125

10. EFICIÊNCIA, DISTRIBUIÇÃO E MECANISMOS FOTOQUÍMICOS DE

CV E MB EM CÉLULAS HELA

Como ficou constatado nos resultados apresentados previamente nesta tese

bem com aqueles descritos na literatura, que CV e MB apresentam características

fotofísicas e fotoquímicas distintas, com exceção do valor elevado da constante de

absortividade molar na região espectral do vermelho que é semelhante para ambos

os compostos. As principais diferenças estão descritas a seguir: CV apresenta alto

rendimento quântico de decaimento não radiativo, perdendo grande parte da energia

de excitação na forma de calor. CV tem constante de dimerização menor que MB.

CV está envolvido em reações fotoquímicas que geram principalmente espécies

radicalares com pequeno rendimento quântico. MB apresenta alto rendimento

quântico de cruzamento inte-sistemas (ΦΤ~0,5), e portanto gera eficientemente

espécies tripletes. Além disso, MB tem alto rendimento quântico de geração de

oxigênio singlete (φ∆~0,5). Em superfícies negativas dependendo da relação

concentração de MB e número de sítios de ligação, MB pode dimerizar, e nesta

situação, as reações fotoquímicas são distintas, culminando principalmente com a

geração de espécies radicalares devido às reações de transferência de elétrons entre

os constituintes do par (veja introdução).

No entanto, estas características presentes em soluções isotrópicas, podem

não ser totalmente relacionadas com a eficiência fotodinâmica no meio celular. A

complexidade das células pode e deve trazer outros fatores a serem considerados.

Desta forma, optamos por fazer uma comparação da eficiência e mecanismo destes

dos fotossensibilizadores em células cancerosas HeLa.

126

10.1 CARACTERIZAÇÃO DA INTERAÇÃO FÍSICA DOS

FOTOSSENSIBILIZADORES COM CÉLULAS

10.1.1 INCORPORAÇÃO DE CV E MB EM CÉLULAS

A relação da taxa de incorporação de CV e MB em células HeLa em função

do tempo foi investigada (Figura 28). Observe que a concentração de ambos os

fotossensibilizadores no meio intracelular é crescente com o tempo e atinge um

máximo após três horas de incubação. Este período de incubação representa o tempo

mínimo necessário para obtenção do máximo de incorporação destes compostos.

Este período foi adotado em todos os outros experimentos envolvendo incubação de

fotossensibilizadores em células.

Na Figura 29 estão apresentadas as taxas de incorporação de CV e MB em

função da concentração de incubação dos fotossensibilizadores. Note que a

porcentagem é de aproximadamente 70% para todas as concentrações testadas de

MB. Valores maiores do que 80% foram observados em células incubadas com CV

em baixas concentrações e ocorre diminuição na incorporação de CV com o

aumento na concentração de CV. O fato da porcentagem de incorporação de CV

diminuir tem relação com a viabilidade celular como será discutida a seguir. Isto

indica que independente da concentração de fotossensibilizador empregada, um

equilíbrio se estabelece quando as células são expostas aos corantes e pelo menos

70% das moléculas de CV e MB incubados permeiam e permanecem nas células.

A alta captação de CV e MB pelas células deve-se ao caráter

lipofílico:hidrofílico favorecer a permeação destas moléculas (Indig 2000). Em

estudos comparativos dentro de uma série de cada um destes compostos observou-se

que MB apresentou taxas de incorporação mais altas que as obtidas para azul de

toluidina e uma cinética de incorporação mais rápida (Cañete 1993). Estudos

semelhantes mostraram que CV possui características estruturais que permitem uma

127

melhor partição em membranas entre os TAM (Indig 2000).

0 100 200 300 400 500 600-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Inco

rpor

ação

, %

Tempo, min

Figura 28: Porcentagem de incubação de CV ( ) e MB ( ) em função do tempo de

incubação. 1,4.106 células/mL, [CV]=10µM; [MB]=10µM

128

BA

5 10 15 20 25 30 35 40 450

10

20

30

40

50

60

70

80

Inco

rpor

ação

, %

[MB] incubado, µM

10 20 30 40 500

20

40

60

80

1 00

Inco

rpor

ação

, %

[ CV] incubado, µM

Figura 29: Porcentagem de incubação de CV (painel A) e MB (painel B) em HeLa em

função da concentração total de fotossensibilizador usada na incubação. Tempo de

incubação = 3h; 1.106 células/mL

Já que há uma alta taxa de incorporação de MB, é preciso verificar se MB

encontra-se na forma livre ou formando agregados dentro da célula. Sabe-se que

MB sofre agregação e que seus agregados são facilmente identificados

espectroscopicamente (Bergmann 1963, Ohline 2001, Lee 1999, Lewis 1943). As

espécies monoméricas e diméricas podem ser observadas na Figura 30. Note que os

espectros são bem distintos, sendo que há duas bandas de absorção. As duas bandas

de absorção são localizadas uma em 600 nm e a outra em 665 nm (Figura 30). Essas

bandas foram atribuídas à absorção de diferentes espécies de MB (Bergmann 1963,

Ohline 2001, Lee 1999, Lewis 1943). Assim, a espécie monomérica tem um máximo

de absorção em torno 665nm e a dimérica em 600nm. O fenômeno observado na

129

Figura 30 ilustra a presença de diferentes espécies de MB dependendo das condições

do meio. Em baixas concentrações de SDS, há uma menor quantidade de micelas e

portanto de sítios de ligação, havendo favorecimento na formação de agregados de

MB. Porém, ao aumentar a concentração de SDS, o número de sítios aumenta e

consequentemente o equilíbrio é deslocado para formação de monômeros, Figura 30.

Assim, utilizou-se desta facilidade experimental e determinou-se o estado de

agregação de MB em células através de espectroscopia de absorção na superfície.

500 600 700

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Abs

orbâ

ncia

comprimento de onda, nm

[SDS]=4mM [SDS]=12mM

Figura 30: Espectros de absorção de MB em micelas normais de dodecil sulfato

de sódio (SDS). [MB]=10µM em ambas curvas.

Mediu-se espectros de absorção na superfície das células plaqueadas em

tampão e após a retirada do mesmo seguido de lavagem. A Figura 31 ilustra

espectros de absorção de MB nas células plaqueadas na presença do tampão (Painel

130

A) e posterior remoção do mesmo (Painel B). Note que os dois espectros são

distintos. As duas bandas de absorção (Figura 31) correspondem às absorções de

monômeros e dímeros de MB. Agregados maiores de MB têm sido também

caracterizados na literatura (Bergmann 1963 e Cione 2000), sendo o máximo de

absorção do trímero e de oligômeros de MB em 575 nm. No entanto não

observamos tais agregados nos nossos experimentos (Figura 31). Note que na placa

em que há meio de incubação e células incubadas com MB, o espectro apresenta

maior proporção de monômeros, Figura 31 painel A. Porém após a retirada do meio

de cultura seguida de lavagem, tem-se o espectro direto das células incubadas com

MB, Figura 31 painel B. Note que nesta situação a proporção de dímeros é muito

maior, Figura 31 painel B. Indicando que nesta concentração MB tende a formar

agregados no interior das células, vide Figura 31 painel B.

450 500 550 600 650 700 750

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Abso

rbân

cia

comprimento de onda, nm500 550 600 650 700 750

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

Abs

orbâ

ncia

comprimento de onda, nm

A B

Figura 31: Espectros de absorbância de superfície de MB em células em tampão (painel A)

e em células lavadas (painel B). Tempo de incubação = 3h; 1,1.106 células/mL;

[MB]=50µM.

131

A Figura 32 mostra a relação D/M para células incubadas com diferentes

concentrações de MB. Note que o aumento da concentração de MB provoca

aumento na relação D/M (Figura 32 A). Para baixas concentrações, MB permanece

no estado monomérico (D/M menor que 0,4). Como esperado, um aumento na

concentração deve provocar aumento na relação D/M já que a taxa de incorporação

de MB é alta (em torno de 70%).

A Figura 32 painel B tem-se a absorção de MB em 690nm em função da

concentração de MB utilizada na incubação. Note que um aumento na concentração

aumenta a absorção em 690nm. Neste comprimento de onda tem-se somente a

absorção do monômero (Junqueira 2002). Isto comprova que há um aumento de

população de MB não agregado com o aumento da concentração total de MB. No

entanto, o aumento de absorção não é linear em concordância com a formação de

agregados de MB.

