• Catalizadores biológicos: substâncias de origem biológicas que aceleram as reações químicas

• As vias metabólicas (sequencias ordenadas de reações) são possíveis porque as enzimas catalizam passos sequencias em cada via.

• As enzimas também controlam as vias metabólicas permitindo que o metabolismo se adapte a mudanças.

• A maioria das enzimas são proteínas mas existem também moléculas de acido ribolnucleico cataliticamente ativas chamadas ribozimas.

Cada traço representa uma enzimaEnzimas

Mapa metabólico

A Benzima

A BEnzimainativada

Atividade enzimática• A atividade enzimática é quanto produto é

produzido na presença da enzima por unidade de tempo em condições químicas definidas (temperatura, pH, composição de sais...):

mmol / segundo .(milimol de produto por segundo)Ou mais freqüentemente:mol /minuto(micromol de produto por minuto)

A B

A BA B

A BA B

A BA B

A B

B

B

A

A

enzi

ma

A B

A BA B

A BA B

A BA B

A B

B

B

A

A

Enz

ima

2

Regulação da atividade enzimática1. Regulação pelo produto (feedback negativo)

EnzimaSQuando o produto se liga ao sítio regulador inativa a enzima

Enzima 1 Enz. 2Enz 3

Enz.4S A B C P

Quando produto da via se liga à enzima regulatória da via inibe sua atividade...

Sítio regulador

P

Via metabólica...e, por conseqüência, inibe a via

1.1 – Inibição pelo produto imediato da enzima

1.2 – Inibição pelo produto final da via

Regulação da atividade enzimática2 - Regulação por fosforilação-defosforilação

EnzimaOH

EnzimaOPO3

-2

cinase

fosfatase

PO4-3

Forma ativa(ou forma inativa)

Forma inativa(ou forma ativa)

ATP ADPfosforilação

defosforilação

Cinase: enzima regulatória que fosforila outras enzimasFosfatase: enzima regulatória que defosforila outras enzimasA fosforilação é uma modificação covalente reversível

formadefosforilada

Formafosforilada

ciclo fosforilação-defosforilação

Classes de enzimas

• Existem mais de 2000 enzimas conhecidas até hoje• Um sistema de classificação foi desenvolvido com base

no tipo de reação• Todas enzimas estão catalogadas num cadastro formado

por quatro números separados por pontos(EC- de “enzime comission”. Ex.:1.13.11.11 ).

• O primeiro indica a qual das seis grandes classes de proteínas ela pertençe

• Os dois seguintes indicam sub-classe e sub-subclasse• O último indica qual é a enzima propriamente dita

As seis grandes classes de enzimasClasse Tipo de reação Sub-classes

Ex: lactatato desidrogenase: EC no: 1.1.1.27

• Classe 1 (Oxiredutase)• Subclasse 1.1: Grupamento CH-OH como doador de elétron• Sub-subclasse 1.1.1: NAD(P)+ como aceptor de elétron• Enzima número 1.1.1.27: lactato desidrogenase

Lactato

Piruvato

NAD reduzido NAD oxidado

Catálise Enzimática• Enzimas são catalizadores muito eficientes• Podem aumentar a velocidade de uma reação em até

1017 vezes(1017= 100.000.000.000.000.000)

Exemplos de algumas enzimas e o aumento na velocidade de reação causado por cada uma delas

Reação não catalizada

• Para comprender os mecanismos envolvidos na catálise enzimática vamos antes observar uma reação não catlizada:

A + B C + D• Em solução, os reagentes A e B encontram-se hidratados e movem-se

randomicamente.• Para que reagam é nescessário que colidam de forma favorável (colisão efetiva)• Quando colidem o complexo A-B passa por um estado de transição que requer

energia para ser alcançado• Grande parte da energia de ativação é utilizada para remover parte das moléculas de

água que formam a camada de hidratação em torno dos reagentes.• Em virtude desses limitantes a reação aconteçe em extensão muito pequena mesmo

quando termodinâmicamente favorável.

água de hidratação

Reação catalizada por Enzima

• Enzimas são capazes de reunir os reagentes (substratos) dentro de seu centro ativo.• No centro ativo os substratos ficam numa orientação ótima para ao formação do intemediário

de transição.• A ligação dos substratos ao centro ativo remove boa parte de suas camadas de hidratação.• A interação com os aminoácidos que formam o sítio ativo favorece a formação do

intermendiário de transição.• Reunidos, esses fatores favorecem a formação do intermediário de transição e a reação em si.

