Teseguaiaca.ufpel.edu.br/.../1/tese_karina_lemos_goularte.pdf · 2018-04-10 · 1 KARINA LEMOS...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Faculdade de Veterinária

Programa de Pós-Graduação em Veterinária

Tese

Sistema de gestão da qualidade para Centros de

Coleta e Processamento de Sêmen bovino:

elaboração, implantação e impacto

Karina Lemos Goularte

Pelotas, 2014.

http://www.ufpel.tche.br/

1

KARINA LEMOS GOULARTE

Sistema de gestão da qualidade para Centros de Coleta e Processamento de

Sêmen bovino: elaboração, implantação e impacto

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área do conhecimento: sanidade animal).

Orientador: Thomaz Lucia Junior Co-orientador (es): Arnaldo Diniz Vieira

Eduarda Hallal Duval Rafael Gianella Mondadori

Pelotas, 2014.

1

Dados de catalogação na fonte:

( Gabriela Machado Lopes – CRB-10/1842 )

G694s Goularte, Karina Lemos

Sistema de gestão da qualidade para centros de coleta e

processamento de sêmen bovino: elaboração, implantação e impacto /

Karina Lemos Goularte ; orientador Thomaz Lucia Junior - Pelotas, 2014.

88 f. : il.

Tese (Doutorado) Programa de Pós- Graduação em Veterinária.

Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2014.

1. Appcc 2. Sêmen bovino 3. Qualidade 4. Marcador 5. Fertilidade I.

Lucia Junior, Thomaz (orientador) II.Título.

CDD 636.21

2

Banca Examinadora: Professor Doutor Thomaz Lucia Junior (orientador), Doutor em Medicina Veterinária pela Universidade de Minnesota, EUA. Professor Doutor Elci Lotar Dickel, Doutor em Ciências Veterinárias pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Professor Doutor Bernardo Garziera Gasperin, Doutor em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Santa Maria. Doutor José Carlos Ferrugem Moraes, Doutor em Ciências Veterinárias pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

3

Agradecimentos

Ao programa de Pós-Graduação em Veterinária da UFPel pela oportunidade

de realização do doutorado.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

pela concessão da bolsa de estudos e a oportunidade de realização do doutorado

sanduíche, que agregou muito na minha formação profissional e pessoal.

Ao professor orientador Thomaz Lucia Junior por acreditar na minha

capacidade profissional, pelo apoio e os ensinamentos passados durante o

doutorado.

Ao meu companheiro Murilo pelo incondicional apoio ao meu crescimento

profissional e pessoal.

À minha colega e amiga Eduarda Hallal Duval pela ajuda, pelos

ensinamentos obtidos durante a elaboração e execução do meu trabalho e, a

amizade nascida durante a execução desse trabalho.

Ao professor Rafael Gianella Mondadori pela inegável ajuda e incentivo

quanto ao meu crescimento.

Aos professores integrantes do grupo ReproPEL Carine Dahl Corcini,

Arnaldo Diniz Vieira, Ivan Bianchi e Antônio Sérgio Varela Junior pelo apoio e ajuda

nos momentos necessários.

Aos colegas do ReproPEL Fabiana Moreira, Elisângela Mirapalheta Madeira,

Elisa Caroline dos Santos, Carlos Eduardo Ranquetat Ferreira e Jorgea Pradie pela

ajuda, apoio, companheirismo, amizade e momentos únicos vividos nesses 4 anos

de convivência.

Aos alunos da graduação, estagiários do laboratório ReproPEL, pela ajuda e

oportunidade de convivência nesse período.

Aos meus pais, Julieta e Ubirajara, pelo exemplo que me foi dado, apoio e

incentivo na minha caminhada.

As minhas irmãs, Cristina e Fabiana, e “irmãos”, Celso e Leonardo, pelo

incentivo e apoio que me foi fornecido.

4

Aos funcionários da multinacional ABS Pecplan por acreditarem no meu

trabalho e apoiarem na execução do mesmo.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse

trabalho e, consequentemente, para a minha formação...

MUITO OBRIGADA!

5

Resumo

Goularte, Karina Lemos. Sistema de gestão da qualidade para Centros de Coleta e Processamento de Sêmen bovino: elaboração, implantação e impacto. 2014. 88f. Tese (Doutorado em Sanidade Animal) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2014. Apesar de o Brasil ter comercializado mais de 12 milhões de doses de sêmen bovino no ano de 2012, ainda não existe um padrão de processamento das doses comercializadas pelos estabelecimentos cadastrados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. A hipótese do presente trabalho é de que a elaboração e a implantação de um sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) para um centro de coleta e processamento de sêmen bovino seja capaz de identificar as etapas potencialmente danosas para a viabilidade das doses, diminuir a sua rejeição e melhorar a sua qualidade final, a partir da adoção de medidas preventivas e de controle do processo. A implantação do sistema APPCC identificou as etapas que apresentavam perigos para a qualidade das doses de sêmen produzidas, ocorrendo redução na contaminação durante o seu processamento (P<0,05), Também houve um incremento na motilidade progressiva e na integridade das membranas plasmática e acrossomal dos espermatozóides (P<0,05) após a implantação do sistema APPCC, bem como uma redução na rejeição de partidas e doses de sêmen (P<0,05), o que se refletiu em uma diminuição dos custos de produção. Assim, a utilização do sistema APPCC resultou na padronização do processo de produção de sêmen bovino congelado, com incremento da qualidade seminal, redução na rejeição de doses e nos custos para a indústria. Adicionalmente, durante o programa de doutorado sanduíche na Universidade de Calgary (Canadá),foi avaliado o envolvimento da enzima conversora da angiotensina no processo de capacitação espermática e fertilização in vitro em bovinos. Após o bloqueio da atividade da enzima com o inibidor específico captopril,observou-se níveis semelhantes de fosforilação da proteína tirosina e de clivagem e desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto, em comparação com o controle (P>0,05). Portanto, o presente estudo sugere que a enzima conversora da angiotensina não é necessária para o processo de capacitação espermática nem está envolvida na fertilização in vitro, em bovinos. Palavras-chave: APPCC; sêmen bovino; qualidade; marcador; fertilidade.

6

Abstract

Goularte, Karina Lemos. Quality management system for bull artificial insemination centers: design, execution and impact. 2014. 88f. Tese. (Doutorado em Sanidade Animal) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2014. Although more than 12 million doses of bull frozen semen were sold in Brazil in 2012, the production process of the doses sold by the artificial insemination centers registered in the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply is not yet standardized. The hypothesis of the present study is that the design and implementation of a hazard analysis and critical control points (HACCP) system in a bull artificial insemination center can identify steps potentially harmful to the viability of semen doses, to decrease their rejection and to improvement their final quality, after the adoption of preventive and process control measures. The implementation of the HACCP system identified hazardous steps for the quality of the produced semen doses, leading to a reduction in their contamination during processing (P<0.05). There was also an increase in progressive motility and plasma membrane and acrosome integrity of spermatozoa (P<0.05) after implementing the HACCP system, which resulted in reduced rejection of semen batches and doses (P<0.05) and decreased production costs. Thus, the execution of the HACCP system standardized the production process of bull frozen semen, with improved sperm quality and reduction in both rejection of doses and costs to the industry. Additionally, during the sandwich doctorate program at the University of Calgary (Canada), the involvement of angiotensin converting enzyme in the capacitation process and in vitro fertilization in cattle was evaluated. After blocking the enzyme’s activity by the specific inhibitor captopril, there were similar levels of tyrosine phosphorylation and cleavage and embryonic development until the blastocyst stage in comparison with the control group (P>0.05). Therefore, the present study suggests that the angiotensin converting enzyme is neither required for sperm capacitation nor involved in in vitro fertilization in cattle. Keywords: HACCP; bovine semen; quality; marker; fertility.

7

Lista de Figuras

Artigo 1 APPCC: um modelo para Centros de Coleta e

Processamento de Sêmen Animal

Figura 1 Modelo de um fluxograma para centro de coleta e

processamento de sêmen animal.....................................

33

Quadro 1 Determinação do PCC...................................................... 34

Quadro 2 Monitoramento do(s) PCC(s)............................................ 35

Quadro 3 Resumo do plano APPCC................................................ 36

Artigo 3 Bovine angiotensin-converting enzyme testis

specific is neither required for sperm capacitation

nor released during this phenomenon

Figure 1 Tyrosine phosphorylation before (1) and after incubation

for 4.5 h in Sp-TALP (2), 100 µM of ouabain (3) or 100

µM of ouabain + 10 µM of captopril (4). PL = protein

marker ladder – kDa…………………………………………

79

Figure 2 Germinal ACE content before (1) and after incubation for

4.5 h in Sp-TALP (2), 100 µM of ouabain (3) or 100 µM

of ouabain + 10 µM of captopril (4). PL = protein marker

ladder – kDa………………………………………………….

80

8

Lista de Tabelas

Artigo 2 Impacto da implantação do sistema APPCC em um

centro de coleta e processamento de sêmen bovino

Tabela 1 Contagens microbianas médias (UFC/mL) nos

diferentes pontos de coleta em um CCPS bovino, antes

e após a implantação do sistema APPCC........................

54

Tabela 2 Parâmetros de qualidade do sêmen bovino após o

descongelamento, antes e após a implantação do

sistema APPCC................................................................

55

Tabela 3 Produção do Centro de Coleta e Processamento de

Sêmen bovino, durante o período de 4 meses antes e 4

meses após a implantação do sistema APPCC...............

56

Artigo 3 Bovine angiotensin-converting enzyme testis

specific is neither required for sperm capacitation

nor released during this phenomenon

Table 1 Total, progressive and linear motility of bull spermatozoa

after incubation for 4.5 h (n = 150 sperm samples)……...

77

Table 2 Rates of cleavage and embryo development to the

blastocyst stage after in vitro fertilization using bull

sperm with or without (Control) captopril prior to

exposition to cumulus-oocyte complex……………………

78

9

Lista de Abreviaturas

APPCC Análise de perigos e pontos críticos de controle

ACE Angiotensin converting enzyme

BPF Boas práticas de fabricação

BPP Boas práticas de processamento

COC Complexo cumulus oocyte

ECA Enzima conversora da angiotensina

ACE Angiotensin Converting Enzyme

GPI Glycosylphosphatidylinositol

ML mililitro

OMC Organização mundial do comércio

PC Ponto de controle

PCC Ponto crítico de controle

POP Procedimento operacional padrão

PPHO Procedimento padrão de higiene operacional

UFC Unidade formadora de colônia

µL Microlitro

µM Micromolar

10

Sumário

1. Introdução.................................................................................................. 12

2. Objetivos.................................................................................................... 16

3. Artigos........................................................................................................ 17

3.1 Artigo 1 - APPCC: um modelo para Centros de Coleta e Processamento

de Sêmen Animal.......................................................................................

18

Resumo...................................................................................................... 18

Introdução.................................................................................................. 18

Elaboração do APPCC.............................................................................. 20

Histórico de revisão do plano..................................................................... 28

Referências................................................................................................ 30

3.2 Artigo 2 - Impacto da implantação do sistema APPCC em um centro de

coleta e processamento de sêmen bovino.................................................

37

Resumo...................................................................................................... 38

Introdução.................................................................................................. 39

Metodologia............................................................................................... 40

Resultados................................................................................................. 43

Discussão................................................................................................... 44

Conclusão.................................................................................................. 49

Referências................................................................................................ 50

11

3.3 Artigo 3 - Bovine angiotensin-converting enzyme testis specific is neither

required for sperm capacitation nor released during this

phenomenon…………………………………………………………………….

57

Summary………………………………………………………………………... 58

Introduction……………………………………………………………………... 59

Results………………………………………………………………………….. 61

Discussion………………………………………………………………………. 62

Materials and Methods………………………………………………………… 66

References……………………………………………………………………… 71

4. Conclusão geral………………………………………………………………... 81

5. Referências…………………………………………………………………….. 82

6. Anexo…...………………………………………………………………………. 85

7. Apêndice………………………………………………………………………... 87

12

1 INTRODUÇÃO

Em 2012, foram comercializadas mais de 12 milhões de doses de sêmen

bovino no Brasil, o que representa um crescimento de 74.4% na atividade, em

comparação com o ano de 2002 (ASBIA, 2012; 2002). Segundo o Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), a bovinocultura é um dos principais

destaques do agronegócio brasileiro no cenário mundial, sendo o Brasil detentor do

segundo maior rebanho do mundo, com cerca de 200 milhões de cabeças.

Apesar do crescimento na comercialização de doses de sêmen no Brasil,

apenas 10% das fêmeas em idade reprodutiva são inseminadas (ASBIA, 2012). Em

alguns casos, o uso da inseminação artificial depende da importação de sêmen

(BARBOSA& MACHADO, 2008), que responde por 46,7% do total das doses de

sêmen comercializadas em 2012 (ASBIA, 2012). Apesar de os centros de coleta e

processamento de sêmen (CCPS) bovino serem responsáveis pelo processamento

de 53,3% das doses de sêmen comercializadas no Brasil, estes indicadores

mostram que o mercado a ser explorado ainda é bastante amplo,

Em função de serem fiscalizados pelo MAPA, os CCPS devem cumprir uma

série de exigências quanto à estrutura física, documentação, sanidade do rebanho,

entre outros aspectos. Apesar destas exigências, não existe ainda um padrão de

processamento das doses comercializadas. Por outro lado, em 2012, o Brasil

exportou 226.020 doses de sêmen bovino congelado, em especial para Canadá,

Paraguai e Colômbia (ASBIA, 2012). Segundo o MAPA, a partir de 04 de dezembro

de 2013 o Brasil pode exportar sêmen e embriões bovinos para a Costa Rica,

evidenciando o crescente mercado existente. Porém, para a introdução de seus

produtos e a sua manutenção em um mercado cada vez mais competitivo, torna-se

necessário a padronização de seu processamento e dos serviços oferecidos, com

incremento da qualidade.

13

O sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC),

utilizado inicialmente na indústria de alimentos, vem ao encontro dessa necessidade.

Além de padronizar a qualidade da produção, o sistema APPCC permite identificar

avaliar e controlar os perigos significativos para a qualidade e a segurança do

produto (FAO & WHO, 2009). Além disso, sua implantação satisfaz à legislação

nacional e internacional, dando segurança e favorecendo a exportação (RIBEIRO-

FURTINI & ABREU, 2006).

O processo de criopreservação resulta em redução da viabilidade

espermática, quando comparado com o sêmen fresco, caracterizada principalmente

pelo declínio da motilidade (WATSON, 2000). Um crescimento excessivo de

bactérias, provenientes da microflora do prepúcio ou da genitália externa do touro

(THIBIER & GUERIN, 2000) ou introduzidas durante a coleta ou o processamento do

sêmen, no ambiente da sala de coleta ou no laboratório (KAPROTH & KRICK,

2004), pode resultar em aglutinação espermática e diminuição da motilidade

(ALTHOUSE, 2008; MORETTI et al., 2009). Portanto, mesmo que os CCPS realizem

exames sanitários regularmente para o controle de doenças transmitidas através do

sêmen, para evitar uma queda na viabilidade e qualidade das doses produzidas,

deve-se avaliar todo o processo de produção de doses de sêmen congeladas,

identificando-se as etapas potencialmente perigosas no que diz respeito à

contaminação microbiológica das amostras, implementando medidas preventivas

e/ou ações corretivas.

O sistema APPCC descreve detalhadamente as atividades realizadas e

representa uma cópia fiel do sistema de produção, com a descrição de seu

fluxograma, a identificação de seus perigos com os pontos de controle e/ou pontos

críticos de controle, com registro de suas operações, com as revisões e correções

necessárias para garantir a segurança e qualidade do produto final. Assim, a

elaboração de um sistema APPCC para CCPS foi proposto no projeto “Centro de

rastreabilidade sanitária e genética de sêmen”, aprovado no Edital

MCT/CNPq/MAPA/SDA nº 64 em 2008, buscando a implantação de um centro

colaborador em Defesa Agropecuária, vinculado ao MAPA, junto ao laboratório de

reprodução animal da Faculdade de Veterinária da UFPel (ReproPel). O sistema

visou auxiliar o MAPA no que diz respeito a fiscalização dos CCPS, descrevendo

todo o sistema de produção apontando etapas chave para a qualidade do produto

14

final. Assim, além de padronizar os processos de produção em cada CCPS, o

sistema ajudará o MAPA no momento da realização de auditorias.

Somando-se a garantia de alguns parâmetros seminais e microbiológicos

provida pela implantação do APPCC, para a indústria da inseminação artificial,

touros testados com alta capacidade fertilizante são essenciais para garantir a

eficiência reprodutiva (FOOTE & PARKS, 1993; MOURA, 2005), apesar de existirem

diferenças entre machos ou amostras e estas não poderem ser explicadas pelas

avaliações convencionais da viabilidade espermática ou morfologia (SAACKE et al.,

2000). Dessa maneira, a expectativa de dispor de marcadores que indiquem o

potencial reprodutivo de cada indivíduo tem sido o foco de inúmeras pesquisas, que

provavelmente poderão contribuir significativamente na escolha de reprodutores

superiores (JOBIM et al., 2009). A enzima conversora da angiotensina (ECA) é uma

ectoenzima ancorada na membrana plasmática que cataliza a conversão da

angiotensina I para o octapeptídeo ativo angiotensina II (CORVOL et al., 1995). A

ECA existe em duas isoformas: somática (sECA) e testicular ou germinal (gECA),

sendo esta expressa exclusivamente sobre a célula germinal haplóide no testículo e

caracterizada por uma região N-terminal espécie-específica e dividindo a mesma

região C-terminal com a sECA (SIBONY et al., 1993; SIBONY et al., 1994).

Fuchs et al (2005) não encontraram diferença na concentração, morfologia

ou motilidade espermática após a capacitação, comparando o sêmen de

camundongos tipo selvagem e homozigotos mutantes. Porém, após o teste de

ligação a zona pelúcida (ZP), os espermatozóides dos machos do tipo selvagem

ligaram-se facilmente a ZP (33,2 espermatozóide/ovócito) enquanto os

espermatozóides dos machos mutantes tiveram uma grande redução (1,2

espermatozóide/ovócito), demonstrando a importância da ECA no processo de

fertilização. Estes achados concordam com os dados de Hagaman et al (1998), que

relataram que espermatozóides de camundongos knockout-ECA apresentaram

inabilidade para migrar para o oviduto e deficiência de ligarem-se a ZP.

A capacidade fertilizante do espermatozóide é alcançada após a

capacitação, um processo maturacional que leva ao desenvolvimento do estado de

fertilização competente, in vivo ou in vitro (YANAGIMACHI, 1994). A fosforilação das

proteínas espermáticas é importante para a capacitação, especialmente nos

resíduos de tirosina (NAZ & RAJESH, 2004), sendo esta relacionada com a

capacitação espermática em bovinos (GALANTINO-HOMER et al., 2004) e

15

considerada o evento marca da capacitação (GALANTINO-HOMER et al., 1997). A

ECA é tirosina fosforilada no ectodomínio (SANTHAMMA et al., 2004), podendo

estar envolvida no processo de capacitação e, por conseguinte, na aquisição da

capacidade fertilizante. O papel exato da ECA no trato reprodutivo masculino e sua

real função no processo de fertilização não estão completamente elucidados,

principalmente em bovinos, podendo esta ser um candidato a marcador para

fertilidade na espécie.

Portanto, visando padronizar o processo de produção de doses de sêmen e

melhorar a qualidade do produto final comercializado pelos CCPSs e, também,

buscar um marcador de fertilidade para sêmen bovino o presente trabalho levanta

duas hipóteses: (1) que a implantação do sistema APPCC em um CCPS bovino

tenha como benefícios a padronização da produção de doses de sêmen, com

incremento na qualidade e (2) que a ECA esteja envolvida no processo de

fertilização em bovinos, podendo, futuramente, ser utilizada como marcador de

fertilidade.

16

2 OBJETIVOS

Objetivo Geral

Elaboração e implantação de um sistema de Análise de Perigos e Pontos

Críticos de Controle em um centro de coleta e processamento de sêmen bovino.

Objetivos Específicos

Determinação dos possíveis perigos, pontos de controle (PC) e pontos

críticos de controle (PCC) relacionados ao processamento do sêmen

bovino.

Estabelecimento de protocolos de boas práticas de processamento (BPP),

procedimentos-padrão de higiene operacional (PPHO) e análise de

perigos e pontos críticos de controle (APPCC) que sirvam de modelos

para centros de coleta e processamento de sêmen bovino.

Otimização da eficiência do processo de criopreservação de sêmen

bovino, com redução dos custos e certificação da qualidade do produto

final.

Avaliar os efeitos do bloqueio da atividade da enzima conversora da

angiotensina em bovinos sobre parâmetros como: movimento

espermático, fosforilação de resíduos de tirosina (avaliados no processo

de capacitação espermática), taxas de clivagem e blastocisto após

fertilização in vitro.

Contribuir com os órgãos governamentais responsáveis pela fiscalização

dos centros de coleta e processamento de sêmen animal.

17

3 ARTIGOS

3.1 Artigo 1

Artigo formatado de acordo com as normas da revista Theriogenology

APPCC: um modelo para Centros de Coleta e Processamento de

Sêmen Animal

K.L. Goularte1*; E.H. Duval2; R.G. Mondadori 1,3; E.M. Madeira1, T. Lucia Jr 1

1ReproPEL, Faculdade de Veterinária, 2LIPOA, Faculdade de Veterinária, 3Instituto

de Biologia

Universidade Federal de Pelotas, 96010-900, Pelotas-RS, Brazil

*Autor para correspondência: ReproPel, Faculdade de Veterinária,

Universidade Federal de Pelotas,

Campus Capão do Leão, 96010-900, Pelotas, RS, Brasil;

Tel./fax: (55) 53-32759161. E-mail address: [email protected]

mailto:[email protected]

18

APPCC: um modelo para Centros de Coleta e Processamento de

Sêmen Animal

K.L. Goularte1*; E.H. Duval2; R.G. Mondadori 1,3, E.M. Madeira1, T. Lucia Jr 1.

1ReproPEL, Faculdade de Veterinária, 2LIPOA, Faculdade de Veterinária, 3Instituto

de Biologia


Resumo

O sistema de análise de perigos e pontos críticos de controle (APPCC) permite uma

abordagem científica e sistemática de controle dos processos identificando e

atuando sobre as etapas onde possam ocorrer perigos ou situações críticas. A

implantação do sistema satisfaz à legislação nacional e internacional, dando

segurança e abrindo as portas para a exportação. O objetivo do presente trabalho foi

elaborar um modelo de APPCC a ser implantado em centros de coleta e

processamento de sêmen animal, o qual permitirá um maior controle na produção

das doses de sêmen congelado bem como a certificação do produto oferecido. A

elaboração baseou-se na literatura disponível sobre a utilização do sistema na

indústria de alimentos e, também, nos resultados obtidos após a implantação do

APPCC em um centro de coleta e processamento de sêmen bovino. A elaboração

do plano levou em consideração as etapas de implementação do sistema. Cada

linha de produção apresenta um fluxograma diferente, devendo portanto, o plano ser

avaliado e adaptado para cada uma. A utilização do sistema nos centros de coleta e

processamento de sêmen animal permite um maior controle do processo de

produção de doses de sêmen congelado, diminuindo-se as perdas oriundas do

processamento e, por conseguinte, a elaboração de um produto com qualidade

certificada, sendo o mesmo mais competitivo possibilitando a inserção e manutenção

no mercado externo.

Paralavras-chave: APPCC, qualidade sêmen, centro de coleta

1. Introdução

Entende-se por Centro de Coleta e Processamento de Sêmen (CCPS) o local

em que se reúnem animais para a realização da coleta e processamento do sêmen

[1]. Esses centros ficam sob fiscalização do Ministério da Agricultura, Pecuária e

19

Abastecimento (MAPA) cumprindo exigências com relação a estrutura física,

documentação, exames sanitários entre outros. Esses requisitos são avaliados para

obtenção e manutenção do registro como CCPS.

O sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) vem ao

encontro de qualquer sistema de produção, permitindo uma abordagem científica e

sistemática de prevenção e controle dos processos, identificando e atuando sobre as

etapas onde possam ocorrer perigos ou situações críticas [2]. A utilização desse

sistema já vem sendo amplamente aplicada em vários ramos da indústria, além da

alimentícia [3]. Logo, a implantação do sistema APPCC nos CCPSs permite um

maior controle no sistema de produção de doses de sêmen congeladas e,

consequentemente, incremento na qualidade das doses produzidas.

O oferecimento de um produto com qualidade certificada permite as empresas

uma maior concorrência no mercado, atingindo inclusive mercados externos.

Segundo o Ministério do Desenvolvimento, Indústria e Comércio Exterior-Brasil, a

empresa que exporta adquire vantagens em relação aos concorrentes internos,

pois diversifica mercados, aproveita melhor sua capacidade instalada, aprimora a

qualidade do produto vendido, incorpora tecnologia, aumenta sua rentabilidade e

reduz custos operacionais.

Em 1998, o Ministério da Agricultura e Abastecimento instituiu, através da

portaria número 46, o SISTEMA DE ANÁLISE DE PERIGOS E PONTOS CRÍTICOS

DE CONTROLE - APPCC a ser implantado, gradativamente, nas indústrias de

produtos de origem animal sob o regime do Serviço de Inspeção Federal – SIF,

considerando a necessidade de atendimento aos compromissos internacionais

assumidos no âmbito da Organização Mundial de Comércio (OMC) e consequentes

disposições do Codex Alimentarius, assim como no do MERCOSUL. Logo, a

20

implantação do APPCC satisfaz à legislação nacional e internacional, dando

segurança e abrindo as portas para a exportação [4].

