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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE AGRONOMIA
ANA KELLY FIRMINO DA SILVA
INVESTIGAÇÃO DE HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE BEGOMOV ÍRUS PARA
TOMATEIRO POR MEIO DE TÉCNICAS BIOLÓGICAS E MOLECUL ARES
FORTALEZA
2007
2
ANA KELLY FIRMINO DA SILVA
INVESTIGAÇÃO DE HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE BEGOMOV ÍRUS PARA
TOMATEIRO POR MEIO DE TÉCNICAS BIOLÓGICAS E MOLECUL ARES
Monografia apresentada ao Curso de
Agronomia do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal do Ceará, como parte
das exigências da Disciplina Atividade
Supervisionada.
Orientadora: Profª Dra Carmem Dolores G. Santos
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ANA KELLY FIRMINO DA SILVA
INVESTIGAÇÃO DE HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE BEGOMOV ÍRUS
PARA TOMATEIRO POR MEIO DE TÉCNICAS BIOLÓGICAS E MO LECULARES
Monografia apresentada ao Curso de
Agronomia do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal do Ceará, como parte
das exigências da Disciplina Atividade
Supervisionada.
APROVADA em: 05/ 07/2007
Orientadora Prof. Dra. Carmem Dolores Gonzaga Santos
Universidade Federal do Ceará
Conselheira Prof. Dra. Cândida Hermínia Campos Magalhães Bertini
Universidade Federal do Ceará
Conselheiro M. Sc Fernando Antonio Souza de Aragão
Pesquisador da Embrapa Agroindústria Tropical
5
DEDICO
Aos meus pais Francisco Rosário da Silva e
Maria de Fátima Firmino, aos meus irmãos
Alexandre, Ana Lúcia, Ana Maria e Ana
Paula, ao meu esposo Luís Alex, a minha filha
Bianca Gabrielle, aos meus sobrinhos e a
todos os demais familiares pelo apoio e
compreensão nos momentos difíceis e ao
amor a mim dedicado.
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AGRADECIMENTOS
Á Deus pelo o Dom da vida e por me dar forças para enfrentar os desafios que
surgiram ao longo de minha caminhada.
A Universidade Federal do Ceará por disponibilizar o curso de Agronomia.
Ao PET (Programa de Educação Tutorial), pela formação técnica e intelectual, pela
bolsa de estudos concedida e instalações utilizadas.
Ao Laboratório de Virologia Vegetal-UFC pela colaboração na realização deste
trabalho.
A professora Carmem Dolores Gonzaga Santos por sua orientação, ensinamento, por
seus conselhos e confiança.
Aos professores Ervino Bleicher, Márcio Cleber de Medeiros Correa e Cândida
Hermínia Campos Magalhães Bertini por seu compromisso, disponibilidade, ensinamentos e
amizade.
A professora Cândida Bertini por participar da banca e pelas informações sugeridas.
Ao pesquisador da Embrapa Agroindústria Tropical Fernando Aragão pela
participação na banca, e pelas sugestões.
A todos os professores do curso de Agronomia da Universidade Federal do Ceará,
que de alguma forma contribuíram para minha formação profissional.
Aos meus colegas de Curso pela amizade, solidariedade e ajuda.
A equipe do Laboratório de Virologia: Aline Kelly, Fatinha, Eduardo, Ana Lúcia,
Marilena e a do laboratório de Fitopatologia: Kelma, Natália, Francisco José, Aurigélia,
Conceição, Maria Paula, Camila por toda ajuda na condução dos experimentos.
A todos os bolsistas e colegas do PET-Agronomia por todas as experiências e
amizades.
Em especial as minhas amigas Elisangela Maria, Aline Kelly por fazerem parte dos
momentos alegres e difíceis vividos durante a minha formação profissional.
Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para o sucesso deste trabalho, e de
minha vida acadêmica.