MB tende a agregar em superfícies negativas incluindo micelas normais,

micelas reversas, vesículas e mitocôndrias (Junqueira 2002, Severino 2003, Gabrielli

2004). A observação que MB agrega no meio intracelular é compatível com a sua

ligação em organelas, especialmente mitocôndrias.

132

BA

0 10 20 30 40 500,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Abso

rção

690n

m

[MB], µM0 10 20 30 40 50

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

D/M

[MB] incubado, µM

Figura 32: Painel A: Relação dímero/monômero de MB em células HeLa em função da

concentração de MB incubado. Painel B: Absorção de MB em 690 nm em função da

concentração de MB incubado em células. Tempo de incubação=3h; 1,1.106 células/mL.

10.1.2 TOXICIDADE DE CV E MB EM CÉLULAS

Para verificar a toxicidade celular na presença de fotossensibilizador e no

escuro, realizou-se experimentos de sobrevivência em função da concentração de

fotossensibilizadores (Figura 33). Verificou-se que ambos CV e MB, quando em

baixas concentrações (até 10µM para CV e 20µM para MB), não são tóxicos às

células. Com o aumento da concentração ocorre diminuição considerável na

viabilidade celular sendo que CV é mais tóxico do que MB. Nos demais

experimentos de viabilidade na presença de luz e citolocalização utilizaram-se

sempre concentrações que não causaram danos às células.

133

0 20 40 60 8045

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105S

obre

vivê

ncia

, %

[fotossensibilizador], µM

MB CV

Figura 33: Porcentagem de sobrevivência celular em função da concentração de

fotossensibilizador incubados em células no escuro. Tempo de incubação=3h;

1.106células/mL.

Dados da literatura mostram que dentre uma série de derivados de

fenotiazinas, MB foi o composto que apresentou menor citotoxicidade no escuro.

Rice e colaboradores confirmaram que 20µM a toxicidade de MB é menor que 10%,

de acordo com os nossos resultados (Rice 2000). Já os corantes TAM apresentam

uma toxicidade mais elevada no escuro comparativamente com as fenotiazinas.

Verificou-se que alguns corantes TAM provocam inibição do complexo III da

mitocôndria e diminuição no potencial transmembranar mitocondrial (Kowaltowski

1999).

Para certificar a metodologia empregada de avaliação da viabilidade celular,

resolveu-se realizar uma curva de crescimento celular após um período de exposição

134

das células à droga na ausência de luz. A Figura 34 apresenta as curvas do número

de células viáveis em função do tempo, sendo que a incubação com MB ocorreu 15

horas após o início da cultura para amostras controle, e expostas a 25 e 100µM de

MB. Note que 50 horas após a incubação com MB, as células que foram expostas a

100µM MB apresentaram crescimento consideravelmente menor do que as demais

condições. Esse dado indica que esta concentração de MB prejudicou o crescimento

das células. Esses resultados estão de acordo com outros dados que mostram que

fenotiazinas podem suprimir proliferação celular em células (Zhelev 2004, Piette

2003).

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

20

40

60

80

100

120

Incubação c/ MB

[MB] em µM: 0 25 100

núm

ero

de c

élul

as (1

05 )/mL

Tempo (h)

Figura 34: Curvas de crescimento de células HeLa controle e incubadas com MB a

diferentes concentrações. Tempo de incubação=3h

Já para o caso das células que estiveram expostas a 25µM MB (Figura 34),

uma pequena diferença em relação ao controle foi observada a partir de 90 horas.

135

Isto demonstra que apesar da exposição ao MB ser uma condição não fisiológica, o

crescimento celular foi pouco alterado em relação ao controle na concentração de

25µM. Estes dados corroboram aqueles obtidos a partir do experimento com MTT

indicando que MB é pouco tóxico a concentrações menores que 20µM e que para

CV a toxicidade é baixa em concentrações menores que 10µM.

A toxicidade de MB no escuro foi reportada anteriormente. Em células de

tumor mamário de camundongo EMT-6, observou-se o mesmo perfil que

encontramos para HeLa, ou seja, 20µM MB provocou baixa toxicidade no escuro

(Wainwright 1997). Outro artigo apresentou a dose letal 50% para MB no escuro em

células fibrosarcoma de camundongo RIF-1, de 150µM (Mellish 2002). Além disso,

devido a baixa toxicidade de MB, foi possível utilizar mais de 300µM de MB sem

causar dano no escuro em células de queratinócitos humano H103 (Zeina 2002). Em

Escherichia coli, tal toxicidade é reversível se o corante for retirado do meio, porém

torna-se irreversível após a iluminação (Menezes 1990). Esses dados corroboram os

dados reportados aqui, ou seja, 20µM de MB não é tóxico para células em cultura no

escuro e portanto esta concentração foi usada nos experimentos desta tese.

Após estudar a toxicidade destas drogas no escuro realizou-se estudos de

fototoxicidade na mesma linhagem celular. As células foram incubadas com CV ou

MB, lavadas e expostas à luz. A taxa de sobrevivência das células HeLa

posteriormente à incubação com CV e seguida de irradiação a laser está apresentada

na Figura 35. Note que houve uma diminuição na taxa de sobrevivência ao aumentar

a concentração de CV em ambas as curvas de células expostas ou não à irradiação.

Note que acima de 10µM de CV células irradiadas apresentam taxa de sobrevida

constante e menor que 20%. A maior diferença entre a viabilidade no claro e no

escuro ocorre na concentração de 10µM (viabilidade no claro é 20% e no escuro

95%). Vale notar que 10µM as células absorvem praticamente 90% do CV com as

quais foram incubadas, veja Figura 29.

A Figura 36 apresenta a taxa de sobrevivência celular na presença do MB e

136

de luz. Note que nas células irradiadas observa-se grande decréscimo na taxa de

sobrevivência com o aumento da concentração de MB até 20µM (taxa de

sobrevivência é 13%). Acima desta concentração, a taxa de sobrevivência aproxima

do valor zero de sobrevivência. A viabilidade celular no escuro permaneceu acima

de 80% em toda a faixa de concentração de MB testada. Ou seja, MB nas

concentrações estudadas causou dano celular principalmente após sofrer excitação

luminosa.

Ajustando os pontos experimentais iniciais de porcentagem de sobrevivência

em função da concentração de MB e CV numa função linear é possível obter uma

relação comparativa da taxa de sobrevivência das células que sofreram ou não

irradiação (veja Tabela XII para MB e Tabela XIII para CV).

0 10 20 30 40 50

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

( )

( )

Sob

revi

vênc

ia, %

[CV], µM

células não iluminadas células iluminadas

Figura 35: Porcentagem de sobrevivência celular em função da concentração de CV,

amostras: células expostas a luz de laser 532nm ( ) e no escuro( ). Tempo de

incubação=3h; 1.106células/mL; dose de luz=1,68J/cm

137

0 20 40 60 80

0

20

40

60

80

100

células não irradiadas células irradiadas

Sob

revi

vênc

ia, %

[MB], µM

( )

( )

Figura 36: Porcentagem de sobrevivência celular em função da concentração de MB,

amostras: células expostas a laser 665nm ( ) e no escuro ( ). Tempo de incubação=3h;

1.106células/mL; dose de luz = 1,73J/cm2.

Tabela XII: Coeficiente angular das curvas para células não irradiadas e irradiadas

da Figura 36 definido até 20µM de MB

Coeficiente angular

Curva células não irradiadas -0,21

Curva células irradiadas -4,38

138

Tabela XIII: Coeficiente angular das curvas para células não irradiadas e irradiadas

da Figura 35 definido até 10µM de CV

Coeficiente angular

Curva células não irradiadas -0,7

Curva células irradiadas -7,77

Note que a relação no valor de coeficiente angular das curvas (controle e

células irradiadas) é de aproximadamente vinte vezes para MB e de onze vezes para

CV, ou seja, as células irradiadas morreram numa taxa vinte vezes maior do que as

não irradiadas para MB e de onze vezes maior para células irradiadas com CV.

Para verificar se isto ocorre devido a diferença de absorção de luz nos

comprimentos de onda utilizados na excitação, determinou-se a absorção de luz no

comprimento de onda de excitação nas células. Os resultados encontram-se na

Tabela XIV.