A aplicação do sistema em diferentes áreas de produção vem demonstrando

seus benefícios como, controle de indicadores de condições higiênico-sanitárias no

leite [5], redução dos custos para manter a qualidade em planta de processamento

de pescados [6] e medidas preventivas para pontos de controle e pontos críticos de

controle na produção suína [7]. Assim, a utilização do sistema APPCC na indústria

de material genético animal, além de promover a padronização dos serviços

oferecidos garantirá a qualidade do produto final, tornando o mesmo competitivo e

atrativo para o mercado externo.

O modelo aqui apresentado baseou-se nos princípios do sistema já utilizados na

indústria de alimentados [9], nos resultados obtidos com a implantação do APPCC

em um CCPS bovino (dados não mostrados) e, também, no depósito de pedido de

patente do processo gerado nesse trabalho [8]. Vale ressaltar que, as indústrias

apresentam fluxograma diferente, ou seja, a avaliação do modo de produção deverá

ser realizado por um profissional capacitado, bem como as adaptações necessárias

a cada linha de produção.

2. Elaboração do APPCC

A elaboração do sistema é realizada baseando-se nas etapas abaixo

relacionadas.

2.1 Definição dos objetivos

Nesta etapa são identificados os objetivos da implantação do sistema na

empresa em questão, como maior controle do processo de produção de doses de

sêmen congeladas; diminuição das perdas oriundas do processamento inadequado

21

ou da falta de controle sobre alguma etapa do processo; produção de doses de

sêmen bovino congeladas com qualidade certificada; inserção no mercado externo;

entre outros.

2.2 Identificação e organograma da empresa

A elaboração do plano inicia pela identificação, razão social, endereço e telefone

da empresa, o que por ela é produzido e o destino de sua produção (mercado

interno e/ou externo). Devem ser identificados os setores envolvidos no

desenvolvimento, implantação e manutenção do sistema, sendo nomeados os

responsáveis e suas respectivas funções e atribuições pela elaboração, implantação,

acompanhamento e revisão do programa.

2.3 Descrição do produto e uso esperado

Nessa etapa, o produto a ser comercializado deve ser descrito, por exemplo: “o

produto sêmen bovino congelado é composto por sêmen bovino adicionado de

diluente para sua manutenção e preservação”.

As informações que estão contidas nessa etapa são a composição do produto

como matéria-prima e demais ingredientes, as características importantes do

produto final, como motilidade e vigor mínimos aceitáveis, as formas de uso

esperado como inseminação artificial e fertilização in vitro, as características da

embalagem e as instruções contidas na mesma como número da partida

correspondente a data do congelamento, nome ou número de registro do CCPS no

MAPA, nome e número de registro genealógico definitivo do doador, código da raça

- padronizado internacionalmente por duas letras, e no caso de sêmen sexado letra

M para Macho e F para Fêmea) [1].

22

Nessa etapa é importante mencionar também os cuidados durante a distribuição

e comercialização onde pode ser citado a manutenção das doses de sêmen em

nitrogênio líquido, devendo este ser periodicamente medido para evitar danos às

amostras congeladas.

2.4 Fluxograma do processo

A descrição do processo de produção das doses de sêmen bovino congelado

facilita a identificação de perigos e etapas potencialmente danosas para a qualidade

do produto final. O fluxograma compreende desde a avaliação do status sanitário do

rebanho, toalete dos touros até o armazenamento e posterior liberação das doses

para comercialização. A descrição do processo segue a ordem do fluxograma.

Ainda, para cada etapa do processamento, o POP (procedimento operacional

padrão) correspondente deve ser elaborado. Cada POP contempla as seguintes

informações: operação a ser realizada, responsável, descrição da atividade, ação

preventiva, monitoramento, ação corretiva e registro. Na figura 1 encontra-se um

modelo de fluxograma para centro de coleta e processamento de sêmen animal,

ressaltando que cada CCPS terá seu próprio fluxograma.

2.5 Classes e tipos de perigos contemplados no plano

Refere-se aos possíveis perigos encontrados desde a coleta do sêmen até o

envase, congelamento e liberação do produto final.

Perigo por definição é agente biológico, químico ou físico presente ou adicionado

ao ejaculado, com potencial para causar perda da viabilidade, da qualidade do

produto final ou representar risco para a sanidade do rebanho onde a dose for

utilizada (adaptado de [9]).

23

Em um CCPS são considerados perigos biológicos (B) bactérias, vírus ou

protozoários, perigos químicos (Q) alguns componentes utilizados na elaboração do

diluente como o crioprotetor glicerol e resíduos dos desinfetantes utilizados na

limpeza do material. Perigos físicos (F) são considerados presença de maravalha,

poeira, terra ou qualquer objeto que possa causar prejuízo na qualidade da amostra

ou risco ao animal em que a dose de sêmen será utilizada. Temperatura elevada ou

reduzida do diluente no momento da diluição podendo causar choque térmico e

resíduo de água no material utilizado para coleta, nesse caso também são

considerados perigos físicos. Adição errônea do volume de diluente interfere na

padronização das doses produzidas. Todos estes perigos citados acima são

exemplos que podem ser modificados para cada estabelecimento.

A elaboração de um formulário identificando todas as etapas do processamento,

com os perigos potenciais para cada etapa, a respectiva análise dos perigos e suas

medidas preventivas auxiliam na tomada de decisões, sendo importante anexá-lo ao

plano. Cada etapa pode apresentar mais de um perigo, devendo os mesmos serem

identificados e listados. Os perigos referentes a etapas posteriores ao fluxograma,

que não podem ser controlados no estabelecimento, podem ser listados e

identificados em formulário próprio.

2.6 Análise dos perigos e medidas preventivas

Esta etapa é efetuada contemplando a identificação dos perigos significativos,

do risco e da severidade de cada perigo e caracterização das medidas preventivas

correspondentes. Para garantir a segurança, sempre que necessário deve-se

modificar o processo. Esta etapa serve de base para identificação dos pontos

críticos de controle (PCCs).

24

2.6.1 Risco e Severidade dos Perigos

Perigos Biológicos: risco zero não existe no mundo biológico [10], mas ele deve

ser o mais próximo possível a este valor. Para avaliação da severidade do perigo

biológico deve ser levada em consideração a recomendação da OIE [11] de

contagens abaixo de 5000 UFC/ml de sêmen processado.

Perigos Químicos: Na avaliação da severidade destes perigos deve ser levado

em consideração o fato de o componente ser ou não espermicida, sendo altamente

prejudicial para a amostra ou apenas diminuir a viabilidade dos espermatozóides

[12]. É importante lembrar que a composição correta dos diluidores é fundamental

para o sucesso da criopreservação [13].

Perigos Físicos: Presença de maravalha e/ou terra no ejaculado deve ser

avaliada em termos de quantidade e no caso de excesso destes contaminantes o

ejaculado deve ser descartado. O espermatozoide não é adaptado a sofrer as

variações de temperatura envolvidas na criopreservação, devendo estas, assim

como os tempos de resfriamento e congelamento, serem obedecidas [14,15].

2.6.2 Limites críticos e de segurança

Limite crítico por definição é um critério, valor ou atributo, que separa o

aceitável do inaceitável [9], enquanto que o limite de segurança é um critério mais

estreito ou restrito que o limite crítico, sendo parâmetro utilizado para reduzir o risco

[2]. Cada CCPS deve definir o limite crítico e de segurança para os perigos

identificados, como por exemplo a concentração de glicerol no diluente citrato-gema

para sêmen bovino, que pode variar de 6 a 8% [16]. O limite crítico será um valor,

nesse caso, o qual encontra-se fora da variação permitida e, o de segurança,

compreendido dentro da variação.

25

2.6.3 Medidas preventivas

As medidas preventivas devem estar listadas em formulário próprio,

identificando-se a etapa, os perigos encontrados (B e/ou Q e/ou F) com suas

respectivas medidas.

Exemplo:

Etapa – pré-coleta (toalete do touro);

Perigos encontrados: F - maravalha, terra; Q - resíduo do desinfetante e B -

microrganismos contaminantes;

Medidas preventivas: Higiene Pessoal dos Colaboradores, Realização da

toalete conforme descrito (POP), higienizando o prepúcio externamente e

internamente, secando a região previamente a coleta.

2.7 Identificação dos Pontos Críticos de Controle

As Boas Práticas de Fabricação (BPF) e os Procedimentos Padrão de Higiene

Operacional (PPHO), juntamente com o Sistema de Análise de Perigos e Pontos

Críticos de Controle (APPCC) formam os Programas de Autocontrole conforme as

Circulares Nº 175 e Nº 176 de 2005 [17,18], para indústrias de alimentos. A

implantação desses programas é capaz de controlar muitos dos perigos identificados

(Pontos de Controle – PC). Já, os perigos que não são controlados através dos

programas de BPF e PPHO, e não passarão por etapas subsequentes capazes de

colocá-los sob controle, são nomeados de Ponto Crítico de Controle – PCC. Estes

devem ser mantidos sob controle através da aplicação de medidas preventivas.

Estes conceitos são igualmente aplicados para fluxogramas de produção em

indústrias de difusão de material genético animal.

26

No fluxograma de processo e nas planilhas, os PCCs devem estar

representados numa sequência numérica de acordo com a ordem em que são

detectados, com indicação, entre parênteses, se o perigo é de natureza biológica

(B), química (Q) ou física (F). Ressaltando que, mais de um perigo pode ser

controlado em um mesmo PCC.

No quadro 1 encontra-se um exemplo das perguntas que devem ser respondidas

no momento da elaboração do formulário para a identificação e registro das etapas

onde os perigos podem ser controlados com base nos pré-requisitos (PC) e/ou

aqueles considerados como PCCs.

Dois exemplos podem ser citados como possíveis PCCs em um fluxograma de

coleta, avaliação e congelamento de sêmen, sendo eles a avaliação do status

sanitário do rebanho e a etapa de diluição final. Caso o diagnóstico de alguma

enfermidade não tenha sido realizado (perigo biológico), nenhuma etapa posterior

corrigirá, podendo ela ser transferida através da dose de sêmen para outros

rebanhos. Da mesma forma, se a medição do volume de diluente (perigo físico) na

etapa de diluição final for efetuado de forma equivocada, nenhuma etapa posterior

corrigirá esse desvio. Nesse caso, poderão ser produzidas doses com uma

concentração abaixo do que estará descrito (excesso de diluente adicionado) ou

acima (escassez de diluente adicionado), sendo que neste último caso o CCPS

deixará de produzir o número possível de doses.

2.8 Procedimentos de Monitoração e estabelecimento das Ações

Corretivas

A monitoração é uma sequência planejada de observações e mensurações

utilizada para avaliar se o (s) perigo (s) da (s) etapa (s) considerada (s) PCC (s) está

27

(ão) sob controle. Caso um desvio ocorra, ações corretivas devem ser

imediatamente aplicadas.

Para esse processo são utilizados métodos de monitoração como observação

visual do processo nas etapas correspondentes aos perigos, medição de volumes e

aferições de temperaturas, como por exemplo, temperatura da estufa ou banho-

maria onde o diluente é mantido e do balcão refrigerado onde é realizada a curva de

resfriamento das amostras.

No processo de monitoração deve ser descrito o que está sendo monitorado, a

forma e frequência de monitoramento e o responsável, conforme quadro 2.

2.9 Procedimentos de Verificação

São procedimentos que somados a monitoração evidenciam se o sistema

APPCC está funcionando corretamente, sendo realizados para assegurar que os

PCCs estão sob controle e que o plano está sendo cumprido, validar as mudanças

implementadas no plano original, assim como a modificação do plano devido a

mudanças no processo, equipamento, e outras.

Esta etapa é realizada com a adoção de processo técnico ou científico através

de uma revisão do processo e/ou de literatura, no que se refere aos limites críticos

nos PCCs verificando se os mesmos são adequados ao controle dos perigos,

processo de validação do plano assegurando que o sistema APPCC está

funcionando efetivamente e/ou processo de auditoria interna avaliando

conformidades ou não-conformidades do sistema.

A frequência de verificação do plano deve ser suficiente para confirmar que o

sistema está funcionando de forma eficaz [9], podendo em um primeiro momento,

ser realizada mensalmente. A verificação deve ser arquivada juntamente com todos

28

os registros de monitoração dos PCCs, desvios e ações corretivas, relatórios de

treinamentos de atualização dos colaboradores e, qualquer alteração que for

realizada no plano e/ou fluxograma do processo.

2.10 Procedimentos de Registros

Os registros devem ser realizados em toda linha de processamento. As tarefas

correspondentes aos POPs são informadas nas planilhas de utilização de

equipamentos e/ou tarefas realizadas, limpeza das instalações e equipamentos,

calibração de equipamentos e aferição das temperaturas. Além desses registros, o

relatório de verificação atualizado a cada 12 meses também deverá ser arquivado.

Por fim, registros das auditorias informando conformidades e não conformidades do

processo. Todos esses registros devem ser mantidos arquivados para controles

futuros.

2.11 Resumo do Plano

No resumo do plano devem ser informados: identificação dos perigos, pontos de

controle, pontos críticos de controle, limites críticos e limites de segurança (avaliados

para cada CCPS), procedimentos de monitoração, ações corretivas, procedimentos

de verificação e sistemas de registro.

No quadro 3 segue um exemplo de como elaborar o resumo do plano.

3. Histórico de Revisão do Plano

A validação do plano fica condicionada ao resultado de auditoria específica,

realizada por profissional capacitado, executada preferencialmente no prazo de 30

dias após a comunicação da implantação do plano por parte da empresa [2]. Deve

29

ser elaborado um histórico de revisão do plano, onde a implantação representa o

início das atividades e cada revisão numerada progressivamente com identificação

das alterações, caso essas existam.

30

Referências

[1] Brasil. Instrução Normativa Nº 53, de 27 de setembro de 2006. Aprova o

Regulamento para registro e fiscalização de Centro de Coleta e Processamento

de Sêmem (CCPS) bovino, bubalino, caprino e ovino. Ministério da Agricultura

Pecuária e Abastecimento

[2] Brasil. Portaria Nº 48, de 10 de fevereiro de 1998. Instituir o Sistema de Análise

de Perigos e Pontos Críticos de Controle - APPCC a ser implantado,

gradativamente, nas indústrias de produtos de origem animal sob o regime do

Serviço de Inspeção Federal – SIF.

[3] World Health Organization. Application of Hazard Analysis and Critical Control

Point (HACCP) methodology to pharmaceuticals. In: WHO Technical Report

Series. Geneva, Nº. 908, Anexo 7, 2003;99-110.

[4] Ribeiro-Furtini LL, Abreu LR. Utilização de APPCC na indústria de alimentos.

Ciênc. agrotec 2006;30:358-363.

[5] Spexoto AA, Oliveira CAF, Olival AA. Application of hazard analysis and critical

control points system in a grade A dairy farm. Ciência Rural 2005;35:1424-1430.

[6] Lupin HM, Parin MA, Zugarramurdi A. HACCP economics in fish processing plants.

Food Control 2010;21:1143–1149.

[7] Horchner PM, Pointon AM. HACCP-based program for on-farm food safety for pig

production in Australia. Food Control 2011;22:1674-1688.

[8] Depósito de Pedido de Patente NºPI1106687-3. Sistema de análise de perigos e

pontos críticos de controle (APPCC) para centros de coleta e processamento de

sêmen (CCPS) animal 2011.

31

[9] Fao and Who. Food Hygiene. World health organization and Food and agriculture

organization of the United Nations. Fourth edition, Rome, 2009, 136p.

[10] Thibier M, Guerin B. Hygienic aspects of storage and use of semen for artificial

insemination. Animal reproduction science 2000;62:233–251.

[11] Office International des Epizooties. Toma y Tratamiento del semen. In: Código

Zoosanitário Internacional. Décima edición, França 2001;315-323.

[12] Maia MS. Tecnologia do Sêmen e Inseminação Artificial em Caprinos e Ovinos.

VII Circuito de tecnologias adaptadas para a agricultura familiar, Governo do

Estado do Rio Grande do Norte. ISSN 1983-280 X, 2010.

[13] Reichenbach HD, Moraes JCF, Neves JP. Tecnologia do Sêmen e Inseminação

Artificial em Bovinos. In: Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. São Paulo:

Ed. Roca; 2008, p.57-82.

[14] Watson PF. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal

Reproduction Science 2000;60–61:481–492.

[15] Holt WV. Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction

Science 2000;62:3–22.

[16] Vandemark NL, Miller WJ, Kinney WCJr, Rodriguez C, Friedman ME.

Preservation of Bull Semen at Sub-Zero Temperatures.

http://www.gutenberg.org/files/37041/37041-h/37041-h.htm#Ch3. 2011; pp. 49

[17] Brasil. Circular Nº 175, de 16 de maio de 2005. Coordenador geral de

programas especiais / Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Anima.

Procedimentos de verificação dos programas de autocontrole.

[18] Brasil. Circular Nº 176, de 16 de maio de 2005. Coordenador geral de

programas especiais / Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal.

Modificação das instruções para a verificação do PPHO, encaminhados pela

http://www.gutenberg.org/files/37041/37041-h/37041-h.htm#Ch3

32

Circular Nº 201/97 DCI/DIPOA e aplicação dos procedimentos de verificação dos

Elementos de Inspeção previstos na Circular Nº 175/2005 CGPE/DIPOA.

33

Figura 1: Modelo de um fluxograma para centro de coleta e processamento de

sêmen animal.

Avaliação do status sanitário dos machos doadores de

sêmen e das manequins utilizadas para a coleta (PCC1)

Rebanho residente - Início do regime de coleta

Toalete na região prepucial do macho doador de sêmen e na

região do quarto da manequim

Coleta do sêmen


Entrega do ejaculado na janela de duplo óculo


Avaliações e diluição inicial


Curva de resfriamento


Diluição final (PCC2)


Estabilização 1


Envase


Estabilização 2


Curva de congelamento


Armazenamento


Avaliação para liberação das doses para comercialização


34

Quadro 1: Determinação do PCC.

Etapa do processo

Perigos Significativos

(F, Q e B)

O perigo é controlado pelo programa de pré-

requisitos?

Existem medidas preventivas para o perigo?

Esta medida elimina ou reduz o perigo a níveis

aceitáveis?

O perigo pode aumentar a níveis inaceitáveis?

Uma etapa subsequente eliminará ou reduzirá o

perigo a níveis aceitáveis?

PCC / PC

35

Quadro 2: Monitoramento do(s) PCC(s).

Etapa / PCC Diluição final – PCC1

O que? Volume de diluente

Limite crítico 5% para mais ou para menos do volume final a ser

adicionado

Como? Observação visual do processo, Aferir o volume das

diferentes porções do diluente em outra proveta.

Quando? Sempre que for realizada a diluição final.

Quem? O funcionário responsável pela diluição final.

Ação corretiva:

PCC1 – aquisição de provetas novas;

Treinamento dos colaboradores.

36

Quadro 3: Resumo do plano APPCC.

Etapa PC/

PCC

Perigos Medidas Preventivas Limite crítico Monitoração Ação

corretiva

Registro Verificação

Pré-

coleta

PC Maravalha,

terra;

Resíduo do

desinfetante;

microrganism

os

Aplicação do

procedimento referente

a higiene pessoal dos

colaboradores;

Realização da toalete

conforme descrito no

Procedimento

Operacional Padrão.

Resíduo de

desinfetante =

ausente

O que? A realização da

toalete nos touros

Como? Observação visual

da toalete

Quando? Semanalmente

durante a toalete

Quem? Colaborador do

controle de qualidade

Realizar a

toalete

novamente.

Registro

diário das

coletas

Mensal

37

3.2 Artigo 2

Artigo formatado de acordo com as normas da revista Veterinary

Microbiology (ISSN: 0378-1135)

Impacto da implantação do sistema APPCC em um centro de

coleta e processamento de sêmen bovino

Goularte, Karina Lemos1*; Duval, Eduarda Hallal2; Mondadori, Rafael

Gianella1,3; Vieira, Arnaldo Diniz1; Ferreira, Carlos Eduardo Ranquetat1;

Lucia, Thomaz, Jr1

1ReproPEL, Faculdade de Veterinária,2LIPOA, Faculdade de

Veterinária,3Instituto de Biologia


* Autor para correspondência: ReproPel, Faculdade de Veterinária,

Universidade Federal de Pelotas,

Campus Capão do Leão, 96010-900, Pelotas, RS, Brasil;


mailto:[email protected]

38

Impacto da implantação do sistema APPCC em um centro de

coleta e processamento de sêmen bovino

Goularte, Karina Lemos1; Duval, Eduarda Hallal2; Mondadori, Rafael Gianella1,3;

Vieira, Arnaldo Diniz1; Ferreira, Carlos Eduardo Ranquetat1; Lucia, Thomaz, Jr. 1

1ReproPEL, Faculdade de Veterinária, 2LIPOA, Faculdade de Veterinária,

3Instituto de Biologia


Resumo

Ainda que 53,3% das doses de sêmen bovino comercializadas no Brasil sejam

produzidas em Centros de Coleta e Processamento de Sêmen (CCPS) nacionais,

estes sistemas de produção não possuem metodologia padronizada. O objetivo

deste trabalho foi avaliar a influência da implantação de um sistema de análise de

perigos e pontos críticos de controle (APPCC) sobre a eficiência de produção e a

qualidade do sêmen produzido em um CCPS bovino. Inicialmente, foi realizado o

acompanhamento das atividades e a descrição do fluxograma do processo, com

elaboração de manuais necessários à implantação do sistema APPCC,

descrevendo: boas práticas de processamento; procedimentos padrão de higiene

operacional; e procedimentos operacionais padronizados. O impacto da adoção do

sistema foi avaliado mediante a realização de duas avaliações, com intervalo de oito

meses, considerando parâmetros de viabilidade espermática, níveis de

contaminação microbiológica e a produtividade do sistema. Após a adoção do

sistema APPCC, houve melhoria na motilidade espermática e na integridade da

membrana plasmática e do acrossoma pós-descongelamento (P < 0,0001), redução

39

dos níveis de contaminação microbiológica (P = 0,0004) e queda no número de

doses de sêmen rejeitadas (P < 0,05). A implantação do sistema APPCC padronizou

o processamento das doses de sêmen, incrementando a qualidade das doses

produzidas.

Palavras-chave: APPCC, controle microbiológico, qualidade, sêmen bovino.

1. Introdução

No Brasil, a comercialização de sêmen bovino aumentou 51,1% de 2009 até

2012, sendo o sêmen produzido no Brasil responsável por 53,3% do movimento

comercial (Asbia, 2012). O Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento

(MAPA) regulamenta essa atividade no Brasil através de: Lei Nº 6.446 de

05/10/1977; Decreto Nº 187 de 09/08/1991; IN Nº 48 de 17/06/2003; IN Nº 2 de

14/01/2004; IN Nº 8 de 10/03/2006 e a IN Nº 53 de 27/09/2006. No decreto 187

(1991, Art.7◦) consta a seguinte redação: “O Ministério da Agricultura e Reforma

Agrária (atual MAPA) estabelecerá padrões tecnológicos e higiênico-sanitários para

sêmen destinado à comercialização, inclusive quanto à garantia de identidade e

qualidade”. Porém, a legislação não define uma metodologia padronizada para

orientação dos Centros de Coleta e Processamento de Sêmen (CCPS) para

comercialização de doses de sêmen congelado, com padrões similares e com

qualidade certificada.

Existem muitas fontes de variabilidade (fisiológicas, metodológicas e

operacionais) que podem influenciar a qualidade final do sêmen produzido em um

CCPS, o que justifica o estabelecimento de um sistema de controle (Álvarez et al.,

2005). O sistema de análise de perigos e pontos críticos de controle (APPCC) foi

originalmente desenvolvido para identificar, avaliar e controlar perigos significantes

40

para a segurança alimentar (FAO & WHO, 2009). Entretanto, seus princípios vêm

sendo amplamente utilizados em outros ramos industriais (WHO, 2003), uma vez

que o emprego de medidas preventivas adequando o controle dos processos,

acompanhado por verificações periódicas e ações corretivas, é considerado mais

efetivo do que a inspeção de problemas no produto final (Ropkins & Beck, 2000).

Portanto, a aplicação do sistema APPCC em um CCPS bovino permitiria maior

controle do processo de produção de doses de sêmen congelado, identificando os

perigos e aplicando medidas preventivas, visando diminuir perdas no

processamento, para incrementar a qualidade do produto final.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da implantação de um sistema

APPCC, com suas adequações, em um CCPS, sobre a viabilidade espermática, os

níveis de contaminação microbiológica e a eficiência de produção do sistema.

2. Metodologia

Coleta de dados e elaboração de documentos

O trabalho foi realizado em um CCPS localizado no município de Delta-MG.

Inicialmente, foi feito o acompanhamento da rotina de trabalho no CCPS, com a

descrição das tarefas realizadas, desde a higienização no prepúcio dos touros

previamente a coleta até a liberação das doses de sêmen congeladas para

comercialização.

Durante um período de 30 dias, foram levantados os dados para elaboração dos

manuais de Boas Práticas de Processamento (BPP) e Procedimentos Padrão de

Higiene Operacional (PPHO), visando a padronização da produção e a redução de

perdas. Ainda, todas as tarefas e o funcionamento e manutenção dos equipamentos

foram descritos, dando origem aos Procedimentos Operacionais Padronizados

41

(POPs). Esse conjunto de documentos foi empregado na composição do sistema de

Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), formando os Programas

de Autocontrole (BrasilA, BrasilB 2005).

Durante o levantamento dos dados para a elaboração dos documentos, foram

coletadas amostras para avaliar a contaminação bacteriana em algumas etapas

identificadas como potencialmente perigosas para a qualidade das amostras

produzidas. Também foram colhidas amostras de sêmen congelado, para análise de

qualidade seminal. Os pontos de coleta foram: lavado da vagina artificial (VA);

sêmen puro (SP); diluente pré-diluição (DP); fração A do diluente de congelamento

do sêmen (DA); fração B do diluente de congelamento do sêmen (DB); sêmen

resfriado (SR); lavado do tubo flexível da máquina de envase (TF); sêmen envasado

(SE); e sêmen congelado (SC).