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RESUMO
O tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill .) é uma das hortaliças mais apreciadas em todo o mundo. Dentre as numerosas enfermidades da cultura, destacam-se as viroses causadas por begomovírus, os quais são transmitidos pela mosca-branca, Bemisia tabaci biótipo B. Infecções naturais desses vírus têm sido relatadas em plantas daninhas, as quais podem constituir importantes fontes do patógenos para o tomateiro. Na Chapada da Ibiapaba, os begomovírus têm sido relatados em numerosas lavouras de tomate causando sérios danos à produção. Este trabalho teve por objetivo investigar a transmissão de begomovírus a partir de tomateiros infectados para plantas daninhas, bem como verificar a transmissão viral retornando das plantas daninhas para o tomateiro. Para tanto, mudas sadias de tomateiro e de plantas daninhas como: bredo de espinho (Amaranthus spinosus), caruru de mancha (Amaranthus viridis), mentrasto (Ageratum conyzoides) e picão preto (Bidens pilosa), espécies comumente encontradas nas lavouras de tomate, foram submetidas à inoculação, por meio de três formas: moscas-brancas virulíferas, enxertia e inoculação mecânica. Após 15 dias, realizou-se a extração do DNA de amostras foliares das plantas daninhas e dos tomateiros inoculados. A PCR realizada com oligonucleotídeos degenerados e específicos para begomovírus, revelou que na transmissão com o vetor as quatro espécies de plantas daninhas foram infectadas com o begomovírus do tomateiro, enquanto que por enxertia, apenas o picão preto foi infectado. Resultados positivos foram também constatados nas transmissões realizadas a partir das quatro espécies de plantas daninhas para o tomateiro. Constataram-se um percentual de 70%, 50%, 20 % e 12,5% de transmissão para o tomateiro quando o vetor adquiriu o vírus em mentrasto, bredo de espinho, picão preto e caruru de mancha, respectivamente. Na enxertia, a transmissão viral para o tomateiro ocorreu apenas quando se empregaram secções de bredo de espinho e de picão preto infectados. As plantas daninhas investigadas demonstraram ser hospedeiras alternativas do begomovírus de tomate, indicando que, em condições naturais e na presença do vetor podem ser fontes importantes desses begomovírus para a cultura do tomate.
Palavras-Chaves: Plantas daninhas, mosca-branca, PCR.
8
ABSTRACT
Investigation of alternative host begomovirus from tomato by biological and molecular techniques
Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) it is one of the vegetables more appreciated all over the world. Among the numerous diseases of the culture, the viruses caused by begomovirus are considered the most important diseases that affect the tomato plants. They are transmitted by the whitefly, Bemisia tabaci biotype B, and natural infections of those viruses have been reported in weeds, which can constitute important sources of the pathogen for the tomato. In the Chapada da Ibiapaba-Ce, the begomovirus have been found in numerous areas where tomatoes are cultivated causing serious damage to the production. The aim of this project was to investigate the transmission of begomovirus from infected tomatoes to weeds and from infected weeds to tomatoes. Healthy seedlings of weeds commonly found in the tomato farming such as: bredo de espinho (Amaranthus spinosus), caruru de mancha (Amaranthus viridis), mentrasto (Ageratum conyzoides) and picão preto (Bidens pilosa), as well as healthy seedlings of tomato were inoculated with the viruses by using viruliferous whiteflies, grafting or mechanical inoculation. After 15 days of the inoculation, leaves of the weed and tomato plants were collected for DNA extraction. Using specific oligonucleotideos for begomovirus in a PCR reaction we could detected the presence of begomovirus in all four species of weeds tested when tomato was used as a source of inoculum and whiteflies used as a vector. By grafting, only picão preto showed to be infected by begomovirus in the PCR reaction. When the four species of weeds infected with begomovirus were used as inoculum for the tomato seedlings, the transmission was also detected by PCR. When the vector acquired the virus in mentrasto, bredo de espinho, picão preto and caruru de mancha, a 70 %, 50 %, 20% and 12.5 % percentage of transmission was verified, respectively. By grafting, the viral transmission from infected weeds to tomatoes only happened when infected thorn bredo or picão preto were used as grafts. The investigated weeds demonstrated to be alternative hosts of the tomato begomovirus, indicating that, in natural conditions and in the presence of the vector they can be important sources of those begomovirus for the tomato plants. Word-keys: Weeds, whitefly, PCR.
