ao endotélio vascular (WARD, 2010).
Mudanças na superfície do endotélio causadas por mediadores inflamatórios
como histamina, leucotrienos e citocinas derivados de células como basófilos,
mastócitos e macrófagos, ao se depararem com alguma agressão, resultam no
recrutamento de neutrófilos (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
A presença de neutrófilos é de extrema importância para a defesa do
organismo, possui a função de fagocitar, destruir e degradar qualquer agente
agressor através de suas enzimas proteolíticas e espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio, porém ao se intensificar esse fluxo, essas enzimas podem causar danos
no tecido. Dessa forma, ressalta-se a necessidade de um equilíbrio na migração de
neutrófilos para o sítio da lesão, sendo esse, umas das estratégias dos agentes anti-
inflamatórios (DOMICIANO et al., 2013; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
Os neutrófilos são considerados os principais agentes da inflamação aguda
com ação pró-inflamatória como no recrutamento de células e ação anti-inflamatória,
como na remoção de células ou microrganismos. No recrutamento de neutrófilos
além de mudanças no endotélio e da ação das moléculas de adesão, estão
envolvidas também as citocinas pró-inflamatórias como IL-1β e TNF e a quimiocina
KC. A transmigração do vaso sanguíneo para a infiltração no local lesionado leva
aproximadamente 20 minutos (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013; VIEIRA; LEMOS;
CUNHA, 2009).
Para verificar a presença de neutrófilos no tecido lesionado, muito estudos
têm realizado ensaios bioquímicos que avaliam, de forma indireta, o nível de
23
mieloperoxidase (MPO) no sítio da lesão, uma das enzimas presentes em seus
grânulos azurófilos (BAUMGARTNER et al., 2011; DOMICIANO et al., 2013; FABRI
et al., 2013; ZANUSSO-JUNIOR et al., 2011).
Quando ocorre estímulo pró-inflamatório, os fagócitos mononucleares, ou
monócitos circulantes no sangue, são recrutados para o local lesionado
diferenciando-se em macrófagos, dessa forma classificado macrófagos ativos, os
quais atuam como um mediador pró-inflamatório. Outra classificação funcional do
macrófago é referente as classificações binárias relacionada a estados inflamatórios,
sendo considerados os macrófagos ativos e os macrófagos altamente ativos e os
macrófagos M1 e M2. Os basófilos secretam IL-4, a qual estimula a diferenciação de
macrófagos M1 pró-inflamatórios para macrófago M2 anti-inflamatório
(PASPARAKIS; HSASE; NESTLE, 2014; WILLENBORG; EMING, 2014; WYNN;
CHAWLA; POLLARD, 2013).
Os eventos ocorridos de imediato no tecido são regulados pela liberação
sequencial de mediadores vasoativos e quimiotáticos que correspondem aos sinais
cardinais da inflamação como calor, rubor, edema e dor, os quais foram
apresentados há mais de 2000 anos por Celsus, sendo que Virchow acrescentou no
século passado a perda da função (FECCHIO et al., 2010). Esses eventos são
desencadeados pela vasodilatação e consequente aumento do fluxo sanguíneo no
local inflamado, juntamente com o aumento da permeabilidade microvascular, sendo
este o resultado da perda de fluido e proteínas do plasma (LAWRENCE;
WILLOUGHBY; GILROY, 2002).
A vasodilatação e o aumento da permeabilidade vascular ocorrem através da
ação de mediadores vasoativos como a histamina, serotonina, cininas (bradicinina),
as anafilatoxinas C3a e C5a, óxido nítrico (NO), fator de agregação plaquetária
(PAF) e prostaglandinas (PGs), os quais tem capacidade de interagir com a parede
vascular. Juntamente com o aumento da permeabilidade vascular há o recrutamento
de neutrófilos para o local do sítio inflamatório, através da ação quimiotática da
anafilatoxina C5a e das citocinas IL-1β e TNF (WARD, 2010).
Para estabelecer o equilíbrio das ações pró-inflamatórias e anti-inflamatórias
além dos macrófagos há outras células que possuem um papel muito importante
nesta regulação como os basófilos, mastócitos e células dendríticas (DCs). Os
mastócitos segregam IL-2 e as DCs segregam IL-10, facilitando a regulação de
células T. Em contrapartida, os mastócitos podem liberar pré-formadores de TNF,
24
que estimularão a liberação de IL-1 pró-inflamatória por macrófagos M1
(PASPARAKIS; HSASE; NESTLE, 2014).
A IL-1 é uma citocina inflamatória que desempenha um papel central na
resposta imune inata. Suas respostas biológicas pró-inflamatórias são mediadas
pelos seus membros clássicos IL-1α e IL-1β através da ativação do receptor tipo I de
IL-1, expresso em quase todos os tipos celulares. Já a sua ação anti-inflamatória
ocorre a partir do receptor IL-1 (IL-1 Ra) que tem a capacidade de se ligar a IL-1 do
receptor tipo I, dessa forma, evitando a ligação das moléculas IL-1α e IL-1β. Esta
citocina desenvolve respostas locais e sistêmicas, como sensibilidade à dor, febre,
vasodilatação e hipotensão. Possui ainda ação sobre a adesão de células
endoteliais, o que permite a infiltração de células inflamatórias e imunocompetentes
para os tecidos lesionados (NUTAN; KANWAR; PARSAD, 2012).
Lee e colaboradores (2013) complementam que a ativação da IL-1α é para
posteriormente estimular a produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β, TNF,
IL-6 e CXCL8 (IL-8). A IL-1α é constitutiva e a IL-1β é secretada como um precursor
biológico inativo, normalmente presentes nos queratinócitos. De acordo com
Stamatas e colaboradores (2013), os queratinócitos desempenham significativa
atividade imunológica, secretando citocinas e mediadores pro-inflamatórios como IL-
1α, IL-6, IL-10 e TNF.
As interleucinas IL-1β, IL-1α, IL-6 e IL-8 e o TNF são citocinas pró-
inflamatórias que apesar de serem proteínas transcritas a partir de genes diferentes,
desempenham funções essenciais na inflamação aguda, como o TNF que em
muitas doenças auto-imunes, induz a secreção de outras citocinas pró-inflamatórias
(SALIM; KUMOLOSASI; JANTAN, 2014). A produção dessas citocinas por TNF
juntamente com as células T prolongam a inflamação na pele (LEE et al., 2013).
O TNF é considerado uma importante citocina presente na inflamação de
pele, entretanto, com seus mecanismos de ação ainda são pouco entendidos. O
efeito do TNF é mediado por via de ativação de fatores de transcrição, como o fator
de transcrição nuclear-kB (NF-kB) sendo esta uma via de sinalização fundamental
para o processo inflamatório de pele. A ativação de NF-kB pode ser desencadeada
de diversas formas, como por exemplo: stress oxidativo, citocinas como IL-1 e TNF e
danos ao DNA (LEE et al., 2013; PASPARAKIS, HAASE; NESTLE, 2014).
As quimiocinas são proteínas pequenas de baixo peso molecular que fazem
parte de uma família de citocinas quimiotáticas. De acordo com suas características
25
estruturais, são divididas em subfamílias chamadas de CXC, CC e CX. As
quimiocinas CXC atuam na quimiotaxia de neutrófilos através da adesão às células
endoteliais e estão presentes também no processo de angiogênese (FU et al., 2005;
LAING; SECOMBES, 2004).
A interação celular das quimiocinas se dá através do receptor acoplado à
proteína G, o que facilita a interação do receptor de células de suporte de quimiocina
com moléculas de adesão endoteliais, induzindo a estimulação à adesão e a
diapedese, permitindo o recrutamento de células até o tecido lesionado. As
quimiocinas CXC em humanos são pertencentes à família de IL-8, porém esta não é
detectada em rato, neste caso, a IL-8 é aceita como a quimiocina CINC (cytokine-
induced neutrophil chemoattractant) (FU et al., 2005; KNOTT et al., 2001; LAING;
SECOMBES, 2004; ZAJA-MILATOVIC; RICHMOND, 2008). Fan e colaboradores
(2007) descreveram que até aquele momento havia somente um receptor de IL-8
identificado e caracterizado em rato, encontrado por grande afinidade para ligação
de KC e de MIP-2.
Durante o processo inflamatório, de epitelização e de angiogênese há a
participação de quimiocinas como a CXCL1/KC, sendo essa, comumente expressa
por queratinócitos, sendo que nos processos inflamatórios pode ser induzida por IL-1
e TNF (ZAJA-MILATOVIC; RICHMOND, 2008).
Além das quimiocinas, derivadas de queratinócitos, e as citocinas derivadas
de monócito/macrófagos, os quais são as primeiras células que aparecem no local
da inflamação, existem também outros mediadores inflamatórios derivados dessas
células, chamados de eicosanoides. Esses mediadores são liberados a partir de
fosfolipídios da membrana. Os fosfolipídios da membrana contém ácidos graxos
incluindo o ácido araquidônico, o qual é o substrato predominante para a síntese dos
eicosanoides. Os ácidos graxos são fundamentais para a proteção da barreira
cutânea. O ácido araquidônico pode ser mobilizado por várias enzimas fosfolipases,
sendo a fosfolipase citosólica A2 fundamental para a produção dos eicosanoides. Os
eicosanoides incluem as prostaglandinas (PGs), os tromboxanos (TXs), leucotrienos
(LTs), ácidos hidroxieicosatetraenóicos (HETEs) e as lipoxinas (LX) (CALDER, 2006;
KENDALL; NICOLAOU, 2013).
Na maioria das vezes, os eicosanoides são produzidos em baixa
concentração, atuando de forma fundamental na fisiologia da pele e na homeostasia.
Quando passam a ser produzidos em altos níveis podem mediar a proliferação
26
celular e a inflamação. Os eicosanoides imunomoduladores regulam a ativação das
células T que são fundamentais para determinar o tipo de resposta imunitária ao
local lesionado (KEDALL; NICOLAOU, 2013). Os derivados do ácido araquidônico
como a prostaglandina E (PGE2) são pró-inflamatórios, sendo esta produzida por
queratinócitos e fibroblastos e auxiliando na vasodilatação (NICOLAOU;
PILKINGTON; RHODES, 2011).