Para a coleta de amostras da VA e do TF, foi realizada uma lavagem com 10mL de

água peptonada tamponada autoclavada. Para avaliar a carga microbiana presente

no SP, SR, SE, DP, DA e DB, as amostras foram diluídas em água peptonada

tamponada autoclavada, realizando-se diluições seriadas, quando necessário, ou

semeando as amostras puras. O cultivo em duplicata foi realizado em Plate Count

Agar (PCA) conforme metodologia recomendada pela OIE (2001), utilizando-se

500µL da amostra em cada placa semeada pelo método “Plour Plate”, e incubadas a

37oC por 72h. Após esse período, foram selecionadas as placas cuja diluição

apresentava o intervalo entre 30 e 300 colônias para a realização da contagem. Os

resultados foram expressos em unidades formadoras de colônia (UFC/mL).

Após a confecção dos manuais, foi conduzido um treinamento, para conscientização

dos colaboradores. Posteriormente, foi realizado o acompanhamento da adoção das

práticas recomendadas para alguns procedimentos.

42

Análise da qualidade seminal

As amostras de SC foram analisadas antes e após a implantação do sistema

APPCC. As palhetas foram descongeladas em banho-maria a 37oC durante 30s.

Foram avaliadas: a motilidade espermática progressiva; a integridade da membrana

plasmática através das sondas diacetato de carboxifluoresceína e iodeto de propídio

(Harrison & Vickers, 1990) e a integridade do acrossoma com a utilização da sonda

Lectin pisum sativum (Kawamoto et al., 1999).

Avaliação da eficácia do sistema APPCC

Oito meses após a implantação dos manuais, foi realizada uma nova coleta de

amostras, nos mesmos locais, para análise microbiana, com o objetivo de avaliar a

eficácia da implantação do sistema APPCC na padronização das tarefas e redução

da contaminação das doses produzidas.

Dados de produção do CPPS

A eficiência de produção do CPPS foi avaliada através da comparação do número

de ejaculados, de partidas e de doses de sêmen rejeitadas, antes e após a

implantação do sistema APPCC. Também foi feita uma simulação do impacto

econômico da implantação do sistema APPCC, considerando um custo médio de

R$2,50 por dose produzida (custos fixos + custos variáveis). Para o cálculo do valor

que o CCPS deixou de ganhar com a venda das doses de sêmen, ou custo de

oportunidade (Polson et al, 1993), foi considerado um valor médio de R$20,00 por

dose (valor médio de comercialização).

Análise estatística

O número de UFC/mL nos diferentes pontos de coleta foi comparado entre os

períodos antes e após a implantação do sistema APPCC, através de análise de

variância, com comparação entre médias pelo teste de Tukey. Em função da

43

ausência de normalidade, detectada pelo teste de Wilk-Shapiro, o número de

UFC/mL foi submetido à transformação para a escala logarítmica. A motilidade

espermática e a integridade da membrana espermática e do acrossoma pós-

descongelamento foram comparados entre os períodos através do teste de soma

dos rankings de Wilcoxon, para dados não paramétricos, pois também não

apresentaram normalidade. As frequências de rejeição de ejaculados, partidas e

doses de sêmen foram comparadas entre os períodos, através do teste de qui-

quadrado. Todas as análises foram conduzidas com Statistix® (2008).

3. Resultados

A implantação do sistema APPCC promoveu uma redução da contaminação

microbiana (P < 0,05) nas amostras de VA, SP e TF (Tabela 1). Também ocorreu um

aumento na contaminação do sêmen resfriado (SR) após a implantação do sistema

APPCC (P < 0,05).

A contaminação das amostras de SE não diferiu entre os período anterior e o

período posterior à implantação do sistema APPCC (P > 0,05), porém houve um

aumento no SR até o momento do envase no período pós-implantação (P < 0,05).

Apesar disso, houve redução da população bacteriana no SC (P < 0,05).

A motilidade, a integridade da membrana espermática e a integridade do acrossoma

nas amostras de sêmen produzidas e descongeladas após a implantação do sistema

APPCC foram superiores (P < 0,05) às observadas no período anterior (Tabela 2).

No período de 4 meses antes da implantação do sistema APPCC, foram coletados

2.916 ejaculados, dos quais 1.039 (35,0%) foram rejeitados (Tabela 3). Já no

período posterior, 731 dos 2.117 ejaculados coletados foram rejeitados (34,5%), o

que representou uma porcentagem semelhante à observada no período anterior (P <

44

0,05). Porém, houve uma redução de mais de 12 pontos percentuais na rejeição de

partidas de sêmen e de 10 pontos percentuais na rejeição de doses de sêmen (P <

0,05), após a implantação do sistema APPCC, em comparação com o período

anterior (Tabela 3).

De acordo com a simulação financeira, antes da implantação do sistema APPCC, o

descarte de 70.429 doses representaria uma perda de R$ 176.072,50, durante o

período analisado. O custo de oportunidade associado à rejeição destas doses seria

de R$ 1.408.580,00. Após a implantação do sistema APPCC, as perdas por rejeição

de doses seriam de R$ 68.685,00 e o custo de oportunidade foi reduzido para

R$549.480,00. Assim, o CCPS reduziria suas perdas financeiras em R$ 107.387,50.

4. Discussão

No Brasil, existem atualmente 27 CCPS bovinos registrados no MAPA, que é

responsável pela fiscalização desses estabelecimentos, bem como pela inscrição

dos animais doadores de sêmen. Segundo o Código Terrestre de Saúde Animal

(OIE, 2013), os objetivos do controle sanitário oficial da produção de sêmen são:

manter a saúde dos animais dos CCPS em um nível que permita a distribuição

internacional desse produto, com risco desprezível de infectar outros animais ou ao

homem; e garantir que o produto seja coletado, processado e armazenado

higienicamente. Porém, nem o MAPA nem a OIE indicam adequadamente a maneira

correta e/ou eficaz de se obter um produto seguro e com qualidade. A utilização do

sistema APPCC na indústria de coleta e processamento de sêmen permitiu uma

abordagem sistemática do processamento, identificando etapas potencialmente

prejudiciais à segurança e qualidade do produto, bem como a utilização de medidas

preventivas que contribuam para a qualidade do produto final. Apesar de sistemas

45

desta natureza já serem utilizados na indústria de alimentos (Ribeiro-Furtini & Abreu,

2006; Wang et al., 2010), o presente trabalho é o primeiro a relatar o impacto da

implantação de um sistema APPCC em um CCPS comercial.

A obtenção de um ejaculado estéril não é viável do ponto de vista fisiológico, pois

microrganismos estão presentes na microflora do prepúcio ou na genitália externa do

touro (Thibier & Guerin, 2000), ou podem ser introduzidos durante a coleta ou o

processamento do sêmen, no ambiente da sala de coleta ou no laboratório (Kaproth

& Krick, 2004). Porém, a identificação dos perigos através do sistema APPCC

permitiu que fossem estabelecidas medidas preventivas para controlá-los. Com a

realização de procedimentos padronizados na toalete dos touros, no preparo da VA

e com a suspensão do reaproveitamento dos tubos flexíveis da máquina de envase,

foi possível reduzir a carga microbiana oriunda dessas etapas, o que resultou na

diminuição do nível de contaminação, tanto do sêmen puro, como do sêmen

congelado. As contagens de UFC nos diluentes DP, DA e DB após a implantação do

APPCC foram superiores às observadas no período anterior. Na avaliação do

processo de elaboração do diluente, com seus respectivos pontos de controle,

observou-se a ineficácia do antibiótico tilosina, utilizado no coquetel de antibióticos.

É importante ressaltar que essa constatação somente foi possível porque o sistema

APPCC estava implantado. Os diluidores prolongam a viabilidade do sêmen, mas

também proporcionam a oportunidade para certas bactérias contaminantes

alcançarem seu limiar necessário para provocar um efeito negativo sobre a

fertilidade do sêmen preservado (Althouse, 2008). Após a identificação da origem do

problema, a partida do antibiótico tilosina foi substituída e as contagens microbianas

subsequentes foram reduzidas (dados não publicados). A preparação do diluente

deve enfatizar a utilização de produtos com qualidade, higiene pessoal e limpeza de

46

equipamentos e utensílios (Hueston & Sivula, 1988), sendo todos esses aspectos

abordados no sistema APPCC. O aumento nas contagens microbianas no SR no

momento pós-implantação foi consequência do aumento nas contagens nas

amostras das frações do diluente, pois se considerada a redução das contagens no

SP, o SR consequentemente apresentaria menor contaminação.

Os CCPS devem produzir doses inseminantes livres de contaminantes, na medida

do possível (Hueston & Sivula, 1988). Nesse sentido, o acompanhamento e a

revisão do fluxo de produção com a utilização do sistema APPCC mantém os

perigos sob controle, permitindo a imediata correção dos desvios, preferencialmente

através de ações preventivas. Antes da implantação do sistema, os tubos flexíveis

da máquina de envase (TF) foram identificados como fonte de contaminação para as

doses produzidas, pois o processo de lavagem e a tentativa de esterilização eram

ineficazes para reduzir ou eliminar a sua contaminação interna. A suspensão do

reaproveitamento dos TF propiciou a ausência de contaminação microbiana após a

implantação do sistema. Portanto, se o equipamento e as instalações não são

adequadas para o processamento e limpeza, provavelmente serão fontes constantes

de contaminação (Kaproth & Krick, 2004), sendo os mesmos monitorados e

avaliados constantemente no sistema APPCC.

A OIE, (2001) preconiza uma carga microbiana de no máximo 5.000 UFC/ml de

sêmen processado, buscando-se com a utilização do sistema APPCC a adequação

das doses produzidas a essa norma internacional. Um crescimento excessivo de

bactérias pode resultar em aglutinação espermática e diminuição da motilidade e

viabilidade (Althouse, 2008), podendo provocar infecção uterina na fêmea que

receber a dose inseminante (Kaproth & Krick, 2004). Com a adoção do sistema

APPCC, houve uma redução na contaminação microbiana no SC, em comparação

47

com o período anterior. Apesar das contagens microbianas ainda continuarem acima

do preconizado pela OIE, a redução nas contagens no SC após a implantação do

sistema provavelmente não foi marcante devido à ineficácia do antibiótico tilosina.

Porém, com as adequações realizadas no fluxograma de produção das doses de

sêmen congeladas, conseguiu-se uma redução significativa nessas contagens e,

consequentemente, a qualidade das doses produzidas.

A avaliação isolada de um parâmetro espermático não apresenta sensibilidade

suficiente para a determinação da fertilidade, porém, a combinação de diversos

métodos tem agregado maior precisão para a estimativa do potencial de fertilização

das amostras de sêmen bovino (Maziero et al., 2009). No presente trabalho foram

avaliados a motilidade progressiva e a integridade das membranas plasmática e

acrossomal das amostras após sofrerem as crioinjúrias do congelamento e

descongelamento. Houve um incremento na qualidade seminal, observada nos três

parâmetros, após a implantação do sistema APPCC, podendo este estar relacionado

a diminuição das contagens microbianas encontradas nessas amostras (SC), no

mesmo período. A contaminação bacteriana excessiva em amostras de sêmen

reduz a viabilidade espermática (Althouse, 2008), principalmente pela indução de

apoptose e necrose, que podem ser parcialmente responsáveis pela redução da

motilidade espermática (Moretti et al., 2009). Alguns agentes patogênicos podem

afetar diretamente a fertilidade do touro por causar doença do trato reprodutivo ou

por se associarem aos espermatozoides, impedindo a fecundação (Givens & Marley,

2008). Em suínos, o aumento na concentração de E. coli em amostras de sêmen foi

associado com redução no tamanho da leitegada (Martín et al., 2010).

Como qualquer empresa comercial, um CCPS tem por objetivo a produção de um

número de amostras suficiente para abastecer o mercado, com máxima qualidade e

48

com custo mínimo de produção. Nos períodos avaliados, o número de ejaculados

rejeitados não diferiu, indicando que o sistema APPCC não interferiu nos parâmetros

inerentes ao touro, que podem ter sido influenciados pela época do ano, com um

grande número de rejeições de ejaculados devido ao estresse térmico. No entanto,

as modificações realizadas desde a coleta do ejaculado até seu envase e

congelamento, a partir da implantação do sistema APPCC, tiveram reflexo na

redução no número de partidas e doses rejeitadas. Considerando um custo de

produção de R$2,50 por dose, a redução de 10 pontos percentuais na rejeição de

doses representou uma redução nas perdas financeiras de R$ 107.387,50, nos

quatro meses avaliados. Se o CCPS vendesse cada dose rejeitada por R$20,00,

após a implantação do sistema APPCC o custo de oportunidade seria reduzido em

R$859.100,00, em comparação com o período anterior, o que indica que o

incremento na qualidade seminal e a redução no nível de contaminação das doses

se refletiu também em impacto econômico. Assim, medidas preventivas para

adequar o controle do processo, acompanhado por verificações periódicas e ações

corretivas são mais efetivas do que inspecionar defeitos de cada lote final do produto

(Ropkins & Beck, 2000). A indústria de pescado demonstrou uma diminuição

significativa nos custos totais de qualidade após a implantação do APPCC (Lupin,

Parin & Zugarramurdi, 2010), reforçando os benefícios advindos da implantação

desse sistema na indústria de sêmen bovino congelado.Portanto, o sistema APPCC

é uma ferramenta de gestão importante para os CCPS, bem como para os órgãos

fiscalizadores, que deve ser implementada com a maior brevidade possível.

49

5. Conclusão

A implantação do sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle no

Centro de Coleta e Processamento de Sêmen bovino identificou as etapas que

representam risco para as amostras de sêmen, padronizou o processo e permitiu o

estabelecimento de medidas de controle para os perigos identificados. Como

consequência, houve melhoria na qualidade seminal e redução na contaminação

microbiológica e na rejeição de doses, com impacto na redução dos custos de

produção da indústria.

Agradecimentos

À Capes pelo suporte financeiro ao primeiro autor e ao MAPA-CNPq pelo

financiamento do projeto.

50

5. Referências

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poderá ser distribuído no Brasil o sêmen bovino ou bubalino coletado em

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Ministério da agricultura pecuária e Abastecimento - MAPA, que cumprem os

requisitos sanitários mínimos para a produção e comercialização de sêmen

bovino e bubalino no país. Ministério da Agricultura Pecuária e

Abastecimento, Secretaria de Defesa Agropecuária.

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51

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Agricultura Pecuária e Abastecimento.

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54

Tabela 1: Contagens microbianas médias (UFC/mL) nos diferentes pontos de coleta em um CCPS bovino, antes e após a

implantação do sistema APPCC*

Amostra n Pré-implantação n Pós-implantação

Vagina artificial 13 81,1 ± 19,5A 10 19,5 ± 19,5B

Sêmen puro 35 41,8 x 103 ±19,8 x 103A 21 9,8 x 103 ± 4,1 x 103B

Diluente P 10 115 ± 6 9 1,9 x 103 ± 8

Diluente A 10 56 ± 3 9 2,4 x 103 ± 1,0 x 103

Diluente B 10 78 ± 6 9 873 ± 6

Sêmen resfriado 35 240 ± 10A 21 1,5 x 103 ± 5B

Tubo flexível 21 2,5 x 106 ± 5,2 x 105A 15 0B

Sêmen envasado 35 1,2 x 106 ± 6,6 x 102 21 1,7 x 103 ± 4

55

Sêmen congelado 35 23,3 x 103 ± 4,1 x 103A 21 7,3 x 103 ± 3,5 x 103B

A,BMédias ± EPM com expoentes distintos indicam diferença significativa nas linhas (P < 0,05)

*Comparações feitas com dados transformados para a escala logaritimica

56

Tabela 2: Parâmetros de qualidade do sêmen bovino após o descongelamento,

antes e após a implantação do sistema APPCC*

Parâmetro (%) Pré-implantação Pós-implantação

Motilidade progressiva 33,7 ± 1,3A 57,7 ± 1,3B

Integridade da membrana 47,9 ± 1,6A 85,3 ± 1,4B

Integridade do acrossoma 61,4 ± 3,0A 81,6 ± 3,6B

n 35 21

A,BMédias ± EPM com expoentes distintos indicam diferença significativa nas linhas (P < 0,0001).

*Comparações através do teste de soma de rankings de Wilcoxon para dados não paramétricos

57

Tabela 3: Produção do Centro de Coleta e Processamento de Sêmen bovino,

durante o período de 4 meses antes e 4 meses após a implantação do sistema

APPCC

Produção Pré-implantação Pós-implantação

Ejaculados rejeitados 1.039/2.916 (35,0%) 731/2.117 (34,5%)

Partidas rejeitadas 209/1.197 (17,5%)A 46/944 (4,9%)B

Doses rejeitadas 70.429/407.766 (17,3%)A 27.474/ 378.520 (7,3%)B

A,BExpoentes distintos indicam diferença significativa nas linhas (P < 0,01)

58

3.3 Artigo 3

Artigo formatado de acordo com as normas da revista Molecular,

Reproduction and Development (ISSN: 1098-2795)

Bovine angiotensin-converting enzyme testis specific is neither required for

sperm capacitation nor released during this phenomenon

Karina L. Goularte1*, Rafael G. Mondadori1,2, Thomaz Lucia Jr. 1

and Jacob Thundathil3

1ReproPEL, Faculdade de Veterinária, 2Instituto de Biologia


3Department of Production Animal Health, Faculty of Veterinary Medicine,

University of Calgary, Calgary, AB, Canada

*Corresponding author at: ReproPel, Faculdade de Veterinária, Universidade

Federal de Pelotas, Campus Capão do Leão, 96010-900, Pelotas-RS, Brazil.


59

Bovine angiotensin-converting enzyme testis specific is neither required for

sperm capacitation nor released during this phenomenon

Karina L. Goularte1*, Rafael G. Mondadori1,2, Thomaz Lucia Jr. 1

and Jacob Thundathil3

1ReproPEL, Faculdade de Veterinária, 2Instituto de Biologia


3Department of Production Animal Health, Faculty of Veterinary Medicine,

University of Calgary, Calgary, AB, Canada

SUMMARY

Germinal angiotensin converting enzyme (gACE) is expressed exclusively on haploid

germ cells in the testis and it is probably involved in fertilization. The objectives of this

study were: to investigate the requirement of testis specific isoform of ACE activity for

sperm movement; to examine the role of gACE in phosphorylation of bull sperm

proteins; and the shedding of gACE during capacitation. In the first experiment,

samples of fresh sperm from 3 bulls were incubated in: Sp-TALP (control); Sp-TALP

+ 100 µM ouabain (capacitation stimulator); Sp-TALP + 10 µM captopril (ACE

inhibitor); and Sp-TALP + 10 µM captopril + 100 µM ouabain (captopril added 30 min

before ouabain) for 4.5 h. The second experiment evaluated the need of gACE

activity for sperm tyrosine phosphorylation and its shedding during sperm incubation

in capacitation conditions. In the third experiment, cumulus-oocyte complexes

(COCs) were inseminated with sperm incubated with or without captopril. Blocking

gACE by captopril reduced total, progressive and linear sperm motility (P < 0.05).

The tyrosine phosphorylation pattern was not influenced by gACE inhibition and the

gACE content was not altered before and after capacitation, regardless of the

60

presence of captopril. Inhibition of gACE had no influence on cleavage and

blastocyst rates (P > 0.05). In conclusion, the present study suggests that gACE

activity may not be necessary for protein tyrosine phosphorylation, not involved in

capacitation of bull spermatozoa and not required for in vitro fertilization.

Keywords: sperm capacitation, ACE, bovine.

INTRODUCTION

Angiotensin converting enzyme (ACE; EC 3.4.15.1) is an ectoenzyme

anchored to the plasma membrane that catalyzes the conversion of angiotensin I to

the active octapeptide angiotensin II (Corvol et al., 1995). ACE exists in two isoforms:

somatic; and testicular (or germinal). Both such isoforms are transcribed from a

single gene at different initiation sites (Sibony et al., 1993). The somatic ACE (sACE)

isoform has molecular weight of 150-180 kDa (Sibony et al., 1993), is expressed in

somatic tissues and is widely distributed in Leydig cells, epididymis and prostate

(Nassis et al., 2001). On the other hand, the germinal form (gACE), with nearly 110

kDa, is expressed exclusively on haploid germ cells in the testis, being characterized

by a specie-specific N-terminal region sharing the same C-terminal region with

somatic ACE (Sibony et al., 1993; 1994).

Spermatozoa from homozygous mutant (stst) mice showed inability to migrate

into the oviduct and deficiencies in binding to the zona pellucida (ZP) (Hagaman et

al., 1998). More recently, it was hypothesized that, in mice, ACE may act shedding

GPI-anchored proteins from the sperm, contributing to spermatoza-ZP binding

(Kondoh et al., 2005) or that gACE acts by dicarboxypeptidase activity allowing

sperm-ZP binding (Fuchs et al., 2005). Nevertheless, the contribution of gACE for

fertilization in mice may follow a dual mode: as a dipeptidase in sperm modification in

61

the epididymis; and as a GPIase in binding of mature spermatozoa to ZP (Deguchi et

al., 2007), concluding that dideptidase activity of ACE indirectly supports its GPIase

activity by maintaining a suitable pH necessary to GPIase activity (Watanabe and

Kondoh, 2011). However, the role of gACE in bull sperm capacitation or during in

vitro fertilization is still unknown.

Captopril was the first ACE inhibitor approved for treatment of human

hypertension (Cushman and Ondetti, 1991). Captopril interacts directly with catalytic

Zn2+ ion deep inside the channel at the active site of gACE (Natesh et al., 2004). The

use of ACE inhibitor in fertilization studies is somewhat controversial and related to

specie-specific findings, since it does not impair in vitro fertilization and sperm ZP-

binding in ovine (Métayer et al., 2001), but reduces oocyte penetration in humans

(Foresta et al., 1991). To our knowledge, no information is available about gACE

involvement in in vitro or in vivo fertilization in bovine.

The fertilization-competent state of spermatozoa is achieved after

capacitation, a process derived from physiological and functional modifications that

occur either in vivo, in the female reproductive tract, or in vitro, under defined

conditions (Yanagimachi, 1994). The phosphorylation of sperm proteins is important

for capacitation, especially tyrosine, which may be the primary or even the exclusive

indicator of a signal transduction pathway at cell level (Naz and Rajesh, 2004). The

incubation of sperm with ouabain induced tyrosine phosphorylation and capacitation

in bovine sperm (Thundathil et al., 2006). Therefore, if gACE is involved in sperm

capacitation, when its activity is blocked, both the signal transduction pathway and

phosphorylation of sperm proteins will also be blocked.

The aims of the present study were: to investigate the requirement of testis

specific isoform of ACE activity for normal sperm movement; and to examine the role

62

of gACE in phosphorylation of bull sperm proteins and its shedding during

capacitation.

RESULTS

Experiment 1

Mean parameters of sperm motility after incubation for 4.5 h were: total = 75.9

± 12.7%; progressive = 70.9 ± 14.4%; hyperactive = 10.4 ± 7.9%; linear = 55.1 ±

12.2%; nonlinear = 0.6 ± 0.4%; and curvilinear = 2.2 ± 1.5%.

Blocking gACE by captopril (10 µM) reduced total, progressive and linear

sperm motility (P < 0.05). The presence of captopril and the capacitating agent

ouabain (100 µM) reduced (P < 0.05) progressive and linear motility, although those

agents had no effect on sperm motility when combined (Table 1). However, with

gACE inhibitor captopril and ouabain, total motility, progressive and linear motility

were similar to that of the control group (P > 0.05). Bull B presented lower linear

motility than the other tested bulls (P < 0.05), whereas both progressive and total

motility were greatest for bull C, intermediate for bull A and lowest for bull B (P <

0.05). No effects of the treatments were observed on non linear, curvilinear and

hyperactive sperm motility (P > 0.05).

Experiment 2

The incubation of bull sperm with ouabain and captopril was associated with

the tyrosine phosphorylation of a subset of proteins of Mr = 30 000 – 240 000, and

the tyrosine phosphorylation pattern was not influenced by gACE inhibition (Figure 1).

The gACE content was unaltered before and after capacitation, regardless of the

presence of the ACE inhibitor (Figure 2).

63

Experiment 3

The inhibition of gACE had no influence (P > 0.05) on either cleavage or

blastocyst rate (Table 2).

DISCUSSION

In the present study, incubation of bull sperm in medium containing captopril

impaired total progressive and linear motility. So, gACE or another component of the

renin angiotensin system (RAS) may be involved with sperm movement.

Nonetheless, captopril is a potent inhibitor of both the N and C domains of somatic

ACE and gACE (Natesh et al., 2004) and impairs both the conversion of angiotensin I

to angiotensin II and the kinin hydrolysis (Peng et al., 2005). Angiotensin II type 1

(AT1) receptors were found in the tails of rat, human and non-capacitated stallion

spermatozoa (Vinson et al., 1995; Sabeur et al., 2000) and over the entire head of

spermatozoa of bulls and stallions during capacitation (Gur et al., 1998; Sabeur et al.,

2000). Sperm motility would be inhibited by the specific AT1 inhibitor, DuP 753

(Vinson et al., 1995), indicating involvement of angiotensin II in sperm motility (Ball et

al., 2003). Therefore, the reduced motility observed for bull sperm incubated with

captopril may be attributed to shortage of angiotensin II, which would not be

converted from angiotensin I since gACE activity was blocked.

