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Enzimas microbianas de uso terapêuticoe diagnóstico clínico

Karine Rigon Zimmer1Gustavo Luís Borré2

Danielle da Silva Trentin2

Clovis Woicickoski Júnior2Amanda Piccoli Frasson2

Alexandre de Arruda Graeff2Patrícia Gomes2

Alexandre José Macedo3

Resumo

Enzimas microbianas têm se destacado como um dos principais produtostecnológicos do mundo moderno, porém seu uso tem relatos nos tempos maisremotos. No início do século XX, teve início a produção em grande escala deenzimas industriais, hoje enzimas para detergentes de roupas, por exemplo,somam quantias significativas no comércio mundial. Por outro lado, enzimasde uso em diagnóstico clínico e terapêutico tiveram seu uso iniciado nadécada de 60 e década de 80, respectivamente, e vêm recebendo especialatenção da indústria de biotecnologia. Os avanços já podem ser percebidosna sociedade com tratamentos mais efetivos e diagnósticos laboratoriaismais rápidos e precisos. Nesta revisão são apresentados aspectos históricos,mercadológicos e de aplicações dessas enzimas.

Palavras-chave: Enzimas terapêuticas e diagnóstica. Polimerase. Ribonu-clease. Colagenase. Fosfatase. Inibidores enzimáticos.

Abstract

Microbial enzymes have been pointed as one of the most important

technological product in the modern World, even that its use has been reported

in the ancient ages. At the beginning of the 20th Century, the industrial enzymes

started to be produced; today the enzymes used in detergents for clothes

washing, for example, sum a significative portion of the world market. On

the other hand, the use of special enzymes for clinical diagnostic and

therapeutic started to be used at the beginning of 60`s and 80`s years

respectively and caught the interest of the companies in biotechnology.

Advances might be realized in the society, such as more effective therapeutic

treatments and faster and more precise diagnostics in the clinic. In this revision

are present aspects of history, market and application of these enzymes.

Keywords: Therapeutic and diagnostic enzymes. Polymerase. Ribonu-

clease. Colagenase. Phosphatase. Enzymatic inhibitors.

1 Pós-Graduando do Programa de Pós-Graduação em Biologia celular e molecular - Centro de Biotecnologia - Universidade Federal do Rio Grande do Sul.2 Pós-Graduando do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - Faculdade de Farmácia - Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

³ Professor da Faculdade de Farmácia, Laboratório de Tecnologia Bioquímica e do Centro de Biotecnologia, Grupo de Biofilmes & DiversidadeMicrobiana - Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre - RS, Brasil. E-mail: [email protected]

Recebido em 29/05/09 e aceito em 17/08/09.

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Zimmer, K. R., Borré, G. L., Trentin, D. S., Júnior, C. W., Frasson, A. P., Graeff, A. A., Gomes, P., Macedo, A.J.

Revista Liberato, Novo Hamburgo, v. 10, n. 14, p. 123-137, jul./dez. 2009

1 Considerações iniciais“Enzimas especiais” são aquelas destina-

das ao uso terapêutico, diagnóstico, analítico,química fina e pesquisa. Conceitualmente enzi-mas são proteínas que possuem atividade catalí-tica, ou seja, aceleram a velocidade de reaçõesquímicas. Atualmente, as enzimas são empre-gadas massivamente em produtos de limpeza,que contém, por exemplo, proteases, ainda naárea petroquímica produzindo biodiesel atra-vés do uso de lipases, na produção de sucos,com a utilização das pectinases e na terapêu-tica e em kits de diagnósticos, entre outras tan-tas áreas.

Industrialmente uma das principais fon-tes produtoras de enzimas são os microrganis-mos. Estes são considerados fontes atrativas ede baixo custo na produção de metabólitos,podendo ser cultivados em grandes quantida-des e em tempo relativamente curto. Acrescen-ta-se ainda a vantagem da produção não estarcondicionada às questões sazonais e geográfi-cas e pela possibilidade de uso de matérias-primas pouco dispendiosas.

Uma ampla gama de enzimas, de diferen-tes fontes e para diversos usos terapêuticos ede diagnóstico pode ser encontrada no merca-do. O Brasil apresenta grande potencial para abusca de novos fármacos e biomarcadores enzi-máticos uma vez que é inigualável a quantida-de e variedade de produtos naturais, incluindoa notável biodiversidade microbiana disponí-vel para transformação em produtos úteis demaior valor agregado. A grande eficiência dasenzimas, aliada a sua alta especificidade, tor-nam-nas agentes de grande potencial para usoterapêutico. Assim sendo, a relevância do usode enzimas como medicamento relaciona-secom o fato de que pequenas quantidades docatalisador biológico podem produzir efeitosbastante específicos em condições fisiológicas.

Enzimas especiais exigem alto nível depureza em decorrência da sua aplicação, as-sim, uma sequência de processos de purifica-ção é necessária até a obtenção final da enzi-ma. Como o processo de purificação é sofisti-cado e de extrema complexidade, o custo des-

ta etapa pode representar até 80% do custo doproduto final (KILIKIAN et al., 2001).

O mercado externo brasileiro de enzimasfoi avaliado no ano de 2005 em 147,2 milhõesde dólares, correspondendo a apenas 3,7% domercado internacional. Das enzimas produ-zidas em escala industrial, uma fatia significa-tiva do mercado mundial é representada pelasenzimas especiais. No Brasil, as enzimas diag-nósticas são predominantemente importadasenquanto que essa classe de enzimas produzi-das no Brasil é exportada em uma quantidademuito menos expressiva. No período de 1998-2005, considerando-se enzimas especiaiscomo um todo, o Brasil importou o equiva-lente a US$ 516 milhões e exportou US$24,5 milhões, o que corresponde a 84% deimportação e 16% de exportação. Dentro des-tas, as enzimas terapêuticas são responsáveispela maior parte do mercado neste período,contando com uma importação de US$ 85milhões (AEHLE, 2007). A previsão de cresci-mento para o mercado mundial de enzimas éde 7,6% ao ano, sendo responsável por estecrescimento tanto a queda no preço e o maioracesso às enzimas de aplicação industrial quan-to a inclusão de novas enzimas especiais, cadavez mais sofisticadas e de alto custo. No perío-do de 2003 a 2005, as indústrias brasileirasque mais importaram e exportaram enzimasforam as de diagnóstico e as farmacêuticas(BON et al., 2008).