As prostaglandinas tem sua síntese iniciada pela via da ciclooxigenase,
mediada pelo metabolismo do ácido araquidônico (BREYER et al., 2001). As
enzimas ciclooxigenases (COX) possuem três isoformas, a COX-1 expressa
constitutivamente, COX-2 induzida para dar origem aos prostanoides, tromboxanos
e prostaciclinas e COX-3, considerada uma variante da COX-1 é detectada
principalmente no sistema nervoso central (BURDAN; CHALAS; SZUMITO, 2006;
KENDALL; NICOLAOU, 2013; SIMMONS, 2003). Segundo Glezer e colaboradores
(2000), a enzima COX-2 pode ser produzida através do seu gene que sofre
regulação pelo fator de transcrição NF-kB.
Após a cascata de eventos que conduzem a inflamação aguda, algumas
células e mediadores permanecem para a fase de resolução, como células do
sistema imunológico e algumas citocinas, entre elas o TNF, o fator de transformação
de crescimento (TGF-β) e IL-10, muito embora, o mecanismo que controla a
resolução da inflamação aguda ainda não está integralmente descrito (ZHANG et al.,
2013).
Outro grupo de células que está presentes nas duas fases do processo
inflamatório são os macrófagos. O macrófago M1 tem seus efeitos como pró-
inflamatório e o macrófago M2 tem um papel essencial na resolução da inflamação
de pele, atuando na eliminação de detritos, na angiogênese e na resolução da
inflamação. Eles secretam IL-10 e TGF-β, fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF) o qual facilita o crescimento de vasos linfáticos para a eliminação no caso
de antígenos (PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014; WILLENBORG; EMING,
2014).
O VEGF é um mediador potente da angiogênese, secretado principalmente
por queratinócitos, o qual estimula a migração e a proliferação de células endoteliais,
facilitando a permeabilidade vascular (LEE et al., 2013).
Na fase final de resolução do processo inflamatório, tem-se como um evento
muito importante, a presença dos fatores de crescimento, como o VEGF e o fator de
27
crescimento derivado das plaquetas (PDGF), que atuam na proliferação de
fibroblastos e na produção da matriz extracelular; o fator de crescimento
transformador alfa (TGF-α), que atua na proliferação celular, na angiogênese e
estimula a epitelização; e o TGF-β derivado de plaquetas, responsável pelo aumento
da síntese matricial, atuando na formação do tecido granuloso (CAMPOS; BORGES-
BRANDO; GROTH, 2007).
Macrófagos, queratinócitos e fibroblastos são considerados as células mais
importantes para a regeneração dérmica. Macrófagos M2 secretam TGF-β que
estimula a migração e proliferação de fibroblastos ,os quais produzem colágeno tipo
I para auxiliar na formação do tecido conjuntivo (HERGERT et al., 2013). A pele
íntegra contém aproximadamente 80% de colágeno tipo I e 20% colágeno tipo III,
que pode aumentar em até 40%. Os macrófagos são considerados as células mais
importantes, pois desenvolvem um papel fundamental no término das atividades de
defesa iniciada pelos neutrófilos, contribuindo para a transição para a fase
proliferativa (CAMPOS; BORGES-BRANDO; GROTH, 2007).
Na reepitelização, os queratinócitos constituem duas zonas de múltiplas
camadas: o epitélio cornificado, que atua como uma barreira contra o meio externo,
e na borda da ferida o epitélio hiperproliferativo. Sequencialmente, os processos de
angiogênese juntamente com macrófagos e fibroblastos formam o tecido granuloso
para a reparação da derme. Por fim, a fase de remodelação consiste na restauração
da barreira epitelial, onde células de colágeno são depositadas no leito da lesão
(LEBLANC et al., 2011).
A fase de remodelamento ou maturação pode durar entre 21 dias a 2 anos,
até que o tecido tenha recuperado aproximadamente 80% de sua resistência
original. Quando a lesão se dá a partir de uma ferida cutânea, tem-se a cicatrização
por primeira intenção, a qual abrange as feridas cirúrgicas agudas, que cicatrizam
pela aproximação das bordas da pele, tendo menor risco de infecção. Em alguns
casos pode haver a cicatrização por segunda intenção, como nas feridas crônicas
que não possuem aproximação das bordas da pele, tendo maior risco de infecção e
um período prolongado de cicatrização (HESS, 2002).
Salienta-se que a reparação de feridas é um dos processos biológicos mais
complexos que ocorrem no corpo humano. Trata-se de um processo dinâmico que
pode variar de meses a anos. Nas feridas agudas, eventos bioquímicos e celulares
28
complexos são desencadeados em prol de sua cura e ocorrem em três fases que se
sobrepõe para obter a cicatrização (AGHA et al., 2011).
Essas fases de forma geral são divididas em etapas como: inflamatória;
proliferativa e de maturação/remodelamento (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005;
CAMPOS; BORGES-BRANDO; GROTH, 2007).
Visto que o processo inflamatório compreende na primeira fase da
cicatrização, há estudos que avaliam a ocorrência de possíveis alterações nessa
fase, como por exemplo a sua diminuição ou o seu prolongamento, interferindo no
processo de cicatrização. Oliveira e colaboradores (2014) investigaram os efeitos do
óleo essencial de Lippia sidoides na pele intacta e danificada, verificando que em
aplicações contínuas o óleo aumentou a resposta inflamatória, mas não atrasou a
cicatrização.
A fase proliferativa no tecido lesionado é constituída por etapas fundamentais
que consistem em epitelização, angiogênese, formação do tecido de granulação e
deposição de colágeno, tendo início próximo ao 4º dia após a lesão (CAMPOS;
BORGES-BRANDO; GROTH, 2007).
Para alcançar o reparo tecidual, cada fase consiste em perfeita e coordenada
cascata de eventos, os quais são interdependentes de forma cronológica pré-
definida (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005; CAMPOS; BORGES-BRANDO;
GROTH, 2007).
Portanto, a cicatrização de feridas cutâneas é um processo complexo e para
que ocorrer o fechamento da ferida, é necessário que haja a formação do tecido de
granulação na derme e reepitelização da epiderme, processo em que os fibroblastos
e queratinócitos desempenham papeis fundamentais. Em suma, a cicatrização é o
resultado de interações das ações entre citocinas, fatores de crescimento no
sangue, elementos celulares e a matriz extracelular (DORAI, 2012).
3.3 Fitoterapia e o tratamento de lesões cutâneas
No reino vegetal o homem tem encontrado recursos para sua alimentação e
para tratamentos de suas enfermidades, especialmente a partir do uso de plantas
medicinais. Durante a história das civilizações, foi-se constatando e consolidando
informações sobre o uso terapêutico dessas plantas. Os primeiros relatos sobre o
uso de plantas medicinais pelo homem ocorreram na Mesopotâmia. Em 2600 a.C. já
29
se mencionava o uso dos óleos de cedro (Cedrus sp.) e o alcaçuz (Glycyrrhiza
glabra), os quais são muito utilizados nos dias atuais para tratamento de infecção
parasitária, inflamação e resfriados (LEITE, 2009).
Os povos primitivos identificaram algumas plantas com potenciais
terapêuticos, utilizando-as para fins medicinais. Extraiam sucos, secavam as folhas e
raízes, trituravam sementes, e com essa prática durante muito tempo, obtiveram
conhecimentos os quais agregados à intuição, e ao empirismo usufruíam do grande
manancial de recursos terapêuticos oferecidos pela natureza (PEREIRA; BERTONI,
2008).
Há no Brasil em torno de 120.000 espécies de plantas superiores, muitas
dessas usadas pelos indígenas como remédio para curar doenças (FERRO, 2008).
Para Alam, Singh e Singh (2011), nos países desenvolvidos, 25% dos
medicamentos se baseiam em plantas e seus derivados. Durante muito tempo, o
conhecimento popular foi o alicerce para o uso empírico de plantas medicinais
contra diversas doenças, porém, na atualidade, a fitoterapia está sendo cada vez
mais estudada e apoiada nos aspectos da qualidade, da eficácia e da segurança
(CUNHA; SILVA; ROQUE, 2003).
Vale salientar que o aumento da procura pela fitoterapia é atribuído a fatores
como o menor custo ao consumidor. Porém, o aumento na oferta de medicamentos
fitoterápicos, depende, sobretudo de investimento em pesquisas dedicadas à
confirmação de eficácia e segurança através estudos pré-clínicos e clínicos, o que
nem sempre se traduz em menor custo para as empresas farmacêuticas
(MALHEIROS et al., 2010).
Os estudos com plantas medicinais são de grande relevância, pois
representam novas possibilidades de intervenções terapêuticas, com menos efeitos
colaterais, e contribuem para a validação do conhecimento popular. Nesse âmbito,
são realizados testes para a identificação de novas moléculas-protótipo, assim como
para a produção de medicamentos fitoterápicos (SALIM; KUMOLOSASI; JANTAN,
2014; SCHENKEL; GOSMANN; PETROVICK et al., 2010)
Para o desenvolvimento de fitoterápicos até o seu registro e produção para a
comercialização, acrescentam-se os estudos prévios, tais como estudos botânicos
para identificação da espécie, estudos agronômicos que visam à produção
abundante da matéria-prima, estudos químicos realizados por etapas de isolamento,
elucidação estrutural e identificação de constituintes, estudos de atividade
30
farmacológica e toxicológica das substâncias isoladas de frações ou extratos e
estudos de desenvolvimento de metodologias analíticas para avaliação da qualidade
(SCHENKEL; GOSMANN; PETROVICK, 2010; SCHULZ; HANSEL; TYLER, 2002;
SIMÕES, 2007).
Os medicamentos fitoterápicos podem ser comercializados na forma líquida –
extrato fluido, tinturas, sucos, alcoolatos; sólida – pós, granulados, cápsulas e
comprimidos e na forma semissólida – pomadas, géis, cremes e loções, atentando-
se para a padronização dos extratos como quesito fundamental para a sua
qualidade (COUTO; VITORINO; SILVA, 2010).
Para que os princípios ativos pertencentes à planta medicinal tenham o efeito
esperado após sua absorção e distribuição pelo organismo, deve ser realizada a
escolha correta da forma farmacêutica e da via de administração, garantindo, assim
tal efeito almejado. Na formulação, outro ponto avaliado é a escolha do veículo, já
que interfere na ação do extrato, podendo fazer com que o ativo tenha maior ou
menor permeação nos tecidos (FERREIRA; LEITE, 2009).
As formas farmacêuticas semissólidas são indicadas para uso externo,
todavia, o tipo de emulsão, a organização do sistema, micro ou nanoemulsionado,
lipossomado e fatores de formulação, que incluem os promotores de penetração ou
absorção, agentes de oclusão, entre outros, são parâmetros fundamentais a serem
considerados para melhor aplicabilidade do produto em consonância com as
características da superfície lesionada (SILVA, 2010).