Tabela XIV: Absorção de luz das drogas incubadas em células em comprimentos de

onda utilizados na irradiação

ελ x [droga] x % incorporação Absorção de luz (D.O.)

CV: 58638 532nm x 20 µM x 80% ~1

MB: 81600 665nm x 20 µM x 70% ~1

Note que ambas as drogas utilizadas apresentam absorção de luz

aproximadamente igual a 1 (D.O.) nos respectivos comprimentos de onda de

excitação. Isso significa que as populações de CV e de MB que absorveram fótons e

atingiram o estado excitado singlete foram similares. Ou seja, não há uma diferença

139

de absorção de luz e, portanto, a diferença na eficiência fotodinâmica é devido às

propriedades fotoquímicas de cada fotossensibilizador no ambiente celular.

Essas diferenças encontradas revelam que a fotoquímica seguida por cada

uma dessas drogas deve ser distinta. Dados reportados mostraram que a geração de

oxigênio singlete via excitação de CV incubado em células é baixa (em torno de

1%). No caso de MB, o rendimento quântico de geração de oxigênio singlete via

excitação de MB é grande (19% em células). Porém ambos causam morte celular

com eficiência (veja a seguir).

10.2 MECANISMO DE MORTE CELULAR NA PRESENÇA DE MB E CV

Freqüentemente o ponto final da apoptose é a separação da dupla fita de DNA

em regiões definidas entre os nucleossomos. Os fragmentos de DNA podem ser

observados no histograma de DNA como um pico subdiplóide ou também chamado

de pico sub-G1. Através da fluorescência do iodeto de propídio, que liga-se ao

DNA, é possível determinar o conteúdo de DNA na fase sub-G1. Esta fase indica a

presença de fragmentos de DNA, os quais são característicos de apoptose.

O gráfico de histograma do número de eventos (sinais de fluorescência acima

do ruído, ou seja células marcadas) em função do conteúdo de DNA de cada evento

(a ligação do IP é proporcional ao conteúdo de DNA) para células HeLa controle

(painel A), células irradiadas ausentes de fotossensibilizador (painel B), células

incubadas com MB e não irradiadas (painel C) e células incubadas com MB e

irradiadas (painel D) estão apresentados na Figura 37.

Note na Figura 37, células nas fases G0, G1, S, G2 e M. Nas fases G0/G1 e

G2/M não há aumento do conteúdo de DNA, por isso observa-se picos. O pico

G2/M apresenta maior intensidade de fluorescência de IP devido ao conteúdo de

DNA nestas fases ser o dobro daquele em G0/G1. A fase no histograma entre G0/G1

e G2/M representa células contendo quantidades intermediárias de DNA,

140

correspondendo, portanto, células que estão em processo de síntese de DNA, logo

fase S. Em condições ideais, o histograma apresentaria picos agudos para as fases

G0/G1 e G2/M. Porém, devido à inexatidão da medida de DNA, os picos são

alargados, veja Figura 37.

Veja também os valores de M1 na Figura 37. Este dado representa a região do

histograma que corresponde a células com núcleo sub-diplóide, os quais são típicos

de apoptose. O valor obtido para M1 é expresso em porcentagem de células com

núcleo sub-diplóide em relação à quantidade de célula total. Note que os valores de

M1 são baixos para as amostras ausentes de MB, Figura 37. Os valores de M1 em

até 6% indicam quantidade de núcleos sub-diplóides não significativamente alta para

inferir presença de apoptose. Isto indica que a dose de luz sozinha não causou dano

nestas células.

141

Figura 37: Fluorescência de DNA marcado com IP em células controle (painel A),

irradiadas (painel B), em células incubadas com 20µM MB não irradiadas (painel D) e em

células incubadas com 20µM MB irradiadas (painel D) após 14 da irradiação. Os picos G0,

G1, G2, S e M estão indicados na Figura. MI é a porcentagem de células com núcleo sub-

diplóides. M1=marca 1, região anterior ao pico de G1.

M1=4,1 M1=5,6

M1=39,2 M1=4,3

A B

C D

142

A Figura 37 painel C mostra DNA marcado com IP para células

administradas com MB não irradiadas. Note que o valor de M1 é aproximadamente

o mesmo obtido para células controle (painéis A e B) assim 20µM de MB no escuro

não causou dano às células. No entanto para células incubadas com MB na mesma

concentração seguidas de irradiação o valor do M1 é de 39% (painel D). A Figura 38

ilustra a porcentagem de apoptose em função da concentração de MB 14 e 36 horas

após a irradiação. Note que porcentagem M1 é maior nas amostras de 36 horas. A

apoptose é um processo lento pois requer tempo para que as alterações celulares

ocorram, sugerindo novamente a indução de apoptose em células tratadas com MB e

irradiadas.

Embora estes dados sugiram a presença de apoptose é ainda necessário um

estudo detalhado com outros marcadores para confirmar a indução de apoptose. De

maneira semelhante ao observado para MB, dados da literatura mostram que

corantes da classe triarilmetanos induzem apoptose em células após a incidência de

luz. Análise de citometria de fluxo mostraram sub-núcleos após a ação fotodinâmica

do corante azul vitória sobre células leucêmicas isoladas da medula de pacientes

com leucemia (Fiedorowicz 1997, Morgan 2000).

143

5 10 15 200

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Por

cent

agem

de

apop

tose

[MB], µM

14h 36h

Figura 38: Porcentagem de células HeLa apoptóticas em função da concentração de MB

para períodos de 14 ou 36 horas após irradiação.

10.3 GERAÇÃO DE ESPÉCIES EXCITADAS APÓS EXCITAÇÃO DOS

FOTOSSENSIBILIZADORES CV E MB EM CÉLULAS.

Como já comentado, realizou-se o estudo sobre a fotofísica e a fotoquímica

do CV em sistemas micelares (Oliveira et. al. 2006). Esses sistemas representam

modelos simplificados das membranas biológicas, o que tornou possível caracterizar

reações complexas deste corante no estado excitado. Observou-se tanto a geração de

radicais quanto de oxigênio singlete com rendimentos quânticos pequenos (~1%).

Muitos trabalhos da literatura estimam a produção de oxigênio singlete em

células de maneira indireta através da fotooxidação de sondas que reagem com o

oxigênio singlete (Wainwright 1997, Wagner 1998, Petrat 2003, Mellish 2002). As

medidas indiretas trazem artefatos devido a inespecificidade das reações de ROS e

144

oxigênio singlete frente a estes compostos. Para evitar estes problemas, optamos por

um método bastante sensível e que pode determinar diretamente a presença de

oxigênio singlete através de medidas de intensidade de emissão no infra-vermelho

próximo (1270nm). A emissão em 1270nm corresponde ao comprimento de onda de

máxima emissão de oxigênio singlete (Browne 1964).

A Figura 39 a emissão de oxigênio singlete em função do comprimento de

onda em células incubadas com CV na ausência e na presença de azida bem como

no branco. Note que em todas as curvas há uma variação de linha base que não deve

ser confundida com a emissão de oxigênio singlete. No caso das células incubadas

com água deuterada sem CV, a curva é idêntica àquela observada para água

deuterada pura indicando, como esperado, que não há emissão de oxigênio singlete.

No caso de células incubadas com CV há um pequeno aumento na emissão na região

de 1270nm que diminui na presença de azida. Embora este resultado seja

reprodutível, é difícil afirmar que realmente há emissão de oxigênio singlete nas

células tratadas com CV e não é possível quantificar esta emissão. Compare este

resultado com aquele observado em micelas (Figura 23 painel B). Pode-se, no

entanto, afirmar que a geração de oxigênio singlete nas células é muito pequena.

Na tentativa de quantificar esta emissão obteve-se o transiente de emissão em

1270nm em função da concentração de CV. A Figura 40 painel A ilustra a

intensidade de emissão de oxigênio singlete para células HeLa incubadas com CV.

Note que as diversas concentrações de CV empregadas não causaram diferenças na

intensidade de emissão de oxigênio singlete. Os dados deste experimento em

triplicata estão apresentados na Figura 40 painel B. A concentração de CV igual a

zero, representa células sob as mesmas condições experimentais das demais porém

ausentes de droga. Observe que a intensidade de emissão de oxigênio singlete é nula

nesta condição. Com o aumento na concentração de CV de 5 a 25µM, há um

aumento da intensidade de emissão com máximo em torno de 10µM. Novamente,

este resultado indica que oxigênio singlete é gerado mas em pequenas quantidades

que outras rotas reacionais sejam preferenciais para CV após sofrer excitação, como

145

já hipotetizado anteriormente (Baptista 1998).