Esta revisão foi realizada dentro das ativi-dades da disciplina “Enzimas microbianas deuso farmacêutico” do Programa de Pós-Gra-duação em Ciências Farmacêuticas da Universi-dade Federal do Rio Grande do Sul.

2 Histórico do uso de enzimasNão se sabe precisamente quando as en-

zimas passaram a ser utilizadas nas atividadescotidianas das sociedades primitivas. Entre-tanto, as enzimas já eram amplamente utiliza-das sem que se conhecesse seu conceito efunção exata. Sabe-se, porém, que desde omomento em que o homem começou a deixar

125Revista Liberato, Novo Hamburgo, v. 10, n. 14, p. 123-137, jul./dez. 2009

Enzimas microbianas de uso terapêutico...

registro escrito de seus atos, há referências aouso de processos enzimáticos. Um dos maisantigos alimentos processados pelo homem,o queijo, produzido na época das primeirascivilizações – a partir de leite de cabra – foi aforma rudimentar encontrada para mantê-lo emcondições de consumo por longos períodos detempo, e adicionalmente, facilitar seu transportepor longas distâncias. O processo produtivoenvolve a transformação dos açúcares presen-tes no leite em ácido lático. Seu consumo estádescrito na Odisséia de Homero, revelando queos Gregos já tinham difundido em sua culturaa produção deste alimento.

A produção e o consumo de cerveja naBabilônia data de 6000 a.C. (JAY, 2000) e osegípcios fabricavam pão dois milênios antesde Cristo nascer (CARBALLO, 2002), ambosproduzidos com auxílio da levedura Saccharo-

myces cerevisiae. A cerveja tornou-se rapida-mente um produto de importância social, deonde deriva o motivo para inclusão de umasérie de leis no código de Hamurabi sobre afabricação, comercialização e consumo da cer-veja. Já o pão, outro importante alimento, nosprimórdios da humanidade era fermentadoao ar, naturalmente, sem a adição de nenhumtipo de produto. Este processo baseia-se no fatode que existem esporos microbianos suspensosna atmosfera, os quais, ao atingirem a massacontendo os açúcares do trigo, crescem fermen-tando a mistura, permitindo a fabricação dopão. Já na Idade Média passou-se a guardarparte da massa fermentada para utilizar-se nasproduções seguintes, visto que a “massa ve-lha” contém grande quantidade de microrga-nismos fermentadores viáveis, reduzindo-se,desta forma, o tempo de fermentação do pão.

Inicialmente, esta produção era puramenteempírica. A escolha do tipo de microrganismomais adequado para cada processo era reali-zada por tentativa e erro, e o conhecimento erapassado através das gerações. Por muito tem-po não se soube que estas leveduras eram orga-nismos vivos. A certeza deste fato veio apenasno século XIX com Louis Pasteur (JAY, 2000).No século XVIII, Spallanzani, um cientistaitaliano, já conhecia a ação digestiva de secre-

ções estomacais sobre a carne, porém o isola-mento de uma enzima só foi realizado em 1833pelos franceses Anselme Payen e Jean-FrançoisPersoz que precipitaram a diastase, enzimaatualmente conhecida como amilase (SILVER-MAN, 2002). Em 1836, Theodor Schwann, ob-servou a primeira enzima descoberta a partirde um tecido animal, a pepsina, responsávelpela digestão protéica (SILVERMAN, 2002).

No século XIX, Pasteur descreveu aconversão do açúcar em álcool por leveduras,demonstrando desta forma, que os agentes res-ponsáveis pela fermentação eram organismosvivos. Pasteur postulou que estes fermentoseram inseparáveis da estrutura celular do leve-do, declarando que "a fermentação alcoólica éum ato correlacionado à vida e à organizaçãodas células do fermento e não à sua morte ouputrefação" (BUCHNER, 1907). Somente em1878, passou-se a fazer distinção entre os or-ganismos inteiros e as moléculas capazes derealizar a catálise, passando a serem chamadaspelo termo cunhado por Wilhelm Kühne,enzimas, do grego, “no fungo” (PRICE, 1999),e a ação destas moléculas, chamada de fermen-tação.

No fim do século XIX, Eduardo Büchner,provou que as enzimas permanecem ativasmesmo fora das células que as produzem,demonstrando que estas não necessitam decélulas vivas para a sua atividade. Esta desco-berta valeu-lhe o prêmio Nobel de Química de1907 (BUCHNER, 1907). Todavia, depois detranscorrido um quarto do século XX, não setinha conhecimento da natureza das enzimas,até que em 1926 James Sumner purificou ecristalizou a urease, sabidamente uma enzima(PRICE, 1999; NORTHROP, 1946). Tal fatocontribuiu com a elucidação deste mistério quecaiu por terra com os trabalhos de Northrop eStanley no início da década de trinta do séculopassado com as enzimas pepsina, tripsina equimiotripsina, provando inequivocamente queas enzimas são proteínas (NORTHROP, 1946).

Em 1955, Sanger desenvolveu o primei-ro método para determinar a estrutura primáriade proteínas, sendo a insulina a primeira a sersequenciada (SANGER, 1958). Quase dez anos

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depois, foi determinada pela primeira vez aestrutura tridimensional de uma proteína, alisozima, através de técnicas de cristalografiade raios-X (PRICE, 1999).