Os fármacos específicos para tratamentos de alterações e/ou lesões cutâneas
são destinados à ação tópica, sem absorção sistêmica, diferentemente das
preparações conhecidas como transdérmicas, na qual o fármaco é encaminhado
para absorção transcutânea, passando pela epiderme, estendendo-se à corrente
sanguínea e chegando até o tecido-alvo (FERREIRA; LEITE, 2009; NETZ, 2010).
A ação local de fármacos através de aplicação tópica depende da penetração
dos ativos pelas camadas da pele, sendo que o estrato córneo é a principal barreira
de fármacos e outras substâncias exógenas, seguido dos outros estratos da
epiderme e a derme. No entanto, se a derme for bem vascularizada, os fármacos
que atravessam o estrato córneo e a epiderme, ao chegarem aos capilares
sanguíneos dérmicos, podem ter efeitos sistêmicos (SILVA, 2010).
Estimativas atuais mostram que aproximadamente seis milhões de pessoas
sofrem com feridas crônicas com elevadas chances de falência múltiplas dos órgãos
31
e/ou a morte do paciente. Lesões produzidas na pele consideradas como feridas
podem ser conceituadas como uma interrupção na integridade do tecido epitelial da
pele, ou mesmo a perda ou quebra da homeostase celular do tecido vivo (ALAM;
SINGH; SINGH, 2011).
As feridas cutâneas são consideradas lesões que requerem atenção diante de
sua cicatrização, visto que esse processo pode ser agravado e gerar problemas à
saúde do indivíduo. Como opção de tratamento para as lesões de pele entre as
terapias complementares, enquadra-se a fitoterapia. Como reportado anteriormente,
o emprego da fitoterapia tem recebido o incentivo da Política Nacional de Práticas
Integrativas e Complementares do Sistema Único de Saúde (PNPIC-SUS), que
integra a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF).
Nessa direção, o anexo da Resolução da Diretoria Colegiada nº. 10, de 09 de
março de 2010 (BRASIL, 2010) apresenta uma lista de drogas vegetais com
indicação terapêutica e modo de uso fundamentados em levantamentos científicos,
mas principalmente de tradicionalidade de uso.
Destaca-se na RDC nº10 as drogas vegetais com ação antisséptica, anti-
inflamatória e cicatrizante as quais possuem indicação para o tratamento de lesões
cutâneas como: Anacardium occidentale (entrecascas); Arctium lappa (raízes);
Calendula officinalis (flores); Caesalpinia férrea (favas); Casearia sylvestris (folhas);
Hamamelis virginiana (cascas); Psidium guajava (folhas jovens); Rosmarinus
officinalis (folhas); Stryphnodendrom adstrigens (cascas) (BRASIL, 2010).
Alam, Singh e Singh (2011) complementam o levantamento de plantas que
apresentaram potencial significante na cicatrização de feridas, dentre elas, a Rubia
cordifolia Linn. (Rubiaceae), o Ocimum kilimandscharicum (Laminaceae), a
Tephrosia purpurea Linn. (Leguminosae), a Aloe vera Linn. (Liliaceae), a Kigelia
pinnata Sausage (Bignoniaceae), a Musa sapientum (Musaceae), a Sphaeranthus
indicus Linn. (Asteraceae), a Ageratum conyzoides Linn. (Asteraceae), entre outras.
Entre as pesquisas com plantas medicinais com ação cicatrizante, anti-
inflamatória e analgésica, destaca-se a A. moluccana, investigada há mais de uma
década pelo Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) na
Universidade do Vale do Itajaí (CECHINEL-FILHO, 2000).
32
3.3.1 Aleurites moluccana (L.) Willd. (EUPHORBIACEAE)
A família Euphorbiaceae é pantropical distingue-se por apresentar espécies
de interesse econômico, sendo predominantemente distribuída em zonas
temperadas. Tal família é formada por aproximadamente 300 gêneros e 6.000
espécies, dos quais, 70 gêneros e 1.000 espécies estão no Brasil (SOUZA, 2008;
VILLALOBOS; CASTELLANOS, 1992).
Estudos realizados com cerca 120 espécies, na sua maioria do gênero
Euphorbia, apresentaram compostos químicos como triterpenoides, flavonoides,
alcaloides, cumarinas, glucoides cianogênicos e taninos. Nos gêneros Aleurites,
Croton, Jatropa, Sapium foram encontrados ésteres de álcool diterpênico, forbol,
resiniferonol e ingenol, substâncias tóxicas e irritantes à pele. Grande quantidade
das espécies da família Euphorbiaceae, incluindo a A. moluccana, originam
sementes tóxicas ao homem por meio da ingestão (SOUZA, 2008).
A despeito da toxicidade apresentada, há relatos da sua utilização como
fontes de obtenção de matéria-prima para a indústria de petróleo, borracha, papel,
medicamentos e óleos. O óleo de Aleurites extraído a partir de suas raízes ou
sementes tinha sua aplicação ligada à produção de verniz, sabão, velas uso em
pomada para reumatismo (CORRÊA, 1984; VILLALOBOS; CASTELLANOS, 1992).
Aleurites moluccana (L.) Willd. pertence à família Euphorbiaceae e tem como
sinonímia Aleurites triloba Forst., Camirium cordifolium Gaertn., C. moluccanum
Ktze., C. oleosum Reissm.; Jatroba moluccana L. (CORRÊA, 1984). Conhecida
também como “nogueira-de-iguape” e “noz-da-Índia”, a A. moluccana é uma árvore
originária da Índia e adaptada ao Brasil a partir do estado de São Paulo até o Rio
Grande do Sul (CORRÊA, 1984).
As características botânicas de cada parte de A. moluccana são de grande
relevância para a sua identificação (Figura 2), suas folhas apresentam-se longo-
pecioladas; revestimento estrelado-tomentoso curto; limbo oval de 5 a 7 lóbulos;
inflorescências paniculadas nas extremidades dos ramos; flores monoicas,
raramente dióicas; alvas; pequenas e numerosas; masculinas com cálice de 3 mm e
femininas de 6 mm; pétalas, as primeiras lanço-ovaladas, as últimas linguiformes;
com 7 a 9 mm de comprimento; frutos carnosos na parte externa; glabros e de ápice
aguçados; sementes duras; globular-comprimidas; casca óssea, dura e espessa;
amêndoas com aproximadamente 60% de óleo graxo (CORRÊA, 1984).
33
Há relatos publicados sobre o seu emprego na medicina popular em países
como Índia, Indonésia e Japão. Faz-se o uso da casca, para o tratamento de
tumores e disenteria; da polpa aplicada em cataplasma para cefaleia, febres, úlceras
e em edemas nas articulações e das folhas para tratamento de reumatismo (DUKE,
1929). Também é usada para tratar mal estar decorrentes de problemas no
estômago ou no intestino em crianças, mau hálito, feridas na pele, asma, e o seu
óleo é considerado um forte laxante. É comum a utilização das folhas na forma de
cataplasma para (Niazi et al., 2010).
Niazi e colaboradores (2010) investigaram a ação anti-inflamatória e
antipirética do extrato metanólico das folhas de A. moluccana em ratos Wistar. O
pré-tratamento de 100 a 300 mg/kg, por via oral, preveniu de forma dose
dependente, o aumento do edema de pata induzido por carragenina. Na dose de
300 mg/kg, demonstrou efeito antipirético quando comparado com o paracetamol
150 mg/kg.
Com base no uso popular de A. moluccana em diversas patologias, iniciaram-
se pesquisas sobre os seus constituintes fitoquímicos. Shamsuddin e colaboradores
(1988) identificaram a substância moluccanina, da classe das cumarinas, no extrato
etanólico dos caules.
Liu e colaboradores (2008) identificaram três compostos da classe dos 3,4-
seco-podocarpano-tipo trinorditerpenoides nos caules e folhas: o ácido molucânico,
o ácido metil éster molucânico e o 6,7-dehidromolucânico, os quais foram também
avaliados através de modelo in vitro com células de linfoma de Burkitt’s e células
carcinoma hepatocelular. O ácido molucânico e o 6,7-dehidromolucânico
apresentaram atividade citotóxica fraca e o ácido metil éster molucânico apresentou
atividade citotóxica moderada.
Com base em estudos realizados há mais de cinco décadas, a A. moluccana
vem sendo estudada intensivamente nos últimos dez anos pela Universidade do
Vale do Itajaí. Pesquisas realizadas avaliam os seus constituintes fitoquímicos por
intermédio de técnicas cromatográficas e espectrométricas usuais e suas ações
farmacológicas em testes in vitro e in vivo (CAMARGO et al., 2010; MATOS et al.,
2011; MEYRE-SILVA, et al., 2011; PEDROSA et al., 2002; QUINTÃO et al., 2011;
QUINTÃO et al., 2012).
34
Figura 2 – Inflorescências, fruto e folha da A. moluccana
Outros estudos identificaram os compostos ácido acetilaleuritólico dos caules,
para o qual foi demonstrada atividade antimicrobiana e a swertisina das folhas, que
não demonstrou atividade analgésica no modelo de contorções abdominais induzida
por ácido acético em camundongos (MEYRE-SILVA et al.,1997; MEYRE-SILVA et
al., 1998; MEYRE-SILVA et al., 1999).
Inflorescências Folhas
Frutos
Fonte: SEEDSHELF (2008)
Frutos
35
Outros constituintes fitoquímicos presentes nas folhas de A. moluccana como
n-hentriacontano; α β-amirinona; β-sitosterol; stigmasterol e o swertisina-2”-O-
ramnosil e glutinol também foram extraídos e identificados ((MEYRE-SILVA et
al.,1997; MEYRE-SILVA et al., 1998; MEYRE-SILVA et al., 1999). Após a
identificação, foi demonstrada ação anti-nociceptiva, através do modelo in vivo de
contorções abdominais induzidas por ácido acético em ratos, mais eficaz do que a
aspirina e o paracetamol (CECHINEL-FILHO, 2000; MEYRE-SILVA et al., 1998,
2011).
A partir dos estudos fitoquímicos e farmacológicos da A. moluccana, em
especial, para a ação anti-inflamatória, cicatrizante e antinociceptiva, teve início o
desenvolvimento de tecnológico de formas farmacêuticas sólida e semissólida
(CESCA et al., 2012), a começar pela investigação dos processos extrativos e de
secagem, a partir da droga vegetal.