Como a estabilização do estado de transição favoraçe a reação:

um modelo intuitivo

Princípios de catálise enzimática

a) Aproximação e orientação dos substratos

b) Exclusão de águac) Estabilização do estado de

transiçãod) Transferência de grupo

Cinética Enzimática

• Velocidade de reação em função das concentrações dos subastratos

• Determinação do Km e da Vmax

• Detrminação do ótimo de pH e de temperatura

• Inibidores

Cinética de Michaelis–Menten

• Velocidade x concentração de substrato• Vmax: velocidade máxima

• Km: concentração de substrato na qual a reação acontece na metade da velocidade máxima

• Na Vmax virtualmente todas as moléculas de enzima estão com seus sitios ativos ocupados

• No Km (constante de Michaelis) metade das moléculas de enzima presentes no meio de reação estão com seus sítios ocupados.

• Km é uma medida da afinidade da enzima pelo substrato, quanto menor o Km maior a afinidade.

• A curva se proxima de Vmax, mas nunca alcança esse valor isso caracteriza uma assíntota.

Tipos de InibidoresCompetitivos

• Reversíveis: não causam alteração permanente na enzima, não se ligam covalentemente

Não competitivos• Irreversíveis, se ligam covalentemente à enzima

Alostéricos• Se ligam em um sítio diferente do sítio catalítico e

alteram a afinidade da enzima

Muitos inibidores são análogos do substrato natural da enzimaOutros são análogos do intermediário de transição

Cinética enzimáticaÉ o estudo de como a velocidade da enzima varia em função da concentração de substrato

[S] mmol/L

Velocidademol/min.

00,20,51,02,03,04,05,06,0

[S] mmol/L

Vel

ocid

ade

mol

/min

.

25

50

75

100

1 2 3 4 5 600

02550748590949799

Parâmetros cinéticosVelocidade máxima (Vmáx): é a velocidade máxima alcançada pela enzimaKm: é a concentração de substrato que faz com que a enzima funcione na metade da Vmáx

0,5mmol/L

V máx

V máx

/2100mol/min

Inibidores• Muitas substancias podem afetar processos

metabólicos afetando a atividade de enzimas• Os inibidores de enzimas são particularmente

importantes• Uma grande quntidade de remédios atuam como

inibidores enzimáticos(ex: sinvastatina na síntese de colesterol, aspirina na síntese de prostaglandinas...)

• Metabólitos naturais também estão envolvidos em processos regulatórios atuando como inibidores enzimáticos (mecanismo de controle por “feedback” é muito comum uma via metabólica ser inibida por seu produto final)

Inibição competitiva

Se ligam ao síto ativo mas não podem ser convertidos em produto

Como inibidor e substrato competem pelo mesmo sítio esse tipo de inibição é chamado competitiva.

Podem ser retirados do sítio ativo por um excesso de substrato, portanto aumenta o Km mas não altera a velocidade máxima

[S] mmol/L

Vel

ocid

ade

mol

/min

.

25

50

75

100

1 2 3 4 5 600

Sem inibidor

Inibidor Em conc.2X

Inibidor Em conc. X

V máx

“Km aparente” aumenta

Vmáx não mudaV m

áx/2

Inibição não-competitivaO inibidor se liga de forma irreversível à enzima inativando-aAtua como se diminuísse a concentração de enzima, na verdade diminuí a concentração de enzima ativaAs moléculas que não se ligaram ao inibidor funcionam normalmente, por isso o Km não muda

E

E-I E

EE EE

E

EE

E-I

Inibidor em concentração X

E-I

E

EE

EE

E

E E

E

E

E

E

Sem inibidor

E-IE

E

E

EE

E-I

E-I

E-IE-I

E-I

E

Inibidor em concentração 2X

[S] mmol/L

Vel

ocid

ade

mol

/min

.

25

50

75

100

1 2 3 4 5 600

sem inibidor

inibidor na conc. X

inibidor na conc. 2X

V máx

V máx

V máx

Km

Vmáx diminui

não muda

Inibição não-competitiva

• Qundo o inibidor interage com um grupamento importante para a ativiadade da enzima mas não pode ser deslocado pelo substrato a inibição é chamada não-competitiva

• “Substratos suicidas” possuem um grupamento reativo que forma uma ligação covalente estável com o sítio ativo da enzima

Inibição alostérica

• Inibidores alostéricos se ligam a um sítio afastado do centro ativo• Provocam uma mudança conformacional na enzima que

indiretamente reduz sua atividade• Não pode ser descrito pelo modelo de Michaelis–Menten

(resulta em uma sigmóide em vez de uma hipérbole)

Cinética enzimática II

• As propriedades catalíticas das enzimas, consequentemente sua atividade, são influenciadas por vários fatores que devem ser otimizados e controlados para que as medidas sejam feitas de uma forma reprodutível e útil.

• Esses fatores incluem:– Temperatura– pH– Força íonica (concentração de sais)– Concentrações de substratos, cofatores, inibidores

Dependência ao pH

• pH ótimo• Protonação/desprotonação

do sítio ativo• Em pHs extremos a proteína

é inativada por desnaturação

Efeito da temperatura na atividade enzimática

• O aumento de temperaura geralmente acaarreta um aumento na atividade enzimática

• Até um valor de temperatura em que começa a haver desnaturação e consequente perda de atividade