3 Enzimas de uso terapêuticoO uso terapêutico de enzimas remonta

ao final do século XIX, quando preparaçõesbrutas de enzimas pancreáticas de origem suínajá eram empregadas como auxiliares diges-tivos (CRUZ et al., 2008). Para as enzimasutilizadas em aplicações digestivas e tópicas,a pureza, a fonte e a dose não são considera-das cruciais (AEHLE, 2007). Entretanto, o usoendovenoso de enzimas microbianas requeruma purificação de alta seletividade acopladaà preservação da atividade enzimática, evi-tando a desnaturação protéica e a proteólise.Diversos requisitos devem ser consideradospara o uso de enzimas com fins terapêuticos,dentre eles a baixa resposta imunológica, altaatividade e estabilidade em pH fisiológico,baixa taxa de eliminação e independência decofatores exógenos. Além disso, quando seutilizam microrganismos como fonte destasmoléculas, deve-se buscar cepas não pato-gênicas objetivando evitar a presença de to-xinas (NETO, 2001; AEHLE, 2007).

Na prática, poucas enzimas possuem aspropriedades necessárias para este fim, cujainstabilidade dos biocatalizadores, suscetibi-lidade ao ataque de proteases, dificuldade deacesso ao órgão-alvo e antigenicidade repre-sentam algumas das limitações da terapiaenzimática. Entretanto, estas dificuldadespodem ser contornadas por diferentes estraté-gias de formulação, como a conjugação quí-mica com polímeros utilizada para diminuir aresposta imune, um dos efeitos mais comunsdas enzimas microbianas. Além disso, a incor-poração de enzimas a lipossomos (vesículasmicroscópicas compostas de uma ou maismembranas lipídicas envolvendo um compar-timento aquoso) confere diminuição da toxi-cidade, direcionando o acesso ao órgão-alvoe reduzem a resposta imunológica (CRUZet al., 2008).

De acordo com a finalidade, as enzimaspodem ser administradas por via tópica, oral,intravaginal e parenteral, apresentando-se, noúltimo caso, geralmente na forma de prepara-ções liofilizadas contendo sais tamponantesbiocompatíveis. Atualmente existe no merca-do uma ampla variedade de medicamentos àbase de enzimas para aplicação como anti-inflamatórios, antissépticos, auxiliares diges-tivos, na reposição de enzimas hemostáticas,na inibição da coagulação, na reposição deenzimas metabólicas, no tratamento da fibrosecística bem como na terapia contra o câncer(tabela 1). Dentre as principais enzimas tera-pêuticas de origem microbiana, destaca-se aL-asparaginase utilizada para o tratamentode leucemia linfocítica aguda. Esta enzima écapaz de esgotar os estoques de asparaginaplasmática, causando a morte de células blás-ticas que não possuem a enzima asparaginasintetase (NARTA et al., 2007). Células sadiasnão são afetadas, uma vez que não necessitamde aporte exógeno de asparagina. A enzimaé obtida principalmente através dos microrga-nismos Escherichia coli e Erwinia carotovora,havendo formulações no mercado da enzimanativa de ambos os organismos e da L-aspara-ginase de E. coli conjugada ao polietilenoglicol(PEG) (NARTA et al., 2007). As formulaçõeslipossomais ainda estão em estudo e apresen-tam, assim como a PEG-asparaginase, menortoxicidade, aumento do tempo de circulaçãona corrente sanguínea e consequente aumentoda atividade terapêutica (NETO, 2001).

A enzima estreptoquinase, produzida porStreptococcus ß-hemolítico, especialmente S.

pyogenes e S. equisimilis, pertence à primeiraclasse de agentes fibrinolíticos a ser utilizadana clínica, sendo capaz de ativar o plasmino-gênio, substância precursora da plasmina, quepor sua vez dissolve os coágulos sanguíne-os (RANG et al., 2004). É utilizada para eli-minação de trombos venosos e embolias pul-monares agudas e quando administrada naforma endovenosa, reduz a taxa de mortalida-de no infarto do miocárdio. Uma das princi-pais limitações desta terapia é a resposta anti-gênica, variando desde reações menores, como



febre e exantema cutâneo – onde a pele apre-senta-se vermelha, áspera e com prurido in-tenso – até reações anafiláticas graves.

As ß-lactamases por sua vez, constituemoutro exemplo de enzimas microbianas terapêu-ticas e apresentam a capacidade de romper oanel ß-lactâmico de penicilinas e cefalosporinas.A produção de ß-lactamases por diversas bacté-rias representa um grande mecanismo de resis-tência aos antimicrobianos, por outro lado, ouso destas enzimas com fins terapêuticos se dáem reações alérgicas agudas após administra-ção de penicilinas. Estas enzimas podem serproduzidas por uma série de microrganismos,dentre eles, Bacillus cereus, Streptomyces

cacaoi, S. albus, E. coli, e Citrobacter diversus.

4 Enzimas em diagnósticoEnzimas diagnósticas ou para uso analí-

tico são enzimas utilizadas diretamente oucomo componentes de kits diagnósticos paraa determinação de diferentes substâncias(AEHLE, 2007). São enzimas com papel im-portante na análise de amostras de sangue,urina, soro, entre outros fluidos corporais, parao monitoramento e diagnóstico de diferentespatologias (CRUZ et al., 2008). Dentre as subs-tâncias que podem ser determinadas com tes-tes e kits compostos por enzimas, podemoscitar substâncias químicas como fosfatos,amônia, etanol e ácido acético, além de meta-bólitos tais como glicose, uréia, creatinina e até