Figura 39: Emissão do oxigênio singlete em função do comprimento de onda em células

HeLa incubadas com CV na presença e na ausência de azida. Tempo de incubação com

fotossensibilizador=3h, Tempo de incubação com azida=2h, 1.106 células/mL,

[azida]=10mM.

1100 1150 1200 1250 1300

200

400

600

Emis

são

λ, nm

D2O (branco semcélulas) D2O (branco com células)

[CV]=10µM: controle (CV em células) azida (CV em células acrescidas de azida)

1270

146

0 5 10 15 20 25

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Inte

nsid

ade

emis

säo

de 1 O

2, u.a

.

[CV], µM

100 200 300 400 500

0

40

80

120

Inte

nsid

ade

do s

inal

de 1

O2, u

.a.

Tempo, µs

[CV] em µM: 5 10 20 25

branco

A B

Figura 40: Painel A: Transientes de emissão de oxigênio singlete em suspensão de células

HeLa incubadas com CV a diferentes concentrações. Painel B: Intensidade de emissão de

oxigênio singlete presente em células incubadas com CV a diferentes concentrações.

Tempo de incubação = 3h; 1.106 células/mL.

O mecanismo de formação de oxigênio singlete após excitação da molécula

de MB tem sido estudado pelo nosso grupo de pesquisa (Severino 2003, Junqueira

2002). Esta molécula ao ser excitada forma MB no estado singlete o qual sofre

cruzamento inter-sistemas, gerando MB no estado triplete, o qual reage com

oxigênio, gerando oxigênio singlete. O rendimento quântico de formação de

oxigênio singlete por este processo é grande, φ∆=0,5 (Tanielian 1995).

A Figura 41 painel A apresenta a emissão em função do comprimento de

onda na região do infra-vermelho próximo em células pré-incubadas com MB após

excitação luminosa com laser. Note que há um máximo de emissão em 1270nm.

Esse espectro é característico do oxigênio singlete, comprovando, portanto, a

147

presença de oxigênio singlete nas células incubados com MB e irradiados.

-- 5 -- 10 -- 20 -- 50 --

100

1000

Inte

nsid

ade

de e

mis

são

de 1 O

2, u.a

.

[MB], µM1200 1250 1300 1350

500

1000

1500

2000

Em

issã

o

λ, nm

branco[MB]=20µM:

controle azida

A B

Figura 41: Painel A: Emissão do 1O2 em função do comprimento de onda em suspensão de

células HeLa; amostras: branco: ausência de droga, controle: pré-incubação com MB,

azida: pré-incubação com MB e posterior adição de azida. Painel B: Intensidade de emissão

de oxigênio singlete presente em células incubadas com MB a concentrações crescentes.

Tempo de incubação com MB=3h, Tempo de incubação com azida=2h, 1.106 células/mL,

[azida]=10mM.

Um outro controle que foi realizado é medir a emissão na presença de um

conhecido supressor de oxigênio singlete. A azida é um supressor de oxigênio

singlete e atravessa membranas (Ibuki 2002, Pecci 1999, Ding 2004, Melnikova

1999). Muitos trabalhos na literatura utilizam azida para certificar da presença de

oxigênio singlete (Ibuki 2002, Ding 2004, Melnikova 1999). Assim, utilizamos

azida em células pré-incubadas com fotossensibilizador. Note que na presença de

azida houve diminuição da emissão do oxigênio singlete (Figura 41 painel A),

148

comprovando a geração de oxigênio singlete.

Para se certificar que o oxigênio singlete é gerado realmente no interior

celular, realizou-se experimentos de supressão de tripletes. Sabe-se que MB tem seu

estado triplete suprimido por ascorbato (Harmatz 1983). Ascorbato apesar da sua

hidrofilicidade atravessa membranas e pode se encontrar no ambiente celular, porém

a permeação é lenta, sendo necessários de 24 a 72 horas de incubação (Lee 2004,

Peterszegi 2002, Mazzorana 1993). Assim, em períodos curtos de incubação,

ascorbato encontra-se no ambiente extracelular. Utilizou-se, portanto, ascorbato para

avaliar se a geração de oxigênio singlete foi gerado intracelular. A Figura 42

apresenta os transientes de emissão em 1270nm obtido com MB em água deuterada

e em células. Note que em solução, o sinal de emissão de oxigênio singlete é

drasticamente reduzido na presença do ascorbato, Figura 42. Isto indica que

ascorbato suprime o triplete do MB, o que está de acordo com os dados anteriores

(Harmatz 1983). Como a velocidade de supressão do triplete de MB na presença de

ascorbato é grande, a reação do triplete de MB com oxigênio molecular é

desfavorecida, impedindo, portanto, a formação de oxigênio singlete, Figura 42.

A Figura 42 também apresenta o sinal dos transientes de emissão de oxigênio

singlete observado nas células incubadas com MB na presença e na ausência de

ascorbato. Note que a intensidade de emissão de oxigênio singlete permanece

constante para ambos os casos. Aumentou-se a concentração de ascorbato na

amostra (de 100 para 300µM) para certificar-se de que há supressor em quantidade

suficiente ou até em excesso para proporcionar supressão (concentrações menores de

ascorbato também foram testadas). Aumentou-se também o tempo de incubação do

ascorbato após a pré-incubação com a droga de 30 minutos para 2 horas e não

observou-se diferença no perfil do sinal. Este dado mostra que as moléculas de MB

que estão gerando oxigênio singlete estão presentes no interior das células e

consequentemente a geração de oxigênio singlete é intracelular. Dados recentes

mostram que oxigênio singlete em células, pode até mesmo atravessar a membrana

citoplasmática e se encontrar no meio exterior (Skovsen 2005).

149

50 100 150 2000

2000

4000

6000[MB]=10µM:

MB MB + 100µM ascorbato células controle células + 300µM ascorbato

Inte

nsid

ade

de e

mis

são

1270

nm

Tempo, µs

Figura 42: Transientes de emissão de 1O 2. Amostras: MB em D2O ( ........ ), MB na presença

de ascobarto ( ____ ), células pré-incubadas com MB (controle) ( _ . _ . _ . _ ), células pré-

incubadas com MB acrescidas de ascorbato ( -- ° -- ° -- ). Tempo de incubação com MB=3h,

tempo de incubação com ascorbato=30minutos ; 1.106 células/mL; [MB]=10µM.

Verificou-se também o efeito da concentração de MB sobre a geração de

oxigênio singlete (Figura 41 painel B). Observe que com o aumento da concentração

de MB há um aumento na intensidade de emissão de oxigênio singlete. A quantidade

absoluta de MB incorporada por célula é tanto maior quanto maior a concentração

de MB incubada, por isso a porcentagem de incorporação é constante veja Figura

29. Assim, a amostra com maior concentração absoluta de MB intracelular ao ser

excitada gera uma maior população de MB no estado excitado e portanto reage com

um número maior de moléculas de oxigênio molecular, resultando numa maior

150

produção de oxigênio singlete, (Figura 41 painel B).

Uma vez caracterizada a presença de oxigênio singlete diretamente nas

células, a determinação da eficiência de geração de oxigênio singlete (η∆) é um dado

fundamental para compararmos a fotoatividade de CV com MB no meio

intracelular.

A Figura 43 apresenta os decaimentos de oxigênio singlete obtidos em células

incubadas com CV ou MB e em solução etanólica de MB. O φ∆ em solução

etanólica de MB é 0,5 (Tanielian 1995). Estimou-se o η∆ em células, veja Tabela

XV.

Tabela XV: Eficiência de geração de oxigênio singlete em diferentes meios:

Meios [droga] em µM η∆ (a)

CV em HeLa [CV]=20 0,008

MB em HeLa [MB]=20 0,185

MB em etanol [MB]=20 0,500(b)

MB em HeLa [MB]=50 0,130

(a) Os valores são obtidos comparando-se dados experimentais com o valor do Φ∆ em

solução etanólica de MB, que estão descritos na literatura (Baptista 1998, Tanielian

1995). O termo eficiência de geração de oxigênio singlete (η∆) foi utilizado por não

ter sido considerado o espalhamento das células na solução para o cálculo e

portanto não se trata de um rendimento quântico (φ∆).