Ouabain was also associated with reduced progressive and linear motility, but

using a different route. Although ouabain does not affect the total bull sperm motility

(Thundathil et al., 2006; Newton et al., 2010), incubation with ouabain reduced

progressive motility, velocity average path and curvilinear velocity of spermatozoa in

a dose-dependent manner (Thundathil et al., 2006). This could be due to the fact that

ouabain binds to the Na+/K+ ATPase, inhibiting its activity (James et al., 1999) and

64

blocking the α1 and α4 isoforms present on spermatozoa (Wagoner et al., 2005). The

α4 isoform was found in the flagellum of spermatozoa of rats (Woo et al., 2000),

although in bulls, it was uniformly distributed over the head of uncapacitated

spermatozoa, but confined to the post-acrosomal region of capacitated spermatozoa

(Newton et al., 2010). The inhibition of the α4 isoform increases intracellular H+

concentrations, causing a pH decline of the sperm cytoplasm that results in the loss

of motility (Woo et al., 2000; 2002; Jimenez et al., 2010) and in a difficulty to control

Na+ and K+ gradients that are important for maintenance of the sperm membrane

potential in concert with K+ channels (Jimenez et al., 2010).

When gACE was blocked, the pattern of protein tyrosine phosphorylation was

similar to that observed with ouabain (positive control) and similar gACE content was

observed before and after capacitation, suggesting that gACE is not necessary for

protein tyrosine phosphorylation and is not released during sperm capacitation.

Inside the channel at the active site of gACE, captopril makes a direct interaction with

the catalytic Zn2+ ion deep, which is anchored solely at the central carbonyl group

and the proline carboxylate group, being positioned by two strong hydrogen bonds

from the two histidines (His 513 – His 353) (Natesh et al., 2004). Thus, the captopril-

gACE interaction may inhibit only the gACE activity, but not the tyrosine

phosphorylation. ACE is tyrosine phosphorylated at the ectodomain (Santhamma et

al., 2004) and also phosphorylated on a specific serine residue of the cytoplasmic

domain (Chattopadhyay et al., 2005). Protein tyrosine phosphorylation is related to

bovine sperm capacitation (Galantino-Homer et al., 2004) and considered as a

hallmark event of capacitation (Galantino-Homer et al., 1997), a maturational

processes leading to the development of the fertilization-competent state, either in

vivo or in vitro (Yanagimachi, 1994). The inhibition of gACE does not prevent bull

65

spermatozoa to phosphorylate its tyrosine residues, an important phenomenon

occurring during capacitation, which lead us to conclude that gACE activity is not

necessary for bull spermatozoa capacitation.

ACE bound to germ cell membranes was only found on testicular spermatozoa

of mice and rats (Métayer et al., 2002). On normal human spermatozoa, ACE was

present in cytoplasmic droplets and in the acrosome and on the plasma membrane of

the post-acrosomal region, the neck and midpiece, but widely distributed on defective

cells (Köhn et al., 1998b; Nikolaeva et al., 2006). In ejaculated bull spermatozoa, it

was present over the entire acrosome (Costa and Thundathil, 2012). The release of

ACE may happen in vivo, in a soluble active form, as sperm pass through the

proximal caput of the epididymis (Gatti et al., 1999; Métayer et al., 2002). In contrast,

gACE can be released during capacitation (Köhn et al., 1995; 1998a) or at a specific

stage of spermatozoa maturation, appearing in the seminal fluid (Balyasnikova, et al.,

2005). In the present study, gACE content in fresh spermatozoa and after incubation

with or without inhibitor was similar, with no release during capacitation, which

perhaps occurred after capacitation or during acrosome reaction. Ectodomain

shedding is a universal phenomenon that affects a wide range of ectoproteins, such

as enzymes, receptors and cell adhesion molecules (Balyasnikova, et al., 2005).

Sheddase binds to a “recognition domain” in the target protein before cleaving the

stalk, shedding of gACE is much more efficient than somatic ACE (Ehlers et al.,

2012), likely because gACE is smaller, less complex and more easily shed to the

plasma membrane. ACE secretion is enhanced by tyrosine phosphorylation, which

presumably takes place in the endoplasmic reticulum and is promoted by the action

of the p38 MAP kinase pathway (Santhamma et al., 2004). As gACE content was not

released during sperm capacitation and tyrosine phosphorylation pattern was not

66

influenced by incubation of bull sperm with captopril, we conclude that gACE is not

involved in capacitation, at least on in vitro conditions.

As the inactivation of gACE by captopril did not prevent IVF, cleavage and

blastocyst rates were similar for oocytes inseminated with or without incubation with

captopril. Thus, gACE is apparently not involved in spermatozoa-oocyte recognition.

As the absence of gACE is detrimental for spermatozoa transport in the oviducts and

binding to ZP, it plays a relevant role in the fertilization process (Hagaman et al.,

1998; Ramaraj et al., 1998), which may occur through two modes: GPIase activity for

spermatozoa egg-binding ability (Kondoh et al., 2005); and dicarboxypeptidase

activity, (Fuchs et al., 2005). However, gACE may act as a dipeptidase in sperm

modification in the epididymis and as a GPIase in binding of mature spermatozoa to

ZP, contributing for fertilization in a dual mode (Deguchi et al., 2007). However, the

gACE inhibition by captopril did not impair IVF (Métayer et al., 2001; 2002) and

sperm binding to the ZP (Köhn et al., 1998a), contradicting reports of reduced oocyte

penetration rate after gACE inhibition (Foresta et al., 1991). Additionally, gACE

showed no involvement in human fertilization, especially in ZP binding (Mustapha et

al., 2013). The lack of effect of captopril in IVF, also reported elsewhere (Métayer et

al., 2001; 2002; Mustapha et al., 2013), may be due to its relevant antioxidant role in

vitro (Benzie and Tomlinson, 1998), protecting endothelium against injuries from free

radicals and scavenging superoxide anions (Kim et al., 2013).

In summary, the gACE inhibition by captopril was associated with reduced

total, progressive and linear bull sperm motility. However, as gACE activity is not

necessary for protein tyrosine phosphorylation, gACE may not be involved in

capacitation of bull spermatozoa and not required for in vitro fertilization.

67

MATERIALS AND METHODS

Reagents and Media

Glycine, Tris, NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, bromophenol blue, methanol, and

Tween-20 were purchased from Fisher Scientific (Edmonton, AB, Canada);

Ammonium persulfate, 10× Tris/Glycine/SDS Buffer, 30% Acrylamide/Bis Solution

and gel electrophoresis apparatus were purchased from Bio-Rad (Mississauga, ON,

Canada). The Kodak scientific imaging film was purchased from Mandel Scientific

(Guelph, ON, Canada). The remaining chemicals were purchased from Sigma Aldrich

(Oakville, ON, Canada), unless stated otherwise.

Experiment 1: Effect of inhibition of gACE on sperm motility

Ejaculates were collected from three mature Holstein bulls from an artificial

insemination center (Alta Genetics, Calgary, AB, Canada). Semen samples were

immediately diluted 1:4 with Sp-TALPH (Galantino-Homer et al., 1997) and

centrifuged at 1,400 rpm x 12 min, to remove the seminal plasma. Samples were

washed twice more with Sp-TALPH discarding the supernatant. The sperm pellet was

resuspended in 1 ml of Sp-TALPH and transported to the laboratory within 30 min, in

thermic containers at 20 oC. Only samples with at least 70% motility were further

processed. Sperm concentration in the resulting pellet was determined using a

hemocytometer and adjusted to 100 x 106/ml with Sp-TALP.

Sperm pellets were split into a series of 1.5 ml microtubes. Samples with 25 x

106 spermatozoa/ml were incubated in water bath at 39oC (5% CO2 and high

humidity) with: Sp-TALP (control); Sp-TALP + 100 µM ouabain (capacitation

stimulator); Sp-TALP + 10 µM captopril (ACE inhibitor); and Sp-TALP + 10 µM

captopril + 100 µM ouabain (captopril added 30 min before ouabain) for 4.5 h.

68

At 0 and 4.5 h of incubation, 4 µl of the sperm preparation were drawn from

each group and parameters of sperm motility were recorded by computer assisted

semen analysis (CASA), using the Sperm Vision® software (Minitube).

As four repeats were conducted across treatments, a total of 150 sperm

samples were evaluated. Among those, 75 were from bull A, 35 were from bull B, and

40 were from bull C.

Experiment 2: Effect of inhibition of gACE on tyrosine phosphorylation and

gACE content

Sperm samples were processed as described in experiment 1, except for the

group including only captopril. The tyrosine phosphorylation and the gACE content

were measured as described elsewhere (Thundathil et al., 2006) with the following

modifications. Sperm were washed in 1 ml of TALPH including phosphatase

inhibitors (1 mM sodium vanadate; 1 mM glycerophosphate; and 1 mM sodium

fluoride) and then centrifuged at 10,000 x G, for 5 min at room temperature. The

supernatant was discharged and the pellet was re-suspended in 50 µl of Sp-TALP

containing inhibitors and 12.5 µl of 5X sample buffer (containing dithiothreitol, SDS

and inhibitors – 1 mM). The preparation was mixed and boiled for 5 min at 100oC,

then centrifuged at 10,000 x g, for 5 min, at room temperature. The supernatants

were used for SDS-PAGE and immunoblotting. Samples were subject to

electrophoresis in duplicate: one gel for tyrosine phosphorylation; and the other for

the gACE content.

For SDS-PAGE and immunoblotting, sperm extracts prepared as described

above were subject to electrophoresis on 10% polyacrylamide gels at 100 V, until the

running front reached the bottom of the gel. The gels were equilibrated in transfer

69

buffer (tris-glycine pH 8.5, containing 20% methanol) for 30 min and

electrotransferred to nitrocellulose membrane (Bio TraceTM NT), using the same

buffer. Blots were rinsed in distilled water and Ponceau stained (Galantino-Homer et

al., 1997) to ascertain that the transfer worked. After a quick wash with distilled water,

the membranes were incubated with a solution of skim milk (5%, w/v) in Tris (20mM,

pH 7.8)-buffered saline containing Tween 20 (TTBS; 0,1% v/v, 1h), washed with

TTBS and then treated with a monoclonal antibody developed in mouse against

phosphotyrosine proteins (clone 4G10, Millipore®, which recognizes tyrosine-

phosphorylated proteins from all species) (1:10,000 in TTBS) or with a monoclonal

antibody (clone 3C5, MAB5228, Abnova®, which react with bovine ACE) developed

in mouse against angiotensin converting enzyme (1:3,000 in TTBS) overnight at 4◦C.

After washing with TTBS three times during 10 min (anti-angiotensin converting

enzyme or 5 X for 10 min – anti-phosphotyrosine), membranes were incubated with

goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (secondary antibody

purchased from Upstate Technologies®, Temecula, CA) (1:5000 in TTBS) for 1 h, at

room temperature, and then washed again with TTBS. Immunoreactive bands were

detected using enhanced chemiluminescence system. Membranes were reprobed

with anti-B-tubulin antibody (Sigma®) (1:10,000) as loading control.

Experiment 3: Effect of inhibition of gACE on in vitro fertilization

Ovaries obtained from a slaughterhouse, after transported to laboratory within

2 hours, were washed with warmed saline and kept in a beaker containing saline in

water bath at 35◦C until oocyte aspiration. Follicles from 3 to 9-10 mm were aspirated

with a vacuum system. The follicular content was kept in the aspiration tube for 15

minutes to decant. Thereafter, the supernatant was discharged. The cumulus-oocyte

70

complexes (COC) were recovered under stereomicroscope, in a petri dish, and

transferred to a 200 µl of flushing media (tissue culture medium 199 -TCM with

Hepes plus 1 mg/ml gentamicin, and 3 mg/ml BSA), maintained on heated plate at

39◦C. The selected COCs were transferred to a maturation medium drop (TCM-199

containing 25 mM sodium pyruvate, 1 mg/ml gentamicin, 0.5 mg/ml FSH, 5 mg/ml

LH, 2 mg/ml estradiol-17b, and 10% fetal calf serum) in a small petri dish to remove

flushing media. Afterwards, the COCs were transferred to a multiwell dish (20 COCs

per 500 µl/well), under mineral oil to mature for 24 h.

Straws containing frozen sperm from 5 bulls with known fertility were thawed in

a water bath for 30 s at 37°C. Sperm were washed twice by centrifugation (500 x g

for 5 min) and the pellet re-suspended in 200 µl of fertilization medium. The final

sperm pellet was then overlaid with 100 μL of fertilization medium in two treatments:

one including 10 µM of captopril and incubated at 39°C and 5% CO2 for 30 min with

lid open (n = 365 oocytes); and a control treatment with no captopril (n = 386

oocytes). Both treatments had heparin for sperm capacitation.

Then, the upper two-thirds of the medium, which contained actively motile

sperm (1 x 106 sperm/mL), were used for inseminating matured COC in 20 μL drop of

fertilization medium containing 10 bovine oocytes. After 18 h, the presumptive

zygotes were denuded of their cumulus cells by vortexing and cultured for 8 d in 40

μL drops (20 presumptive zygotes per drop) of synthetic oviduct fluid (SOF; 107.7

mM NaCl, 7.16 mM KCl, 1.19 mM KH2PO4, 25.06 mM NaHCO3, 0.3 mM sodium

pyruvate, 2.5 mM sodium lactate 60% syrup, 1 mM glutamine, 8 mg/mL bovine

serum albumin, 1 X BME essential amino acids, and 1X MEM non-essential amino-

acids). Cleavage was evaluated 48 h after fertilization and embryo development was

recorded every 48 h.

71

Statistical analyses

In Experiment 1, parameters of sperm motility were compared across distinct

treatments using analysis of variance, including the effects of the bulls and potential

interaction, with comparisons of means conducted with the Tukey’s test. In

Experiment 3, the average rates of cleavage and embryo development to the

blastocyst stage were compared between treatments using a two-sample t test. All

analyses were conducted with Statistix® (2008).

Acknowledgements

To CAPES foundation, for the financial support of the first author, and to professor

Jacob Thundathil from University of Calgary-Canada for the opportunity of having an

exchange programme with him and his university doing my PhD.

72

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78

Table 1: Total, progressive and linear motility of bull spermatozoa after incubation for

4.5 h (n = 150 sperm samples)

Treatments* Sperm motility

Total (%) Progressive (%) Linear (%)

Control 77.7 ± 1.5A 73.8 ± 1.7A 59.5 ± 1.7A

Ouabain 73.2 ± 1.5AB 67.4 ± 1.7BC 51.5 ± 1.7BC

Captopril 67.5 ± 1.8B 61.4 ± 2.0C 45.5 ± 2.0C

Captopril +

ouabain

77.1 ± 1.5A 72.3 ± 1.7AB 55.5 ± 1.7AB

A,B,CMeans ± SEM with distinct superscripts indicate significant differences in the

columns (P < 0.05).

*Control – Sp-TALP;

Ouabain – Sp-TALP + 100 µM ouabain;

Captopril – Sp-TALP + 10 µM;

Captopril + ouabain – Sp-TALP + 100 µM ouabain + 10 µM captopril added 30 min

before ouabain

79

Table 2: Rates of cleavage and embryo development to the blastocyst stage after in

vitro fertilization using bull sperm with or without (Control) captopril prior to exposition

to cumulus-oocyte complex.

Treatment* Oocytes (n) Cleavage (%) Blastocysts (%)

Control 365 75.2 ± 3.2 37.1 ± 4.5

Captopril 386 67.3 ± 5.0 28.5 ± 3.3

Mean rates ± SEM in 18 routines did not differ (P > 0.05).

*Control: sperm incubated with fertilization medium

Captopril: sperm incubated with fertilization medium + 10 µM captopril

80

Figure 1: Tyrosine phosphorylation before (1) and after incubation for 4.5 h in Sp-

TALP (2), 100 µM of ouabain (3) or 100 µM of ouabain + 10 µM of captopril (4). PL =

protein marker ladder - kDa.

PL 1 2 3 4

ß-tubulin ~ 50 kDa

81

Figure 2: Germinal ACE content before (1) and after incubation for 4.5 h in Sp-TALP

(2), 100 µM of ouabain (3) or 100 µM of ouabain + 10 µM of captopril (4). PL =

protein marker ladder - kDa.

PL 1 2 3 4

ß –tubulin ~ 50 kDa

82

4 CONCLUSÃO GERAL

Os benefícios obtidos com a implantação do Sistema APPCC em uma

indústria, por si só justificam sua utilização. Para CCPS bovino esse é o primeiro

modelo elaborado e aplicado, sendo inegáveis os proveitos obtidos. Com a utilização

do sistema houve melhoria na qualidade seminal e redução na contaminação

microbiológica e na rejeição de doses, com impacto na redução dos custos de

produção da indústria. Assim, além de padronizar o processo incrementando a

qualidade do produto oferecido, o sistema permite, através de uma manipulação

correta de produtos e equipamentos, treinamento dos colaboradores com

padronização das tarefas realizadas e identificação das etapas potencialmente

danosas para a qualidade do produto, manter todos os perigos sob controle através

da aplicação de medidas preventivas, diminuindo com isso o custo final devido à

redução na rejeição de doses. Portanto, a implantação do sistema nos centros de

coleta e processamento de sêmen bovino traz benefícios não somente para o

produtor que adquire um produto com qualidade certificada, mas também para a

indústria, que pode reduzir suas perdas com rejeições de doses e para o MAPA na

realização de auditorias, confirmando assim, a hipótese do presente trabalho.

Porém, o estudo realizado com a ECA teve sua hipótese negada. Após o

bloqueio de sua atividade, o padrão de fosforilação da tirosina e as taxas de

clivagem e blastocisto foram similares ao grupo controle, sugerindo-se assim, que a

enzima conversora da angiotensina não é necessária para o processo de

capacitação e não está envolvida no processo de fertilização em bovinos, ao menos

in vitro.

83

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86

6 ANEXO

88

7 APÊNDICE

Manual de Boas Práticas de Processamento (BPP) e Procedimentos

Padrão de Higiene Operacional (PPHO), bem como os Procedimentos

Operacionais Padronizados (POPs) elaborados e implantados no Centro de

Coleta e Processamento de sêmen bovino onde o estudo foi realizado.

Revisado por: Data:____/____/2012

Karina Lemos Goularte


Sumário

Manual de Boas Práticas de Processamento (BPP)

Etapa 1 – Identificação da empresa...................................... 04 Etapa 2 – Recursos Humanos............................................... 05

Etapa 3 – Instalações, edificações e saneamento.................... 10 Etapa 4 – Equipamentos...................................................... 15

Etapa 5 – Sanitização.......................................................... 21

Etapa 6 – Produção............................................................. 22 Etapa 7 – Embalagem e rotulagem....................................... 27

Etapa 8 – Controle de qualidade........................................... 29 Procedimentos Padrão de Higiene Operacional (PPHO)

PPHO 1 – Potabilidade da água............................................. 38 PPHO 2 – Higiene das instalações, equipamentos e utensílios... 40

PPHO 3 – Prevenção da contaminação cruzada....................... 52 PPHO 4 – Higiene pessoal dos colaboradores.......................... 55

PPHO 5 – Proteção contra contaminação do produto................ 59 PPHO 6 – Agentes tóxicos.................................................... 62

PPHO 7 – Saúde dos colaboradores....................................... 64 PPHO 8 – Controle integrado de pragas................................. 67

Procedimento Operacional Padronizado (POP) Autoclave........................................................................... 82

Balança analítica de precisão................................................ 84

Balança eletrônica............................................................... 86 Balança para pesagem do sêmen.......................................... 88

Balcão refrigerado............................................................... 90 Banho-maria...................................................................... 92

Coleta de sêmen................................................................. 94 Container de nitrogênio líquido da máquina de congelamento de

sêmen...........................................................................

97

Controle de pulverização para controle para controle de moscas 99

Deionizador de água............................................................ 100 Destilador de água.............................................................. 103

Diluidor automático de sêmen............................................... 105 Envase e identificação......................................................... 108

Estufa de aquecimento das vaginas artificiais.......................... 111 Estufa de aquecimento de material........................................ 113

Estufa de secagem de material............................................. 115

Estufa de secagem e esterilização......................................... 117 Fotômetro........................................................................... 119

Máquina de congelamento.................................................... 121


Lista de figuras

Figura 1: Organograma das instalações do CCPS.................... 11

Figura 2: Imagem aérea do CCPS......................................... 12

Lista de Quadros

Quadro 1: Limpeza de equipamentos.................................... 42

Quadro 2: Limpeza de utensílios........................................... 44

Quadro 3: Limpeza de instalações......................................... 45

Anexos

Anexo 1: Atestado de saúde ocupacional............................... 31

Anexo 2: Responsáveis pela CIPA......................................... 32

Anexo 3: Laudo do controle de pragas................................... 33

Anexo 4: Fórmula do diluente.............................................. 36

Anexo 5: Laudo de higienização das caixas d’água.................. 72

Anexo 6: Laudo de avaliação físico-química e bacteriológica da

água.................................................................................

74

Anexo 7: Check list para realização de auditoria de interna...... 75

Anexo 8: Cartaz indicando como lavar as mãos...................... 80


Manual de BPP

Etapa 1 – Identificação da empresa

Cód: 01

Seção: 1

Revisão: 10/08/2012

Página: 04

1. IDENTIFICAÇÃO DA EMPRESA

1.1 Razão Social

ABS Pecplan – American Breeders Services Planejamento Pecuário

1.2 Endereço

Rodovia BR 050, Km 196

Delta, Minas Gerais

CEP: 38108-000

1.3 Responsável Técnico

Fernando Vilela Vieira

CRMV-MG: 3466

1.4 Autorização de Funcionamento

O Centro de Coleta e Processamento de Sêmen bovino (CCPS) ABS -

Pecplan está registrado no Ministério da Agricultura Pecuária e

Abastecimento (MAPA) sob o número MG05197-7.

Horário de Funcionamento

Área administrativa: das 8:30 às 17:30 horas;

Área de Produção: das 7:00 às 16:00 horas.

1.5 Produto final processado e forma de comercialização

Sêmen bovino processado e congelado em palhetas de 0,5 mL armazenadas

em nitrogênio líquido.


2. RECURSOS HUMANOS

2.1 Procedimento na admissão dos colaboradores

Os colaboradores admitidos em sua grande maioria são provenientes

de outras centrais ou tem experiência no trabalho com bovinos, sendo

selecionados em caso de demanda da empresa.

Para sua inserção na rotina de trabalho o novo colaborador passa por

uma semana de treinamento sob orientação do Médico veterinário,

acompanhando as atividades dos funcionários do setor de sua alocação.

Durante este período são repassadas todas as informações referentes ao

uso de equipamento de proteção individual (EPI), as normas internas e a

padronização das tarefas através da utilização dos procedimentos

operacionais padronizados (POPs) e do manual de boas práticas de

processamento (BPP).

2.2 Treinamento e orientação dos colaboradores

Em virtude da característica de sua atividade a empresa dispõe de

instalações adequadas como vestiários e sanitários feminino e masculino

para garantir adequadas condições de higiene e saúde dos colaboradores. O

detalhamento das condições e controle dessas instalações está descrito no

PPHO 4.

Colaboradores da área laboratorial: Neste setor o treinamento se dá

por acompanhamento e realização dos procedimentos efetuados pelos

responsáveis de cada setor. O colaborador é orientado a seguir os

procedimentos padrão de higiene operacional (PPHO 4), de acordo com

cartazes fixados no local de trabalho.

Manual de BPP

Etapa 2 – Recursos Humanos

Cód: 02

Seção: 2

Revisão: 10/08/2012

Página: 05


Orientações principais:

- Uso do EPI (jaleco azul e sapato branco) exclusivamente dentro do

laboratório.

- Fazer a higienização das mãos antes, durante e após a rotina de trabalho.

- Não se alimentar e usar equipamentos para acondicionar alimentos, não

usar adornos e espirrar ou tossir sobre o produto ou equipamentos para

evitar contaminações.

Colaboradores da área externa: Como área externa entende-se os

setores de quarentenário (unidade I) e de manejo geral dos touros. Nestes

setores o treinamento se dá por acompanhamento e realização dos

procedimentos efetuados pelos demais colaboradores de cada setor sob

orientação do Médico Veterinário. O colaborador é orientado a seguir os

procedimentos padrão de higiene operacional (PPHO 4), de acordo com

cartazes fixados no local de trabalho.

Orientações principais:

- Uso do EPI (calça, camisa, botas com ponteira de aço e luvas descartáveis

durante o trabalho no quarentenário e no momento da coleta do ejaculado).

- Atenção a atitudes que possam reduzir a qualidade do sêmen como: tossir

e/ou espirrar sobre os produtos e equipamentos; expor o ejaculado a

luz solar direta.

- Não fumar, não se alimentar e não utilizar adornos que possam

apresentar risco dentro da rotina de trabalho.

- Não utilizar a geladeira da sala de apoio para armazenar materiais que

não os da rotina.

- Higienizar as mãos sempre que utilizar o sanitário ou executar uma tarefa

contaminada (levar ou trazer um touro do piquete, manipular cabrestos de

touros ou manequins) ou sempre que julgar necessário de acordo com a

sistemática descrita no PPHO 3 e no PPHO 4.


2.3 Procedimento para avaliação médica

O controle da condição de saúde clínico dos colaboradores é realizado

através de um convênio com empresa especializada contratada.

São realizados exames admissionais, periódicos e demissionais em todos os

colaboradores da área de produção:

Admissional: avaliação clínica;

Periódico: realizado anualmente

Colaboradores da área externa: avaliação clínica, audiometria, colinesterase

plasmática e colinesterase eritrocitária. Para os operadores de máquinas é

realizado também o exame de acuidade visual.

Colaboradores da área interna: avaliação clínica, audiometria, colinesterase

plasmática e colinesterase eritrocitária.

Demissional: avaliação clínica e os demais exames solicitados para

colaboradores das áreas externa ou interna, conforme a área específica de

trabalho de cada um.

No Anexo 1 está o modelo do laudo emitido pela empresa,

considerando o colaborador apto ou não para a função.

Os colaboradores, quando acometidos por qualquer alteração na

condição de saúde são afastados conforme a prescrição médica, havendo

para isso a necessidade de comprovação através de um atestado médico

com a respectiva indicação da doença.

A sistemática especificando o controle deste requisito está descrita no PPHO

7.