Tabela 1 – Exemplos de enzimas terapêuticas (adaptado de AEHLE, 2007 e CRUZ et al., 2008)

amiznEoremúN

.C.EetnoF laicremocemoN ocituêparetosU

esadixootarU 3.3.7.1 suvalfsulligrepsA emyzocirU atoG

esatumsidodixórepuS 1.1.51.1 soticórtireeonivobodagíFmronixoreP

mronixOoãçamalfnI

esapiL 3.1.1.3 suzihrrasupozihR ovitsegidrailixuA

esaelcunobirrixoseD 1.12.1.3 etnanibmocerOHCsaluléC emyzomluP acitsícesorbiF

esaelcunobirrixoseD)esanrodotperts(

1.12.1.3 sucitylomeahsuccocotpertS esadiraV sacirtságsareclÚ

esaelcunobiR 4.62.1.3 sneipipanaR esanocnOsnuglaelarivitnA

serecnâc

esalima-B 1.1.2.3 eazyrosulligrepsA ovitsegidrailixuA

esaluleC 4.1.2.3 edirivamredohcirT ovitsegidrailixuA

amizosiL 71.1.2.3 sovoedaralC ratsiploCemyzaruM ocitóibitnA

edadisotcalaG 22.1.2.3uosanamuhsaluléCsetnanibmocerOHC

lagalpeRemyzarbaF yrbaFedaçneoD

esatcaL 32.1.2.3,siligarfsecymorevyulK

regin.A,eazyrosulligrepsAdiatcaLcaleruS esotcalaaicnârelotnI

esadisorberecocilG 54.1.2.3 setnanibmocerOHCsaluléC emyzereC rehcuaGedaçneoD

esaniuqotpertsE 37.12.4.3 uccocotpertS ocitilomehßs esanikibaKesatpertS oeníugnasolugáoC

esacirefsE 12.4.3 sucireahpssullicaBacinôrcetiuqnorBadugaainomuenP

aníapaP 2.22.4.3 ayapapaciraC lifanaP esonimreVoãtsegiD

esanegaloC 3.42.4.3 mucitylotsihmuidirtsolC esanegalloKlytnaS elepedsareclÚ

esatpeparreS 04.42.4.3 aitarreS 51E neznaD oãçamalfnI

esanigarapsa-L 1.1.5.3,ilocaihcirehcsE

arovotoracainiwrEesaniwrErapslE

acitícofnilaimecueLaduga

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mesmo substâncias tóxicas como pesticidas,herbicidas e metais pesados. Antígenos virais,anticorpos, proteínas, medicamentos, vitami-nas e hormônios estão entre outros compostosque podem ser analisados por métodos queutilizam enzimas.

As enzimas para uso diagnóstico são emmuitos casos obtidas de microrganismos. Aprincipal razão para se utilizar microrganismosna produção de enzimas que poderiam serisoladas de plantas e animais, é a facilidade nomelhoramento e a eficiência na produção (KO-PETZKI et al., 1994; AEHLE, 2007). Enzimasem diagnóstico são normalmente necessáriasem quantidades relativamente pequenas (me-nos de 10 kg/ano no mundo), diferentementedas enzimas industriais que são usualmente pro-duzidas em grandes quantidades.

Do ponto de vista industrial, técnicas mo-leculares, em especial a tecnologia de DNArecombinante, têm sido amplamente emprega-das na produção destas enzimas. Recentesavanços nesta área têm permitido a clonagemde numerosos genes de interesse e a manipu-lação de diferentes células (em especial asbacterianas e fúngicas), permitindo maior pro-dução da enzima desejada. Há registros indi-cando aumentos de até mil vezes na produçãode enzimas de uso diagnóstico comparadascom os níveis obtidos do organismo produtornatural (KOPETZKI et al., 1994). Assim,enzimas recombinantes com alto nível de ex-pressão, obtidas a partir de técnicas moleculares,reduzem a necessidade de passos de purifica-ção, tornando muitas vezes o processo maiseficiente. Enzimas como glicose-6-fosfatodesidrogenase (Leuconostoc dextranicus),creatinase (Pseudomonas putida), galactosedesidrogenase (P. fluorescens) e Taq polimerase(Thermus aquaticus) têm sido produzidas comsucesso utilizando estas técnicas (KOPETZKIet al., 1994).

A utilização de enzimas nestes ensaiosapresenta inúmeras vantagens comparada aosmétodos químicos convencionais, já que estessão de difícil realização devido à baixa sensibi-lidade, seletividade, custo, tempo de realiza-ção e quantidade de amostra que necessitam

(GACESA; HUBBLE, 1990; KOPETZKI et al.,1994; AEHLE, 2007). As enzimas podem serempregadas para uso diagnóstico de uma for-ma geral de três diferentes maneiras:

a) Ensaios enzimáticos. Inúmeros en-saios, baseados em diferentes enzimas, estãoatualmente disponíveis utilizando uma amplavariedade de métodos de detecção. Em muitoscasos, as reações enzimáticas são monitoradaspela medida espectrofotométrica da oxidação/redução de coenzimas ou utilizando reaçõescolorimétricas de ponto final (AEHLE, 2007).Um dos métodos comercialmente disponíveispara a quantificação de glicose emprega aenzima glicose oxidase a qual é obtida a partirde diferentes fontes fúngicas, principalmentedo gênero Penicillium e Aspergillus como, porexemplo A. niger (WONG et al., 2008). Alémdisso, enzimas microbianas como colesterolesterase (obtida de espécies de Nocardia,

Saccharomyces cerevisiae e Saccharopolys-

pora erythraea) e urease (obtida de espéciesde Lactobacillus e Streptococcus) têm sidoamplamente utilizadas em ensaios enzimáticos(WONG et al., 2008) e em biosensores paradeterminação de metabólitos importantes emáreas médicas e ambientais. Biosensores enzi-

máticos são importantes exemplos da utiliza-ção de enzimas microbianas em testes diag-nósticos. Estes têm movimentado milhares dedólares em todo mundo. Enzimas em bio-sensores são muito atrativas, devido à varie-dade de produtos de reação quantificáveis osquais incluem prótons, elétrons, luz e calor(NEWMAN; TURNER, 2005; WONG et al.,2008). Na tabela 2, encontram-se alguns exem-plos de enzimas utilizadas nesse tipo de ensaiocom um dos possíveis produtores da enzimaem questão.