(b) Tanielian 1995

Estes dados revelam inicialmente que o η∆ em células incubadas com MB é

maior do que o obtido para células com CV, sendo que o mesmo comportamento é

observado em solução isotrópica e em sistemas microheterogêneos. O valor de η∆

obtido para CV é extremamente pequeno, comparável com o φ∆ obtido em micelas

reversas (0,01, Figura 43). Este valor pequeno de η∆ pode ser explicado pelo fato de

estar envolvido em várias reações no estado excitado nas quais há formação de

151

radicais livres, entre eles o CV•, CV2+•, O2-• entre outros intermediários (Bhasikuttan

2002, Bhasikuttan 1995, Indig 2000, Li 1999).

0 100 200 300 400 500

1

10

100

1000

10000

Inte

nsid

ade

do s

inal

de

1 O2, u

.a.

Tempo, µs

MB em etanol

100 200 300

10

100

1000

Inte

nsid

ade

do s

inal

de

1 O2,

u.a.

Tempo, µs

MB em células

100 200 300 400

10

100

Inte

nsid

ade

do s

inal

de

1 O2, u

.a.

Tempo, µs

CV em células

Figura 43: Transientes de emissão de 1O2 em solução etanólica de MB e em suspensão de

células incubadas com CV ou MB. [droga]=20µM, Tempo de incubação=3h,

1.106células/mL (As setas indicam os valores de intensidade de emissão utilizados para

determinação dos valores de ν∆ ou φ∆).

No caso de MB, os valores de η∆ em células (0,10 a 0,20) são menores do que

152

aqueles observados em solução isotrópica (0,5). No entanto, são valores de

η∆ consideráveis indicando que oxigênio singlete deve ter papel fundamental na

fotoquímica de MB em meios celulares.

Os estudos da fotoquímica de MB em meios micelares e vesículas realizados

pelo nosso grupo revelaram que esta droga apresenta fotoquímica diferenciada

conforme o seu estado de agregação (Junqueira 2002 e Severino 2003). Na forma

monomérica, MB triplete reage com oxigênio molecular formando oxigênio

singlete, sendo esta a principal rota de desativação. Porém quando MB forma

dímeros, as reações de transferência de elétrons são favorecidas, formando espécies

semi-reduzidas ou semi-oxidadas. Assim, a formação de oxigênio singlete nesta

situação é menor. Os dados realizados com células corroboram com os obtidos em

meios miméticos (Tabelas X e XV). Ao se aumentar a concentração de MB, há uma

redução de 30% no valor de η∆ (0,185 comparado com 0,130). Isto se deve,

provavelmente, ao estado de agregação de MB. Em baixas concentrações, MB está

preponderantemente na forma de monômeros em células (Figura 32, D/M igual a

0,6), a formação de oxigênio singlete nesta situação é favorecida, Tabela XV. Na

concentração de MB igual a 50µM a relação D/M é de aproximadamente 0,9 (Figura

32). Ou seja, os dímeros presentes nesta situação reagiram por transferência de

elétrons, o que provoca uma diminuição no valor de η∆, Tabela XV.

10.4 MECANISMO FOTOQUÍMICO DOS FOTOSSENSIBILIZADORES CV E

MB EM CÉLULAS

Os dados de sobrevivência celular após excitação eletrônica indicam que há

formação de espécies excitadas capazes de culminar com a morte celular.

Identificou-se que MB após excitação eletrônica favorece a geração de oxigênio

singlete (Figuras 41 e 42). A estimativa do η∆ é de 20% em células incubadas com

MB, vide Tabela XV. Neste caso grande parte da energia de excitação está sendo

153

convertida para formação de oxigênio singlete. Portanto, tem-se favorecimento do

mecanismo tipo II. Com o aumento da concentração de MB ocorre o aumento da

concentração de dímeros diminuindo η∆ para em torno de 10%.

Estudos realizados por nós em micelas reversas e dados da literatura indicam

que CV, quando ligado em sítios que impeçam o movimento dos seus anéis

aromáticos e após excitação eletrônica, desencadeia principalmente reações de

geração de radicais livres (Oliveira 2005, Naguib 1986, Li 1999, Kitagawa 1999,

Reszka 1986) embora oxigênio singlete tenha sido detectado em micelas reversas.

Os radicais observados nos sistemas estudados foram principalmente CV· e CV2+·. Além disso, observou-se que estes radicais reagem com oxigênio molecular

proporcionando formação de O2-· e OH· (Naguib 1986, Li 1999, Kitagawa 1999,

Reszka 1986). Estes compostos são extremamente tóxicos e podem culminar com a

morte celular.

As Figuras 39 e 40 mostram que CV após excitação proporciona uma discreta

formação de oxigênio singlete em células. A Figura 35 mostra que CV após

excitação eletrônica proporciona morte celular eficientemente. Uma vez que CV não

é uma eficiente droga geradora de oxigênio singlete, é possível que a morte celular

observada ocorreu devido à presença de radicais livres. Assim, provavelmente a

morte celular observada anteriormente (Figura 35) deve-se à formação destes

radicais. Com os dados apresentados em células e os obtidos em micelas reversas e

com a literatura é possível inferir que CV atua pelo mecanismo tipo I. No entanto,

embora CV possa gerar outras espécies reativas o rendimento total deve ser ainda

pequeno quando comparado com MB pois grande parte da energia de excitação

luminosa é perdida na forma de calor (decaimento não radiativo). Uma possível

razão para explicar o fato de que a atividade fotodinâmica do CV ser próxima da

observada para MB (Figuras 35 e 36) pode estar relacionada com os padrões de

citolocalização. Diferentes mecanismos de resposta celular podem ser acionados

dependendo da localização da droga e da sua ação intracelular. Como por exemplo,

resposta celular apoptótica pode estar relacionada com a fotoação de drogas que

154

localizam em mitocôndrias e lisossomos (Plaetzer 2005, Barge 2004, Lemasters

2005, Kessel 1997, Lam 2001).

10.5 LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DE CV E MB EM CÉLULAS HELA

Microscopia ótica e eletrônica têm se tornado ferramentas importantes para o

estudo do efeito de PDT sobre o ambiente celular. Por exemplo, tem sido possível

identificar a localização de fotossensibilizadores em células com o uso da

microscopia confocal (Gorman 2004, Kapsokalyvas 2005). A verificação de células

sadias (anteriormente) e danificadas (posteriormente) à aplicação de hematoporfirina

e luz foi verificada por microscopia de contraste de fase (Waki 2005). Com o uso da

microscopia eletrônica de transmissão identificou-se em detalhe dano em

mitocôndrias e núcleos de neurônios após PDT (Uzdensky 2002).

Neste trabalho, utilizou-se a técnica microscopia de fluorescência para

identificar a localização subcelular dos fotossensibilizadores CV e MB em células

HeLa.

A Figura 44 apresenta a imagem de uma célula incubada com R123

(marcador de mitocôndrias veja Materiais e Métodos). Veja que há diversas

marcações as quais correspondem às mitocôndrias da célula HeLa. Para investigar se

a localização de CV é mitocondrial, células HeLa foram incubadas com R123 e com

CV. A Figura 45 apresenta as imagens da fluorescência dos corantes na mesma

célula separadamente (painéis A e B) e a sobreposição das imagens destes mesmos

corantes obtida (painel C). Note que a fluorescência de CV delineia regiões

específicas na célula semelhantes às obtidas por R123. A imagem de sobreposição

apresenta a colocalização da imagem obtida de CV com a de R123. Note que a cor

da imagem obtida é amarela, indicando a colocalização perfeita das imagens de CV

com a de R123, Figura 45 painel C. A análise da colocalização das áreas integradas

da imagem de R123 e da imagem de CV (veja Materiais de Métodos) apresenta

155

valor igual a 0,99. Este valor indica que 99% da área delineada por R123 coincide

com a obtida por CV, ou seja, CV apresenta a mesma citolocalização que R123.

Portanto, CV encontra-se preferencialmente em mitocôndrias.

Figura 44: Micrografia de célula incubada com R123. [R123]=200nM.