2.4 Fornecimento e uso de uniformes

Na admissão os colaboradores recebem dois conjuntos de uniformes,

sendo calça e camisa de cor bege para os da área externa e jaleco azul e

sapato branco para os da área interna. A medida que houver desgaste os

uniformes serão repostos pela empresa.


Cada colaborador é responsável pela conservação e lavagem do

uniforme seguindo as normas do PPHO 4. A troca por uniforme limpo deve

ser diária e semanal para os colaboradores da área externa e interna,

respectivamente.

2.5 Procedimento para capacitação dos funcionários

As reciclagens ocorrem anualmente abordando as tarefas realizadas

rotineiramente, ressaltando sua importância para a obtenção de um produto

de qualidade com total segurança dos colaboradores. São realizadas

também, palestras semestralmente sobre assuntos diversos como a

importância da quarentena, zoonoses e pontos que podem afetar a

qualidade do produto final. A comprovação da realização das palestras

ficará arquivada junto aos registros de realização das tarefas (POP) para

controle futuro.

2.6 Procedimento em relação à segurança do trabalho

A prevenção de acidentes é executada pela Comissão Interna de

Prevenção de Acidentes (CIPA). Esta comissão reune-se uma vez por mês

para discutir assuntos relacionados a rotina de trabalho. Semestralmente

são realizadas palestras ressaltando a importância e orientando quanto ao

uso dos EPIs e da atenção no momento de manejar os touros e trabalhar

com as máquinas agrícolas. A comprovação da realização das reuniões da

CIPA ficará arquivada junto aos registros de realização das tarefas (POP)

para controle futuro. Os responsáveis pela CIPA com seus respectivos

cargos apresentam-se no Anexo 2.

Equipamento de Proteção Individual (EPI)

Cada colaborador da área externa recebe junto com os uniformes na

admissão: um par de botas de borracha, um par de botinas com ponteira de

aço, um par de botinas de couro, um par de caneleiras, um protetor


auricular e um par de óculos de proteção. Conforme a necessidade esses

equipamentos são repostos.

Os colaboradores que realizam a aplicação de herbicida, ou qualquer

outro produto químico que possa trazer riscos à saúde do manipulador

utilizam máscaras, macacão especial e botas.


Manual de BPP

Etapa 3 – Instalações, Edificações e

Saneamento

Cód: 03

Seção: 1

Revisão: 10/08/2012

Página: 10

3. Instalações, Edificações e Saneamento

A empresa possui área total de 250 hectares destinados a abrigar

touros de diversas raças, laboratórios e escritórios.

As instalações como alojamento dos animais, laboratório e

quarentenário estão cercadas por tela com dois metros de altura e cerca

perimetral com no mínimo 25 m de distância garantindo isolamento dos

criatórios vizinhos e da rodovia.

O CCPS está instalado em área drenada e em perfeitas

condições para manter a saúde e o bem-estar dos animais alojados e

a boa qualidade do produto, possuindo entradas e saídas controladas,

com rodolúvio automático para desinfecção de veículos que entram

na área isolada.

As instalações identificadas nas figuras 1 e 2 constam de: unidade

laboratorial; unidade de coleta de sêmen; unidade de apoio (constituída por

sala de preparação de material de coleta, laboratório de apoio sanitário,

escritório veterinário e vestiário masculino); unidade de alojamento do

rebanho residente; unidade de quarentena; oficinas, depósitos de ração e

feno; unidade administrativa; unidade comercial e de estocagem de sêmen,

residências dos funcionários.


Figura 1: Organograma das instalações do CCPS.

QUARENTENÁRIO (1)

28 dias para exames sanitários

TRONCO DE CONTENÇÃO (10)

Lavagem prepúcio

ÁREA COBERTA DE COLETA (11)

Coleta dos touros europeus

ÁREA EXTERNA DE COLETA (10)

Coleta touros zebuínos

UNIDADE LABORATÓRIAL (12)

Avaliações e congelamento do sêmen

BLOCO DE APOIO (12)

Sala do veterinário

Sala de preparação vaginas artificiais

Sala de apoio sanitário

Vestiário masculino

REBANHO RESIDENTE (2)

117 piquetes

ENFERMARIA (3)

Possui 6 baias para

touros em tratamento veterinário

UNIDADE DE CASQUEAMENTO

PEDILÚVIO E PESAGEM DOS TOUROS (5)

OFICINA (4)

Armazenamento e manutenção dos equipamentos

CAPINEIRAS (6) UNIDADE ADMINISTRATIVA (7)

ESTOQUE

REFEITÓRIO (8) CASAS DOS FUNCIONÁRIOS (9)


Figura 2: Imagem aérea do CCPS. Os números identificam as unidades

citadas na figura 1.

3.1 Tipo de construção

Todos os prédios que fazem parte da empresa são de alvenaria,

incluindo os abrigos dos piquetes dos touros.

As condições das instalações prediais (conservação de portas,

janelas, telas, estruturas e revestimentos das paredes, estrutura das casas

dos touros bem como dos bebedouros e comedouros) são verificadas

mensalmente pelo funcionário responsável pela manutenção.

3.2 Abastecimento de água

A água utilizada no CCPS é proveniente de poço artesiano,

abastecendo as caixas d’água de cada setor (quarentenário, laboratório e

área administrativa). A água para limpeza geral e banho dos touros é em

01

02

03

04

05

06

07 09

10

11 12

07

08


parte captada da chuva ou de represa própria, ficando armazenada em duas

caixas d’água auxiliares (no quarentenário e próximo a área coberta de

coleta). O controle de qualidade da água utilizada na empresa é descrita no

PPHO 1.

3.3 Sistema de esgotos

As águas servidas do laboratório, banheiros sanitários e provenientes

da limpeza em geral são captadas para fossas sépticas distantes dos pontos

de captação. Quando cheias, as fossas são esvaziadas desprezando-se o

conteúdo no depósito para lixo.

A água utilizada na lavagem dos touros e na área do tronco de

contenção é armazenada em fossa de decantação. Desta fossa é feito o

bombeamento da fração líquida para as capineiras.

3.4 Lixo e dejetos

O material com risco biológico (laboratório e área externa) é

armazenado em recipientes plásticos específicos ou caixas de descarte de

material perfuro cortante que são recolhidos mensalmente por empresa

terceirizada.

O lixo comum é descartado em lixeiras com tampa dispostas em

vários locais da empresa. O recolhimento destes resíduos é feito em carreta

tracionada por trator da ABS três vezes por semana seguindo o fluxo: das

lixeiras da área de produção, refeitório, logística e administração e

residências dos funcionários até o depósito de lixo. Duas vezes por semana

esses resíduos são recolhidos por um caminhão da prefeitura do município.

As embalagens de produtos agrícolas são devolvidas aos

fornecedores, conforme legislação em vigor.

Os dejetos animais (esterco e camas) coletados nos abrigos dos

touros, locais de coleta e quarentenário são armazenados em composteiras

para fermentação e posterior uso como adubo orgânico nas capineiras.


Higienização das Lixeiras

Uma vez a cada quinze dias, ou mais frequentemente se necessário,

as lixeiras são lavadas com água, detergente neutro e escova. As lixeiras da

área interna são ainda desinfetadas com álcool 70%.


Manual de BPP

Etapa 4 – Equipamentos

Cód: 04

Seção: 1

Revisão: 10/08/2012

Página: 15

4. Equipamentos

4.1 Equipamentos existentes e suas especificações

Sala 1

- Sistema de filtração de água

- Destilador de Água

Modelo 724 FANEM LTDA®

São Paulo – Brasil

- Deionizador de água

PURITECH PT 0020

- Autoclave Vertical modelo 415

FANEM LTDA® São Paulo – Brasil

- Osmômetro eletrônico digital 3122

LAKTRON

- Máquina seladora

Imap – Ribeirão Preto – SP

Série 72

- Balança Analítica de Precisão

GEHAKA BK 500


Sala 2

- Estufa de cultivo modelo 002 CB

FANEM LTDA® - São Paulo – Brasil

- Máquina de Análise Computadorizada de Sêmen

Programa Casa – IMV®

Hamilton Thorne Ivos

- Bloco térmico BT 02

KACIL Indústria e Comércio Ltda

- Agitador Biomixer

QL 901

- Descongelador eletrônico de sêmen

FERTILIZE LTDA 220 V

Belo Horizonte – MG

- Placa aquecedora

NEOVET

- Centrífuga

FANEM® - São Paulo

- Centrífuga

Damon / IEG Division

- Geladeira

Brastemp®

- Armário ultra-violeta

Esterilização dos ovos


Sala 3

- Estufa de secagem e esterilização

Modelo 315 SE FANEM®-SP

- Estufa retilínea

FANEM® LTDA-SP

Sala 4

- Estufa retilínea

FANEM®- LTDA SP

- Balança eletrônica

Bioprecisa JA3003N B345

- Bloco térmico

Kacil Indústria e Comércio Ltda

- Pipeta eletrônica

Rainin®

- Fotômetro

IMV® Technologies

Bovine protometer n° 694

- Diluidor de sêmen

Equilab® Microlab 530B diluter

Siemens distribuidor CA 810

- Computador

Dell®


Quantidade: 2

- Banho Maria: Modelo 102

FANEM® LTDA-SP

- Placa aquecedora

Eletrovet®

- Microscópio óptico

Nikon® Labophot

- Maquina de envase de sêmen

IMV Technologies®

- Máquina identificadora de palhetas

IMAJE 7S

Impressora INK JET

- Botijões de nitrogênio líquido

MVE Cryogenios

- Máquina de congelamento

Digitcool 5300 3T

Computador acoplado

- Reservatório para nitrogênio líquido

- Split

Split totaline

Quantidade: 2

- Microscópio óptico

Olympus® Modelo BH


- Balcão Refrigerado

- Microscópio Óptico

Zeiss®

4.2 Programa de manutenção preventiva e calibração dos

equipamentos

A descrição da operação a ser realizada quando o equipamento for

utilizado está escrita no procedimento operacional padronizado (POP),

específico de cada equipamento.

O programa de manutenção preventiva e calibração dos equipamentos

é executado pelo funcionário responsável pelo equipamento, conforme

descrito no POP, ou por empresa responsável como no caso da balança de

precisão, por exemplo.

Estufas (n=6), balcão refrigerado e bloco térmico: A manutenção

preventiva e a calibração das estufas, do balcão refrigerado e do bloco

térmico são realizadas pelo acompanhamento de suas temperaturas através

da utilização de um termômetro para cada equipamento. No balcão

refrigerado deve ser utilizado termômetro de máxima e mínima mantendo o

sensor imerso em água a fim de evitar flutuações bruscas de medição.

Havendo a impossibilidade da correção de desvios na temperatura de

qualquer equipamento a assistência técnica deve ser acionada.

Balanças de precisão (n=2): o perfeito funcionamento das balanças

depende de sua correta utilização: (1) nivelando e não movimentando o

equipamento; (2) limpando delicadamente após o uso utilizando pincel de

cerdas macias; (3) removendo a base de pesagem para completa limpeza.

A verificação da calibração deve ser realizada semanalmente utilizando-se o

peso padrão. Caso alguma das balanças apresente alteração em relação ao

padrão, a assistência técnica deve ser acionada.

Pipetador de volume ajustável: o pipetador deve ser higienizado com

álcool 70% antes e após o uso, permanecendo em suporte apropriado na

posição vertical evitando agregação de partículas em seu interior. Seu

adequado funcionamento deve ser monitorado avaliando-se a constância do


volume ou formação de gotas. Em caso de suspeita efetuar teste

hidrostático: (1) fixar a ponteira ao pipetador; (2) pipetar água destilada

até o primeiro estágio da pipeta; (3) obstruir a abertura da ponteira com

um dedo; (4) acionar o êmbolo até o segundo estágio durante 20

segundos; (5) liberar o acionador do êmbolo lentamente até sua posição

original; (6) desobstruir a abertura da ponteira. Caso seja observado

deslocamento da água é confirmada a existência de problema no

acoplamento com a ponteira ou de vedação do pipetador. Caso não seja

possível corrigir o problema, o pipetador deve ser encaminhado a

assistência técnica.

Geladeiras (n=3): devem ser monitoradas quanto a temperatura

observando-se os termômetros internos. No caso de acúmulo de gelo

superior a 01 cm o equipamento deve ser descongelado e limpo com água e

detergente neutro. Caso haja alteração de temperatura fazer a verificação

das borrachas de vedação das portas e do funcionamento do termostato. Se

houver problema, encaminhar o equipamento para manutenção

Microscópios ópticos (n=3): devem ser mantidos com as lentes

(objetivas e oculares) limpas usando papel absorvente macio e solução de

etanol/éter etílico (60/40). Limpar a poeira do condensador e da mesa do

microscópio com pincel e manter os equipamentos cobertos com capa de

tecido após o uso. Quando for detectada contaminação fúngica ou

desalinhamento de componentes, encaminhar o equipamento para

manutenção.

Autoclave: manter o cesto e a câmara de autoclavagem limpos e com

água destilada cobrindo totalmente a resistência. Em caso de detecção de

vazamento de vapor na tampa ou na válvula de segurança tentar ajustar.

Caso não seja possível controlar o vazamento ou houver alteração de

funcionamento do manômetro, encaminhar o equipamento para

manutenção.

Fotômetro e diluidor automático: a calibração do fotômetro deve ser

aferida semanalmente mediante utilização de cubetas padronizadas

(próprias do equipamento). Já a calibração do sistema de diluição e

determinação da concentração espermática deve ser aferida mediante

realização de avaliações sucessivas da mesma amostra seguida da aferição

no sistema CASA. Em caso de inconstância dos resultados rever o


procedimento. Se não for detectada a origem do problema, solicitar

orientação da assistência técnica.

Máquina de envase e impressão nas palhetas: verificar o nível do

reservatório de tinta e testar a velocidade de impressão observando a

adequada impressão das informações (usar palhetas de teste). Conectar as

agulhas e tubos de preenchimento das palhetas de forma higiênica. Caso o

preenchimento das palhetas não esteja adequado, conferir a montagem do

sistema. Se não for possível ajustar a impressão e/ou o preenchimento das

palhetas solicitar orientação ou a antecipação da visita anual da assistência

técnica para calibração.

Osmômetro: verificar o nível da solução de resfriamento (trocar

mensalmente) e calibrar o osmômetro com as soluções padrão. Caso não se

obtenha calibração, encaminhar o equipamento para manutenção.

Não havendo possibilidade de calibração e/ou reparo de algum

equipamento ou utensílio deve-se proceder sua substituição.


Manual de BPP

Etapa 5 – Sanitização

Cód: 05

Seção: 1

Revisão: 10/08/2012

Página: 21

5. Sanitização

A descrição da frequência, produto utilizado e procedimento de

higienização de equipamentos, utensílios e de ambiente estão descritos no

PPHO 2 – Higiene das instalações, equipamentos e utensílios.

5.1 Controle de pragas

No ambiente da empresa podem ocorrer infestações de moscas,

formigas, ratos e carrapatos. A entrada de insetos no laboratório é

prevenida por barreiras físicas (portas e janelas com telas) associada a

aplicação quinzenal de inseticida a base de piretróides (usar EPI durante a

aplicação). A aplicação deve ser monitorada (data, freqüência e colaborador

responsável) mediante registro em planilha arquivada junto aos demais

registros gerados (POP, etc).

O controle de roedores é feito mediante emprego de armadilhas

estrategicamente distribuídas e inspecionadas quinzenalmente por empresa

especializada terceirizada (Anexo3).

O controle de carrapatos é realizado mediante pulverizações nos

touros com produto carrapaticida de acordo com recomendação do médico

veterinário.


Manual de BPP

Etapa 6 – Produção

Cód: 06

Seção: 1

Revisão: 10/08/2012

Página: 22

6. Produção

6.1 Matéria-Prima

Entende-se por matéria-prima o sêmen obtido dos touros que fazem

parte do plantel residente do CCPS. Para entrarem no plantel residente os

animais passam por um período de quarentena em que são sanitariamente

testados de acordo com a regulamentação do MAPA. Segundo a INSTRUÇÃO

NORMATIVA Nº 48, de 17 de junho de 2003 (MAPA), os touros somente

poderão ingressar no rebanho residente para iniciarem o regime de coleta

após submetidos à quarentena por um período mínimo de 28 dias onde

serão testados para as seguintes doenças: brucelose, tuberculose,

campilobacteriose genital bovina, tricomonose e diarréia viral bovina (BVD).

O status de produção é avaliado a cada rotina de coleta enquanto a

condição sanitária é reavaliada semestralmente para as seguintes doenças:

brucelose, tuberculose, campilobacteriose genital bovina e tricomonose.

Para o processamento da matéria-prima são utilizados compostos

químicos (antibióticos e reagentes) e biológicos (gema de ovo pasteurizada)

provenientes de fornecedores com reconhecida capacidade técnica e

higiênico-sanitária. No recebimento dos compostos são verificadas data de

fabricação/produção, data de validade e condições da embalagem.

6.2 Etapas de processamento

1 - Preparação da solução base de diluente

Inicialmente são pesados/medidos os antibióticos (pó ou solução comercial

mantido em geladeira) preparando soluções base para adição ao sêmen ou

diluente pronto. Em seguida os componentes químicos (mantido no


almoxarifado) são pesados e diluídos em uma proveta usando água

destilada, constituindo a solução base de citrato de sódio.

2 - Preparação do diluente para processamento do sêmen

O diluente é preparado a cada dois dias usando uma proveta de um litro

misturando a solução base de citrato de sódio, gema de ovo e antibiótico

para constituição do diluente (frações A1 e B1) (anexo 4). Os componentes

são homogeneizados e mantidos sob refrigeração de 5°C por 12 horas para

decantação. Após esse período, descarta-se o sedimento e prepara-se as

duas frações de diluente: fração A2 (sem glicerol) e Fração B2 (com glicerol

e corante alimentício verde) (anexo 4).

3 - Processamento da matéria-prima

A partir do recebimento da matéria-prima na janela de duplo óculo o

coletador repassa a identificação do touro doador do sêmen para o

laboratorista. Após identificar e registrar o horário de entrada o

laboratorista coleta uma amostra para determinação da concentração, pesa

o tubo de coleta e adiciona 2% de solução de antibióticos ao ejaculado. O

material é mantido em incubação no bloco térmico por cinco minutos até

ser realizada a primeira diluição (1:1 ou 1:2) com a fração A2 do diluente. A

partir do material diluído procede-se a avaliação da motilidade da amostra

(apto ou não ao congelamento), determinando-se o grau de diluição final a

que será submetido, de acordo com o registro programado para cada touro

(programa PecTouro). As amostras aptas ao congelamento são levadas ao

compartimento do balcão refrigerado a 9°C onde permanecerão por uma

hora. Ao final deste período a amostra será levada ao compartimento

principal do balcão refrigerado para atingir 5°C (uma hora) para então

completar a diluição (PCC1) com a fração A do diluente isotérmico e a

fração B2 correspondente, sendo a última de modo escalonado a fim de

evitar choque osmótico. Trinta minutos após a diluição final, as amostras

são submetidas ao envase em palhetas de 0,5 mL. As palhetas prontas são

então inspecionadas quanto ao correta preenchimento, contadas e


acondicionadas em recipientes a granel. Os recipientes contendo as

palhetas de cada touro são então acondicionadas em caixa térmica a 5°C

para transporte ao setor de congelamento (PC1).

No setor de congelamento as palhetas são raqueadas dentro da câmara fria

antes de serem levadas ao túnel de congelamento, onde ocorrerá a curva

de congelamento para posterior imersão em nitrogênio líquido (-196°C) e

acondicionamento em botijões criogênicos (PCC2).

Após ser atestada a viabilidade espermática pós-descongelamento (analise

da concentração e motilidade através do sistema Computer Assisted Semen

Analysis - CASA) a partida será liberada para expedição.

5 – Distribuição

As amostras de sêmen são distribuídas em botijões criogênicos.

6.3 Fluxograma de processamento da matéria-prima

REVISAR PLANILHAS DA COLETA DIÁRIA

IDENTIFICAR TOUROS

TRAZER TOUROS PARA ÁREA DE COLETA

REALIZAR HIGIENIZAÇÃO DOS TOUROS SOMENTE NO MOMENTO DA COLETA

PEGAR A MANEQUIM DE PREFERÊNCIA DO TOURO, HIGIENIZANDO SEU

POSTERIOR COM A SOLUÇÃO DESINFETANTE ANTES DE CADA COLETA

DESVIAR O PÊNIS DO TOURO NOS TRÊS PRIMEIROS SALTOS

PREPARAR A VAGINA ARTIFICIAL

REALIZAR A COLETA DO SÊMEN E ENTREGAR O TUBO COM ETIQUETA DE

IDENTIFICAÇÃO NA JANELA DE DUPLO ÓCULO


AMOSTRA NA JANELA DUPLO ÓCULO: VERIFICAR NOME DO TOURO, COLETADOR E

HORÁRIO - REGISTRAR NA PLANILHA

PESAR, ADICIONAR ANTIBIÓTICO, VERIFICAR CONCENTRAÇÃO E REALIZAR A PRÉ-

DILUIÇÃO

AVALIAR MOTILIDADE E ANOTAR TODOS OS DADOS NO PROGRAMA PECTOURO,

LIBERANDO OU NÃO A AMOSTRA PARA CONGELAMENTO

LEVAR AMOSTRA PARA O COMPARTIMENTO A 9°C NO BALCÃO REFRIGERADO

DEIXANDO POR 1 HORA

AMOSTRA NO BALCÃO A 5°C POR 1 HORA E EM SEGUIDA REALIZAR A DILUIÇÃO

FINAL DEIXANDO A AMOSTRA ESTABILIZAR POR 30 MIN (PCC1)

IDENTIFICAR AS PALHETAS

ENVASAR AS AMOSTRAS NAS PALHETAS REVISANDO-AS APÓS ENVASE

(CONTROLE DE QUALIDADE)

COLOCAR AS PALHETAS EM CAIXA TÉRMICA COM GELO RECICLÁVEL –

TRANSPORTE PARA A ÁREA DE CONGELAMENTO (PC1)

RAQUEAMENTO NO INTERIOR DA CÂMARA FRIA

CONGELAMENTO NO TÚNEL DE CONGELAMENTO

ARMAZENAR AS PALHETAS NOS BOTIJÕES ATÉ LIBERAÇÃO (PCC2)


6.4 Etapas críticas do processo

Ponto Crítico de Controle (PCC)

Etapa: Diluição Final - PCC1

Medidas de controle: Medir corretamente o volume de diluente que deverá

ser adicionado a amostra. Para isso, usar provetas graduadas previamente

testadas quanto a medição correta de líquidos.

Etapa: Armazenamento – PCC2

Medidas de controle: Manter o nível de nitrogênio líquido adequado nos

botijões de armazenamento.

Ponto de Controle (PC)

Etapa: Transporte – PC1

Medida de controle: Utilizar gelo do tipo reciclável suficiente para manter a

temperatura no interior da caixa térmica em 5°C.


Manual de BPP

Etapa 7 – Embalagem e Rotulagem

Cód: 07

Seção: 1

Revisão: 10/08/2012

Página: 27

7. Embalagem e Rotulagem

7.1 Procedimento de armazenamento e manipulação das palhetas

de envase

Para o envase da matéria-prima processada são utilizadas palhetas

de cloreto de polivinil (IMV®) brancas com vedantes de cor vermelha e azul

e capacidade para 0,5 mL. As palhetas vazias são armazenadas no

almoxarifado do laboratório dentro de sua embalagem original lacrada,

preservando sua condição sanitária. No momento do uso a embalagem e as

mãos do laboratorista devem ser limpas com álcool 70%. A manipulação

das palhetas deve ser restrita a sua colocação no reservatório do

equipamento de rotulagem e posterior envase para evitar contaminação.

7.2 Sistema de envase e rotulagem

A matéria-prima processada é envasada através de sistema

automatizado (IMV®) que lacra as palhetas previamente rotuladas em

sitema automatizado (IMV®) com identificação do CCPS, nome do touro,

raça do touro, partida e data de congelamento (sentido plug de vedação

para ponta).

7.3 Armazenamento e distribuição

O produto final envasado e congelado é mantido em condições

criogênicas em nitrogênio líquido sendo liberado para expedição após

avaliação da viabilidade pós-descongelamento. O produto é mantido

armazenado na área de estoque onde é preservada a condição de higiene e


o favorecimento logístico de facilidade de acesso para expedição em

botijões criogênicos de transporte.


Manual de BPP

Etapa 8 – Controle de Qualidade

Cód: 08

Seção: 1

Revisão: 10/08/2012

Página: 29

8. Controle de qualidade

A qualidade da matéria-prima é garantida através de

acompanhamento da motilidade e vigor espermático no sêmen recém-

coletado em cada rotina. Somente são considerados para processamento os

ejaculados com mínimo de 70% de motilidade progresiva e vigor ≥3 (0 -5)

com mínimo de 70% de células normais determinado em espermograma

semanal. As avaliações de motilidade e vigor de rotina são realizadas pelos

laboratoristas treinados enquanto o espermograma e a decisão final pela

liberação ou condenação do ejaculado é de responsabilidade do médico

veterinário do laboratório.

Após o processamento e congelamento são avaliadas amostras de

todas as partidas através do sistema Computer Assisted Semen Analysis

(CASA). Nesta avaliação é feita a aferição da concentração e motilidade

espermática na dose de sêmen para liberação ou rejeição das partidas. O

resultado destas análises fica arquivado no laboratório para registro do

desempenho dos touros.

O controle de qualidade microbiológico do material processado é

realizado mensalmente (ou no caso de troca de partida de antibióticos)

mediante envio de amostras para laboratório terceirizado equipado para

realização de espermocultura. Para o teste são enviadas 10 palhetas de três

touros e 10 palhetas preparadas somente com diluente (sem sêmen)

identificadas como VET TESTE dia/mês/ano raqueadas com identificação de

controle de qualidade (CQ).