b) Imunoensaios enzimáticos. Dentro des-te grupo encontram-se enzimas utilizadas emtécnicas imunológicas, nas quais elas apresen-tam-se acopladas a anticorpos ou antígenos.A notável especificidade torna o ensaio espe-cífico, a alta afinidade dos anticorpos pelosantígenos e o poder amplificador da catáliseenzimática tornam o ensaio extremamente sen-sível. Nesses métodos, enzimas originárias de



organismos como E. coli, Vibrio harveyi, Elec-

trophorous electicus e A. niger são ligadas deforma covalente a um determinado anticorpoe a reação catalisada pela enzima, quando daadição de substrato específico, é utilizada paraquantificar o sistema (ROITT et al., 1999)(tabela 2).

c) Quantificação direta de enzimas micro-bianas. Realizada em fluidos corporais repre-senta outra ferramenta importante na detecçãode infecções microbianas. Visto que estas en-zimas são produzidas unicamente por certosmicrorganismos, sua detecção em fluidos cor-porais é um forte indício de infecção. Enzimaspotencialmente úteis para este propósito inclu-em ß-lactamases, glicosidases, neuramidases,galactosidases entre outras (YOLKEN, 1981).

5 RibonucleasesAs ribonucleases ou RNases são as proteí-

nas responsáveis pela atividade degradativa deRNA, participando de diversos processos fisio-lógicos, como a transcrição e processamentodo RNA, morte celular, defesa do hospedeiroe controle do crescimento tumoral (ÚSUGA;

Tabela 2 – Exemplos de enzimas de origem microbianautilizadas em ensaios diagnósticos

Enzima Microrganismo

Ensaios enzimáticos

Glicose oxidase Aspergillus niger, Penicillium sp.

Glicose-6-fosfato desidrogenaseLeuconostoc mesenteroides,

L. dextranicus

UreaseLactobacillus fermentum,

Streptococcus sp.

Creatinase Pseudomonas putida

Galactose desidrogenase Pseudomonas fluorescens

Piruvato oxidase Lactobacillus plantarum

Colesterol oxidase

Saccharomyces cerevisiae,

Saccharopolyspora erythraea,

Nocardia sp.

Imunoensaios enzimáticos

Acetilcolinesterase Electrophorous electicus

Fosfatase alcalina Escherichia coli

ß-galactosidase Escherichia coli

Glicose oxidase Aspergillus niger

Glicose-6-fosfato desidrogenase Leuconostoc mesenteroides

RUGELES, 2006). Estas enzimas estão presen-tes em bactérias, fungos, protozoários, plan-tas superiores e vertebrados. As RNases sãoclassificadas em três grandes famílias: superfamília A, família T1 e família T2. As RNasestêm como substratos diferentes sequências doRNA. Por exemplo, a RNase A cliva a extre-midade 3’ de resíduos terminados em C e U,dando origem a um produto 3’-fosforilado. ARNase Phy I apresenta como substratos resí-duos G, A e U e como produtos mononucleo-tídeos com C 5’ terminal. A RNase U2 clivaligações 3’-fosfodiéster adjacentes às purinas,originando purinas 3’-fosfato ou ainda oligonu-cleotídeos com esse grupo terminal (RITTIÉ;PERBAL, 2008).

A produção de ribonucleases por diver-sos microrganismos tem sido amplamente estu-dada. A tabela 3 ilustra os principais microrga-nismos produtores de RNases as quais já fo-ram isoladas e caracterizadas.

O cultivo destes microrganismos é geral-mente realizado em meio líquido, e a fermen-tação ocorre sob diferentes condições tais comofermentação submersa com agitação (XIONGet al., 2005) e com células imobilizadas (MA-NOLOV et al., 1993). As RNases obtidas apartir de microrganismos têm sido utilizadasamplamente em técnicas de biologia moleculare na indústria farmacêutica (XIONG et al.,2004). Muitas RNases são altamente citotóxi-cas e, em alguns casos são seletivas às célulasmalignas. Como fatores determinantes dessacitotoxicidade, podemos citar a atividade catalí-tica, a habilidade de escapar de inibidores natu-rais, a estabilidade e a eficiência de internali-zação. Esse somatório de fatores indica que asRNases podem ser utilizadas como fármacosalternativos no tratamento de tumores (MAKA-ROV; ILINSKAYA, 2003).

Outra aplicação bastante investigada éo uso destas enzimas na terapia antiviral. Seuemprego pode ser justificado pela capacidadede penetração na célula e degradação do RNAviral (RNA ribossomal, no caso dos vírus deRNA e RNA mensageiro após a transcrição,em vírus de DNA), somado ao fato de promo-ver quimiotaxia às células do sistema imune(ÚSUGA; RUGELES, 2006).

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Tabela 3 – Exemplos de microrganismos produtores de ribonucleases

serotudorpsomsinagrorciM

suropsibsuciragA mudiculamredonaG muiger-rebutsutoruelP

aecardnilycebycorgA sueromramsugizispyH suevinsupozihR

sutavalcsulligrepsA suetcalxeprI eazyrosupozihR

reginsulligrepsA sedodesunitneL refinolotssupozihR

eazyrosulligrepsA nrutcapmociverbmuillicineP snecserivsulussuR

sudillapsulligrepsA munirticmuillicineP sulubolgsecymotimreT

ataleacaitavlaC iignyresutoruelP nujabnagarohpelehT

amixamebycotilC sutaertsosutoruelP alecavlovalleiravloV

ataisudniarohpoytciD suiranomlupsutoruelP

sepitulevanilummalF ujacrojassutoruelP

Pesquisadores demonstraram que umaRNase homóloga à RNase A é capaz de ini-bir a replicação viral em células infectadas pelovírus HIV-1 (SAXENA et al., 1996). Além dis-so, destaca-se o emprego das RNases comoferramenta analítica. Elas desempenham pa-pel importante em estudos sobre a estrutura efunção do RNA; são utilizadas para removerRNA de produtos que devem ser livres deste;e ainda são capazes de produzir nucleotídeospara uso clínico (XIONG et al., 2004; RITTIÉ;PERBAL, 2008).