Para confirmar este padrão de localização subcelular, células foram pré-

incubadas com R123 e posteriormente à obtenção de imagens com este marcador, as

células foram expostas à uma solução tampão de CV e imagens de fluorescência

foram obtidas em função do tempo (Figura 46). Note que as mitocôndrias foram

devidamente marcadas por R123 na ausência de CV. Quando CV foi introduzido à

amostra, as células captaram este corante e a fluorescência do mesmo foi observada,

sendo que a intensidade da fluorescência de CV aumentou em função do tempo.

Com tempo de exposição igual a seis minutos é possível observar a captura de CV

pela célula. Note também que a imagem de CV obtida é semelhante à obtida por

R123, indicando a citolocalização mitocondrial de CV nesta célula.

Após um certo período de exposição a CV (cerca de 6 minutos), nota-se que a

fluorescência de R123 torna-se difusa (Figura 46). Como a concentração de CV

156

utilizada neste experimento ([CV]=500nM) foi mais alta que a do experimento

descrito na Figura 45 ([CV]=100nM), ocorreu uma mais alta incorporação de CV.

Esta alta incorporação de CV provocou um desbalanceio da diferença de potencial

mitocondrial pois trata-se de cargas positivas que são captadas para matriz

mitocondrial diminuindo o potencial mitocondrial. R123 que é atraído somente pelo

potencial mitocondrial, tem a sua distribuição difusa na sua ausência ou redução do

potencial mitocondrial.

Figura 45: Micrografias de célula incubada com R123 e CV. Painel A: CV e painel

B: R123. Painel C: Sobreposição das imagens obtidas por R123 e por CV.

[CV]=100nM e [R123]=100nM

A B

C

157

Somente R123

0

CV adicionado à amostra:

2 min

4 min

6 min

10 min

20 min

Figura 46: Micrografias de célula incubada com R123 e posteriormente com CV em função

do tempo. Imagens em verde: R123, imagens em vermelho: CV. [CV]=500nM e

[R123]=100nM.

158

Para confirmar estes dados, utilizou-se o desacoplador valinomicina. A

valinomicina é um antibiótico carreador dos íons K+. Esta molécula é cíclica e

dispõe de seis átomos de oxigênio em volta do centro da molécula. Os átomos de

oxigênio quelam o K+. A periferia da molécula é hidrocarbonada (grupos metila e

isopropila) que torna o complexo íon-carreador solúvel no interior da bicamada

lipídica, permitindo portanto o transporte do íon através da membrana. Além disso,

o centro de coordenação encaixa perfeitamente o íon K+ que é grande (r=1,33Å) e

não Na+ que é pequeno (r=0,95Å). Assim, esta molécula não transporta íons Na+

(entre outros íons com raios pequenos), o que a torna praticamente específica para

K+. Na presença de valinomicina a distribuição de K+ segue de acordo com a

equação de Nernst (Nelson 2002, Voet 1995, Nicholls 1982).

As células foram então incubadas com o marcador R123 ou com CV e

posteriormente adicionou-se a valinomicina, os resultados encontram-se na Figura

47. Note que a fluorescência de R123 torna-se difusa após a adição de valinomicina

em função do tempo. Como valinomicina reduz a diferença de potencial

eletroquímico mitocondrial, R123 não sofre atração para este sítio e portanto

difunde-se para o citoplasma apresentando uma fluorescência espalhada por toda a

célula, Figura 47. A fluorescência de CV também encontra-se espalhada pelo

citoplasma, porém de uma maneira mais discreta que a observada para R123, Figura

47. Note que o grau de espalhamento para R123 é maior que o obtido para CV, vide

Figura 47. Isto indica que a atração de CV pela mitocôndria foi reduzida ao alterar-

se a diferença de potencial mitocondrial, porém parte do CV encontra-se ainda

ligado à mitocôndria. Ou seja, a força atrativa de ligação de CV em mitocôndrias é a

diferença de potencial mitocondrial, contudo uma vez neste sítio, há outras

características estruturais que garantem a permanência de uma parte significativa de

CV em mitocôndrias, mesmo após a alteração no potencial.

A baixas concentrações de CV observou-se que o mesmo encontra-se em

mitocôndrias. Porém, evidências experimentais de CV em células mostraram que o

efeito fotodinâmico é mais efetivo em concentrações mais elevadas de CV. Assim,

159

para observar o efeito da concentração de CV sobre a sua citolocalização, um estudo

com diversos marcadores foi realizado.

500nM de valinomi- cina

R123 200nM:

CV 200nM:

500nM valinomicina

Figura 47: Micrografias de células

incubada com R123 ou com CV

acrescidas de valinomicina conforme

indicado. Imagens em verde: R123,

imagens em vermelho: CV.

[CV]=200nM e [R123]=200nM.

160

A Figura 48 apresenta imagens obtidas com a incubação do marcador bodipy

TR-C5 e com CV (painéis A e B). O bodipy TR-C5 é um marcador para complexo

de golgi. Note que ambos apresentam imagens delineando locais específicos na

célula e que não coincidem entre si, Figura 48. A sobreposição das imagens está

apresentada na Figura 48 painel C. Note que as imagens não colocalizam. A

concentração de CV utilizada foi relativamente alta ([CV]=300nM) e mesmo nesta

situação não houve incorporação de CV pelo complexo de golgi. Isto indica que CV

não se localiza no complexo de golgi.

Utilizou-se também o marcador para núcleo H33342 (Kessel 1998). Imagens

somente com o marcador foram obtidas (Figura 49 painéis A e B). Note que o

H33342 definiu a região do núcleo das células (Figura 49 painel B). Posteriormente,

células foram incubadas com o marcador H33342 e com CV. A Figura 49 (painéis C

e D) apresenta as imagens obtidas para incorporação de CV e de H33342 em células.

Note que as imagens obtidas para estes corantes são bem distintas. O que indica que

CV não localiza em núcleos celulares.

Além desses marcadores, utilizou-se também o marcador para lisossomos

Lysotracker. A Figura 50 mostra as imagens de CV (painéis B, C, E e F) e de

Lysotracker (painéis A, C, D e F) em células. Note que o perfil de localização destes

corantes é bem distinto. Medidas da porcentagem de sobreposição das áreas

integradas das imagens de fluorescência dos dois corantes revelam que não há

colocalização, ou seja, CV não se localiza em lisossomos, veja Figura 50.

Experimentos de identificação da localização de CV no ambiente celular

foram realizados com concentrações de até 10µM de CV. No entanto, não foram

observadas mudanças significativas no perfil de localização de CV. Portanto CV

mesmo a altas concentrações apresenta como principal foco intracelular as

mitocôndrias. É importante ressaltar que CV não localiza em núcleos mesmo à altas

concentrações, isto é uma característica vantajosa desta droga, pois não apresenta

ligação ao DNA e consequentemente evita o efeito colateral de mutagenicidade.

161

Figura 48: Micrografias de células incubadas com CV e Bodipy TR-C5. Painel A: CV e

painel B: Bodipy TR-C5. Sobreposição das imagens obtidas por CV e Bodipy (painel C), a

cor de Bodipy foi alterada para cinza para facilitar a visualização com o vermelho.

[CV]=300nM, [bodipy]=1µM.

A

C

B

162

Figura 49: Micrografias de células incubadas com H33342 (painéis de A a D) e com CV

(painéis C e D). Sobreposição de imagens (painéis B e D). [CV]=300nM e

[H33342]=300nM.

A B

D C

163

Figura 50: Micrografias de células incubadas com Lysotracker e CV. Lysotracker: painéis

A, C, D e F. CV: painéis B, C, E e F. [CV]=500nM e [Lysotracker]=100nM.

Alguns estudos sobre a citolocalização de MB em células já foram realizados

(Mellish 2002, Rück 1992, Stockert 1996). Verificou-se que MB está presente em

lisossomos (Mellish 2002, Rück 1992) ou em microtúbulos (Stockert 1996). Porém

estes experimentos foram realizados em altas concentrações de MB ([MB]= 5 a

55µM) (Mellish 2002, Rück 1992). Como os dados são conflitantes e como a

localização de MB depende do tipo de célula (Rice 2000), resolveu-se identificar o

alvo primário da localização de MB em células HeLa, ou seja, a citolocalização a

baixas concentrações.