Matos e colaboradores (2011) desenvolveram o extrato seco, em spray dryer,
com adição de dióxido de silício (25%, m/m), padronizado com 3% de swertisina-2”-
O-ramnosil, a partir do extrato hidroalcoólico das folhas de A. moluccana, obtido por
maceração em 5 dias, na proporção 1:10 em 70% v/v de solução hidroalcoólica.
O início do desenvolvimento de comprimidos contendo alto teor de extrato
seco de A. moluccana foi realizado a partir de estudos analíticos para o
monitoramento e validação das operações de transformação. Os comprimidos foram
padronizados e apresentaram especificações conforme preconizado pela
Farmacopeia Brasileira. As formulações atenderam a especificação de teor de
marcador de 90 – 110% da concentração teórica, similar ao do extrato seco
(CAMARGO; FERREIRA, 2010).
Estudos farmacológicos realizados com os flavonoides isolados do extrato
seco de A. moluccana, como a swertisina e o seu derivado swertisina-2”-O-ramnosil,
demonstraram que ambos quando administrado via oral foram eficazes em inibir a
hipernocicepção induzida por carragenina, e apenas o derivado, swertisina-2”-O-
ramnosil, foi capaz de reduzir a sensibilidade mecânica induzida pelo adjuvante
completo de Freund (CFA) ou PGE2 (QUINTÃO et al., 2011).
Tendo em vista a produção de um medicamento fitoterápico contendo o
extrato de A. moluccana, foram desenvolvidas formulações semissólidas a partir do
extrato hidroalcoólico. Foram testadas várias bases na formulação, entre elas a
Hostacerin CG®, que apresentou boa estabilidade e maior eficácia nos estudos pré-
36
clínicos. As formulações contendo a base Hostacerin CG® e 0,5 e 1,0% do extrato
seco foram aprovados no estudo de estabilidade, mantendo-se sem alteração até
180 dias de estudo acelerado, e à temperatura ambiente com variação <10% nos
parâmetros de análise (CESCA et al., 2012).
Para esta formulação foi comprovada ação anti-inflamatória, cicatrizante e
antinociceptiva, através dos ensaios in vivo, usando modelo de edema de orelha
induzido por óleo de cróton em camundongos, e modelo de ferida cutânea e dor pós-
operatória em ratos (CESCA et al., 2012). Nesse mesmo estudo, os autores
demonstraram o desenvolvimento do método analítico por cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE-UV), que foi validado para a análise dos flavonoides swertisina-
2”-O-ramnosil (I), swertisina (II), além de outros três novos flavonoides.
O efeito antinociceptivo do extrato seco hidroalcoólico das folhas de A.
moluccana (125-500 mg/kg) e de seu constituinte isolado swertisina-2”-O-ramnosil
(5-50,6 mol/kg) também foi investigado, utilizando diferentes modelos experimentais
em camundongos (QUINTÃO et al., 2012). Ambos os tratamentos administrados via
oral diminuíram os níveis de migração de neutrófilos e da IL-1β após injeção de
carragenina, sugerindo alto potencial para o uso terapêutico no controle da dor.
Os estudos que tem demonstrado a efetividade das formulações sólidas e
semissólidas contendo o extrato seco das folhas de A. moluccana, em modelos que
avaliam as ações antinociceptiva, anti-inflamatória e cicatrizante, trazem à tona
patologias que podem ser tratadas, dentre elas patologias cutâneas, que por vezes
apresentam grau relevante de inflamação crônica e dificuldades de cicatrização.
Em razão disso, buscou-se nesse estudo investigar a atividade do creme
contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1% sobre alguns mecanismos
presentes no processo inflamatório e no reparo tecidual cutâneo.
37
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Extrato vegetal e creme
O extrato seco padronizado a partir das folhas de A. moluccana, produzido
pela Empresa Centroflora, por spray drying, contendo extrato hidroalcoólico das
folhas de A. moluccana e dióxido de silício coloidal, foi cedido pela Indústria
Farmacêutica Eurofarma.
O creme lote 168227, contendo o extrato seco padronizado das folhas de A.
moluccana 1% (ESF) e excipientes (Sepigel® 305, vaselina, crodalan®, miristato de
isopropila, BHT, álcool cetoestearílcio, Phenonip®, EDTA e água), foi cedido pelo
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da UNIVALI. A concentração de 1% foi
utilizada neste estudo, com base nos resultados anteriores sobre a atividade anti-
inflamatória do extrato incorporado em base Hostacerin® (CESCA et al., 2012).
Para fins de controle negativo, o creme contendo a mesma composição
descrita acima, sem o ESF, foi utilizado e denominado veículo. Para o grupo controle
positivo, o creme de acetato de dexametasona 1 mg/g fabricado pelo laboratório
EMS S/A (lote 603479), foi adquirido comercialmente.
4.1.2 Reagentes e outras soluções
- Álcool etílico P.A. (Solven, lote 352/11);
- Álcool etílico Absoluto (Meta Química, lote GRUO4.10);
- Bacto TMAgar (Becton Dickinson & Co, lote 2326162);
- DMSO (EMPLURA, lote K44199043);
- Eosina amarelada – C/45380 (Vetec química fina, lote 1100662);
- Entelian® (Merck, lote HX8259682011);
- Éter etílico (Dietílico) (Vetec Química);
- Óleo de cróton (Sigma, lote 065K1429);
- Pen Strep, Penicillin Streptomycin (Gibco® Life Technologies, lote 1128771);
- Solução Hematoxilina de Harris (Dinâmica, lote: 40277);
- Streptavidin-HRP – Kit mouse IL-1β (R&D Systems, lote AEM4907031);
38
- Streptavidin-HRP – Kit mouse TNF ( R&D Systems, lote AEM6409042);
- Streptavidin-HRP – Kit mouse CXCL1/KC (R&D Systems, lote: AEM6309021);
-Triton® X-100 (Sigma, lote 29085);
- Tween® 20 (Oxiteno, lote 43927);
- Xileno (Solven, lote 13802);
- Xilazin®- Cloridrato Xilazina 2% (Syntec do Brasil);
- Ketamina (Köning, lote 001/08);
4.1.3 Equipamentos
- Agitador mecânico (Phoenix, mod. AP52);
- Balança (MARTE);
- Capela de exaustão ( Permution, mod. CE0701);
- Centrífuga (MSE, UK, mod. HARRIER 18/80);
- Centrígufa refrigerada (Vision, mod. VS-15000CFII);
- Equipamento de Banho-Maria (Tecnal®, mod. TE 184);
- Estufa (QUIMIS, mod. 317B252);
- Homogenizador (Biospec, mod. 985370);
- Leitor de Elisa (BMG, mod. spectrastar nano);
- Medidor de pH – Digicron Analytical (Digimed, mod. 42271);
- Micrômetro digital (Mitutoyo, mod. MDC-25SB);
- Microscópio óptico (Olympus CBA);
- Microscópio óptico invertido (Olympus, mod. CKX41);
- Micrótomo (Biosystems, mod. American Optical).
4.2 Métodos
Para a avaliação da atividade farmacológica in vivo os protocolos de pesquisa
foram submetidos ao comitê de ética em pesquisa da UNIVALI e aprovado sob o
parecer nº 015/13 e 019/14 (Anexo A e B). A pesquisa foi desenvolvida no
Laboratório de Farmacologia in vivo e in vitro do Programa de Pós-graduação em
Ciências Farmacêuticas da UNIVALI.
39
4.2.1 Animais
Nesta pesquisa foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas, de 20 a 30 g
(2,5 a 3 meses de idade) e Swiss machos, de 25 a 35 g (2,5 a 3 meses de idade)
provenientes do Biotério Central da Univali, onde os animais foram alojados em
gaiolas plásticas e permaneceram em sala à 21 ± 1 °C com ciclo claro/escuro de
12/12 h controlados, recebendo água e ração ad libtum, em caixa de polipropileno
com cama de maravalha. Todos os testes foram realizados de acordo com as
normas internacionais de cuidados com animais de laboratório do National Institutes
of Health (NIH, EUA).
Para aclimatação, os animais permaneceram na sala de experimentação por
no mínimo 24 h antes da realização do experimento. No modelo de cicatrização de
feridas, os camundongos C57BL/6 foram mantidos individualmente em caixa de
polipropileno. No modelo de edema de orelha, os camundongos Swiss foram
separados em grupos de 4 animais por caixa.
4.2.2 Avaliação da ação anti-inflamatória tópica do creme contendo extrato seco das
folhas da A. moluccana (ESF) 1%
O modelo experimental de edema de orelha induzido por óleo de cróton 2,5%,
conforme metodologia descrita por Carlson e colaboradores (1985), foi utilizado para
a avaliação do tratamento tópico com o creme contendo ESF em camundongos
Swiss. Os animais foram divididos em 4 grupos (n=6), sendo um grupo tratado
somente com óleo de cróton 2,5%, denominado grupo controle; um grupo tratado
com o creme sem o ESF, denominado veículo; um grupo tratado com o creme
contendo ESF 1% e um grupo tratado com dexametasona 1 mg/g, denominado
grupo controle positivo.
Inicialmente, os animais foram anestesiados através da inalação com solução
de éter, logo após a espessura da orelha direita dos animais foi medida com o
auxílio de um micrômetro digital para a obtenção da medida basal. Em cada grupo
foram aplicados 50 µL dos respectivos tratamentos na superfície interna da orelha
direita. Após 30 minutos do tratamento, foram aplicados 20 µL do agente flogístico
óleo de cróton 2,5% (v/v) dissolvido em acetona, diretamente na superfície externa
40
da orelha direita. Após 6 h da aplicação do agente flogístico, todas as orelhas
tiveram suas espessuras medidas através de micrômetro digital. A diferença entre a
espessura obtida antes dos diferentes tratamentos, medida basal, e a espessura
obtida após 6h da aplicação do óleo de cróton foi tida como edema. Adicionalmente,
para a dosagem de TNF, IL-1β, quimiocina (KC) e MPO, acrescentou-se a coleta de
pele da orelha de animais que não receberam a aplicação do óleo de cróton e
nenhum tratamento, a fim de avaliar a quantidade destes no estado fisiológico basal.
Este grupo de animais foi denominado naive.