Preparação das palhetas VET TESTE:

Pesar 5,0 mL de água destilada autoclavada;

Acrescentar 0,1 mL do coquetel de antibióticos (100 µg);

Misturar 5,0 mL de diluente A2;

Resfriar e equilibrar até 5°C;

Após 2 horas adicionar 36 mL de diluente A2 e 44 mL de

diluente B2.

O resultado de número de unidades formadoras de colônia (UFC) serve para

acompanhamento do controle da higiene de processamento e eficiência dos

antibióticos usados no diluente, como também, ao cumprimento da norma

internacional estabelecida pela OIE (organização internacional de saúde

animal), de até 5.000 UFC/mL de sêmen processado.


ANEXO 1 – Atestado de saúde ocupacional


ANEXO 2 – Comissão interna de prevenção de acidente - CIPA

NOME FUNÇÃO

Desimar Pereira Cerqueira Presidente

Edson Filiace Suplente

Érsio Estênio Lindenmayer Vice-Presidente

Edmar de Souza Suplente

Érico de Almeida Junior Secretário

Marina da Glória Caldas Santos Suplente


ANEXO 3 – Modelo de laudo de controle de pragas


ANEXO 4 – Diluente citrato-gema

Preparação do diluente: frações A1 e B1.

A1 B1

VOLUME (mL) 500 1000 500 1000

Citrato de sódio dihidratado (g) 29 58 50 100

H2o destilada/autoclavada (ml) 385 770 325 650

*Antibiótico solução estoque (ml) 0,5 1,0 0,5 1,0

Gema de ovo (ml) 100 200 100 200

Total 485,5 971 425,5 851

Osmolaridade 218 a 242mOsm 398 a 420mOsm

30% de tilosina (Tylan 200), 40% de gentamicina (Gentocin) e 30% de

lincomicina + espectinomicina (LincoSpectin).

As frações A1 e B1 preparadas devem permanecer sob refrigeração de 5°C por 12 horas para decantação (o sedimento deve ser desprezado);

As frações A2 e B2 do diluente devem ser preparados na manhã do

dia do congelamento, sendo imediatamente colocados no balcão refrigerado;

Preparação do diluente: frações A2 e B2.

Produto (ml) A2 B2

500 1000 500 1000

Frações A1 ou B1 qsp (ml) 488,5 971 430 860

Tylan 200 (ml) 3 6 - -

Gentocin (ml) 2 4 - -

LincoSpectin (ml) 3 6 - -

Glicerol PA (99%) - - 70 140

Corante alimentício verde - - 0,5 1,0


PROCEDIMENTOS PADRÃO

DE

HIGIENE OPERACIONAL (PPHO)


PPHO 1 Potabilidade da água

Cód: PPHO 1

Revisão: 10/08/2012

Página: 38

1. Objetivo

Estabelecer procedimentos a serem adotados para manter a potabilidade da

água utilizada dentro do CCPS para consumo animal, humano e laboratorial.

2. Campo de aplicação

Aplicação nas três caixas d’água distribuídas no CCPS: uma na área do

laboratório, uma no quarentenário e outra na área administrativa.

3. Definições

- Seguro: que não oferece risco químico ou biológico aos animais, humanos,

processos laboratoriais e a qualidade do produto final;

- Contaminado: oferece risco químico ou biológico aos animais, humanos,

processos laboratoriais e a qualidade do produto final;

- Limpeza: procedimentos de lavagem mediante uso de água e

sabões/detergentes para eliminação de matérias indesejáveis (terra,

matéria orgânica, outros);

- Sanitização: aplicação de produtos químicos com propriedades de destruir,

remover ou reduzir a concentração de microrganismos patogênicos até

níveis considerados seguros, mantendo a água potável.

4. Responsabilidades

O gerente da produção será responsável por implantar, acompanhar e

assegurar o cumprimento do PPHO 1 pelos responsáveis de cada setor.

Os reparos dos reservatórios e linhas de distribuição de água serão

realizados por uma empresa terceirizada também responsável pela limpeza


e sanitização dos reservatórios. O anexo 5 mostra um laudo emitido por

empresa responsável por realizar a limpeza e sanitização das caixas d’água.

5. Monitorização

5.1 Controle da potabilidade da água

É realizado através de análise físico-química e bacteriológica da água. O

anexo 6 mostra o laudo emitido após avaliação da qualidade da água.

Frequência: semestral através de auditoria realizada por empresa

responsável pelo plano APPCC.

5.2 Limpeza e manutenção das caixas d’água e reservatórios

A monitorização é feita através do acompanhamento dos laudos arquivados.

Frequência: semestral através de auditoria realizada por empresa


6. Ação Corretiva

6.1 Controle da potabilidade da água

Segundo o laudo e indicações emitidas pela empresa responsável por essas

análises, o CCPS providencia as medidas necessárias para correção.

6.2 Limpeza e manutenção das caixas d’água e reservatórios

A ação corretiva necessária é realizada pela empresa responsável pela

limpeza e manutenção.


PPHO 2

Higiene das instalações, equipamentos e

utensílios

Cód: PPHO 2

Revisão: 10/08/2012

Página: 40

1. Objetivos

Estabelecer procedimentos e requisitos de higiene de instalações e

superfícies envolvidas no processamento da matéria prima que possam

trazer algum risco de contaminação do produto final.


Este procedimento aplica-se a toda área de quarentenário e de produção

incluindo piquetes dos touros, tronco de preparação para coleta, áreas de

coleta, sala de preparação das vaginas atificiais, laboratório de

processamento, laboratório de apoio sanitário, enfermaria, tronco

hidráulico, pedilúvio e balança de pesagem.


O gerente da produção é responsável por implantar, acompanhar e

assegurar o cumprimento do PPHO 2 pelos responsáveis de cada setor.

Todos os colaboradores são responsáveis por aplicar os requisitos de

higiene descritos neste procedimento.

4. Descrição

4.1 Disponibilização de produtos e utensílios para higienização de

materiais e instalações

- O CCPS disponibiliza detergentes e sanitizantes em quantidade suficiente

para a realização dos procedimentos de limpeza e sanitização. Detergentes

específicos são mantidos na área de lavagem de material no laboratório e

na sala de preparação de material de coleta. Os demais produtos de limpeza


são armazenados em local específico para estocagem no banheiro feminino

da unidade laboratorial.

- As instalações são providas de água fria e quente em quantidade

suficiente.

- Os utensílios (baldes, esponjas, rodos) estão disponíveis em quantidade

suficiente, sendo armazenados no local de estocagem.

4.2 Limpeza e sanitização de equipamentos, utensílios e

instalações

O CCPS possui um programa de higienização para instalações,

equipamentos e utensílios, contemplando informações como: instalação /

equipamento / utensílio; frequência; produto e procedimento de

higienização.


Quadro 1: Limpeza e sanitização de equipamentos

EQUIPAMENTO FREQUÊNCIA PRODUTO PROCEDIMENTO DE HIGIENIZAÇÃO

Balanças digitais , Placa aquecedora, Bloco térmico, Fotômetro,

Balcão refrigerado

Após o uso

(diária)

Álcool 70%

Nas Balanças digitais remover produtos secos com pincel antes de limpar com gaze embebida em álcool 70%. Placa aquecedora, Bloco térmico, Fotômero devem ser limpos com álcool 70% e secos com papel toalha.

Microscópios Após o uso

(diária)

Álcool-éter

Álcool 70%

Limpar lentes (oculares e objetivas) com algodão embebido em álcool-

éter e outras superfícies com álcool 70%.

Estufa de secagem de

material, Estufa de esterilização, Estufa de

aquecimento do diluente, Estufas de aquecimento das VAs

Semanal Álcool 70%

Borrifar álcool 70% no interior das estufas passando em seguida papel

toalha.

Estufa de secagem de material, Estufa de

esterilização, Estufa de aquecimento do diluente,

Estufas de aquecimento das VAs

Mensal Detergente neutro

álcool 70%

Desligar as estufas. Lavar as grades em uma pia usando esponja e detergente neutro e em seguida enxaguar em água corrente. Lavar os

equipamentos interna e externamente com esponja e detergente neutro, tomando o cuidado para não danificar a resistência no interior dos

mesmos. Retirar o excesso de detergente com esponja ou pano úmido. Borrifar álcool 70% nas grades, no interior e exterior das estufas secando com papel toalha. Colocar as grades no lugar e ligar as estufas

controlando se a temperatura correta foi alcançada.

Autoclave

Semanal Detergente neutro

álcool 70%

Lavar o cesto em uma pia usando esponja e detergente neutro e em

seguida enxaguar em água corrente. Lavar a caldeira internamente usando esponja e detergente neutro. Drenar a água e enxaguar até

remover todo o detergente. Borrifar a caldeira e o cesto com álcool 70% secando a seguir com papel toalha. Abastecer a caldeira com água destilada até cobrir a resistência, recolocar o cesto e fechar a tampa do

equipamento.

Armário UV Semanal Álcool 70% Borrifar álcool 70% no interior do armário secando com papel toalha em


seguida.

Armário UV

Quinzenal Detergente neutro

álcool 70%

Lavar as grades em uma pia usando esponja e detergente neutro

retirando o excesso com esponja e em seguida enxaguar em água corrente. Higienizar o interior do armário com esponja úmida e

detergente neutro, retirando o resíduo com a esponja e secando em seguida com papel toalha. Borrifar álcool 70% nas grades e no interior

do armário secando-os com papel toalha.

Balcão refrigerado


álcool 70%

Usar esponja úmida e escova de cerdas macias (para os cantos) com detergente neutro para higienização interna e externa. Remover o

detergente com esponja úmida, borrifar álcool 70% e secar com papel toalha.

Deionizador Mensal Álcool 70%

Manter superfície externa limpa com uso de álcool 70% e papel toalha. Limpar a coluna nova com álcool 70% no momento da troca.

Destilador Mensal

Ácido Acético Álcool 70%

Abastecer a caldeira com ácido acético para remoção de crostas de sais. Após 15 minutos drenar o ácido e enxaguar com água corrente. Limpar

externamente com álcool 70% e papel toalha.

Geladeiras

A cada 2 meses

Detergente neutro, Álcool 70%

Esvaziar e desligar o equipamento forçando o degelo com ventilador.

secar com pano e higienizar interna e externamente com esponja e detergente neutro, retirando o resíduo com a esponja úmida. Após, borrifar álcool 70% e secar com papel toalha.

Armários e gavetas Mensal

Detergente neutro, Álcool 70%

Esvaziar e higienizar interna e externamente com esponja e detergente neutro, retirando o resíduo com a esponja úmida. Após, borrifar álcool

70% e secar com papel toalha.


Quadro 2: Limpeza e sanitização de utensílios

UTENSÍLIO FREQUÊNCIA PRODUTO PROCEDIMENTO DE HIGIENIZAÇÃO

Vidraria

Após o uso

Álcool 96°GL

Detergente neutro

água deionizada

Remover marcas de caneta higroscópica com álcool 96°GL, enxaguar em água

corrente e colocar de molho em água com detergente neutro específico para

vidraria na diluição recomendada pelo fabricante. Após uma hora, lavar com

esponja/escova e detergente neutro e enxaguar dez vezes em água corrente e

duas vezes em água deionizada. Remover o excesso de água por agitação e

colocar na estufa de alta temperatura para secagem. Após a secagem verificar a

qualidade da limpeza e lacrar a abertura dos frascos adequadamente limpos

com papel alumínio antes da esterilização. Relavar os insatisfatórios.

Lâminas para microscopia

Após o uso Detergente neutro

Álcool 96°GL

Enxaguar em água corrente e colocar de molho em água com detergente neutro

específico para vidraria na diluição recomendada pelo fabricante. Após uma

hora, lavar com esponja macia e enxaguar dez vezes em água corrente e

mergulhar em álcool 96°GL. Remover do álcool, secar com papel macio e

embrulhar (20 em 20) em papel alumínio.

Tubos de coleta de sêmen

Após o uso

Detergente neutro

Água deionizada

Enxaguar em água corrente e colocar de molho em água com detergente neutro

específico para vidraria na diluição recomendada pelo fabricante. Após uma

hora, lavar com escova e enxaguar dez vezes em água corrente e duas vezes

em água deionizada. Remover o excesso de água por agitação e colocar na

estufa de secagem de material. Após verificação da qualidade da limpeza,

embalar os tubos (6-8) em papel pardo selado com fita marcadora e autoclavar.

Vaginas artificiais (VAs) Após o uso

Detergente neutro

Kilol e Água

destilada

Enxaguar em água corrente e lavar mucosas e cones com escova de cerdas

macias usando detergente neutro específico para vidraria na diluição

recomendada pelo fabricante. Enxaguar as mucosas e os cones cinco vezes em

água corrente e colocar de molho em solução de Kilol (1:250) por 15 minutos.

Enxaguar com água destilada e colocar para secar na secadora durante 30


Quadro 3: Limpeza sanitização de instalações

INSTALAÇÃO FREQUÊNCIA PRODUTO PROCEDIMENTO DE HIGIENIZAÇÃO

Laboratório Diária Álcool 70%

Ao final da rotina as bancadas devem ser borrifadas com álcool 70% e limpas

com papel toalha e as lixeiras esvaziadas

Laboratório

Três vezes por

semana

Hipoclorito de sódio

detergente neutro

álcool 70%

Após o final da rotina, limpar o chão com pano umedecido em água com

hipoclorito de sódio na diluição recomendada pelo fabricante. Limpar as

bancadas com esponja úmida e detergente neutro e em seguida, borrifar álcool

70% secando com papel toalha.

Laboratório

Mensal Propanol

Ao final da rotina antes do final de semana, conectar o equipamento de

nebulização ao sistema de ar condicionado e abastecer com o bactericida e

fungicida HSW Premiun (saBesto, Wurth). Manter o sistema ligado por 15

minutos. Sala de preparação das VAs

Diária Hipoclorito de sódio

álcool 70%

Após a colocação das VAs na estufa de aquecimento, varrer e lavar o chão com

água e hipoclorito de sódio na diluição recomendada pelo fabricante, e usar

rodo para secagem. Limpar as bancadas com álcool 70% e papel toalha.

Sala de preparação das VAs


álcool 70%

Esvaziar e higienizar os armários (interna e externamente) com esponja e

detergente neutro, retirando o resíduo com a esponja úmida. Após, borrifar

álcool 70% secando com papel toalha

Laboratório de apoio sanitário

Semanal


detergente neutro

álcool 70%

Limpar o chão com pano umedecido em água com hipoclorito de sódio na

diluição recomendada pelo fabricante. Limpar as bancadas com esponja úmida e

detergente neutro e em seguida, borrifar álcool 70% secando com papel toalha.

Laboratório de apoio sanitário


álcool 70%



álcool 70% secando com papel toalha.

Farmácia Semanal Hipoclorito de sódio Higienizar o chão com água e hipoclorito de sódio na diluição recomendada pelo

minutos antes de remontar as VAs e armazená-las em sua estufa de

aquecimento.

Capas de proteção das VAs Após o uso Detergente neutro Lavar em pia com escova e detergente neutro. Enxaguar e deixar secar ao ar.


álcool 70% fabricante e secar com o auxílio de um rodo. Borrifar álcool 70% na estante e

secar com papel toalha.

Almoxarifado Mensal Hipoclorito de sódio

Esvaziar a sala lavando com água e hipoclorito de sódio na diluição

recomendada pelo fabricante. Secar com o auxílio de um rodo.

Balança e tronco hidráulico Após o uso

Remover fezes da balança a seco, no restante utilizar água sob pressão para

remoção dos dejetos (fezes e urina).

Pedilúvio Conforme a

frequência de

uso

Sulfato de cobre

Drenar e remover sólidos com pá antes de limpar com vassoura e água sob

pressão. Após, reabastecer (20 cm de lâmina d’água e 5 kg de sulfato de

cobre).

Tronco hidráulico Conforme a

frequência de

uso


Remover dejetos e lavar com água sob pressão e em seguida enxaguar com

solução de hipoclorito de sódio na diluição recomendada pelo fabricante.

Área coberta de coleta Diária Remover fezes.

Tronco de preparação para

coleta Diária

Quaternário de

amônio

Remover as fezes com auxílio de pá e água sob pressão e em seguida aplicar

solução de quaternário de amônio na diluição recomendada pelo fabricante.

Área de apoio do tronco de

preparação para coleta Quinzenal Detergente neutro

álcool 70%



álcool 70% e secar com papel toalha.

Enfermaria Conforme a

frequência de

uso

Quaternário de

amônio

Durante a permanência do animal, manter a cama de maravalha sem acúmulo

de fezes. Após a saída do animal, remover a cama de maravalha e higienizar o

chão e as paredes com água sob pressão e aplicar solução de quaternário de

amônio na diluição recomendada pelo fabricante.

Abrigos dos touros Diária

Remover restos de alimento do cocho antes de reabastecer. Verificar o

bebedouro, drenando e limpando no caso de haver alimento na água.

Abrigos dos touros

Semanal Quaternário de

amônio

Remover dejetos e terra com pá e vassoura. Drenar o bebedouro e limpar com

escova. Higienizar o chão e as paredes com solução de quaternário de amônio

na diluição recomendada pelo fabricante. Rodolúvio

Semanal Cresóis Remover resíduos com pá e vassoura e acionar o sensor para desinfecção do

rodolúvio

Quarentenário

Diária Quaternário de

amônio

Diariamente (manhã e tarde), remover restos de alimento dos cochos e fezes

da cama de maravalha. A tarde lavar o corredor central com água sob pressão e

usar solução de quaternário de amônio (na diluição recomendada pelo

fabricante) se houver trânsito de animais.

Quarentenário Conforme a Quaternário de Na área de apoio para exames e curativos, as bancadas devem ser limpas com


frequência de

uso

amônio

Álcool 70%

álcool 70% e papel toalha. O tronco de contenção e o chão devem ser limpos

com pá e água sob pressão antes da aplicação de solução de quaternário de

amônio na diluição recomendada pelo fabricante

Quarentenário

Mensal Quaternário de

amônio

A sala das cordas deverá ser varrida e higienizada com solução de quaternário

de amônio na diluição recomendada pelo fabricante. As cordas e cabrestos

deverão ser lavados em solução de quaternário de amônio na diluição

recomendada pelo fabricante assim que o touro deixar o quarentenário ,e em

seguida, deixados secar ao sol.

Quarentenário Conforme a

frequência de

liberação

Quaternário de

amônio

Ao ser liberada, cada baia deve ser completamente limpa (paredes, chão,

canos, porteiras e cochos) com pá, vassoura, escova e água sob pressão e em

seguida desinfetada com solução de quaternário de amônio na diluição

recomendada pelo fabricante.


Fluxo no Quarentenário

O colaborador responsável (portador da chave de acesso) entra pelo

portão (sempre trancado) e acessa o vestiário onde troca de roupa

(macacão, bota e luva) antes de ter contato com os animais alojados ou

receber novos animais.

Durante o recebimento de animais, o colaborador responsável dá

acesso ao veículo de carga (após desinfecção no rodolúvio) até a rampa de

descarregamento e brete de contenção (identificação, exame clínico, coleta

de amostras, tratamentos). Durante este processo o colaborador

responsável se assegura de que pessoas estranhas ao setor estarão usando

botas descartáveis e não acessarão a instalação principal.

Durante o manejo diário (alimentação e limpeza) o colaborador

responsável deve trocar de luvas ou higienizar as mãos entre os

procedimentos com animais diferentes.

Ao deixar a instalação principal o colaborador deve tomar banho e

trocar de roupa e se assegurar do fechamento das vias de acesso da

instalação. Ao sair pelo portão o colaborador deve desinfetar seu calçado

com spray de cresol usando bomba manual.

O colaborador responsável deve se assegurar que materiais e

equipamentos utilizados no quarentenário não sejam levados as instalações

do rebanho residente sem a adequada desinfecção.

5. Monitorização

5.1 Disponibilização e manutenção de instalações, produtos e

utensílios para higienização

Através de observação visual e do Check list (anexo 7).

Frequência: a cada dois meses.


instalações

Através da verificação das planilhas de realização das atividades e do Check

list (anexo 7).


Frequência: a cada dois meses.

6. Ação Corretiva

6.1 Disponibilização e manutenção de instalações, produtos e

utensílios para higienização

Reposição de produtos (detergentes e sanitizantes).

Solicitação de manutenção.


instalações

Treinar novamente os colaboradores nos procedimentos de higienização.

7. Verificação

O quê? Como? Quando? Quem?

Registros das

planilhas de

realização das

atividades

Observação

visual

Mensal Responsável por

cada setor

Auditoria interna

através do check

list

Observação

visual

A cada dois

meses

Funcionário da

gerência

Registro de

treinamentos

Observação

visual

A cada dois

meses

Funcionário da

gerência

Registros em

geral

Observação

visual

Semestral Empresa

responsável pelo

plano APPCC


Procedimento Padrão de Higiene Operacional - PPHO

LIMPEZA DAS VAGINAS ARTIFICIAIS

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Lavagem e desinfecção das vaginas

artificiais (VAs) utilizadas na coleta de sêmen

RESPONSÁVEL: Funcionário da área externa

ATIVIDADES

Preparação: vestir avental plástico (usando roupas limpas) e calçar luvas de borracha;

Enxaguar as VAs em água corrente e a seguir esfregar externa e internamente as peças (tubo rígido, mucosa e cone) usando escova de cerdas flexíveis e detergente neutro;

Enxaguar as peças 5-7 vezes com água corrente para remoção do detergente;

Mergulhar as peças em solução de Kilol® (1:250 preparada diariamente) por 15 minutos;

Enxaguar as peças 3-5 vezes em água destilada;

Após breve escorrimento, levar as peças à secadora por 30 minutos;

Após a secagem, remontar as VAs e embalar em saco plástico antes de acondicioná-las na estufa de aquecimento.

AÇÃO CORRETIVA

Enxaguar as peças das VAs maior número de vezes caso ainda seja observado espuma do detergente;

ACÃO PREVENTIVA

Usar água destilada na preparação da solução de Kilol® (40ml/10litros);

Trocar a solução de água com detergente na qual as VAs são deixadas de molho até serem lavadas.

Trocar mucosas danificadas;

Elaborado por: Verificado por: Aprovado por:

MONITORAMENTO

Planilha de limpeza, montagem e verificação mensal de integridade das vaginas artificiais.

Data Nome Atividade Troca de mucosa

Observação Limpeza x Montagem Látex Neoprene


PPHO 3

Prevenção de Contaminação Cruzada

Cód: PPHO 3

Revisão: 10/08/2012

Página: 52

1. Objetivo

Estabelecer os procedimentos a serem adotados para prevenir a

contaminação cruzada (biológica, física ou química) do produto final (sêmen

congelado).


Este documento aplica-se a toda área de produção.

3. Definições

- Contaminação: presença de substâncias ou agentes estranhos (origem

biológica, física ou química) que sejam prejudiciais à qualidade do produto

final;

- Contaminação cruzada: contaminação do produto final com substâncias ou

agentes estranhos (origem biológica, física ou química). Pode ser

considerada contaminação cruzada a mistura inadvertida de sêmen de

touros diferentes por falha durante o processamento.


- O gerente da produção é responsável por implantar, acompanhar e

assegurar o cumprimento deste procedimento.

- Todos os colaboradores são responsáveis por aplicar os requisitos para

prevenção de contaminação cruzada constante neste procedimento.


- Os colaboradores responsáveis pela monitorização são encarregados de

auxiliar o responsável técnico na implantação e cumprimento deste

procedimento.

5. Descrição

5.1 Prevenção através de procedimentos de higiene

- Os colaboradores responsáveis pela preparação do diluente utilizado no

congelamento de sêmen realizam esta atividade após higienização das

mãos com água e detergente neutro desinfetando-as em seguida com álcool

70%.

- O colaborador responsável pela lavagem e higienização das vaginas

artificiais usa roupas limpas, avental plástico e luvas e segue as

recomendações de higienização dos materiais.

- Os colaboradores responsáveis pela preparação dos touros para coleta

lavam adequadamente (externa e internamente) o prepúcio dos touros;

- Os colaboradores responsáveis pela atividade de coleta de sêmen evitam

que o pênis dos touros toque no manequim e realizam a troca de luva e

higienizam as mãos a cada etapa do processo (desvio do prepúcio do touro

e preparação da vagina artificial).

5.2 Prevenção da contaminação por superfície de equipamentos e

utensílios

- Todos os equipamentos, utensílios e instalações físicas são higienizados

conforme o PPHO 2.

6. Monitorização



Através da observação visual durante as auditorias internas realizadas pela

gerência da empresa guiadas pelo Check list e, através de auditoria

realizada por empresa responsável pelo plano APPCC.

Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por

empresa responsável.


utensílios

Através da verificação das planilhas de realização das atividades e do Check

list e, através de auditoria realizada por empresa responsável pelo plano

APPCC.



7. Ações Corretivas


- Promover treinamento básico para os novos colaboradores e manter

programa de capacitação e educação continuada.

- Rejeitar ejaculados contaminados com terra, maravalha ou fezes.


utensílios

- Proceder nova higienização dos equipamentos ou utensílios conforme

procedimentos específicos (PPHO 2).

- Promover treinamento básico para os novos colaboradores e manter

programa de reciclagem periódica.


8. Verificação

O quê? Como? Quando? Quem?

Registros nas

planilhas de

realização das

atividades

Observação

visual

Mensal Responsável por

cada setor

Registro da

auditoria interna

através do check

list

Observação

visual

A cada dois

meses

Funcionário da

gerência

Registros em

geral

Observação

visual

Semestral Empresa

responsável pelo

plano APPCC


PPHO 4

Higiene Pessoal dos Colaboradores

Cód: PPHO 4

Revisão: 10/08/2012

Página: 55

1. Objetivos

Manter as instalações para lavagens de mãos e os serviços sanitários em

boas condições de manutenção e providos com solução detergente e

sanitizante.