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1-Mosca-branca (Bemisia tabaci biótipo B).................................................19
FIGURA 2-Tomate ‘ Santa Clara’ infectado com begomovírus...................................24
FIGURA 3-Mentrasto (Ageratum conyzoides L)..........................................................28
FIGURA 4-Bredo de espinho (Amaranthus spinosus L)..............................................28
FIGURA 5-Caruru de mancha (Amaranthus viridis L)................................................28
FIGURA 6- Picão preto (Bidens pilosa L)....................................................................28
FIGURA 7-Enxertia de ramos de tomateiro infectado..................................................35
FIGURA 8-Ensaio de transmissão de begomovírus com moscas-brancas virulíferas em
mudas de tomate provenientes de plantas daninhas ...............................36
FIGURA 9-Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomate e de
plantas daninhas infectadas com begomovírus.........................................39
FIGURA 10-Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomateiro
inoculado empregando-se o vetor tendo por fonte plantas daninhas........41
FIGURA 11-Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomateiros
enxertados tendo por fonte seções de plantas daninhas. .........................41
.
10
LISTA DE TABELAS
TABELA 1-Relação das plantas daninhas investigadas com relação ao
begomovírus.............................................................................................32
TABELA 2-Ensaio de transmissão de begomovírus de tomateiro para plantas
daninhas.........................................................................................................................38
TABELA 3-Ensaio de transmissão de begomovírus de plantas daninhas para
tomateiro..................................................................................................40
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SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................... 9 LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ 10 1.INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 14
2.1 A Cultura do Tomate............................................................................................... 14 2.2 Pragas e Doenças do tomateiro................................................................................ 17
2.2.1 Pragas do tomateiro 17 2.2.2 Doenças do tomateiro 20
2.3 Plantas Daninhas......................................................................................................25 2.4 Diagnose Viral.......................................................................................................... 29
2.4.1) O método de diagnose através de plantas indicadoras 29 2.4.2) Métodos Sorológicos 29 2.4.3) Métodos Moleculares 30
2.5 Controle de viroses................................................................................................... 31 3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 32
3.1 Material Vegetal.................................................................................................... 32 3.2 PCR- Método empregado na detecção viral......................................................... 33
3.2.1 Extração de DNA total 33 3.2.2 Preparo das amostras para PCR 33
3.3 Teste de transmissão viral de tomateiro para plantas daninhas............................. 34 3.3.1 Inoculação empregando a mosca-branca 34 3.3.2 Inoculação por enxertia 34 3.3.3 Inoculação mecânica 34
3.4. Teste de transmissão viral de plantas daninhas para tomateiro............................ 35 3.4.1 Inoculação empregando a mosca-branca 35 3.4.2 Inoculação por enxertia 36
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 37 5. CONCLUSÃO................................................................................................................ 41 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 43
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1. INTRODUÇÃO
O tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill) é uma hortaliça de grande aceitação
entre diferentes mercados consumidores o que tornou a tomaticultura uma atividade agrícola
de grande importância sócio-econômica, amplamente difundida no mundo todo. A razão de
sua apreciação na dieta humana está associada a sua aparência, ao sabor, ao aroma, à textura e
ao valor nutricional, principalmente, no conteúdo de vitaminas e minerais (ALVARENGA,
2004).