4.2.2.1 Dosagem de citocinas
Os níveis de TNF, IL-1β e quimiocina (KC) foram avaliados com base nos
estudos de Cangussú e colaboradores (2013). Ao final de 6 hs do modelo
experimental conforme descrito no item anterior, os animais juntamente os do grupo
naive, foram eutanasiados através do método de decaptação. Com auxilio de um
vazador de 6 mm, uma amostra da orelha edemaciada foi imediatamente coletada e
armazenada a -80ºC. Os tecidos foram homogeneizados em salina tamponada com
tampão fosfato (PBS; pH=7,4; NaCl 137mM, KCI 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4
1,5 mM) filtrado a 0,2 µm, suplementado com NaCl 0,4 M, PMSF 0,1 mM, EDTA 10
mM, contendo 0,05% de Tween® 20, 0,5% cloreto de benzametônio 0,1 mM e 2
µg/mL de aprotinina. Os homogeneizados foram centrifugados a 6900 rpm, por 10
min a 4 ºC. Os níveis de IL-1β, TNF e KC foram mensurados através dos kits de
ensaio imunoenzimático ELISA (enzyme-linked immuno-sorbent assay), de acordo
com as recomendações do fabricante R & D Systems® (Minneapolis, USA). A
absorbância foi medida usando um leitor de microplacas em 450 nm e 550 nm e os
resultados foram expressos em pg/mg de tecido.
4.2.2 Determinação da atividade da enzima Mieloperoxidase (MPO)
O recrutamento de neutrófilos foi quantificado indiretamente através da
determinação da atividade da enzima MPO, com base no método descrito por
Bradley e colaboradores (1982) com algumas modificações. As amostras do tecido
de cada orelha edemaciada, juntamente com as do grupo naive, foram coletadas
com o auxílio de um vazador de 6 mm, 6 h após a aplicação do óleo de cróton e
41
imediatamente armazenadas no freezer -80 ºC. Os tecidos foram homogeneizados
em tampão EDTA/NaPO4 (pH 4,7) a 5% (p/v) e centrifugados a 4.000 rpm, por 15
minutos a 4 C. O precipitado foi ressuspendido em 111 µL de tampão 1 gelado (pH
7,4; NaCl 0,1 M, NaPO4 0,02 M e EDTA 0,015 M). Adicionou-se 333 µL de NaCl
0,2% gelado e, após 30 segundos, 333 µL de NaCl 1,6% contendo glicose 5%
(gelado). A solução foi centrifugada a 4.000 rpm, por 15 min, a 4 C, e 25 µL do
sobrenadante foram utilizados para o ensaio de MPO. A reação enzimática foi
realizada na presença de tetrametilbenzidina (TMB 1,6 mM), fosfato de sódio
(NaPO4 80 mM) e peróxido de hidrogênio (H2O2 0,3 mM). A absorbância foi medida
em 650 nm, e os resultados foram expressos em densidade óptica (DO) por mg de
tecido.
4.2.3 Avaliação da ação cicatrizante tópica do creme contendo extrato seco das
folhas da A. moluccana (ESF) 1%
O modelo experimental de ferida cutânea, descrito por Yadav e colaboradores
(2014) com algumas modificações, foi utilizado para a avaliação da ação cicatrizante
do tratamento tópico com o creme contendo ESF 1% em camundongos C57BL/6
fêmeas. Os animais foram anestesiados com uma mistura de quetamina (100 mg/kg,
i.p.) e xilazina (10 mg/kg, i.p.), para os procedimentos de tricotomização e de
indução da ferida.
Para a indução da ferida, os animais tricotomizados e anestesiados foram
submetidos à incisão na porção superior do dorso do animal. Para tanto, realizou-se
a assepsia da pele com álcool 70% e as incisões foram feitas traçando-se um
quadrado de 0,5 cm2 com um gabarito e caneta de ponta fina (1,0 mm). Os cortes
foram realizados com o auxílio de uma tesoura de ponta fina, iniciando-se
perpendicularmente à superfície utilizada, até remover a pele do quadrado.
Imediatamente após a retirada completa da pele, os animais foram colocados na
posição de agachamento (crouching) e o perímetro das incisões foi traçado. Em
seguida, os animais foram colocados quatro por caixa, especialmente projetadas de
maneira que a ferida não ficasse em contato com a grade ou com o bebedouro.
Foram tratados 2 grupos (n=8), sendo um deles, com o creme contendo ESF
e o outro com o veículo (sem extrato). Cerca de 450 mg de cada creme foram
42
aplicados sobre a ferida, duas vezes ao dia, até o completo fechamento da área da
ferida.
Cada ferida foi traçada diariamente, no período vespertino, através de
gabarito, em triplicata. Para isso, os animais foram sedados através da inalação de
éter etílico durante 30-40 segundos. Após a sua digitalização, a área da imagem
correspondente a ferida (cm2) foi calculada com o auxílio do programa
computacional ImageJ (NIH).
A área (cm2) da ferida em função do tempo (dias) foi plotada em gráfico, para
cada grupo. Adicionalmente, o registro fotográfico proporcionou uma avaliação
quantitativa e qualitativa da área lesionada.
4.2.4 Análise histológica
A realização dos cortes histológicos da orelha ou do dorso dos camundongos,
os animais foram com base na metodologia descrita por Boller et al., (2010) com
alterações. Os animais foram eutanasiados pelo método de decaptação e
imediatamente os tecidos das orelhas foram coletados após 6 horas de indução com
o óleo de cróton. Já os tecidos das feridas foram coletados ao final de 48 h, 8 dias e
12 dias do início da lesão, conforme modelo descrito no item 4.2.3. Adicionalmente,
acrescentou-se a coleta de pele da orelha, de animais que não sofreram nenhum
tipo de lesão, a fim de avaliar a pele em seu estado fisiológico basal. Este grupo de
animais foi denominado naive.
Após a remoção, os tecidos foram processados pelas etapas de fixação,
desidratação, clareamento ou diafanização e inclusão em parafina, até a confecção
das lâminas para análise.
Os tecidos com aproximadamente 6 mm de diâmetro foram removidos e
imersos em paraformoldeído 4% por 24 h e, posteriormente, mantidos em etanol
70%. Os tecidos foram submetidos a passagens sucessivas em etanol de
concentrações crescentes (etanol 70%, etanol 80%, etanol 90% e, finalmente, etanol
absoluto), para a completa desidratação. Na próxima etapa dita clareamento ou
diafanização, os tecidos receberam dois banhos de xilol de 30 minutos, até
tornaram-se translúcidos. Para a etapa de inclusão em parafina, os tecidos
translúcidos passaram por três banhos, de 1 h cada, em parafina. Os tecidos
43
posicionados nos blocos de parafina foram cortados com a espessura de 3 µm,
através de micrótomo (Leica Co.), e posicionados sobre uma lâmina de vidro.
As lâminas, contendo os cortes teciduais da orelha ou do dorso dos animais,
foram mantidas em estufa a uma temperatura de 70-90 ºC até a completa fusão da
parafina ao redor dos cortes. Posteriormente, os tecidos foram desparafinizados em
xilol (xileno) e hidratados por passagens sucessivas em etanol absoluto e
posteriormente coradas com hematoxilina e eosina.
A integridade da epiderme, infiltração de leucócitos, edema e espessura da
derme foram avaliadas em áreas representativas com o aumento de 4x, 10x ou 40x.
4.2.5 Ensaio de citotoxidade pela difusão em gel de agarose (Agarose Overlay)
O ensaio de irritação cutânea foi realizado conforme metodologia descrita por
Invitox (1991) e Borenfreund e Puerner (1985), com algumas modificações. Neste
teste foram utilizadas células de fibroblasto L929 obtidas do Banco de Células do
Rio de Janeiro (BCRJ), de 4 a 6 passagens. Estas foram crescidas em meio DMEM
suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 1% de antibiótico (penicilina e
estreptomicina 10.000 U/mL), HEPES e NaHCO3. O pH foi ajustado para 7,4 e
colocado em estufa a 37 C com 5% de CO2. Após a cultura se tornar confluente
(aproximadamente 48 h), as células foram coletadas e subcultivadas. O meio foi
trocado sempre que se fez necessário, e os repiques foram feitos semanalmente
seguindo os protocolos do laboratório de Farmacologia in vitro da UNIVALI.
As células foram tripsinizadas e plaqueadas com 300.000 células por poço (2
mL/poço) em placas de 6 poços e mantidas por 24 h em estufa para adesão. Após
esse período, o meio de cultura foi substituído por meio DMEM suplementado
contendo 0,01% de vermelho neutro como corante vital por 1 h no escuro e em
estufa a 37 °C com 5% de CO2 até o aparecimento da coloração vermelha celular.
Posteriormente, o excesso de corante foi removido com PBS e adicionado 3 mL por
poço de uma mistura 1:1 de meio agarose e meio DMEM (mistura overlay) que
foram mantidos em aquecimento (45 °C) a fim de evitar a solidificação dos meios. As
placas com as células e a mistura overlay foram mantidas em estufa a 37 °C em 5%
de CO2 por aproximadamente 20 min para a solidificação da mistura nos poços.
Após a solidificação do meio, as amostras contendo Triton X-100 (controle
positivo); creme contendo ESF 1%; creme veículo, ESF 1%, diluído em DMSO, e
44
DMEM suplementado (controle negativo) foram incorporadas em discos de papel
filtro (0,54 cm), secos e previamente autoclavados (121 °C por 20 min). Na
sequência, as placas foram incubadas por 24 h em estufa a 37 °C em 5% de CO2. O
grau de irritação foi avaliado pela zona de lise (ausência de incorporação do corante
vital) através do uso de paquímetro e avaliação microscópica segundo a
classificação descrita pela Farmacopeia Americana (UNITED STATES
PHARMACOPEIA, 2007) (quadro 1).
Quadro 1 - Classificação do grau de irritação cutânea
Classificação Reatividade Descrição da zona de reatividade
0 Nenhum Nenhuma reatividade ao redor da amostra
1 Leve Alguma má-formação ou
degeneração ao redor da amostra
2 Médio Zona limitou a área ao redor da amostra
3 Moderado Zona estende 0,5 a 1,0 cm além da amostra
4 Severo Zona estende mais que 1,0 cm além da amostra
Fonte: UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2007
4.3 Análise Estatística
Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) de uma via
seguida pelo teste de Newman-Keuls. Valores de p menores que 0,05 (P < 0,05)
foram considerados como indicativos de significância. Todas as análises citadas
acima foram realizadas utilizando o programa GraphPad Prism version 5.00 for
Windows (GraphPad Software, San Diego Califórnia USA).