Estabelecer procedimentos e requisitos de higiene pessoal a serem

adotados por todos os colaboradores que direta ou indiretamente podem

influenciar na qualidade do produto final (sêmen bovino congelado).


Este documento aplica-se a toda área de produção.

3. Definições

- Contaminação: presença de substâncias ou agentes estranhos (origem

biológica, física ou química) que sejam prejudiciais à qualidade do produto

final (sêmen congelado);

- Higienização: procedimentos de limpeza e sanitização;

- Antisséptico ou sanitizante ou desinfetante: produto de natureza química,

que em condições de adequada diluição, é utilizado para reduzir a carga

microbiana até níveis aceitáveis;


sabões/detergentes para eliminação de matérias indesejáveis (pó, terra,

maravalha, outros);

- Desinfecção ou sanitização: ação de reduzir a concentração de

microrganismos contaminantes até níveis considerados aceitáveis;


- Não-conformidade: não atendimento de qualquer um dos requisitos

especificados.


- O gerente da produção é responsável por implantar, acompanhar e

assegurar o cumprimento deste procedimento junto aos responsáveis de

cada setor.

- Todos os colaboradores são responsáveis por aplicar os requisitos de

higiene descritos neste procedimento.

5. Descrição

5.1 Colocação e manutenção de cartazes educativos

Os cartazes educativos “Como Lavar suas Mãos” (anexo 8) estão fixados e

mantidos em todos os locais onde se realizam atividades durante a coleta e

o processamento do sêmen, como também em todos os sanitários.

5.2 Disponibilidade e manutenção de instalações, produtos e

utensílios

Todas as saboneteiras dos sanitários e instalações são mantidas com

solução detergente.

Os porta-toalhas de papel são mantidos abastecidos através de reposição

periódica.

Todas as instalações sanitárias (vasos, pias, chuveiros) estão funcionando.

Os coletores de resíduos da área interna possuem tampa, acionamento por

pedal e os sacos descartáveis são trocados diariamente.

5.3 Conduta e comportamento dos colaboradores

Os colaboradores da área interna usam uniformes limpos (jaleco e sapato) e

são instruídos a higienizá-los semanalmente.


Os colaboradores da área externa usam uniformes limpos (calça, camisa e

bota) e são instruídos a higienizá-los diariamente ou a cada dois dias.

6. Monitorização


Através da realização de auditoria interna realizada pela gerência da

empresa para avaliar as condições de higiene e conduta pessoal e, através

de auditoria realizada por empresa responsável pelo plano APPCC.




utensílios












7. Ações corretivas


- Colocação de cartazes instrutivos para adequada higienização das mãos

em locais onde ainda não existam e reposição dos cartazes danificados ou

ilegíveis;


- Correção de problemas relacionados às não conformidades detectadas na

avaliação das condições de higiene e conduta pessoal.


utensílios

- Reposição de produtos (detergente, sanitizante, papel toalha);

- Solicitação de manutenção (saboneteiras, torneiras, válvulas e válvulas de

descarga);




- Ajustar o programa de capacitação e educação continuada.




PPHO 5

Proteção contra contaminação

química do produto final

Código: PPHO 5

Revisão: 10/08/2012

Página: 59

1. Objetivo

Estabelecer os procedimentos a serem adotados para prevenir que o

produto final (sêmen congelado) seja contaminado com agentes químicos.

NOTA: Os perigos biológicos serão controlados pelos demais PPHO.


Este procedimento aplica-se a toda área de produção.

3. Definições

- Contaminação: presença de substâncias ou agentes químicos prejudiciais

à qualidade do produto final (sêmen congelado);

- Perigo: contaminação inaceitável de natureza química que pode afetar a

qualidade do produto, a saúde/integridade da fêmea inseminada ou dos

ovócitos inseminados em processo de fecundação in vitro.




cada setor.

Todos os colaboradores são responsáveis por aplicar os requisitos descritos

neste procedimento.

5. Descrição


5.1 Proteção contra contaminação por constituintes químicos

presentes no diluente de congelamento

- O colaborador responsável pela preparação do diluente deve se certificar

de estar usando os reagentes adequados (identificação e volume);

- O colaborador responsável pela pesagem dos constituintes do diluente

deve verificar a calibração da balança e fazer a aferição semanal com pesos

padrão.

- O colaborador responsável pela diluição do sêmen deve usar

equipamentos calibrados (pipetas ou provetas);

5.2 Identificação, estocagem e manuseio dos agentes químicos

Conforme PPHO 6.

5.3 Proteção contra contaminação por produtos de limpeza e

sanitização

Conforme PPHO 2.

6. Monitorização



Através do acompanhamento da rotina de formulação do diluente durante

as auditorias internas e, através de auditoria realizada por empresa




6.2 Identificação, estocagem e manuseio dos agentes químicos

Conforme PPHO 6.



sanitização

Conforme PPHO 2.




- Utilizar apenas reagentes grau para análise (PA) na confecção do diluente;

- Utilizar água destilada esterilizada por autoclavagem na preparação do

diluente;

- Utilizar vidraria esterilizada e sem traços de agentes químicos na

preparação do diluente, tendo o cuidado de enxaguar os frascos com água

destilada e esterilizada antes de iniciar a preparação;

- Descartar o diluente em caso de não conformidade na osmolaridade

obtida;

- Encaminhar a balança de precisão para calibração em caso de detecção de

alteração na leitura.

7.2 Identificação, estocagem e manuseio dos agentes tóxicos

Conforme PPHO 6.


sanitização

Conforme PPHO 2.


PPHO 6

Agentes químicos

Código: PPHO 6

Revisão: 10/08/2012

Página: 62

1. Objetivo

Estabelecer os procedimentos a serem adotados no armazenamento e

utilização dos agentes químicos.


Este procedimento aplica-se às áreas de almoxarifado do laboratório e

estoque de produtos de higiene e sanitização.

3. Definições

- Armazenamento: conjunto de tarefas e requisitos para a correta

conservação de insumos e produtos elaborados;

- Higienização: procedimentos de limpeza e sanitização;


sabões/detergentes para eliminação de matérias indesejáveis (pó, terra,

maravalha, outros);

- Desinfecção ou sanitização: ação de reduzir a concentração de

microrganismos até níveis considerados seguros;

- Não conformidade: não atendimento de qualquer um dos requisitos

especificados.




cada setor.


5. Descrição

5.1 Recepção, estocagem e manuseio de produtos de limpeza e

sanitização

O colaborador da administração responsável pela área interna recebe todos

os produtos de higienização e realiza uma conferência do pedido com a nota

fiscal, o rótulo do produto e o prazo de validade.

Os produtos são armazenados:

- área interna – no vestiário feminino;

- área externa – na sala de preparação de material de coleta e no

almoxarifado do quarentenário.

6. Monitorização


sanitização

Através da observação visual durante as auditorias internas realizadas pela

gerência da empresa guiadas pelo Check list e, através de auditoria






sanitização

- Não receber produtos não constantes no pedido e/ou com prazo de

validade ultrapassado;

- Encaminhar para o local adequado os produtos específicos de cada setor,

realocando produtos armazenados em local irregular;

- Proceder a adequada diluição dos produtos de acordo com a

recomendação do fabricante usando máscaras e/ou luvas de acordo com a

necessidade.


PPHO 7

Saúde dos Colaboradores

Código: PPHO 7

Revisão: 10/08/2012

Página: 64

1. Objetivos

Estabelecer os procedimentos a serem adotados na manutenção da saúde

dos colaboradores, identificando e prevenindo problemas de saúde

referentes a atividade profissional. Estabelecer os procedimentos a serem

adotados para preservação da qualidade do produto final.


Este procedimento aplica-se a toda área de produção.

3. Definições

- Comissão Interna de Prevenção de Acidentes (CIPA): comissão formada

por funcionários da empresa responsável por reduzir o número de acidentes

de trabalho mediante conscientização dos colaboradores.

- Equipamento de Proteção Individual (EPI): todo dispositivo de uso

individual de fabricação nacional ou estrangeira destinado a proteger a

saúde e a integridade física dos colaboradores.


O encarregado do Departamento Pessoal é responsável por encaminhar os

colaboradores para a realização dos exames admissionais, periódicos e

demissionais, bem como, pelo controle e arquivamento de todos

documentos relativos ao histórico médico do colaborador na empresa.

O médico veterinário da área de produção é responsável por distribuir e

controlar a utilização dos EPIs na empresa.


5. Descrição

5.1 Controle da condição de saúde dos colaboradores

- A empresa contratada realiza exames médicos admissionais, periódicos

(anual) e demissionais segundo plano de saúde específico para cada setor

de atuação do colaborador.

Colaboradores da área externa: avaliação clínica, audiometria, colinesterase

plasmática e colinesterase eritrocitária. Para os operadores de máquinas é

realizado também o exame de acuidade visual.

Colaboradores da área interna: avaliação clínica, audiometria, colinesterase

plasmática e colinesterase eritrocitária.

- A empresa contratada emite relatórios com resultados parciais da situação

de saúde dos colaboradores à gerência da empresa, fazendo

recomendações caso necessário.

- A empresa contratada apresenta e discute os resultados do relatório anual

da situação de saúde dos colaboradores para a CIPA e a gerência da

contratante.

- Os colaboradores acometidos de alteração de saúde são afastados em

caso de prescrição médica.

6. Monitorização


- Verificação dos arquivos de relatórios da condição de saúde dos

colaboradores por ocasião da auditoria interna e, através de auditoria





- Durante a rotina de trabalho o responsável por cada setor é encarregado

de fiscalizar a utilização de EPIs.



- Por ocasião da auditoria interna, toda irregularidade nos relatórios da

condição de saúde dos colaboradores deve ser comunicado ao

departamento pessoal e gerência.

- Intervenção do gerente de produção caso o responsável do setor não

consiga convencer algum colaborador a usar adequadamente os EPIs.

- A qualquer momento, em caso de identificação de alteração de saúde de

algum colaborador fazer encaminhamento para avaliação médica.


PPHO 8

Controle integrado

de pragas

Código: PPHO 8

Revisão: 10/08/2012

Página: 67

1. Objetivos

Estabelecer uma sistemática para:

- assegurar um controle integrado e eficiente de pragas, prevenindo a

contaminação dos ingredientes, matéria-prima e produto final.

- evitar a proliferação de pragas nas demais instalações da empresa.


Este procedimento aplica-se a todas as áreas internas e externas da

empresa.

3. Definições

Para a utilização deste procedimento são necessárias as seguintes

definições:

- Praga: todo agente animal ou vegetal que possa ocasionar danos

materiais ou contaminações que comprometam direta ou indiretamente a

qualidade do produto final.

- Iscas: objetos em que são colocados produtos específicos para atraírem

insetos e outros animais.

- Controle integrado: seleção de métodos de controle e desenvolvimento de

critérios que garantam resultados favoráveis sob o ponto de vista higiênico,

ecológico e econômico.



- O encarregado do setor é responsável por implantar, acompanhar e

assegurar o cumprimento deste procedimento.

- O gerente da empresa é responsável por autorizar formalmente a

execução dos serviços de desinsetização e desratização na empresa.

- O gerente da empresa é responsável por designar uma pessoa para

acompanhar os serviços de desinsetização e desratização.

- Todos os colaboradores são responsáveis por informar o responsável pelo

setor sobre qualquer indício de existência de pragas.

5. Descrição

5.1 Controle de instalações para evitar a entrada de insetos e

roedores

O colaborador responsável pela atividade de manutenção avalia as

condições das portas, janelas, telas e ralos.

5.2 Controle dos resíduos

- A empresa possui um programa de limpeza e sanitização de

equipamentos, utensílios e instalações (PPHO 2).

- Os resíduos produzidos são coletados e armazenados em lixeiras até sua

remoção. Na área interna da produção, a limpeza das lixeiras é diária e o

material é armazenado em local apropriado até o dia da coleta semanal dos

resíduos de acordo com o descrito no PPHO 2.

- Caixas de descarte de materiais perfurocortantes estão dispostas na área

interna (laboratório) e na área externa (nos locais onde são utilizados).

- O material biológico proveniente da área externa é armazenado em

recipientes plásticos específicos. Estes recipientes e as caixas de descarte


de material perfurocortante são recolhidos mensalmente por empresa

terceirizada.

- O lixo comum coletado nas lixeiras da área de produção, residências dos

funcionários, refeitório, logística e administração é recolhido três vezes por

semana por um funcionário da ABS usando trator e reboque para seu

transporte ao depósito de lixo.

- O depósito de lixo é esvaziado duas vezes por semana pelo serviço de

coleta de lixo da prefeitura do município.

5.3 Controle do ambiente

- Os colaboradores responsáveis pela manutenção avaliam as condições

externas da empresa quanto à presença de animais domésticos, acúmulo de

folhas, vegetação muito crescida, tomando as medidas cabíveis ou

comunicando os responsáveis para adequação.

5.4 Controles relacionados à empresa terceirizada

- Por ocasião da implantação do APPCC e após cada monitoração a empresa

terceirizada elaborará um relatório indicando os pontos de maior

vulnerabilidade da unidade que estejam favorecendo o acesso, abrigo e o

fornecimento de alimento às pragas.

- A empresa terceirizada realiza serviços de desinsetização e desratização

conforme frequência definida no contrato.

- A empresa contratada apresenta os seguintes documentos para consulta e

conhecimento:

Relação das áreas onde são realizados os serviços;

Produtos químicos utilizados, forma de aplicação e os antídotos

recomendados;


Nível de toxidade adequado a área de aplicação (baixa toxidade

nas áreas internas, estocagem, escritórios, vestiários e refeitório);

- Após a aplicação dos produtos químicos, a empresa terceirizada fornece os

seguintes dados sobre os serviços:

Certificado identificando os serviços prestados e as áreas onde estes

foram executados;

Produtos utilizados, composição química e forma de aplicação

(concentração e método);

Mapa de localização dos pontos onde foram colocadas as iscas

numeradas.

6. Monitoração


roedores

Através da observação visual realizada durante as auditorias internas com

auxílio do check list e, através de auditoria realizada por empresa

















6.4 Controles relacionados à empresa terceirizada

A empresa terceirizada é monitorada quanto a eficiência no controle das

pragas através do resultado das auditorias internas.



roedores

Contatar o colaborador responsável por essa atividade quando evidenciado

problema na manutenção das barreiras físicas.


Contatar os colaboradores responsáveis pela atividade de coleta dos

resíduos quando evidenciado acúmulo por atraso em sua remoção. Havendo

atraso na remoção dos resíduos do depósito de lixo, contatar a secretaria

do muncípio.


Contatar os responsáveis de cada setor quando evidenciado problema na

manutenção da área externa.


7.4 Controle relacionado à empresa terceirizada

Contatar os responsáveis para que seja realizado o ajuste, caso não seja

possível, buscar nova empresa com capacidade de prestar o serviço

requerido.


ANEXO 5 – Laudo de sanitização e higienização das caixas d’água


ANEXO 6 – Laudo da análise físico-química e bacteriológica da água


ANEXO 7 – Check list

ROTEIRO DE AUDITORIA INTERNA DE ESTABELECIMENTO

PRODUTOR DE SÊMEN BOVINO

1. Identificação do Estabelecimento 1.1 Razão Social: ABS Pecplan 1.2 Endereço: BR 050 Km 196 1.3 Município-UF: Delta-MG 1.4 Responsável Técnico: Fernando Vilela Vieira 1.5 CRMV-UF: 3466 -MG

2. Informações sobre a auditoria 2.1 Auditor Líder: 2.2 Data: 2.3 Data da última auditoria: 2.4 Objetivo da auditoria:

UNIDADE INTERNA

LABORATÓRIO S / N

1. O laboratório é mantido limpo e organizado?

2. Os equipamentos estão sendo operados conforme descrição anexada aos mesmos?

3. As planilhas de monitorização estão sendo preenchidas?

4. O funcionário responsável pela verificação das planilhas de monitorização está o fazendo?

OBSERVAÇÕES

SALA DE LAVAGEM DOS UTENSÍLIOS E ESTERILIZAÇÃO DA VIDRARIA S / N

5. As condições de higiene e manutenção da sala são adequadas?

6. A vidraria está sendo lavada e esterilizada conforme descrito?

7. Os tubos de coleta estão sendo lavados e esterilizados na autoclave conforme

descrito no manual?

http://www.abspecplan.com.br/


8. A água deionizada utilizada para enxágue dos materiais após lavagem

está sendo descartada e reposta diariamente?

OBSERVAÇÕES

SALA DA AUTOCLAVE E DE DESTILAÇÃO/DEIONIZAÇÃO DA ÁGUA S / N


10. Os procedimentos para destilização/deionização e esterilização são aplicados?

OBSERVAÇÕES

SALA DE AVALIAÇÃO DE SÊMEN S / N


OBSERVAÇÕES

UNIDADE EXTERNA

PIQUETES DOS TOUROS S / N

12. Os abrigos e os piquetes dos touros são mantidos limpos?

13. Os abrigos dos touros são desinfetados semanalmente?


OBSERVAÇÕES


ENFERMARIA S / N

15. A enfermaria é mantida limpa e organizada?

16. O curral é desinfetado assim que o touro sai da enfermaria?

17. As planilhas de monitorização da limpeza e desinfecção estão sendo

preenchidas?

OBSERVAÇÕES

ÁREA DO TRONCO DE CONTENÇÃO E ÁREA COBERTA DE COLETA S / N

18. O tronco de contenção é mantido limpo e organizado?

19. A área do tronco e adjacências é desinfetada diariamente?

20. s armários na área do tronco estão sendo limpos a cada quinze dias?

21. O arquivo de monitoramento da limpeza dos armários existentes na área do

tronco de contenção esta sendo mantido atualizado?

22. A área coberta de coleta é limpa diariamente e a maravalha reposta?

23. A área coberta de coleta está sendo completamente limpa, desinfetada e

recebendo nova cama de maravalha a cada dois meses?

24. As planilhas de monitorização da limpeza e desinfecção estão sendo

preenchidas?

OBSERVAÇÕES

ÁREAS DO TRONCO HIDRÁULICO / PEDILÚVIO / BALANÇA S / N


25. A área do tronco hidráulico é mantida limpa e organizada?

26. A lavagem e higienização da área do tronco hidráulico está sendo realizada

mensalmente?

27. As áreas do pedilúvio e balança para pesagem dos touros são mantidas limpas?

28. A solução do pedilúvio está sendo trocada semanalmente?

29. A farmácia está sendo limpa e organizada semanalmente?

30. A geladeira da farmácia está sendo limpa mensalmente?

31. O almoxarifado está sendo limpo e organizado mensalmente?

32. As planilhas de monitorização de limpeza e higienização e troca de solução do

pedilúvio estão sendo preenchidas?

OBSERVAÇÕES

LABORATÓRIO DE APOIO SANITÁRIO / SALA DE REUNIÃO = VETERINÁRIO S / N

33. O laboratório de apoio sanitário está sendo limpo e higienizado semanalmente?

34. A geladeira do laboratório de apoio sanitário está sendo limpa mensalmente?

35. A sala de reunião/Veterinário é mantida limpa?

36. As planilhas de monitorização de limpeza e higienização estão sendo

preenchidas?

OBSERVAÇÕES


HIGIENIZAÇÃO DOS MANEQUINS / LAVAGEM DE PREPÚCIO S / N

37. A higienização dos manequins está sendo realizada com a pulverização de

aproximadamente 500 Ml da solução desinfetante?

38. Está sendo realizada a higienização dos manequins entre cada coleta de sêmen?

39. A lavagem do prepúcio dos touros está sendo realizada imediatamente antes da

coleta de sêmen?

40. A lavagem do prepúcio dos touros está sendo realizada com água e detergente

neutro externamente e solução salina internamente?

41. O prepúcio dos touros esta sendo secado com papel toalha após a lavagem?

42. O recipiente da solução salina está sendo retirado da área do tronco e guardado

diariamente na sala de preparação de material de coleta?

43. A solução salina concentrada está sendo armazenada na geladeira e sendo

diluída somente no momento de sua utilização?

OBSERVAÇÕES

SALA DE PREPARAÇÃO DE MATERIAL PARA COLETA S / N

44. O funcionário responsável pela higienização e montagem das vaginas artificiais

está realizando a troca de uniforme previamente ao ínício da atividade?

45. As vaginas artificiais e os cones estão sendo mantidos durante 15 minutos em

solução desinfetante?

46. As vaginas artificiais e os cones estão sendo enxaguados em água destilada

após permanecerem na solução desinfetante?

47. As capas das vaginas artificiais estão sendo lavadas diariamente ao final da

rotina de coleta de sêmen?


48. A sala é limpa diariamente após o término da rotina de coleta de sêmen

e lavagem das vaginas artificiais?

49. A sala bem como as bancadas, armários e as estufas estão sendo organizados e

higienizadas semanalmente com registro dessa atividade?

50. O funcionário responsável pela verificação das planilhas de monitorização

da área externa está o fazendo?

OBSERVAÇÕES

RODOLÚVIO E QUARENTENÁRIO S / N

51. O rodolúvio é mantido limpo, com os sensores funcionando e com desinfetante

freqüentemente reposto?

52. A entrada no quarentenário está sendo feita apenas pelo vestiário, com troca de

uniforme antes de iniciar a rotina?

53. O corredor central do quarentenário é desinfetado diariamente?

54. As cordas e cabrestos são lavados e desinfetados a cada troca de touro?

55. Os utensílios e equipamentos do quarentenário são de uso exclusivo dessa

unidade?

56. O quarentenário é mantido limpo e organizado?

57. O funcionário está tomando banho na saída do quarentenário?


OBSERVAÇÕES

Auditor Líder

Fernando Vilela Vieira

Responsável Técnico


ANEXO 8 – Cartaz indicando como lavar suas mãos


PROCEDIMENTO

OPERACIONAL

PADRONIZADO (POP)


POP – Procedimento Operacional Padrão

AUTOCLAVE

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Esterilização de materiais (calor úmido)

RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório

ATIVIDADES

Abrir a tampa e verificar a qualidade (troca semanal) e o nível

de água destilada (deve cobrir a resistência ficando abaixo do nível do suporte de descanso do cesto);

Introduzir o material no cesto (mais leves acima);

Fechar a tampa apertando os manipuladores por igual;

Ligar a chave comutadora no calor máximo (MAX) mantendo o

registro de liberação de vapor fechado;

Atingida a pressão de trabalho (1 atm e 121°C), girar a chave comutadora para calor médio (MED);

Iniciar a contagem de tempo para esterilização (20 minutos);

Terminado o tempo, desligar a chave comutadora;

Abrir o registro de liberação do vapor, soltando os manipuladores somente após o manômetro marcar ZERO;

Abrir a tampa tomando cuidado para evitar queimaduras pelo

vapor;

Retirar o material após estar frio, transferindo-o para estufa

de secagem.

AÇÃO CORRETIVA

Interromper o processo caso alguma das etapas não seja

cumprida;

Caso os valores desejados sejam ultrapassados (pressão = ou > 1 atm e temperatura = ou > 121°C), mudar chave

comutadora para calor mínimo (MÍN) e regular a válvula de segurança.

ACÃO PREVENTIVA

Revisão da borracha de vedação, regulagem da válvula de segurança e da rotina de utilização;


MONITORAMENTO

Planilha para controle da limpeza e troca da água da autoclave:

Data Responsável Observação



BALANÇA ANALÍTICA DE PRECISÃO

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Pesar componentes do diluente e da

solução salina.


ATIVIDADES

Aferir o nivelamento da balança;

Conectar a balança a rede elétrica e pressionar a tecla

Liga/Desliga;

Antes da pesagem, aguardar a estabilização do sistema (30 minutos);

Colocar o recipiente para pesagem sobre o prato da balança e em seguida pressionar a tecla TARA;

Pesar o constituinte necessário repetindo a operação (tara) a cada troca de recipiente;

Após a utilização, desligar a balança pressionando a tecla

Liga/Desliga e desconectar a balança da rede elétrica;

Remover resquícios de material que tenha caído no interior da

região de pesagem usando um pincel (movimentos suaves);

AÇÃO CORRETIVA


cumprida;

Em caso de aderência do material, remover o prato da balança e efetuar sua limpeza com gaze e álcool 70%.

ACÃO PREVENTIVA

Revisão do equipamento através da rotina de utilização e calibração semanal utilizando-se o peso padrão. Apresentando

desvio em relação ao padrão, acionar a assistência técnica;


MONITORAMENTO

Através das planilhas de limpeza e calibração semanal.

Planilha de limpeza e calibração da Balança Analítica de Precisão:

Data Responsável Atividade

Observação Limpeza Calibração



BALANÇA ELETRÔNICA

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Pesagem dos touros

RESPONSÁVEL: Funcionário da área externa

ATIVIDADES

Posicionar as barras de pesagem niveladas ao solo e alinhadas a plataforma de pesagem;

Colocar a plataforma sobre as barras nos devidos pontos de

apoio;

Ligar os cabos na conexão “BARRA” tomando cuidado para

que não haja falha no contato;

Conectar o equipamento a rede elétrica e pressionar a tecla “LIGA”;

Aguardar a rotina de calibração automática, leitura 0 kg no display e acendimento da luz vermelha. Caso a leitura seja

diferente de zero, pressionar a tecla “TARA” até que a leitura seja 0 Kg;

Para iniciar o uso, assim que o animal estiver sobre a

plataforma digitar sua identificação e pressionar a tecla “PESA” para que o resultado seja gravado no display;

Entre cada pesagem pressionar a tecla “LIMPA” ou a tecla “ZERO” para que a tara seja ajustada e o novo resultado seja

gravado;

Após o uso, desligar a balança pressionando a tecla “DESLIGA”, desconectar o equipamento da rede elétrica e em

seguida desconectar os cabos das barras;

Limpar a plataforma de pesagem.

AÇÃO CORRETIVA

Interromper o processo caso alguma das etapas não seja cumprida;

Enviar a balança para revisão no caso de erros de leitura ou qualquer alteração de funcionamento.