No Brasil são comercializadas, anualmente, cerca de 1,5 milhões de toneladas de
tomate. O tomateiro é a solanácea com maior volume de produção no país, sendo a principal
espécie dentre as hortaliças (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995). Em 2006 se destacou na
nona posição da produção de tomate no mundo, com uma safra de 3,3 milhões de toneladas
em 2006 (TOMATE INDUSTRIAL, 2007).
No Ceará, o cultivo de hortaliças, principalmente o tomate, merece destaque
especial por constituir-se fonte geradora de emprego e renda, sobretudo na microrregião da
Ibiapaba, a qual responde pela maior produção do estado (LIMA, et al., 2000, TORRES-
FILHO, 2002).
Segundo Filgueira (2003), as cultivares que têm sido desenvolvida com
resistência genética a uma gama variada de doenças e anomalias, devido à incorporação da
característica “longa vida”, pode ser colhidos maduros e ser conservados à temperatura
ambiente. Os grupos de cultivares atualmente plantada no Brasil são: Santa Cruz, Salada ou
Caqui, Cereja, Italiano e Agroindustrial.
Diversos fatores interferem na produção e produtividade do tomateiro, dentre os
quais se destacam os problemas fitossanitários. Entre as olerícolas de importância econômica,
o tomateiro é uma das que apresenta um maior número de pragas, constituindo um dos fatores
responsáveis por danos à cultura, causando redução da produção Dentre as numerosas
enfermidades, as viroses vêm merecendo uma atenção especial em razão da presença
freqüente de insetos vetores (HAJI et al., 2004). Na natureza a disseminação de vírus em
tomate é feita na maioria das vezes por pulgões (Aphis gossypii Glover), mosca-branca
(Bemisia tabaci Genn. Biótipo B), cigarrinhas (Agallia albidula) e tripes (Frankliniella
schulzei Trybom) (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995).
No Brasil, as viroses constituem um dos mais sérios problemas para a
tomaticultura, uma vez que apresenta dificuldade de controle. Os vírus mais comuns são:
Tobacco mosaic virus (TMV); Tomato mosaic virus (ToMV) do gênero Tobamovirus e
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família Tombusviriridae, Cucumber mosaic virus (CMV), gênero Cucumovirus e família
Bromoviridae; Potato vírus Y (PVY) do gênero Potyvirus e família Potyviridae; Tomato
spotted wilt virus (TSWV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ring spot virus
(GRSV) e o Impatiens necrotic spot virus (INSV), Chrysanthemun stem necrosis virus
(CSNV) do gênero Tospovirus e família Bunyaviridae e o Tomato golden mosaic virus
(TGMV) do gênero Begomovirus e família Geminiviridae (RESENDE; CUPERTINO, 1996;
LOPES; ÁVILA, 2005).
Na última década, surtos epidêmicos de geminiviroses passaram a ocorrer em
todas as regiões produtoras de tomate do Brasil, associados à introdução, da mosca-branca,
vetor muito eficiente e com amplo círculo de hospedeiros. Na Chapada da Ibiapaba-Ce, os
begomovírus são predominantes nas lavouras de tomate, em razão da constante presença da
mosca-branca e, de acordo com Arnaud (2005), os freqüentes prejuízos devido à virose estão
provocando a redução de área plantada com a hortaliça na região.