6 PolimerasesPolimerase é termo utilizado para desig-

nar enzimas capazes de catalisar a incorpora-ção de monômeros em uma cadeia, estandoassociadas à formação de polissacarídeos,terpenos, proteínas e polímeros de ácidosnucléicos. Mais especificamente as polimerasessão enzimas que catalisam a formação decadeias de polinucleotídeos, a partir de seusmonômeros, complementares a uma sequênciamolde. Desta forma, agrupadas nesta cate-goria, estão as DNA polimerases (I, II, III eIV), RNA polimerases (I, II e III), transcrip-tases reversas e telomerases, as quais sãoclassificadas oficialmente como nucleotidil-transferases (EC 2.7.7).

Dentre as diversas polimerases mencio-nadas, algumas possuem uma ampla produ-ção industrial e comercialização, destacando-se as DNA polimerases de organismos termófi-

los como a Taq polimerase e as transcriptasesreversas advindas de retrovírus. Estas enzimastornaram-se poderosas ferramentas da biolo-gia molecular por serem peças-chave das técni-cas da PCR (Polymerase Chain Reaction) eRT-PCR (Reverse Transcription – Polymerase

Chain Reaction), por exemplo, contribuindocom o rápido avanço da biotecnologia.

A Taq polimerase é uma DNA polimerasepresente na eubactéria extremófila Thermus

aquaticus. Sua temperatura ótima de ativida-de, próxima a 75 °C e sua relativa estabili-dade a 95 °C são fatores determinantes para osucesso desta enzima na técnica da PCR. Atécnica, desenvolvida por Kary Mullis em1983, é amplamente utilizada na amplificaçãode sequências de DNA em estudos básicos deestrutura e função gênica na perícia forense,bem como no diagnóstico de doenças infec-ciosas, como a tuberculose e a AIDS (YANG;ROTHMAN, 2004). A disseminação da téc-nica da PCR fez com que a obtenção da enzimaatravés de sua fonte natural se tornasse invi-ável, tanto pelas dificuldades de cultivo dabactéria extremófila, quanto pelo baixo rendi-mento de extração da enzima. Graças à tecno-logia do DNA recombinante, a enzima foiclonada com sucesso em E. coli, uma espéciede fácil e amplo cultivo (LAWYER et al.,1989; MANZUR et al., 2006).

A transcriptase reversa, também conhe-cida como DNA polimerase dependente deRNA, é uma enzima heterodimérica que pos-sui um domínio com a ação polimerásica e



outro com ação RNásica. O mecanismo da sín-tese de DNA a partir de RNA é explorado natécnica de RT-PCR, que alia a ação sequencialda retrotranscriptase e da Taq polimerase.Assim, após a formação da sequência deDNA, a mesma é amplificada tornando possí-vel a identificação, de forma indireta, de frag-mentos de mRNA transcritos em uma célula.Dentre as exemplares mais conhecidas e explo-radas comercialmente destaca-se a retrotrans-criptase do vírus da leucemia murina Moloney(M-MLV). Pelas adversidades que envolvemo cultivo e manuseio viral e pelo baixo rendi-mento na extração da enzima, a produção emlarga escala de retrotranscriptases só foi possí-vel, novamente, com o auxílio da tecnologiado DNA recombinante (ROTH et al., 1985;MANZUR et al., 2006).

7 ColagenasesAs colagenases são enzimas capazes de

hidrolisar as ligações peptídicas de vários ti-pos de colágeno, a proteína mais abundantenos mamíferos. O colágeno é virtualmenteencontrado em todos os tecidos, exercendodiferentes funções de acordo com a organiza-ção de sua estrutura final. Nos organismos, suasfibras resistentes são clivadas em fragmentosmenores pelas colagenases para posteriordegradação dos fragmentos peptídicos poroutras enzimas. Essas enzimas responsáveispela hidrólise dos diferentes tipos de colágenofazem parte do grupo das metaloproteinasesde matriz (MMPs), endopeptidases dependen-tes de uma forte ligação com zinco para apre-sentarem suas atividades catalíticas. Dentre asvárias colagenases já identificadas em hu-manos, pode-se citar como exemplos acolagenase intersticial ou de fibroblastos(MMP-1) e a colagenase de neutrófilos(MMP-8) (BIRKE-DAL-HANSEN et al., 1993).

Microrganismos também produzem enzi-mas colagenolíticas, estas são amplamentecomercializadas para diversos fins. Mais espe-cificamente, o microrganismo Clostridium

histolyticum tem sido muito estudado. Em1937, um estudo realizado por Weil e Kocholaty

(1937) já investigava as proteinases do C.

histolyticum após o relato da atividade pro-teolítica por outros pesquisadores. Posterior-mente, Jennison (1945) avaliou a atividadeproteolítica de certas bactérias sobre o colá-geno, propondo a utilização do termo colage-nase somente para as enzimas que comprova-damente hidrolisam o colágeno, ao contráriodaquelas provenientes de bactérias que somentetêm ação sobre a gelatina.

