Otimização de um protocolo de transformação para bactérias do gênero

Propionibacterium

Aluna: Dayanne Martins de CastroCo-orientadora: Maria Carolina de B. Grassi

Orientador: Gonçalo A. Guimarães Pereira

Você consegue imaginar sua vida SEM PETRÓLEO?

etc...

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Porque substituir o Petróleo?

Volatilidade dos preços e Instabilidade

econômica

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Porque substituir o Petróleo?

Insegurança e Instabilidade Sócio-

política

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Porque substituir o Petróleo?

Acidentes e a questão

ambiental

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Porque substituir o Petróleo?

Preocupação com o esgotamento das

reservas

Utilização de fontes renováveis para produção de matéria-prima

Produção biológica de monômeros para síntese de polímeros› Processos fermentativos› Microrganismos geneticamente

modificadosContextualização do Projeto

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Ácido Propiôni

co

Herbicidas

Flavorizantes

Drogas

Conservantes

Plástico

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Propionibacteria Classe: Actinobacterias Gram-positivas Alto conteúdo GC Anaeróbicas facultativas Microaerófilas Não formadoras de esporos Não móveis Bacilos pleiomórficos

P. acidipropionici

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Pouco se conhece sobre a genética e o metabolismo de P. acidipropionici

Estudos concentraram-se em P. acnes, P. freudenrichii, P. freudenrichii subsp. Shermanii

Caracterização de alguns plasmídeos de propionibactéria (Rehberger et al., 1990)

Vetores de transformação (Kiatpapan et al., 2000; Jore et al., 2001)

Problemas: gene marcador, alto conteúdo GC, parede celular e mecanismo de restrição

Propionibacterium acidipropionici

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

é um método não-invasivo; de fácil execução; de alta eficiência, em torno de 60-70%; não-tóxico; a estrutura e a função biológica das células alvo parece preservada ao fim do processo; por ser um método físico, é bastante versátil, sendo aplicável para uma grande variedade de tipos celulares.

Eletroporação - vantagens

Otimização da transformação

Fatores inicialmente fixados:

Tampão: 7 mM Fosfato de sódio

+ 1mM de cloreto de magnésio + 272 mM de

sacarose

Tipo de pulso:

Decaimento exponencial

Fatores variáveis:

Força do pulso elétrico

Tempo de pulso

Fase de crescimento

Temperatura de incubação

Quantidade de DNA

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Otimização da transformação

Fatores inicialmente fixados:

Tampão: 7 mM Fosfato de sódio

+ 1mM de cloreto de magnésio + 272 mM de

sacarose

Tipo de pulso:

Decaimento exponencial

Fatores variáveis:

Força do pulso elétrico

Tempo de pulso

Fase de crescimento

Temperatura de incubação

Quantidade de DNA

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Otimização da transformação

Fatores inicialmente fixados:

Tampão: 7 mM Fosfato de sódio + 1mM de cloreto de magnésio

+ 272 mM de sacarose

Tipo de pulso:

Decaimento exponencial

Fatores variáveis:

Força do pulso elétrico

Tempo de pulso

Fase de crescimento

Temperatura de incubação

Quantidade de DNA

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Otimização da transformação

Fatores inicialmente fixados:

Tampão: 7 mM Fosfato de sódio + 1mM de cloreto de magnésio

+ 272 mM de sacarose

Tipo de pulso:

Decaimento exponencial

Fatores variáveis:

Força do pulso elétrico

Tempo de pulso

Fase de crescimento

Temperatura de incubação

Quantidade de DNA

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Otimização da transformação

Fatores inicialmente fixados:

Tampão: 7 mM Fosfato de sódio

+ 1mM de cloreto de magnésio + 272 mM de

sacarose

Tipo de pulso:

Decaimento exponencial

Fatores variáveis:

Força do pulso elétrico

Tempo de pulso

Fase de crescimento

Temperatura de incubação

Quantidade de DNA

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Otimização da transformação

Fatores inicialmente fixados:

Tampão: Fosfato de sódio+ 1mM de

cloreto de magnésio

Tipo de pulso:

Decaimento exponencial

Fatores variáveis:

Força do pulso elétrico

Tempo de pulso

Fase de crescimento

Temperatura de incubação

Quantidade de DNA

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

0 1 2 3 4 5 6 70

2

4

6

8

10

12

P. acidipropionici (Glicose)

dias

OD

Otimização da transformação

Fatores inicialmente fixados:

Tampão: 7 mM Fosfato de sódio

+ 1mM de cloreto de magnésio + 272 mM de

sacarose

Tipo de pulso:

Decaimento exponencial

Fatores variáveis:

Força do pulso elétrico

Tempo de pulso

Fase de crescimento

Temperatura de incubação

Quantidade de DNA

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Otimização da transformação

Fatores inicialmente fixados:

Tampão: 7 mM Fosfato de sódio + 1mM de cloreto de magnésio

+ 272 mM de sacarose

Tipo de pulso:

Decaimento exponencial

Fatores variáveis:

Força do pulso elétrico

Tempo de pulso

Fase de crescimento

Temperatura de incubação

Quantidade de DNA

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Transformação de Propionibacterium

Estabelecer um protocolo eficiente

para a transformação de Propionibacterium

por eletroporação.

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Construção de um vetor de transformação

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

pUC_pRGO1

Construção de um vetor de transformação

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Marcador 1: EGFP

Construção de um vetor de transformação

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Marcador 2: tsr ou hph

Promotor e Terminador: gene

MMC

Tiostrepton

rep amp orf4 orf5 orf6

repArepB

pBKT1

Higromicina

rep amp orf4 orf5 orf6

repArepB

pBKT1

Double-joint PCR

Primeiro ROUND

Adicionar caudas de homologia aos primers (25-30 pb)

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Yu et al., 2004.

Resultados esperados

O que já temos?

Double-joint PCR

Segundo ROUND – 1ª reação

Segundo ROUND – 2ª + reações

Assembly reaction

As caudas de homologia funcionam

como primers

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Yu et al., 2004.

Resultados esperados

O que já temos?

Double-joint PCR

Terceiro ROUND

Amplificação do produto final utilizando nested primers

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Yu et al., 2004.

Resultados esperados

O que já temos?

Construção de um vetor de transformação

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

EGFP

tsr

hph

P_mmc T_mmc

Construção de um vetor de transformação

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

pUC_pRGO1

pBKg1

+

Construção de um vetor de transformação

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

+

+pBKg1

Construção de um vetor de transformação

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

pBKHg1

Construção de um vetor de transformação

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

pBKTg1

Construção de um vetor de transformação

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Quan; Tian, 2009

Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR)

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Análise do

processo

Definição das

variáveis

Definição das

respostas

desejadas

Planejamento experimental

Estatística

Bom sens

o

Fatorial FracionadoPlackett &

BurmanFatorial completo

Verificação dos efeitos das variáveis

Otimização da transformação (DCCR)

Pulso Elétrico (kV) 0,8 1,2 1,5

0,3 2,0

Tempo (ms)2,2 3,2 4,2

0,8 5,6

Fase de crescimento (OD) 0,5 0,7 0,9

0,2 1,2

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Otimização da transformação (DCCR)

Quantidade de DNA (ng) 10 15 20

3,1 26,9

Temperatura de incubação (°C) 24 30 36

15,7 44,3

Número de experimentos = 25 + 10 + 2 = 44 x 3 = 142

Introdução

Materiais e Métodos

Objetivo

Resultados esperados

O que já temos?

Double-joint : tsr, hph e EGFP

Plasmídeo pUC_pRGO1 Otimização do meio de seleção: crescimento

em dois dias.

Introdução

Materiais e Métodos

O que já temos?

Resultados esperados

Objetivo

Alguns resultados...

Introdução

Materiais e Métodos

O que já temos?

Resultados esperados

Objetivo

Obter um protocolo eficiente e bem

estabelecido para a transformação de

Propionibacterium por

eletroporação que

renda aproximadamente 104

transformantes / µg DNA.

Obrigada!