Infecções por begomovírus têm sido frequentemente relatadas também em plantas
invasoras. Acredita-se que uma grande diversidade de espécies de geminivírus que estavam
restritas às plantas daninhas migrou para o tomateiro (EMBRAPA, 2007). Espécies de plantas
daninhas podem, assim, constituir importantes fontes de inóculo desses vírus para plantas
cultivadas, mediante transmissão pela mosca-branca (ASSUNÇÃO et al., 2004). No Ceará,
várias plantas daninhas já foram encontradas naturalmente infectadas por begomovírus nas
lavouras de tomate. Contudo, são ainda escassas as informações sobre a interação
begomovírus de tomate, plantas daninhas e vetor. Diante disso, este trabalho teve como
objetivo:
• Detectar begomovírus em tomateiros e em plantas daninhas através da PCR;
• Investigar a transmissão do begomovírus por vetor, por enxertia e inoculação
mecânica de tomateiro para plantas daninhas;
• Verificar a transmissão do vírus por vetor e por enxertia retornando das plantas
daninhas para tomateiro.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A Cultura do Tomate
O tomate é produzido e consumido em inúmeros países, in natura ou
industrializado. No Brasil, introduzido por imigrantes europeus no final do século XIX,
tornou-se a segunda hortaliça em importância, sendo cultivado na maioria dos estados. A
maior parte da colheita nacional destina-se à mesa; porém, a produção destinada às
agroindústrias vem crescendo, especialmente na região dos cerrados (FILGUEIRA, 2003).
O centro primário de origem do tomateiro é um estreito território, limitado ao
norte pelo Equador, ao sul pelo norte de Chile, a oeste pelo oceano Pacífico e a leste pela
Cordilheira dos Andes. Antes da colonização espanhola, o tomate foi levado para o México -
centro secundário, onde passou a ser cultivado e melhorado. Foi introduzido na Europa,
através da Espanha, entre 1523 e 1554. Inicialmente, foi considerada planta ornamental, sendo
o uso culinário retardado, por temor de toxicidade (FILGUEIRA, 2003).
A tomaticultura é uma atividade agrícola de grande importância socioeconômica,
amplamente difundida em todo o mundo, que exige alto investimento, mão-de-obra
qualificada e elevado nível tecnológico (HAJI et al., 2004).
O tomateiro é uma dicotiledônea pertencente à família Solanaceae. É uma planta
herbácea, com haste flexível e incapaz de suportar o peso dos frutos e manter a posição
vertical. Embora sendo uma planta perene, a cultura é anual: da semeadura até a produção de
novas sementes, o ciclo varia de quatro a sete meses. A floração e a frutificação ocorrem
juntamente com o crescimento vegetativo. As folhas são compostas por número ímpar de
folíolos (CAMARGO, 1992; FILGUEIRA, 2003; ALVARENGA, 2004).
As principais vitaminas encontradas no tomate são A, B e C. Entre os minerais,
destacam-se o cálcio, potássio, sódio, cloro, magnésio e ferro. O tomate é considerado
alimento funcional porque contém uma substância que ajuda a reduzir o risco de certas
doenças. Esta substância é um pigmento conhecido como licopeno. O licopeno funciona como
antioxidante que neutraliza a ação dos radicais livres, protegendo as células do
envelhecimento e estimulando as defesas do corpo, com propriedades anticancerígenas.
Pesquisas têm mostrado que o licopeno tem a capacidade de reduzir consideravelmente os
riscos de câncer de próstata. A absorção do licopeno pelo corpo é maior quando o tomate é
consumido na forma de molhos, purês ou extrato do que quando ingerido fresco (PAZINATO
et al., 2005).
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O tomate apresenta dois hábitos de crescimento distintos, que condiciona o tipo da
cultura. O hábito indeterminado é aquele que acontece na maioria das cultivares apropriada
para produção de frutos para mesa, que são tutoradas e podadas, com caule atingindo mais de
2,5 m de altura. Já o hábito determinado ocorre nas cultivares criadas para o cultivo rasteiro,
com finalidade agroindustrial. Os frutos são bagas carnosas, suculentas, com aspecto,
tamanho e peso variados conforme a cultivar (FILGUEIRA, 2003).
O tomateiro é bastante tolerante às variações dos fatores climáticos. Pode
desenvolver-se em clima tropical de altitude, subtropical e temperado. Isto permite que ele
seja cultivado praticamente em todo o Brasil (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995).