Experimentos utilizando C. histolyticum

levaram ao isolamento e caracterização dos seistipos de colagenases por ele produzidas e a suaclassificação em duas classes conforme suasatividades catalíticas (BOND; VANWART,1984). Muitos estudos contribuíram para tor-nar o C. histolyticum o principal microrganis-mo utilizado para a produção industrial de cola-genases, entretanto, essas enzimas são tambémobtidas de outras espécies. Lima e colabora-dores (2009) estudaram uma cepa de Candida

albicans produtora de colagenase com resul-tados promissores para a produção industrial.Outros trabalhos propõem a utilização de orga-nismos geneticamente modificados em associ-ação com técnicas de purificação mais avan-çadas na obtenção dessas enzimas com níveiselevados de pureza e rendimento.

Quanto à utilização das colagenases,pode-se afirmar que as possibilidades são bas-tante variadas. Uma delas é o debridamentoenzimático de ferimentos, pela capacidadedessas enzimas degradarem o colágeno dostecidos necrosados e facilitarem a cicatriza-ção. Seu uso, com essa finalidade ocorre hábastante tempo e uma das colagenases produ-zidas por C. histolyticum, a clostriopeptidaseA, é também utilizada com esse objetivo(ÖZCAN et al., 2002). Resultados animadoresforam obtidos em um estudo de fase III, utili-zando uma colagenase injetável no tratamentode Contratura de Dupuytren, uma condiçãoque usualmente requer tratamento cirúrgicoe intervenções recorrentes (BADALAMENTE;HURST, 2007).

Muito frequente também é a utilização dascolagenases nas técnicas que envolvem cultu-ras de tecidos e células animais. O uso de

132



colagenases é citado em vários métodos, comono isolamento de células endoteliais de cére-bro, estudos de células tronco, células cardía-cas, da pele, do tecido ocular, tanto em huma-nos quanto em modelos animais diversos (LIet al., 2007; ZORN-PAULY et al., 2004; SUPP,WILSON-LANDY, BOYCE, 2002; WOL-BURG et al., 1994). As colagenases apresen-tam potencial para emprego em outras áreasque não somente a terapêutica e de pesquisa.Seu uso pode ser expandido para o setor ali-mentício, como o beneficiamento de carnes,e até como auxiliar no tingimento de couros(KANTH et al., 2008; BI et al., 2007; KIMet al., 2007).

Com esse amplo campo de utilização,observa-se que a produção dessas enzimaspode ser muito vantajosa. As colagenasesestão classificadas, para fins de exportaçãoe importação, como pertencentes ao grupo“outras proteases e seus concentrados” (No-menclatura Comum do Mercosul, NCM:35079049) (BRASIL, 2009). A tabela 4 apre-senta o peso desse grupo de enzimas na ba-lança comercial brasileira. Esses dados cor-roboram com a crescente importância comer-cial da pesquisa e produção de enzimas nocenário econômico atual.

8 FosfatasesAs fosfatases são hidrolases que agem

sobre compostos de fósforo, podendo hidrolisaruma variedade de ésteres e anidridos do ácidofosfórico e liberar fosfato, além de realizar rea-ções de transfosforilação de fosfoésteres deglicerol, fenol e p-nitrofenol, para vários acep-tores, como por exemplo, glicose e piridoxina.As fosfatases encontram-se em diversas

formas moleculares. De acordo com o pHótimo de atuação podem ser classificadas emfosfa-tases alcalinas (FAL) (EC 3.1.3.1, comatividade em pH superior a 8,0) e fosfatasesácidas (EC 3.1.3.2, com atividade em pHinferior a 6,0).

O grande uso das fosfatases microbianasse dá como insumo em kits de reagentes paraanálises clínicas, principalmente para as técni-cas imunoenzimáticas por ELISA. Os testesimunolólogicos baseados na detecção de antí-genos ou anticorpos podem acoplar enzimas,tais como a fosfatase alcalina a um anticorpoou anti anticorpo, dependendo do ensaio, asquais permitem a detecção da reação antígeno-anticorpo e a interpretação do resultado (AL-MEIDA, 2000).

A enzimocosmética é ainda um novocampo de estudo e visa o emprego de enzimasem produtos cosméticos, dificultando ou facili-tando as reações bioquímicas da pele. Nestesentido, a FAL vem sendo considerada umagente redutor de microrrugas, atuando no estí-mulo à proliferação dos fibroblastos (BON et

al., 2008). Além da sua aplicação na área dediagnóstico e cosmética, as fosfatases vêm des-pertando interesse também no setor agro-pecuário, catalisando a conversão do fósforoda forma orgânica em fósforo solúvel.

O interesse na aplicação biotecnológicade enzimas em ração animal deve-se princi-palmente ao custo das matérias-primas tradicio-nais. Além disso, a utilização de enzimas, comoa fosfatase ácida, capaz de hidrolisar o fitatona ração melhora a digestibilidade e a disponi-bilidade do fósforo pelos animais, reduzindotambém a contaminação ambiental. Além dis-so, a poluição das águas pela lixiviação dofósforo a partir de excretas pode provocar a

Tabela 4 – Dados comerciais do grupo comercial no qual as colagenases se inserem (adaptado de BRASIL, 2009)

"sodartnecnocsuesesesaetorpsartuo"opurgodsiaicremocsodaD

onAseõçatropmI)BOF($SU

seõçatropxE)BOF($SU

odlaS)BOF($SU

8002 315.662.3 104.420.31 888.757.9

)ram-naj(9002 131.000.1 400.921.4 378.821.3



eutrofização, ou seja, o crescimento exacer-bado de matéria orgânica e a consequente mortedos seres vivos daquele ecossistema (ABEL-SON, 1999). Ainda, a pesquisa das enzimasfosfatases e peroxidases, juntamente com aanálise microbiológica do leite é usada na veri-ficação da eficiência da pasteurização.

As atividades fosfatásicas têm sido estu-dadas em bactérias como, por exemplo, Lacto-

bacillus curvatus (MAGBOUL e McSWEE-NEY, 1999) e Mycobacterium tuberculosis

(SALEH; BELISLE, 2000) e em fungos comoAspergillus ficuum (SHIEH et al., 1969),Aspergillus nidulans (HARSANYI; DORN,1972), A. fumigatus (BERNARD et al., 2002).Segundo Tarafdar et al. (2001), A. niger liberaelevada quantidade de fosfatases seguidapelo gênero Penicillium, o qual possui habili-dade para secretar grandes quantidades de fos-fatase ácida.