45
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Avaliação da ação anti-inflamatória tópica do creme contendo extrato seco
de A. moluccana (ESF) 1%
O modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton (2,5%) foi
utilizado para avaliar a ação anti-inflamatória do pré-tratamento tópico do creme
contendo extrato seco de A. moluccana 1%. Os resultados podem ser visualizados
na Figura 3.
Figura 3 - Influência do pré-tratamento tópico com o creme contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1% sobre o edema de orelha induzido pela administração tópica de óleo de cróton.
0
100
200
300
400
500
ESF 1%Branco
óleo de cróton 2,5%
Dexametasona
0,5 %
***
**
Controle
Esp
essu
ra d
a o
relh
a (
m)
Camundongos receberam pré-tratamento tópico de (50 µl/orelha direita, superfície interna) para os grupos tratados, exceto o controle, 30 min antes a aplicação do óleo de cróton (20 µl/orelha direita, superfície externa). Os valores representam a média ± E.P.M da diferença entre as medidas do tempo zero e após a instalação da resposta inflamatória nos grupos de animais (n = 6). A análise estatística foi realizada com ANOVA de uma via seguida do teste de Newman-Keuls. **p<0,01, ***p<0,001 para os tratamentos que diferenciam do grupo controle.
A aplicação tópica do óleo de cróton 2,5% induziu um aumento médio da
espessura da orelha de 349,25 ± 27,17 µm, após 6 h no grupo controle. Entre os
grupos tratados, houve redução significativa da espessura da orelha, nos grupos que
receberam o pré-tratamento tópico com os cremes contendo o anti-inflamatório
dexametasona 0,5% para 18,33 ± 2,10 µm (97% de inibição) e ESF 1% para 224,75
± 24,98 µm (36% de inibição), quando comparados com o grupo controle. Já o grupo
tratado apenas com o veículo não apresentou diferença em relação ao controle, com
Ve
Veículo
46
média de espessura da orelha em 362,28 ± 16,87 µm evidenciando o efeito do ESF
a 1%.
Para a realização de estudos in vivo pré-clínicos que avaliam a inflamação
aguda cutânea, o modelo de edema de orelha (CARLSON et al., 1985) é um dos
métodos que usam como agente flogístico o óleo de cróton, uma substância irritante
capaz de promover uma reação de inflamação aguda com o envolvimento de vários
mediadores (BAUMGARTNER et al., 2011; BORGES et. al., 2013; CABRINI et al.,
2011; CHEN et. al., 2012; CHIBLI et al., 2014; DOMICIANO et al., 2013; FABRI et.
al., 2013).
A resposta causada pela aplicação do óleo de cróton é caracterizada por
edema causado pela vasodilatação e infiltração de leucócitos polimorfonucleares,
desencadeadas pela ativação da proteína quinase C (PKC), a qual promove a
ativação da fosfolipase A2 (PLA2). Consequentemente há a ativação da cascata do
ácido araquidônico (A.A), havendo a biossíntese de leucotrienos, prostaglandinas e a
produção de citocinas, os quais atuam conjuntamente de forma pró-inflamatória no
tecido lesionado (CARLSON et al., 1985; CABRINI et al., 2011; CHIBLI et al., 2014;
DOMICIANO et al., 2013).
No presente estudo, os resultados ratificam a atividade anti-inflamatória do
creme contendo o ESF a 1%, que já foi comprovado por estudos anteriores, que
veicularam o ESF em diferentes cremes (CESCA et al., 2012). Este experimento foi
realizado como a primeira etapa para o estudo dos mecanismos envolvidos,
conforme será apresentado nos itens a seguir.
5.2 Dosagem dos níveis das citocinas IL-1 β e TNF e da quimiocina CXCL1 (KC)
no modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton
Neste experimento, avaliou-se o efeito do pré-tratamento do creme contendo
extrato seco de A. moluccana (ESF) 1% (50 µL/orelha) sobre níveis das citocinas IL-
1 β e TNF e da quimiocina CXCL1 (KC). Os resultados podem ser visualizados na
Figura 4.
47
Figura 4 - Efeito do pré-tratamento tópico do creme contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1% sobre os níveis de citocinas IL-1β (A), TNF (B) e quimiocina CXCL1 (KC) (C) após a indução do edema de orelha induzido pela administração tópica de óleo de cróton.
Camundongos receberam pré-tratamento tópico de (50 µl/orelha direita, superfície interna) para os grupos tratados, exceto o controle, 30 min antes a aplicação do óleo de cróton (20 µl/orelha direita, superfície externa). Os valores representam a média de 4-5 animais e as linhas verticais indicam E.P.M. Todas as amostras foram coletadas 6 h após a indução do edema induzido por óleo de cróton para o devido processamento e dosagem das citocinas IL-1β (A), TNF (B) e da quimiocina KC (C). A análise estatística foi realizada por ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls. **p<0,01, ***p<0,001 para os tratamentos que diferenciam do grupo controle.
O pré-tratamento realizado com o creme contendo ESF 1% reduziu de forma
significativa, os níveis de IL-1β de 766,18 ± 41,64 para 415,77 ± 39,9 (com inibição
de 46%) (Figura 4A), os de TNF de 74,16 ± 18,38 para 29,08 ±8,15 (com inibição de
65%) (Figura 4B) e os níveis de KC de 300,60 ± 43,92 para 113,32 ± 35,02 (com
inibição de 62%) (Figura 4C) quando aplicado 30 min antes da indução do edema de
orelha por óleo de cróton. Já o pré-tratamento realizado com o creme de
dexametasona (0,5%), tido como controle positivo, reduziu os níveis de IL-1β para
0
200
400
600
800
1000
ESF 1%Branco Dexametasona
0,5%
óleo de cróton 2,5%
******
A
ControleNaive
46%
56%
IL-
1
(p
g/m
g d
e t
ecid
o)
0
20
40
60
80
100
ESF 1%Branco Dexametasona
0,5%
óleo de cróton 2,5%
**
***
B
ControleNaive
65%
89%
TN
F-
(p
g/ m
g d
e t
ecid
o)
0
100
200
300
400
ESF 1%Branco Dexametasona
0,5%
óleo de cróton 2,5%
*** ***
C
ControleNaive
62% 60%
KC
(p
g/m
g d
e t
ecid
o)
Veículo Veículo
Veículo
48
339, 27 ± 45,10 (com inibição de 56%), de TNF para 8,22 ± 5,33 (com inibição de
89%) e da quimicocina KC para 113,32 ±35,02 (com inibição de 60%)
Os eicosanoides derivados do ácido araquidônico que regulam a produção de
citocinas inflamatórias e outros mediadores podem ser alvos de medicamentos anti-
inflamatórios. Já foi reportado na literatura que os metabólitos secundários de
plantas, na sua maioria, interferem de forma direta ou indireta sobre vários
mediadores inflamatórios como metabólitos do ácido araquidônico. Por exemplo, os
flavonoides, que modulam a ativação de citocinas, a expressão de fatores de
transcrição tais como NF-kB, a expressão de moléculas chave pró-inflamatórias
como COX-2, IL-1β e TNF, neuropeptídios e proteases (CALIXTO; OTUKI;
SANTOS, 2003).
Um exemplo de atuação dos flavonoides se aplica ao flavonoide C-glicosilado
isolado do extrato seco das folhas de A. moluccana, cujo derivado swertisina-2”-O-
ramnosil demonstrou pelo tratamento via oral ter potente atividade antinociceptiva,
através do modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. Também
foi demonstrado que o extrato seco ou o composto isolado atenuaram a migração de
neutrófilos e os níveis de IL-1β após a injeção de carragenina (CECHINEL-FILHO,
2000; QUINTÃO et al., 2012).
Estudos como o de Lawrence, Willoughby e Gilroy, (2002) avaliram os
eventos relacionados à inflamação presentes 48 h após a indução da mesma. Os
autores reportaram que nos primeiros 30 minutos estão presentes as aminas
vasoativas (histamina e serotonina) formação do edema, logo inicia-se a presença
de citocinas e quimiocinas, as quais estarão presentes até a fase de resolução, 72 h
após. Aproximadamente 1 h após a lesão, há a presença de neutrófilos com
permanência até 24 h, a partir de 6 h a 48 h ocorre apoptose celular, sendo que nas
primeiras 24 h, inicia-se a ação dos macrófagos para fazer fagocitose no local e
liberar mediadores anti-inflamatórios para iniciar a resolução.
Várias citocinas apresentam a capacidade de induzir a sua própria produção,
assim como de outros elementos desse grupo, por exemplo, os mediadores TNF
apresentam o papel de iniciar a cascata da ativação de outras citocinas, inclusive a
de IL-1β. A ativação de citocinas ocorre por vários fatores, não podendo ser inibida
somente por uma via, consequentemente, a ativação dessa cascata de citocinas
resulta na ativação da cicloxigenase-2, a qual desencadeia uma cascata de
metabólitos que darão inicio à inflamação. Essa via é muito importante para a ação
49
de anti-inflamatórios, por diminuir os efeitos do processo inflamatório (CALIXTO;
OTUKI; SANTOS, 2003; CALDER, 2006; NICOLAOU; PILKINGTON; RHODES,
2011).
Indo de encontro com resultados anteriormente descritos a cerca dos efeitos
biológicos do extrato da A. moluccana e dos eventos ocorridos durante o processo
inflamatório agudo, apresentamos neste estudo resultados relativos à participação
das citocinas TNF e IL-1β e da quimiocina CXCL1/KC sobre a ação anti-inflamatória
tópica demonstrada por este extrato. O pré-tratamento com o creme contendo ESF
1% reduziu 61% os níveis de TNF, que pode ter interferido na ativação de IL-1 β,
cujos níveis foram reduzidos em 46%, e principalmente de CXCL1/KC.
A liberação de quimiocinas como CXCL1/KC ocorre rapidamente sob várias
situações experimentais e desempenha um papel importante na indução de influxo
de neutrófilos, facilitando sua chegada no sítio da lesão (VIEIRA; LEMOS; CUNHA,
2009; KOLACZKOWSHA; KUBES, 2013). No presente estudo, a redução de 62%
nos níveis de CXCL1/KC, sugere-se que ocorre a diminuição da migração de
neutrófilos para o sítio inflamatório.
5.3 Medida da atividade da enzima Mieloperoxidase (MPO)
Para identificar a presença de neutrófilos, é realizada a medida da atividade
da enzima MPO, sendo esta encontrada em seus grânulos azurofílicos (FABRI et al.,
2013).