ACÃO PREVENTIVA

Revisão da tara do equipamento, da rotina de utilização e calibração.


MONITORAMENTO

Planilhas de utilização, limpeza e calibração da balança para pesagem dos touros.

Data Responsável Atividade (X)

Observação Pesagem Limpeza Calibração



BALANÇA PARA PESAGEM DO SÊMEN

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Pesagem dos ejaculados


ATIVIDADES

Verificar o nivelamento da balança e conectar a balança a rede elétrica;

Ligar o equipamento pressionando a tecla Liga/Deliga e aguardar a estabilização do sistema (30 min);

Calibrar o equipamento para pesar apenas o ejaculado

mediante a colocação de um tubo de coleta vazio (peso = 19g) na balança e em seguida pressionar a tecla TARA;

Retirar o tubo de calibração verificando a leitura de -19g no display = balança pronta para uso.

Ao final da utilização, desligar o equipamento pressionando a

tecla Liga/Desliga, desconectar o equipamento da rede elétrica e efetuar a limpeza com gaze embebida em álcool

70%.

AÇÃO CORRETIVA

Interromper o processo caso alguma amostra derrame na

balança e retornar o uso somente após limpeza e reinício de todo processo.

ACÃO PREVENTIVA

Revisão do equipamento através de checagem diária da TARA e calibração semanal utilizando-se o peso padrão. Apresentando desvio em relação ao padrão, acionar a

assistência técnica.


MONITORAMENTO

Através das planilhas de checagem diária da TARA e calibração semanal.

Planilha de utilização, limpeza e calibração da Balança para Pesagem do Sêmen :


Observação Pesagem Limpeza Calibração



BALCÃO REFRIGERADO

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Resfriamento do sêmen, envase e

identificação das palhetas.


ATIVIDADES

Ligar o equipamento a rede elétrica;

Fechar as janelas de vidro do equipamento;

Ligar os ventiladores, as lâmpadas e o compressor;

Aguardar a estabilização em 9°C no interior da caixa de isopor

e 4-5°C na área de envase (em aproximadamente 30min);

Introduzir as amostras a serem refrigeradas;

Após o uso, desligar o compressor, os ventiladores, as lâmpadas e desconectar o equipamento da rede elétrica;

Abrir as janelas do equipamento e efetuar sua limpeza com

papel toalha e álcool 70%.

AÇÃO CORRETIVA

Aferir e ajustar a temperatura do equipamento na faixa

desejada.

ACÃO PREVENTIVA

Checagem do equipamento dentro da rotina de utilização;

Checagem diária da temperatura;

Calibragem do sensor de temperatura e checagem do gás do

compressor anualmente.


MONITORAMENTO

Planilhas de checagem diária da temperatura; limpeza mensal e calibragem e checagem anual do gás.

Data Responsável

Aferição da temperatura

Limpeza Calibração / gás Observação Início da

curva

Final da

curva



BANHO-MARIA

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: descongelamento de amostras de

sêmen e aquecimento de soluções.


ATIVIDADES

Abastecer o equipamento com água até que a grade do fundo

fique ± 5 cm abaixo do nível;

Conectar o equipamento a rede elétrica;

Ligar o equipamento pressionando a chave LIGA/DESLIGA;

Aguardar o aquecimento até a temperatura de trabalho (37°C);

Após o uso, desligar o equipamento pressionando a tecla LIGA/DESLIGA, desconectar o equipamento da rede elétrica e drenar a água;

Secar o equipamento e passar papel toalha com álcool 70%.

AÇÃO CORRETIVA

Ajustar a temperatura caso a leitura no termômetro seja

diferente de 37°C.

ACÃO PREVENTIVA

Conferir a temperatura da água mediante o uso de

termômetro calibrado;

Revisão do equipamento e da rotina de utilização.


MONITORAMENTO

Através da planilha de limpeza e rotina de utilização.


Calibração Observação

Utilização Limpeza



COLETA DE SÊMEN

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Coletar sêmen bovino

RESPONSÁVEL: Funcionário coletor de sêmen

ATIVIDADES

Tomar conhecimento da relação de touros a ser coletados (lista de touros do dia);

Providenciar que as vacas manequins sejam encaminhadas e contidas nas proximidades da área de coleta;

Providenciar que os touros da lista sejam encaminhados e

contidos nas proximidades da área de coleta;

Posicionar e efetuar a limpeza (pulverização com solução a

1:4000 de amônia quaternária) da região posterior dos manequins antes da coleta de cada touro;

Imediatamente antes da coleta, efetuar a limpeza do prepúcio

do touro;

Usando luvas, lavar o prepúcio do touro externamente com

água corrente e detergente neutro para remover quaisquer sujidades;

Lavar o prepúcio do touro internamente mediante o uso de

solução fisiológica. Essa solução será introduzida no prepúcio através de uma pipeta plástica descartável conectada a um

frasco de 50 mL. Após a inserção da pipeta, o óstio prepucial será fechado para que a solução fique retida permitindo a limpeza do pênis e prepúcio durante breve massageamento

seguido da drenagem do líquido;

Solicitar ao auxiliar que encaminhe o touro até a manequim na

área de coleta (área externa – touros zebuínos e área coberta – touros europeus) e permitir que realize dois saltos sem

coleta;

Retirar as luvas, lavar as mãos com água e sabão, secar com papel toalha e passar álcool gel 70%;

Preparar a vagina artificial (VA) na sala de preparação: colocar água quente, conectar o tubo de coleta, o protetor do

tubo e a capa da vagina, passar o lubrificante e em seguida aferir a temperatura da VA (deve estar entre 42-44°C);

Calçar luvas e seguir para a sala de coleta onde será feito

desvio do pênis e o oferecimento da VA para que o touro ejacule;

Coletado o sêmen, o coletador deve se dirigir para o óculo do laboratório para entrega do tubo de coleta. Nesse momento o


coletador deverá se identificar e informar o nome do touro e o

número do ejaculado (1 ou 2);

Levar a VA para a sala de preparação onde deverá ser

enxaguada em água corrente e a seguir desmontada parcialmente (retirando o cone e soltando as tiras de um lado da mucosa). A VA será deixada de molho em água e

detergente neutro, seguindo recomendação do fabricante, até o momento de sua lavagem ao final da rotina de coleta (ver

POP lavagem da VA);

Ao final da rotina de coleta lavar a capa da VA e os protetores de tubo de coleta. Estes materiais serão lavados com escova e

detergente neutro, enxaguados em água corrente e deixados de molho em solução de Kilol a 0,9% por 15 minutos antes de

serem colocados para secar.

AÇÃO CORRETIVA

O responsável pela coleta deverá avisar ao funcionário que

não cumprir qualquer uma das etapas que deverá iniciar novamente a tarefa.

ACÃO PREVENTIVA

Revisar o processo de coleta caso algum passo esteja apresentando dificuldades de ser cumprido;

Higienizar o touro somente no momento da coleta diminuindo assim a carga contaminante no sêmen;

Usar sempre luvas ao trabalhar com o material biológico

evitando contaminação do pessoal e do sêmen;

Comunicar ao responsável pela área de coleta qualquer

anormalidade observada no touro ou na amostra de sêmen;

MONITORAMENTO

Através do acompanhamento da atividade de coleta pelo

responsável chamando a atenção de todos para o cumprimento das etapas estabelecidas no POP;

Preenchimento da planilha da coleta, identificando o touro,

coletador e horário.



CONTAINER DE NITROGÊNIO LÍQUIDO DA MÁQUINA DE

CONGELAMENTO DE SÊMEN

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Abastecer o container com nitrogênio

líquido (N2L) para utilização no congelamento.


ATIVIDADES

Antes de iniciar o abastecimento garantir que o manômetro esteja na posição 0;

Para abastecer, ligar o exaustor e conectar o tubo de N2L na válvula (entrada e saída) do container;

Controlar a abertura das válvulas de regulagem para não

ultrapassar 3 atm de pressão. No momento que sair N2L na válvula de escape o container estará cheio;

Fechar as válvulas de entrada e saída N2L e de escape de pressão;

Manter a pressão do container em 2,5 atm (ideal para o

congelamento).

AÇÃO CORRETIVA


Caso a pressão alcance 3 atm de pressão, fechar a válvula de

entrada e saída de N2L e abrir a válvula de escape até que atinja 2,5 atm.

ACÃO PREVENTIVA

Revisão e manutenção do equipamento em caso de vazamento;


MONITORAMENTO

Planilha de limpeza e utilização do equipamento.

Data Nome Atividade (X)

Manutenção Observação Utilização Limpeza


CONTROLE DE PULVERIZAÇÃO para controle de moscas

Data da pulverização Local Funcionário



DEIONIZADOR DE ÁGUA

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Eliminar sais inorgânicos da água usada

na limpeza de material e preparação de meios;


ATIVIDADES

Abrir o registro da água da rede de abastecimento de modo

que o fluxo de entrada e saída na torneira na célula

condutivimétrica se estabilizem evitando que o equipamento

transborde;

Conectar o equipamento a rede elétrica e acionar a tecla

LIGA/DESLIGA;

Iniciar a coleta da água no barrilete específico somente após o

acendimento da lâmpada piloto verde da célula

condutivimétrica;

Ao final do uso, fechar o registro de água, pressionar a tecla

LIGA/DESLIGA para desligar e desconectar o equipamento da

rede elétrica;

AÇÃO CORRETIVA


cumprida;

Não coletar a água caso a lâmpada piloto vermelha da célula

condutivimétrica esteja acesa;

ACÃO PREVENTIVA

Trocar a coluna de resina quando estiver próximo de

completar o ciclo de rendimento (900 litros);

Na troca do filtro de carvão ativado e/ou da coluna

deionizadora, abrir a torneira de saída localizada na célula

condutivimétrica para eliminar os traços da solução ativadora

das resinas de troca iônica (que falsamente indicam saturação

da coluna deionizadora);

Sempre que o deionizador ficar por mais de 10 dias sem uso,

ao reativá-lo desprezar a água contida dentro da carcaça,


retirando a coluna deionizadora e esvaziando o conteúdo

sobre uma pia. Depois, reinicie o processo de deionização

normalmente;

Limpeza interna e externa da coluna e barrilete: pano limpo

embebido em álcool 70%.


MONITORAMENTO

Planilha de utilização, limpeza, troca da coluna de resina e do carvão ativado.

Data Nome

Atividade (X) Troca (X)

Observação Utilização Limpeza

(int.= I; ext. =

E)

Coluna Filtro de carvão



DESTILADOR DE ÁGUA

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Destilar água


ATIVIDADES

Abrir o registro da água da rede de abastecimento de modo a gerar um fluxo de água pela válvula de escape;

Ligar a chave disjuntora da rede elétrica;

Acompanhar o início da destilação regulando o fluxo de vazão e temperatura da água que sai pela válvula de escape em

relação ao fluxo de água destilada;

Ao final do uso desligar a chave disjuntora e somente após

alguns minutos fechar o registro de água para que ocorra o resfriamento do equipamento.

AÇÃO CORRETIVA


Caso ocorra transbordamento de água da caldeira do

destilador deve-se reduzir a vazão do registro de entrada;

Caso a água de escape esteja muito quente deve-se aumentar

a vazão do registro de entrada para evitar perda de eficiência de destilação e superaquecimento do equipamento (provocará o desligamento do sistema).

ACÃO PREVENTIVA

Limpeza da caldeira e remoção de sais aderidos a resistência de aquecimento da caldeira do destilador.


MONITORAMENTO

Através da planilha de utilização e limpeza.

Data Nome Utilização Limpeza Observação



DILUIDOR AUTOMÁTICO DE SÊMEN

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: diluição de amostras para determinação

da concentração espermática no ejaculado.


ATIVIDADES

Preparar as palhetas previamente cortando a extremidade que possui algodão;

Conectar o equipamento a rede elétrica através de um estabilizador de tensão;

Ligar o equipamento pressionando a tecla POWER;

Posicionar uma palheta fina e o frasco com solução salina (NaCL 0,9%) nos locais indicados;

Selecionar o programa “Método Bovino”, pressionando a tecla 2 vezes para confirmar;

Para usar, executar o comando de aspiração de salina na

palheta (primeiro toque no pedal de acionamento) e em seguida posicionar a amostra de sêmen em contato com a

palheta e executar o comando de aspiração da amostra (segundo toque no pedal de acionamento);

Para determinar a concentração, executar o comando de liberação da amostra diluída na cubeta do fotômetro (terceiro toque no pedal de acionamento);

Colocar a cubeta com a amostra no fotômetro para leitura;

Repetir os passos trocando a palheta a cada amostra;

Ao final do uso, desligar o aparelho pressionando a tecla POWER e desconectar o estabilizador da rede elétrica;

Limpar o equipamento externamente com pano umedecido

com álcool 70%.

AÇÃO CORRETIVA

Interromper o processo caso a palheta não seja

completamente preenchida ou alguma das etapas não seja cumprida;

ACÃO PREVENTIVA


Revisão do equipamento e da rotina de utilização;

Calibração semanal do equipamento com a utilização das cubetas próprias. Mensalmente realizar avaliação da

concentração de 5 touros na câmara de Neubauer e comparar o resultado com a avaliação do fotômetro. Havendo desvio no resultado das 5 amostras a assistência técnica deverá ser

chamada.


MONITORAMENTO

Através das planilhas da rotina de utilização e calibração semanal do equipamento.


Observação Utilização Calibração



ENVASE E IDENTIFICAÇÃO

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Envase do sêmen e identificação das

palhetas


ATIVIDADES

Recolocar a bigorna em sua posição;

Conectar a rede elétrica ao nobreak e pressionar a tecla LIGA/DESLIGA, ligar o sistema integrado, o computador e o monitor (nessa ordem);

Para iniciar o sistema, pressionar a tecla RESET do sistema integrado;

Para iniciar o computador, pressionar a tecla F2 do teclado (indicar USUÁRIO e SENHA);

Abrir o programa da máquina de envase - IS4 (indicar

CODE/PASSWORD);

Corrigir a data e horário do computador;

Lavar o canhão laser da impressora com metil etil cetona secando em seguida com papel toalha seguido de jatos de ar

produzidos com uma pera;

Abrir o registro da tinta (meia volta no sentido horário);

Ligar a máquina de impressão – clicar em PRINTING-IMAJE

S7 START e confirmar;

Aguardar a tinta sair no canhão cobrindo-o em seguida com a

tampa de proteção;

Clicar em PRINTING e selecionar o programa IS4-MEDIUM;

Conectar o distribuidor de palhetas (máximo 2000 palhetas);

Posicionar o recipiente de acrílico, usado para colocar a amostra a ser envasada, ao lado da máquina de envase;

Acoplar as quatro agulhas com os tubos de sucção posicionados de forma centralizada e de modo que permitam a aspiração de todo o sêmen do recipiente;

Homogeneizar o sêmen a ser envasado antes de depositá-lo no recipiente de acrílico para aspiração;

Selecionar o nome do touro;

Selecionar o formato de impressão (FORMAT – MÉDIO). Touros com nome composto usar o formato ABS;

Selecionar o número de palhetas (QUANTITY TO PRINT);


Selecionar a velocidade de impressão em 1100 (mm/s) (PRINTING SPREED);

Para iniciar, clicar em GO;

Concluído o número de palhetas da amostra do touro, clicar na tecla Espaço;

Substituir agulhas com os tubos e recipiente de envase para reiniciar com nova amostra;

Repetir o passo de seleção do nome do touro e iniciar novamente;

Encerrado a rotina de envase, clicar em PRINTING – IMAJE S7

– STOP para desligar a impressora e, INICIAR – DESLIGAR para desligar a máquina de envase;

Retirar e lavar a bigorna com água e sabão neutro, deixando-a secando para uso no dia seguinte;

Limpar a máquina externamente com papel toalha embebido em álcool 70%.

AÇÃO CORRETIVA


Em caso de paralisação da impressão, verificar indicação da

falha no display (falta de tinta, falta de palheta, falta de sêmen ou palheta trancada). Após resolução do problema,

clicar no Y para reiniciar o processo;

Em caso de impressão borrada, desligar a máquina e lavar novamente o canhão da impressora com metil etil cetona,

secar e reiniciar o processo;

ACÃO PREVENTIVA

Controlar os níveis dos cartuchos de solvente e tinta.

Checar diariamente o volume envasado e a qualidade de impressão nas palhetas;


MONITORAMENTO

Planilha de utilização e revisão do equipamento.

Data Nome

Atividade (X)

Calibração Observação Utilização

Abastecimento

da tinta



ESTUFA DE AQUECIMENTO DAS VAGINAS ARTIFICIAIS

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Aquecimento das vaginas utilizadas na

coleta de sêmen.

RESPONSÁVEL: Funcionário responsável pela lavagem das vaginas

artificiais

ATIVIDADES

Borrifar álcool 70% e secar com papel toalha previamente a

colocação das vaginas artificiais montadas;

Conectar o equipamento a rede elétrica e ligar acionando o

botão LIGA/DESLIGA;

Ajustar o termostato em 37°C;

Desligar o equipamento em caso de paralisação nas atividades

de coleta.

AÇÃO CORRETIVA

Ajustar a temperatura caso não esteja adequada.

Enviar o equipamento para manutenção caso não esteja aquecendo ou aquecendo de forma controlada.

ACÃO PREVENTIVA

Aferir diariamente a temperatura interna com auxílio de termômetro de máxima e mínima calibrado.


MONITORAMENTO

Através das planilhas de checagem diária da temperatura, limpeza do equipamento e da rotina de

utilização.

Data Nome

Atividade (X)

Observação / Calibração Temperatura Limpeza

Máx Mín



ESTUFA DE AQUECIMENTO DE MATERIAL

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Aquecimento de lâminas utilizadas para

avaliação de sêmen e do diluente utilizado na pré-diluição das

amostras.


ATIVIDADES

Conectar o equipamento à rede elétrica e ligar pressionando o

botão LIGA/DESLIGA;

Regular o termostato de modo a manter a temperatura em 35°C;

Carregar o equipamento com o material a ser utilizado na avaliação de sêmen e aguardar que atinja a temperatura de

35°C;

Ao final do uso (depois de concluída a rotina de coleta e avaliação de sêmen), desligar o equipamento e efetuar a

limpeza com álcool 70% e papel toalha.

AÇÃO CORRETIVA


Enviar o equipamento para manutenção caso não esteja aquecendo ou aquecendo de forma controlada.

ACÃO PREVENTIVA

Aferir diariamente a temperatura interna com auxílio de termômetro de máxima e mínima calibrado.


MONITORAMENTO

Através das planilhas de checagem diária da temperatura, limpeza e calibração do equipamento.

Data Nome

Atividade (X)


Máx Mín



ESTUFA DE SECAGEM DE MATERIAL

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Secagem de material


ATIVIDADES

Conectar o equipamento à rede elétrica e ligar pressionando o botão LIGA/DESLIGA. “Este equipamento deve permanecer

ligado permanentemente a não ser em caso de limpeza e períodos de feriado coletivo”;


Carregar com material embalado submetido a autoclavagem ou material molhado não embalado, posicionando-os de modo

a favorecer a evaporação da água (boca para cima);

Remover o material após secagem completa antes de nova recarga.

AÇÃO CORRETIVA

Ajustar a temperatura caso não esteja adequada;

Enviar o equipamento para manutenção caso não esteja

aquecendo ou aquecendo de forma controlada.

ACÃO PREVENTIVA

Avaliação semanal da temperatura com auxílio de termômetro

de máxima e mínima;

Remover as prateleiras e limpar o interior da estufa com

álcool 70% e papel toalha para evitar a queda de sujidades no interior do material colocado para secar.


MONITORAMENTO

Através da planilha de checagem semanal da temperatura, limpeza e calibração do equipamento.

Data Nome

Atividade (X)


Máx Mín



ESTUFA DE SECAGEM E ESTERILIZAÇÃO

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Secagem e esterilização de vidraria e

metais.


ATIVIDADES

Conectar o equipamento à rede elétrica e ligar pressionando o botão LIGA/DESLIGA;


Carregar com o material molhado e não embalado mantendo o equipamento ligado por uma hora para que ocorra a secagem;

Desligar o equipamento para resfriamento com a porta fechada;

Retirar o material do equipamento e proceder a embalagem (fechamento);

Carregar com o material embalado mantendo o equipamento

ligado por duas horas para que atinja a temperatura de esterilização (150°C);

Desligar o equipamento para resfriamento com a porta fechada;

Remover o material esterilizado e guardar em local adequado;

Passar gaze embebida em álcool 70% sempre que esvaziar a estufa.

AÇÃO CORRETIVA


Enviar o equipamento para manutenção caso não esteja

aquecendo ou aquecendo de forma não controlada

ACÃO PREVENTIVA

Aferir diariamente a temperatura interna com auxílio de

termômetro calibrado para certificação de que tenha sido atingida a temperatura de esterilização;

Mensalmente, limpar a estufa internamente para evitar a queda de sujidades no interior dos materiais.


MONITORAMENTO

Através das planilhas de checagem da temperatura, limpeza e calibração do equipamento.

Data Nome

Atividade (X)


Máx Mín



FOTÔMETRO

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Avaliar a concentração espermática nos

ejaculados.


ATIVIDADES

Conectar o equipamento à rede elétrica através de Nobreak e ligar pressionando o botão “0/I”;

Apanhar as cubetas e se certificar que estão limpas;

Colocar uma cubeta vazia com a parte transparente posicionada para área de leitura do equipamento;

Pressionar a tecla VAL e configurar o equipamento para determinação da concentração usando as teclas “˄ ˅”;

Após a configuração, colocar uma cubeta com solução salina e pressionar duas vezes a tecla VAL para deixar o equipamento

pronto para uso;

Para determinar a concentração, colocar a cubeta com a

amostra diluída a ser lida e apertar duas vezes a tecla VAL;

O resultado será demonstrado no display do equipamento em 5 segundos;

Repetir a operação entre as amostras;

Ao final da rotina de determinação da concentração das

amostras, desligar o equipamento pressionando a tecla “0/I”.

AÇÃO CORRETIVA


cumprida;

Enviar o equipamento para revisão caso não seja possível

obter a calibração.

ACÃO PREVENTIVA

Calibração semanal do equipamento utilizando as cubetas de

calibração;

Revisão do equipamento e da rotina de utilização.


MONITORAMENTO

Através das planilhas de limpeza e calibração, como também da rotina de utilização.


Revisão Observação Limpeza Calibração



MÁQUINA DE CONGELAMENTO

OPERACIONAL

OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Congelamento de palhetas de sêmen.


ATIVIDADES

Conectar o computador a rede elétrica através do transformador/estabilizador e ligar pressionando o botão

“0/I”);

Conectar a máquina de congelamento diretamente a rede elétrica (220 V) e ligar pressionando a tecla ON/OFF;

Abrir o programa “Digit Win 3T” e entrar com as informações de User Code/Password;

Clicar em freezing – Start a freezing – Standard – Start;

Preparar o sensor do termostato localizado no tanque de congelamento, colocando-o no interior de uma palheta de

descarte resfriada a 4°C;

Fechar a tampa do tanque da máquina de congelamento;

Verificar a temperatura do tanque mostrada na máquina de congelamento;

Ligar o circulador de ar clicando Start – FANS – Auto N2L

Manual – clicar em Start no programa;

Quando a temperatura do tanque atingir 4°C soara um alarme;

Desligar o circulador de ar (FANS), abrir a tampa do tanque e carregar com as estantes que contém as palhetas (carga máxima 3300);

Fechar a tampa do tanque e acionar o circulado de ar (FANS);

Acompanhar a curva de resfriamento na tela do monitor (4°a -

155°C em 10 minutos);

Ao final da curva soara um alarme, indicando que deve ser desligado o circulador de ar (FANS);

Após alguns minutos, abrir a tampa do tanque e iniciar a remoção das palhetas das estantes colocando-as diretamente

no N2L tomando cuidado para não misturar amostras de touros diferentes;

Durante a remoção das palhetas das estantes ocorrerá o

reaquecimento do sistema. Quando a temperatura alcançar -135°C deve-se fechar a tampa da máquina e acionar o

circulador de ar (FANS) até que a temperatura caia novamente até -155°C;


Após a temperatura ser atingida novamente (-155°C), desligar

o circulador de ar (FANS) e aguardar um minuto até abrir a tampa do tanque novamente;

Retomar o procedimento de remoção das palhetas e caso ocorra reaquecimento indesejável, repetir o procedimento de resfriamento novamente;

Para novo congelamento, desligar o programa Auto N2L Manual e acionar o aquecimento (HEAT) e circulação de ar

(FANS) para que a temperatura retorne a 4°C;

No momento que o equipamento retornar a 4°C, desligar o aquecimento (HEAT) e a circulação de ar (FANS);

Abrir a tampa e recarregar o equipamento para reiniciar o processo;

Ao final da rotina de congelamento (final das palhetas), desligar o programa Auto N2L Manual e acionar o aquecimento (HEAT) e circulação de ar (FANS) para que a temperatura

suba até 27°C;

Desligar o computador e a máquina de congelamento;

Abrir a tampa do tanque e remover a palheta do sensor; Secar o tanque com uma toalha e em seguida passar papel toalha

embebido em álcool 70%;

Deixar a tampa do tanque aberto.

AÇÃO CORRETIVA


Cessar o procedimento caso seja detectado problema em

atingir as temperaturas de congelamento;

Encaminhar o equipamento para revisão caso não seja

possível restabelecer seu funcionamento normal.

ACÃO PREVENTIVA

Aferir a temperatura do interior da máquina de congelamento

mediante o uso de termômetro calibrado;

Revisão da rotina de utilização e calibração do equipamento por empresa certificada;

Descartar as palhetas de sêmen submetidas ao procedimento defeituoso.


MONITORAMENTO

Planilha de utilização, aferição e revisão/calibração do equipamento.

Data Nome

Atividade (X)

Observação Utilização

Revisão /

calibração

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