9 Inibidores EnzimáticosDa mesma forma que o uso de enzimas

é importante, muitas vezes faz-se importantee necessário a inibição específica de algumaenzima. A ação catalítica de uma série de en-zimas pode ser reduzida inespecificamentepor ação de agentes químicos, como sais, oufísicos, tais como variação de pH ou tempe-ratura (LEHNINGER et al., 2002). Porém,com o uso de moléculas adequadas é pos-sível inibir especificamente a ação enzimá-tica, reduzindo seu poder reacional ou mes-mo extinguindo a catálise completamente(LEHNINGER et al., 2002). Esta inibiçãopode ser irreversível ou reversível, sendo estaa forma mais comum de inibição em relaçãoao mecanismo de ação de fármacos.

Inibidores enzimáticos estão entres osprincipais produtos de ação farmacêutica, den-tre os quais destacam-se as classes terapêuti-cas dos redutores de colesterol (inibidores daHMG-CoA redutase), antiulcerantes (inibidoresda secreção ácida estomacal), antidepressivos(inibidor seletivo de recaptação da serotonina),antireumáticos não-esteroidais (AINES), inibi-dores da ECA (enzima conversora da angio-tensina), entre outros (WTN, 2009). Esses

produtos garantem às empresas que detêmsuas patentes, bilhões de dólares anualmente.Somente os quatro fármacos mais rentáveisbaseados em inibição enzimática proporciona-ram um lucro, no ano de 2007, de mais de30 bilhões de dólares (tabela 5; WTN, 2009).

Na inibição irreversível, normalmente,ocorre inativação covalente da enzima. Issodeve-se em grande parte ao ataque de grupa-mentos eletrofílicos, tais como carboxilas,carbonilas, aldeídos, entre outros, presentes noinibidor de grupamentos nucleofílicos situadosna estrutura protéica da enzima, tais comoaqueles presentes em aminoácidos comoserina, cisteína, treonina e tirosina. No caso doácido acetilsalicílico, o ataque parte do grupoacetila e envolve uma serina do sítio ativoda prostaglandina endoperóxido sintetase(PGHS). A descoberta deste mecanismo de açãovaleu a John R. Vane o Prêmio Nobel de Medi-cina em 1982.

São de particular interesse para o ramofarmacêutico os inibidores enzimáticos deproteases ou peptidases. Entre as classes deinteresse na inibição estão as serino-, metalo-,cisteíno- e aspártico-proteases. As serino-prote-ases tem-se particular interesse no combatea problemas inflamatórios como a asma e aartrite reumatóide além da criação de fármacosanticoagulantes que atuem sobre a cascatade coagulação, composta por uma série deproteases (LEUNG et al., 2000). As cisteíno-peptidases agem preferencialmente em meioredutor e em condições de pH moderada-mente ácido, estando envolvidas no crescimen-to, replicação e alimentação de uma série deprotozoários de interesse e na sua interaçãocom o hospedeiro (LECAILLE et al., 2002).Atualmente, são alvos para desenvolvimentode novos protótipos, peptidases de protozoárioscomo Leishmania spp., Trypanosoma cruzi,

Plasmodium falciparum, entre outros. Naclasse das metalo-proteases, já há produtosem amplo consumo pela população como oenalapril e captopril e os inibidores da ECA.A classe das aspártico-proteases apresenta oprimeiro caso de sucesso na construção deinibidores enzimáticos a partir de técnicascomputacionais. Nelfinavir, ritonavir entre

134



outros, foram desenvolvidos a partir do estudoda interação do saquinavir com a enzima alvo,a protease do HIV-1.

Inibidores da monoamino oxidase(IMAO) elevam a concentração de acetilcolinae dopamina no sistema nervoso central, têmboa ação antidepressiva. O uso concomitantede inibidores da ß-lactamase microbiana,como o ácido clavulânico e o tazobactan, afim de aumentar a ação destes medicamentossobre bactérias produtoras de ß-lactamase,representam outros exemplos de inibidoresenzimáticos de importante uso na clínica.

10 Considerações finaisO Brasil vem passando por um período

de plena expansão no setor biotecnológico, emque empresas de inovação estão sendo criadasbuscando competitividade internacional. Alémdisso, o enorme potencial da nossa biodiversi-dade, em que novas espécies de microrganis-mos, animais e plantas estão por serem desco-bertas, poderá trazer melhoria da qualidade devida da sociedade com novas moléculas e,consequentemente, novos produtos. Nesse con-texto, órgãos gestores, sociedade e comunida-de científica devem fortalecer suas relaçõesvisando a maior investimento no desenvolvi-mento de tecnologias a fim de ampliar a produ-ção nacional e a exportação de enzimas.

AgradecimentosOs autores agradecem à CAPES e ao

CNPq o apoio recebido.

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Tabela 5 – Medicamentos baseados em inibidores enzimáticos mais vendidos em 2007 (adaptado de WTN 2009)

oãçisoPon

gniknarocamráF/aserpmE/otudorP açneoD

seõhliBed

seralódotnemicserC

1)amrahPsalletsA/rezifP(rotpiL

)anitatsavrota(loretseloC

odavele7,31$ %1

2)sitnevA-ifonaS/bbiuqSsreyM-lotsirB(xivalP

)lergodipolc(esobmorT 1,8$ %82

5)ebanaTihsibustiM,hguolP-gnirehcS,nosnhoJ&nosnhoJ(edacimeR

)bamixilfni(etirtrA

ediótamuer3,5$ %81

8)sitravoN(naviD

)natraslav(oãsnetrepiH 0,5$ %91



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