O tomateiro prefere solos profundos, de consistência friável, bem drenado e com
médio a alto teor de matéria orgânica. Solos argilosos e compactados ou sujeitos a
encharcamento periódicos devem ser evitados em virtude de propiciarem condições
favoráveis ao desenvolvimento de fungos patógenos de solo (EMPASC, 1991).
A temperatura e a umidade relativa do ar são fatores climáticos que exercem
grande influência nos diversos estádios de desenvolvimento do tomateiro. A cultura é
indiferente ao fotoperíodo desenvolvendo-se bem tanto em época de dias curtos, como em
dias longos. Quanto á temperatura o tomateiro em geral, dependendo do estágio de
desenvolvimento, suporta de 3 a 44 oC por períodos curtos, sendo que as temperaturas ótimas
são 21-28 oC, de dia e 15-20 oC de noite (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995; FILGUEIRA,
2003).
As chuvas e elevados índice de umidade relativa do ar associados às variações de
temperatura favorecem a incidência de doenças e pragas e dificultam o seu controle. Já os
ventos fortes e quentes afetam a floração e frutificação, além de alterar o balanço
fotossintético (FILGUEIRA, 2003).
Os grupos de cultivares atualmente plantada são: Santa Cruz, Salada, Cereja,
Italiano e Agroindustrial. A cultivar Santa Clara (grupo Santa Cruz), originou-se de um
cruzamento natural entre as cultivares Rei Umberto e Chacareiro, ocorrido em Suzano-SP. As
razões do sucesso desse tomate é a notável resistência ao manuseio rude e ao transporte pouco
cuidadoso. Em condições de boa adubação e tratos culturais possui uma elevada
produtividade. Nas cultivares modernas, os frutos comerciáveis pesam entre 160 e 200 g.
Entretanto apresentam sabor pobre comparado aos demais grupos, porém criou-se o hábito de
consumo para esse tipo (FILGUEIRA, 2003).
Atualmente, o tomate Santa Clara original não é mais plantado, sendo substituído
por novas cultivares com características mais favoráveis, como a cultivar Santa Clara criada
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em Campinas-SP. Ao longo da década de 90, houve a introdução de híbridos com a
característica “longa vida”, sendo bons exemplos: ‘Carmem”, ‘Débora Max’, ‘Bruna VF’ e
‘Ataque’. Além dos frutos maiores e de melhor qualidade, apresentam resistência a algumas
doenças, inclusive a certas viroses, em algumas dessas cultivares (FILGUEIRA, 2003).
O grupo Salada, também conhecido como Caqui ou Maçã, apresentamn frutos
maiores em relação ao anterior, com peso superior a 250 g, bem mais delicados e saborosos.
Devido ao tamanho e à fragilidade, apresenta menor resistência ao transporte. Produz o tipo
de fruto mais valorizado para consumo na forma de salada. Alcança preços mais elevados,
porém deve ser cultivado em menor escala, pois a demanda é menor, por atender a um tipo de
consumidor mais exigente e disposto a pagar mais (FILGUEIRA, 2003).
Vários autores têm apresentado o grupo Saladinha como parte do grupo Salada,
considerando o tamanho menor dos frutos. Cultivares ou híbridos desse grupo surgiram do
cruzamento de materiais do grupo da Santa Cruz e do grupo Salada, sendo desse útimo a
maioria. Desse grupo são exemplos os tomates ‘Alambra’, ‘Alboran’, ‘Densus’, ‘Diva’,
‘Infinity’, ‘Facundo’, ‘Fanny’, ‘Monalisa’, ‘Possanga’, ‘Raísa N,’ ‘Saladinha’, ‘Séculos’,
‘Sheila’ e ‘Thomas’, entre outros (ALVARENGA, 2004).
O grupo Cereja foi introduzido no início da década de 90, sendo considerado um
novo grupo de cultivar para mesa. Apresenta frutos de tamanho pequeno (15-25g), com
coloração vermelho-brilhante, lembrando uma cereja, e excelente sabor. São utilizados na
ornamentação de saladas, sendo híbridos todas as cultivares desse grupo (FILGUEIRA,
2003).