Os resultados obtidos através do ensaio bioquímico, que mede a atividade da
enzima mieloperoxidase, podem ser observados na Figura 5. Estes resultados
demonstram que o creme contendo o ESF 1% foi capaz de inibir a atividade da MPO
em de 1.039 ± 0,15 para 0,397 ± 0,05 (com inibição de 62%) enquanto o fármaco
utilizado como controle positivo, dexametasona, foi capaz de reduzir para 0,430 ±
0,05 (com inibição de 59%) (Figura 5).
Neste estudo, a redução da atividade da MPO reforça a atividade anti-
inflamatória apresentada pelo ESF, relacionada com a redução de neutrófilos no
sítio da inflamação.
50
Figura 5 - Efeito da aplicação tópica do creme contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1% sobre a atividade da enzima mieloperoxidase após 6 h de aplicação de óleo de cróton.
0.0
0.5
1.0
1.5
ESF 1%Branco Dexametasona
0,5%
óleo de cróton 2,5%
*** ***
MP
O (
DO
/mg
tecid
o)
ControleNaive
62% 59%
Camundongos receberam pré-tratamento tópico de (50 µl/orelha direita, superfície interna) para os grupos tratados, exceto o controle, 30 min antes a aplicação do óleo de cróton (20 µl/orelha direita, superfície externa). Os valores representam a média de 4-5 animais e as linhas verticais indicam E.P.M. A análise estatística foi realizada por ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls. *** p<0,001 para os tratamentos que diferenciam do grupo controle.
Conforme metodologia realizada, no período de tempo de 0 a 6 h, verifica-se
a atuação de mediadores e células pró-inflamatórias presentes no processo de
inflamação aguda, como os neutrófilos, considerados marcadores na inflamação
aguda (VIEIRA; LEMOS; CUNHA, 2009).
Os neutrófilos são considerados os primeiros leucócitos a serem recrutados
para o sítio da lesão, a fim de, principalmente, eliminar patógenos. Seu recrutamento
inicia-se por macrófagos e mastócitos residentes que controlam e induzem vários
eventos que possibilitam esse processo de recrutamento, como mudanças na
superfície do endotélio, ocasionadas pela ação de mediadores inflamatórios como
histamina e citocinas, e a liberação de quimiocinas (KALACZKOWSKA; KUBES,
2013).
Quimiocinas como CXCL1/KC são sinalizadas pelo receptor CXCR2 levando
a ativação e recrutamento de neutrófilos. Além desta, o TNF também contribui de
uma forma sinérgica no recrutamento de neutrófilos (VIEIRA; LEMOS; CUNHA,
2009). Conforme o estudo de García-Ramallo e colaboradores (2002), o bloqueio
seletivo de CXCR2 inibiu o recrutamento de neutrófilos em 74%, sem a inibição
significativa de monócitos. Observa-se que quando há a diminuição da KC, ocorre
Veículo
51
uma diminuição da ativação de CXCR2, consequentemente uma redução de
neutrófilos.
O recrutamento de neutrófilos no processo inflamatório agudo é de extrema
importância para a proteção do organismo, entretanto, ao mesmo tempo, pode ser
prejudicial em razão dos neutrófilos liberarem oxidantes, proteases e proteínas
antimicrobianas que podem causar lesões permanentes no tecido. Para que se inicie
a resolução do processo inflamatório, um dos principais pontos é a redução na
quantidade de neutrófilos (KALACZKOWSKA; KUBES, 2013).
Correlaciona-se essas informações com os resultados do presente trabalho, o
qual o creme contendo ESF 1% obteve reduções em todas as citocinas e quimiocina
dosadas, dessa forma, ressalta-se a possível interferência na redução do influxo de
neutrófilos.
5.4 Avaliação microscópica da ação anti-inflamatória tópica do tratamento com
creme contendo extrato seco das folhas de A. moluccana (ESF) 1%
Para a avaliação microscópica da ação anti-inflamatória do tratamento tópico
com creme contendo ESF 1%, foi realizada a análise histológica de tecidos que
sofreram a lesão, e receberam algum tipo de tratamento, frente àqueles que não
sofreram nenhum tipo de lesão (grupo naive). Os resultados estão ilustrados na
Figura 6.
A análise histológica do grupo naive permitiu caracterizar a pele em seu
estado fisiológico, pela presença de células residentes, sem alterações na epiderme
e na derme, e na cartilagem. Observou-se na derme, um tecido conjuntivo regular,
com abundante matriz extracelular, a presença de fibroblastos, glândulas sebáceas
e folículos pilosos, além de vasos e micro vasos sanguíneos, em maior quantidade
(aproximadamente 30 unidades/corte) quando comparado com os outros grupos
(Figura 6 A).
Já os grupos controle (que recebeu apenas o óleo de cróton) e veículo (creme
sem ESF) apresentaram alterações importantes, comparadas ao grupo naive
(Figuras 6 B e C, respectivamente). A epiderme apresentou menor queratinização
em algumas regiões. Na derme, o tecido conjuntivo apresentou-se com menor
quantidade de matriz extracelular devido ao aumento no número de células
migradas para o sítio da inflamação, aproximadamente 4 vezes maior que o naive,
52
decorrente do extravasamento plasmático face ao edema ocorrido, e provavelmente
a presença de neutrófilos (ZANUSSO-JUNIOR et al., 2011).
Estes eventos são desencadeados nesse modelo de edema de orelha
induzido por óleo de cróton, conforme demonstrados também nos estudos de Tian e
colaboradores (2013) e Chibli e colaboradores (2014). Não foram observadas
diferenças significativas quanto a quantidade e morfologia das glândulas sebáceas,
folículos pilosos e vasos sanguíneos, quando comparadas ao grupo naive (Figura 6
A).
Os grupos tratados com o creme contendo o ESF 1% e com o creme de
dexametasona apresentaram aspectos semelhantes entre si, como a maior
quantidade de vasos sanguíneos (Figuras 6D e E, respectivamente), quando
comparados com o grupo controle. Em relação às alterações da epiderme e derme,
foi verificado que o tratado com dexametasona apresentou espessura e aspectos do
tecido conjuntivo muito semelhante ao do grupo naive. Já o tratado com o creme
contendo ESF 1% apresentou espessura maior que o controle positivo e menor que
os grupos controle e veículo. A presença de infiltrado celular nos grupos tratados
com os cremes de dexametasona e ESF também foi menor que nos grupos controle
e veículo, caracterizando, portanto, uma redução significativa do edema.
Conforme visto, o processo inflamatório agudo é caracterizado por quatro
sinais clássicos, sendo um deles o edema. Este é percebido através de um inchaço,
um aumento da região lesionada, o qual se torna uma forma de avaliar o processo
inflamatório agudo. Um dos métodos considerado confiável para a avaliação
inflamatória tópica é o de edema de orelha induzido por óleo de cróton,
caracterizado pela vasodilatação, aumento da permeabilidade na matriz extracelular
e infiltração de células, as quais formaram o edema (CABRINI et al., 2011).
Após 6 h de aplicação do óleo de cróton se atinge o pico dos resultados
ocasionados por este agente flogístico como, aumento da permeabilidade vascular e
infiltrado celulares. O aumento verificado da espessura da orelha está relacionada
com a formação de edema, o qual traz a característica central e macroscópica do
modelo, conforme visto no estudo de Chen e colaboradores (2012).
53
Figura 6 - Avaliação microscópica do pré-tratamento tópico com creme contendo ESF de A. moluccana 1% sobre o edema de orelha induzido pela aplicação tópica de óleo de cróton.
Camundongos receberam pré-tratamento tópico de (50 µl/orelha direita, superfície interna) para os grupos tratados, exceto o controle, 30 min antes a aplicação do óleo de cróton (20 µl/orelha direita, superfície externa). As amostras foram coletadas 6 h após a aplicação do óleo de cróton para os grupos controle (6B), veículo (6C), ESF (6D) e dexametasona (6E). Para o grupo naive (6A), as amostras foram coletadas sem que houvesse algum tipo de tratamento. Colchete duplo representa a
espessura da derme e o tecido conjuntivo; ( ) epiderme;( ) glândula sebácea; ( )
vaso sanguíneo; ( ) infiltrado celular. Todas foram avaliadas em áreas representativas com o aumento de 10x e 40x.
54
O modelo realizado neste estudo de edema de orelha induzido por óleo de
cróton permitiu verificar após 6 h a ação anti-inflamatória do creme contendo ESF
1% através da redução da espessura da derme e da diminuição de infiltrados
celulares, conforme também observado no estudo de Baumgartner e colaboradores
(2011).
O flavonóide swertisina-2”-O-ramnosil um marcador do ESF de A. moluccana
administrado via oral já demonstrou em estudos a ação antinociceptiva e redução de
neutrófilos e IL-1β quando induzidos por carragenina (QUINTÃO et al., 2012). Nos
estudos de Chen e colaboradores (2012) são relatados que os polifenóis já foram
reconhecidos como potentes inibidores de ciclooxigenases e da lipoxigenase,
podendo esta também ser uma forma de ação do ESF 1% de A. moluccana.
5.5 Avaliação da ação cicatrizante do creme contendo extrato seco de A.
moluccana (ESF) 1%
Face a ação anti-inflamatória do ESF, no modelo de edema de orelha, e as
importantes alterações na pele lesionada pelo agente flogístico, buscou-se verificar a
ação do ESF sobre outro tipo de lesão, a ferida cutânea no dorso de camundongos.
Nesta parte do trabalho, avaliou-se o efeito dos tratamentos com o creme contendo
o ESF, sobre o tempo (dias) de cicatrização das feridas e as respectivas alterações
morfológicas no processo de reparo tecidual.
Na Figura 7 demonstra a redução da área das feridas em função do tempo,
comparando-se o efeito do creme contendo ESF 1% frente ao veículo (sem o ESF).
Com relação ao tempo para o fechamento da ferida não houve diferença
significativa entre grupo tratado com o creme contendo ESF 1% e o veículo (sem
extrato) (Fig. 7).
No estudo de Cesca e colaboradores (2012), foi realizado o modelo de ferida
cutânea em ratos Wistar para avaliar a ação no processo de reparo tecidual de duas
formulações diferentes, creme contendo o extrato seco hidroalcoólico de A.
moluccana 0,5 % e 1% incorporado em base Lanette N® e em Hostacerin®.
Obtiveram como resultado em relação ao tempo de fechamento da ferida somente o
extrato da planta 0,5 % e 1% incorporado em base Hostacerin®.