Para verificar se MB possui localização lisossomal a baixas concentrações,

células foram incubadas com MB a 300nM e com o marcador para lisossomos

A

D E F

C B

164

Lysotracker. A Figura 51 apresenta as imagens obtidas para Lysotracker (painel A),

MB (painel B) e sobreposição (painel C). Note que não houve aparecimento da

fluorescência de MB, veja Figura 51 painel B. Tomou-se o cuidado que os filtros

utilizados garantiriam a excitação no comprimento de onda de máxima absorção de

MB fundamental e emissão no comprimento de onda de máxima fluorescência de

MB no estado excitado. A dificuldade da localização deste fotossensibilizador em

células HeLa também já foi verificada anteriormente (Cañete 1993). A provável

explicação para tal fenômeno (Figura 51) é a redução de MB no meio intracelular,

formando leuco-MB, que não é fluorescente.

Diversos dados da literatura sugerem a redução intracelular de MB. Em

células, sabe-se que o doador de elétrons NAD(P)H pode reduzir o MB (Tuite

1993). Foi reportado que células cancerosas têm maiores concentrações de

NAD(P)H do que células normais (Schwartz 1974). Além disso, células cancerosas

possuem menos superóxido dismutase que as normais (Oberley 1979). Esse

conjunto de características em tais células pode facilitar a redução de MB neste

meio. A redução de MB por xantina oxidase tem sido também reportada (Salaris

1991). Esta enzima tem sido caracterizada como fonte primária de radicais de

oxigênio tóxicos em muitas doenças, como artrite e mal de Parkinson. Verificou-se

que MB suprime a produção de radical superóxido agindo como aceptor de elétrons

para xantina oxidase, inibindo competitivamente a redução de oxigênio molecular a

radical superóxido (Salaris 1991). Este estudo mostra a capacidade de redução de

MB por alvos biológicos, formando leuco-MB.

Para testar esta hipótese, empregou-se oxidante na amostra de MB em

células. O oxidante provoca a oxidação do leuco-MB a MB e portanto se MB a

baixas concentrações estiver em lisossomos, a sua fluorescência será observada.

O íon Fe3+ é transportado para o interior das células por uma proteína

chamada transferrina (Sun 1987, Ly 2003, Parkers 1994, Pandolfo 2002). A

transferrina captura íons Fe3+ e os libera nos lisossomos (Guilbert 1976, Octave

1983). Assim para verificar se MB é reduzido em lisossomos, cloreto férrico foi

165

adicionado à amostra. Além disso, aumentou-se a concentração de transferrina no

meio de incubação para garantir um aumento no transporte de íons Fe3+ para os

lisossomos (Guilbert 1976, Freshney 2000).

Figura 51: Micrografias de células incubadas com MB e Lysotracker. Lysotracker: painéis

A e C; MB: painéis B e C. Painel B corresponde excitação no comprimento de onda 635nm

e a emissão no comprimento de onda 685nm, os quais correspondem aos máximos de

absorção e de emissão de MB. [MB]=300nM e [Lysotracker]=100nM.

A Figura 52 mostra a sobreposição das imagens obtidas por célula incubada

com Lysotracker e com MB, painéis A e B. Apesar da sobreposição das imagens

observa-se apenas a fluorescência do Lysotracker (painéis A e B). Acrescentou-se

íons Fe3+ ao meio de incubação e após um período obteve-se a imagem do painel B

A B C

166

Figura 52. Observe que mesmo após a adição de íons Fe3+ não houve aparecimento

da fluorescência de MB. Isto indica que MB em baixas concentrações não deve estar

presente em lisossomos.

Figura 52: Sobreposição de micrografias de células incubadas com Lysotracker e com MB

em meio com alta concentração de transferrina (painéis A e B). A fluorescência vermelha

de MB não é observada em ambos os painéis. Acrescentou-se FeCl3 e após um período

obteve-se imagem do painel B. [MB]=300nM; [Lysotracker]=100nM; [FeCl3]=1µM;

[transferrina]=0,52mg.mL-1 ([transferrina] usual no meio=0,36mg.mL-1).

A B

FeCl3

Meio com alta concentração de transferrina

167

Também realizou-se este experimento incubando Lysotracker, MB e FeCl3

juntos em meio com alta concentração de transferrina. Após período de incubação,

imagens foram obtidas e novamente não se observou fluorescência de MB (dados

não apresentados).

Para verificar se MB a altas concentrações encontra-se em lisossomos, as

células foram incubadas com MB e lysotracker, vide Figura 53. Esta Figura

apresenta a imagem de Lysotracker (painel A), de MB (painel B) e a colocalização

(painel C). Note que nesta condição experimental ([MB]=20µM) foi possível

observar a fluorescência de MB. Além disso, o perfil de localização da fluorescência

de MB coincide com a do Lysotracker (painel A e B da Figura 53). Sendo

confirmado pela sobreposição das imagens (painel C), a qual forneceu colocalização

próxima a 100% (sobreposição das áreas integradas igual a 0,97). Isto indica que

MB a altas concentrações encontra-se em lisossomos. Isto está de acordo com a

literatura, em que se observou a localização de MB em lisossomos em células

diferentes da célula por nós empregada (Rück 1992 e Mellish 2002).

168

Figura 53: Micrografias de célula incubada com Lysotracker e MB (painéis de A a C).

Painel A: Lysotracker e painel B: MB. Painel C: sobreposição das imagens de Lysotracker

e MB. [MB]=20µM [Lysotracker]=100nM.

Porém se MB encontra-se em lisossomos somente a altas concentrações, resta

saber qual é o alvo intracelular primário de MB. Empregou-se, portanto, diversos

marcadores intracelulares. A Figura 54 apresenta as imagens de células incubadas

somente com R123 (painel A) e posterior adição de MB (painel B). Novamente não

se observou fluorescência de MB (dado não apresentado), conforme já verificado

A

C

B

169

anteriormente para baixa concentração deste fotossensibilizador (Figuras 51 a 53).

Porém note que a fluorescência de R123 torna-se difusa com a adição de MB, veja

painel B da Figura 54. Isto indica que houve uma perturbação no ambiente

mitocondrial de forma que R123 vazou para o citoplasma. Como a incorporação de

R123 é mediada via potencial eletroquímico da mitocôndria, o vazamento de R123

indica alteração no potencial mitocondrial. Como o MB tem carga positiva, a

entrada desta molécula na matriz mitocondrial provoca um desbalanceio no

potencial mitocondrial. Consequentemente a R123 torna-se menos atraída pela

matriz, sofrendo vazando para o citoplasma. Isto indica que MB deve localizar na

matriz mitocondrial. O perfil de fluorescência difusa de R123 após adição de MB é

semelhante ao observado quando CV é adicionado ao meio contendo R123 (Figura

46), o que é indicativo de que ambos os corantes encontram-se na matriz

mitocondrial.

Estudos com mitocôndrias isoladas de fígado de rato demonstraram que MB

é eficientemente capturado pelas mitocôndrias (Gabrielli 2004). A força propulsora

para a atração é o potencial mitocondrial. Porém uma vez nas mitocôndrias, MB

sofre redução, sendo necessário a utilização de oxidantes para observar a sua

fluorescência (Gabrielli 2004). Confirmando os dados obtidos na Figura 54.

A Figura 55 apresenta células incubadas com R123 (painel A) e com alta

concentração de MB (painel B). Nota-se o aparecimento da fluorescência de MB.

Porém a imagem observada de MB não apresenta o mesmo perfil de localização da

obtida por R123. Isto indica que MB está localizado em outro compartimento

celular. Como já verificado anteriormente, MB a altas concentrações localiza-se em

lisossomos, Figura 53. Além disso, note que a fluorescência de R123 encontra-se

difusa, Figura 55 painel A. Isto é indicativo da presença de MB nas mitocôndrias,

provocando despolarização do potencial das mesmas e conseqüente vazamento de

R123, Figura 55 painel A. Portanto, MB a altas concentrações encontra-se

primariamente em mitocôndrias e em lisossomos.

170

Figura 54: Micrografias de célula incubada com R123 (painel A) e posteriormente com MB

(painel B). [MB]=300nM e [R123]=100nM.

Figura 55: Micrografias de células incubadas com R123 e com MB (painéis A e B). Painel

A: R123, painel B: MB. [MB]=20µM; [R123]=100nM.

B A B

Adição de MB

A B

171

Marcadores de diferentes alvos intracelulares também foram utilizados com

MB. A Figura 56 apresenta diversos marcadores incubados juntos com MB a baixa

concentração, painel A e B. Novamente não há fluorescência notável de MB. A

fluorescência de R123 encontra-se difusa (painel A) e a dos demais marcadores

apresentam o típico perfil destes (painel B). Isto demonstra que MB provocou

perturbação somente na fluorescência de R123, provavelmente porque MB se

encontra no mesmo sítio de ligação deste marcador. Portanto, MB a baixas

concentrações localiza-se somente em mitocôndrias.

Figura 56: Micrografias de células incubadas com R123, H33342, Lysotracker e MB

(painéis A e B). Painel A: R123, painel B: H33342 e Lysotracker. [H33342]=300nM,

[R123]=100nM, [Lysotracker]=100nM, [MB]=200nM.

Para verificar o perfil de localização de MB a altas concentrações, realizou-

experimento com diversos marcadores e MB. A Figura 57 apresenta as imagens

obtidas nos diferentes painéis (A) MB, (B) Lysotracker, (C) H33342 e (D) R123.

Nota-se que quando em altas concentrações de MB é possível verificar sua

fluorescência intracelular (painel A). A imagem adquirida pela fluorescência de MB

A B A B

172

é semelhante à obtida por lisossomos (painel B). Portanto, MB em altas

concentrações está presente em lisossomos. Porém nota-se fluorescência difusa de

R123 (painel D), indicando sua localização mitocondrial. Ou seja, em altas

concentrações, MB localiza-se em mitocôndrias e em lisossomos.

Figura 57: Micrografias de células incubadas com R123, H33342, Lysotracker e MB

(painéis A a D). Painel A: MB, painel B: Lysotracker, painel C: H33342 e painel D: R123.

[H33342]=300nM, [R123]=100nM, [Lysotracker]=100nM, [MB]=20µM.

A B

C D C D

173

11. CONCLUSÕES FOTOSSENSIBILIZADORES CV E MB EM CÉLULAS

Ambos os fotossensibilizadores CV e MB apresentaram altas taxas de

incorporação. Esses dados indicaram que ambos corantes são captados pela célula

com alta eficiência. Isto deve-se à carga positiva que ambos os corantes possuem,

que causa atração destes para com o meio celular que possue ambiente interior

negativo (Daum 1985, Mannella 2006, Hauff 2006). No caso de MB, há

favorecimento da formação de dímeros deste composto em células quando a

concentração de MB é alta no meio de incubação. Este resultado é importante para

analisar os dados da fotoquímica de MB em células, uma vez que o estado de

agregação de MB altera os processos fotofísicos e fotoquímicos no estado excitado,

como já verificado pelo nosso grupo (Junqueira 2002, Severino 2003). O

fotossensibilizador CV não forma agregados em células.

Ensaios de toxicidade no escuro mostraram que estes fotossensibilizadores

não são tóxicos a baixas concentrações.

Verificou-se a localização dos fotossensibilizadores CV e MB em células

HeLa. A citolocalização primária destes fotossensibilizadores é a matriz

mitocondrial. Ambos apresentam cargas positivas e portanto são atraídos pelo

potencial negativo na matriz mitocondrial. Ao aumentar a concentração, o perfil de

localização é alterado. Para CV, o corante permanece na mitocôndria ou extravasa

para o citoplasma sem um sítio específico de localização. Já MB direciona-se para

lisossomos. Trabalhos na literatura também verificaram a presença de MB em

lisossomos, mas não investigaram o efeito da concentração sobre a citolocalização.

Além disso, a redução de MB por biomoléculas não foi considerada, gerando falsas

interpretações nestes trabalhos (Mellish 2002, Rück 1992).

Uma característica considerável de ambos os fotossensibilizadores é o fato de

que não se localizam em núcleo celular. Mesmo a altas concentrações, nenhum dos

fotossensibilizadores estudados localizou em núcleos. Como a incorporação de

moléculas fotoativas num organismo vivo ocorre em todas as células (sendo

174

principalmente capturadas por células cancerosas), a ligação de moléculas em

núcleos pode causar mutagênese nas células normais. Isto é um efeito colateral

danoso. Portanto a não ligação de MB e CV em núcleos mesmo a altas

concentrações é uma vantagem notável.

Uma vez estabelecido que tais corantes entram nas células e como estes

encontram-se neste meio, investigou-se a fotoquímica que os mesmos apresentam

em células ao serem excitados. Dados de emissão no infra-vermelho próximo

revelaram que MB proporciona formação de oxigênio singlete em células incubadas

com este fotossensibilizador. A formação do oxigênio singlete em células foi

confirmada através da supressão do triplete de MB. Tal supressão ocorre

prontamente em soluções isotrópicas mas não se observou o mesmo em células, o

que indica que o triplete de MB está no meio intracelular. MB proporciona formação

de oxigênio singlete eficientemente, (o rendimento quântico de emissão de oxigênio

singlete via excitação de MB é 19% comparado com 1% o proporcionado por CV

em células). Já o CV proporciona discreta geração de oxigênio singlete após a

excitação luminosa.

Os experimentos de sobrevivência celular indicaram morte celular após

incidência de luz em célula pré-incubadas com os fotossensibilizadores. Além disso,

há aumento de morte celular com o aumento da concentração de MB e CV até

atingir uma determinada concentração, a partir da qual concentrações superiores não

causam aumento na morte das células. O efeito fototóxico, contudo, é diferenciado

de acordo com o fotossensibilizador. O efeito fototóxico em relação a células não

irradiadas é de 20 vezes para MB e 10 vezes para CV. CV apresenta um grande

valor de rendimento quântico não radiativo. Isto contribui para a perda de parte da

energia, na forma de calor. Portanto a eficiência de geração de espécies tóxicas

principalmente radicalares é pequena. Já MB possui altos rendimentos quânticos de

cruzamento inter-sistemas e de geração de oxigênio singlete, assim a energia

absorvida pela molécula de MB está principalmente envolvida em reações

fotoquímicas culminando na formação de espécies tóxicas capazes de destruição

175

celular.

Sabe-se que oxigênio singlete é o principal composto citotóxico (Weishaupt

1976, Henderson 1992 Kessel 1996, Smith 1992, Deuticke 1989, Salet 1990, Salet

1991), esta molécula oxida proteínas e membranas culminando com a morte celular

(Henderson 1992, Weishaupt 1976). Como verificamos geração de oxigênio singlete

em células (Figuras 41 e 42) e morte celular após excitação de MB apresentada

anteriormente (Figura 36 a 38), assim podemos inferir que a morte celular observada

deveu-se a geração de oxigênio singlete. Além disso, dados da literatura mostram

que oxigênio singlete desencadeia morte do tipo apoptótica (Kochevar 2000, Xue e

Chiu 2001). Verificou-se formação de oxigênio singlete em células incubadas com

MB após excitação, veja Figura 41. Dados realizados com células incubadas com

MB seguidas de excitação luminosa mostraram a presença de DNA fragmentado,

revelando um provável processo apoptótico (Figuras 37 e 38). Estes resultados

revelam evidências de que este fotossensibilizador deve favorecer este tipo de morte

nas condições realizadas. Este tipo de morte é o preferencial para PDT, uma vez que

a apoptose é uma morte fisiológica e que, portanto, não induz processos

inflamatórios (Henderson 1992).

A apoptose é ainda dependente da concentração da droga no meio celular.

Este aumento de morte por apoptose provavelmente deve-se ao aumento de dano

oxidativo, provocado pelo oxigênio singlete. Tendo-se um valor de 60% de células

apoptóticas ao administrar 20µM de MB. Porém para células que não sofrem

irradiação, esta concentração de MB não é significativamente tóxico.

Concluindo, os dados revelaram que MB apresenta distribuição celular pouco

específica e dependendo da concentração pode formar dímeros. A sua alta geração

de oxigênio singlete indica que o mecanismo principal de ação desta droga é do tipo

II. Já CV tem distribuição mitocondrial. A baixa geração de oxigênio singlete e a

formação de radicais observados nos estudos em micelas reversas fazem concluir

que seu mecanismo de ação é pelo tipo I com baixa eficiência. Apesar dos

mecanismos serem diferentes, a eficiência fotodinâmica final destes

176

fotossensibilizadores é semelhante. Os dados sugerem que a baixa eficiência na

geração de espécies tóxicas e a maior especificidade na localização mitocondrial

fazem com que a eficiência fotodinâmica de CV em modelos de células HeLa seja

semelhante à do MB.

177

12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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