55
Figura 7- Efeito do tratamento com o creme contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1% sobre a evolução do fechamento da ferida cutânea em camundongos.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5ESF 1%
Branco
Tempo (dias)
Áre
a/c
m2
Camundongos receberam tratamento tópico do creme contendo extrato seco das folhas (ESF) da A. moluccana 1% (0,45g/ferida), ou o veículo (sem o ESF), duas vezes ao dia, até o fechamento da ferida. Após a captura das imagens diárias, a área (cm2) das feridas foi calculada com o auxílio do
programa computacional ImagemJ.
Portanto, salienta-se algumas diferenças entre o estudo de Cesca e
colaboradores (2012) e o estudo atual, como modelo animal bem como a alteração
na formulação referente a base utilizada, fatores que podem ter interferido nos
resultados em relação ao tempo de fechamento da ferida.
Entretanto, a avaliação de um reparo tecidual não se dá apenas pelo
fechamento da ferida, como também pela reconstrução do tecido, epiderme, derme
e hipoderme. Portanto, neste estudo buscou-se ir além da avaliação do tempo de
fechamento da ferida, avaliou-se também histologicamente o reparo tecidual,
conforme observado na figura 9.
As feridas também foram avaliadas macroscopicamente, através dos registros
fotográficos. Na Figura 8, as feridas correspondem ao 6º dia após sua incisão. A
Figura 8 A, representa um indivíduo do grupo tratado com o veículo, e a Figura 8 B
representa um indivíduo do grupo tratado com o creme contendo ESF 1%, no qual
se observa uma maior formação de crosta, e aspecto mais volumoso das bordas.
Veículo
56
Figura 8- Análise macroscópica do reparo tecidual das feridas cutâneas no 6º dia após a incisão.
Camundongos receberam tratamento tópico do creme contendo extrato seco de A. moluccana 1% ou veículo (0,45g/ferida) duas vezes ao dia, até o fechamento. (A) representa o grupo tratado com o veículo e (B) representa o grupo tratado com creme contendo ESF 1%.
A Figura 9 representa a avaliação microscópica dos tecidos coletados após
48 h, 8 e 12 dias, que corresponderam ao início, meio e fim do processo de
cicatrização da ferida, tratada até o seu fechamento. A integridade da epiderme e
derme, infiltração de leucócitos, presença de células mortas e o reparo tecidual
foram avaliados.
No período de 48 h foram observadas algumas alterações na pele entre o
grupo tratado com o creme contendo ESF 1% e o grupo tratado com veículo (Figura
9 A e B). Comparativamente, na epiderme do grupo tratado com o creme contendo
ESF 1% observa-se uma diminuição na espessura e desorganização no estrato
córneo. Na derme, o grupo tratado com o creme de ESF 1% também apresentou
menor espessura, incluindo a diminuição de papila dérmica, maior quantidade de
vasos sanguíneos, e processo de angiogênese. Ambos os grupos apresentaram
infiltrados celulares, porém no grupo tratado com o ESF 1%, observou-se maior
quantidade de células em apoptose, dando indícios para a formação de crostas e
início do processo de cicatrização.
No tempo de 8 dias após a incisão da ferida (Figura 9 C e D), ambos os
grupos já apresentavam as feridas com tecido em fase proliferativa.
Microscopicamente, observaram-se algumas diferenças entre o grupo tratado com o
57
creme contendo ESF 1% e o veículo. A epiderme do grupo A. moluccana
apresentou-se ainda em formação e mais fina. Em ambos os grupos, observou-se a
presença de formação de crostas, visualizadas por acúmulos de células mortas,
muitos folículos pilosos, e de tecido adiposo invadindo a derme. Destaca-se a
melhor formação de tecido conjuntivo na derme do grupo tratado com o ESF 1%.
No tempo final de 12 dias (Figura 9 E, F), observou-se maior espessamento
na epiderme do grupo tratado com o ESF 1%, caracterizando uma melhor
reepitelização. A derme apresentou-se com maior quantidade de matriz extracelular
e de papila dérmica. Em ambos os grupos, observou-se a presença de células de
fibroblastos, muitos corpúsculos de Pacini, terminações nervosas livres e folículos
pilosos, descritos na literatura (YAMAOKA et al., 2014) como eventos ocorridos no
reparo tecidual cutâneo.
Os efeitos observados podem apresentar uma relação complexa com a
composição química, especialmente quando se trata de derivados vegetais. Fronza
e colaboradores (2009) sugerem que os triterpenos podem contribuir para a
proliferação e migração de fibroblastos. É possível sugerir que a presença dos
triterpenos β-sitosterol e stigmasterol, além de outros compostos, como o flavonoide
swertisina-2”-O-ramnosil já identificados nos extratos das folhas da A. moluccana
(MEYRE-SILVA et al., 1998; QUINTÃO et al., 2012), em parte, tenham contribuído
para o reparo tecidual, visto que através de administração via oral já reduziram
migração de neutrófilos e IL-1β induzidos por carragenina (QUINTÃO et al., 2012).
Porém, não é possível esta afirmação, sem que seja realizado um estudo com estes
compostos isolados, são necessários para suportar esta hipótese.
58
Figura 9 – Avaliação microscópica da ação do creme contendo extrato seco das folhas de A. moluccana 1% sobre o reparo tecidual no modelo de ferida cutânea em camundongos.
Amostras de tecidos dos camundongos dos grupos (9 A; 9 C; 9 E) tratado com o creme contendo o extrato seco das folhas (ESF) da A. moluccana 1% e dos grupos (9 B; 9 D; 9 F) tratado com o veículo (0,45g/ferida) em diferentes tempos. Todas a foram imagens foram avaliadas em áreas representativas com o aumento de 4x e 10x. Colchete duplo representa a espessura da derme e o
tecido conjuntivo; ( ) epiderme;( ) glândula sebácea; ( ) vaso sanguíneo; ( )
infiltrado celular;( ) folículo piloso; ( ) corpúsculo de Pacini.
59
5.6 Ensaio de citotoxidade pela difusão em gel de agarose (Agarose Overlay)
No presente estudo, tanto o controle positivo quanto o negativo apresentaram
resultados compatíveis em relação à citotoxidade cutânea conforme a literatura
(UNITED STATES PHARMACOPOEA, 2007). O controle positivo apresentou
citotoxidade grau 4 (indica reatividade severa, caracterizada pela zona de
reatividade estendida maior do que 1 cm além da amostra) e o controle negativo
apresentou-se totalmente citocompatível sem halo de inibição. Todas as amostras
testadas apresentaram ausência de halo de irritação (Tabela 1), ou seja, as
preparações contendo e extrato de A. moluccana e o veículo não apresentaram
nenhum grau de irritação cutânea quando comparadas ao controle positivo.
Tabela 1- Resultados obtidos no teste de irritação cutânea através do método de
agarose overlay.
Amostras Classificação
do halo
Reatividade
Triton X-100 (controle positivo)
Presença 4 - Severo
DMEM suplementado (controle negativo)
Ausência 0 – Nenhum
Creme contendo ESF 1% Ausência 0 – Nenhum
Veículo
Ausência
0 – Nenhum
ESF 1% diluído em DMSO Ausência 0 – Nenhum
Como pode ser observado na Figura 10, a ausência de halos de inibição
demonstra a presença de células viáveis, comprovando que as amostras não
induzem irritação cutânea. Como é necessário testar todas as formulações antes da
sua introdução na prática clínica, esse teste se torna um grande aliado no estudo de
novas formulações farmacêuticas, além de ser um teste confiável. Sendo assim, os
métodos in vitro são indispensáveis na avaliação de toxicidade e tornaram-se uma
parte importante dos procedimentos recomendados pelos órgãos reguladores
(CERVINKA et al., 1994).
60
A determinação in vitro do potencial citotóxico de substâncias químicas é
essencial para o monitoramento da toxicidade de cremes, emulsões e géis, já que
esses estudos são utilizados para avaliar o potencial de irritação. A grande
vantagem deste ensaio, comparado aos testes in vivo, é o melhor controle sobre as
condições experimentais, menor custo, possibilidade de testar as formulações bem
como as substâncias puras, além de rapidez nos resultados e principalmente, sem
problemas éticos, já que são utilizadas células de mamíferos (O’BRIEN; JONES;
ROCKLEY, 1990).
Figura 10 – Avaliação do teste de irritação cutânea das amostras contendo ESF 1% e do veículo através do modelo de citotoxidade por difusão em gel (Método agarose overlay).
Placa de 6 poços contendo gel de agarose em contato com as células de fibroblasto L929. Cada amostra está mergulhada no disco de papel que está centralizado do poço. Observa-se que somente o poço contendo Triton X-100 (controle positivo) apresentou halo de lise maior que 1,0 cm, representando grau de reatividade severo.
61
6 CONCLUSÕES
Os dados do presente trabalho demonstram que:
o mecanismo da ação anti-inflamatória do ESF pode ser explicado, em
parte, pela redução significativa sobre as citocinas IL-1β, TNF e da
quimiocina KC, bem como da atividade indireta da enzima
mieloperoxidase;
não houve redução no tempo de cicatrização no modelo animal de ferida
cutânea em camundongos;
a análise histológica do modelo de ferida cutânea sugere uma melhoria no
reparo tecidual, considerando a densidade da matriz extracelular, e de
queratinização na epiderme;
o creme contendo ESF não é irritante tópico, segundo o modelo de
citotoxidade por difusão em gel.
Mais estudos são necessários para elucidar melhor quais as vias de ação que
o extrato de A. moluccana está atuando, embora neste estudo, se possa comprovar
a sua ação na redução do edema, nos níveis de citocinas pró-inflamatórias e
indiretamente a redução do influxo de neutrófilos para o sitio da lesão. Tanto os
mediadores como as células pró-inflamatórias desempenham um papel muito
importante para a defesa do organismo, entretanto, o desequilíbrio dos mesmos
pode levar esse quadro a crônico, e, consequentemente patológico.
O tratamento com o extrato de A. moluccana pode representar uma opção em
muitas patologias cutâneas agudas e crônicas, incluindo o reparo tecidual, já que foi
capaz de inibir as citocinas pró-inflamatórias IL-1β, TNF e KC.
Os resultados em conjunto, norteiam o desenvolvimento de medicamentos
contendo o ESF 1% de A. moluccana, como uma alternativa terapêutica em
processos inflamatórios agudos e de reparo tecidual de feridas cutâneas.
62
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ANEXO A – Parecer da Comissão de Ética no uso de animais
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ANEXO B – Parecer da Comissão de Ética no uso de animais