Introduzido no final da década de 90, o grupo Italiano é o mais recente grupo de
cultivares para mesa. Os frutos são colhidos maduros e apresentam atrativa coloração
vermelha, destinando-se ao preparo doméstico de molhos e servindo também de
ornamentação de pratos (FILGUEIRA, 2003).
No grupo Agroindústria exige-se um tipo especial de tomate, produzido em
cultivo rasteiro, sem tratos culturais sofisticado. Os frutos devem apresentar alta resistência ao
transporte, coloração vermelha intensa distribuída uniformemente pelo fruto, elevado teor de
sólidos solúveis e teor adequado de ácido cítrico (FILGUEIRA, 2003).
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2.2 Pragas e Doenças do tomateiro
2.2.1 Pragas do tomateiro
Diversas espécies de insetos atacam o tomateiro durante todo o seu ciclo
fenológico, e os danos variam de acordo com a intensidade do ataque. Algumas pragas
danificam os frutos inutilizando-os para comercialização e outros são vetores de viroses. As
pragas do tomate podem ser classificadas em dois tipos: pragas-chaves, que causam severos
danos na cultura, ocasionando perdas totais na produção, e pragas-secundárias, que não
causam muito prejuízo para o produtor (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995; HAJI et al., 1998;
ARNAUD, 2005).
Dentre as pragas-secundárias em geral, destacam-se: lagarta-rosca (Agrotis
ipsilon), mosca-minadora (Liriomyza sativae), lagarta-das-folhas (Manduca difissa), vaquinha
(Diabrotica speciosa), broca-grande-dos-frutos (Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, S.
eridania e Pseudoplusia includens), ácaro vermelho (Tetranychus evansi), percevejos (Nezara
viridula, Phthia picta). As pragas-chaves são: broca pequena (Neoleucinodes elegantalis),
microácaro (Aculops lycopersici), tripes (Frankliniella schulzei), pulgões (Myzus persicae,
Macrosiphum euphorbiae e Aphis gossypii) e as pragas exóticas: traça-do-tomateiro (Tuta
absoluta) e a mosca-branca (Bemisia tabaci biótipo B (= B. argentifolii)) (HAJI et al., 1998;
FILGUEIRA, 2003). Na região da Ibiapaba-CE as principais pragas são: broca-pequena,
mosca-branca, minadora e traça (informação dada pelo pesquisador Fernando Aragão).
Os pulgões, tripes e mosca-branca, além de pragas chaves, são também insetos
vetores de vírus e por esta razão são destacados a seguir:
• Pulgões (Myzus persicae, Macrosiphum euphorbiae e Aphis gossypii)
Ocorrem durante todo o ciclo da cultura, mas o período mais crítico é até os 50
dias após a emergência. Atacam principalmente as folhas e brotações novas, sungando a
seiva. É o transmissor dos vírus Y, topo amarelo e amarelo-baixeiro (MAKISHIMA;
MIRANDA, 1995; FILGUEIRA, 2003).
Os meios de controle visam impedir o contato do inseto virulífero com a planta,
sendo eles: produção de mudas em estufa provida de tela fina, aplicação de inseticidas
granulados sistêmicos ao sulco de plantio e pulverizações com aficidas específicos, que não
afetam os inimigos naturais (FILGUEIRA, 2003).
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• Tripes (Frankliniella schulzei)
Os tripes são minúsculos insetos alongados, transmissor do vírus do vira-cabeça.
Ocorre durante todo o ciclo da cultura, mas o período mais crítico é até os 60 dias pós-
emergência, pois a infecção com vírus na fase de muda e/ou logo após transplante causa
morte das plantas. O clima quente favorece a proliferação da praga. Atacam a face inferior
dos folíolos e a brotação nova e habitam, inclusive, botões florais e flores, nas plantas
atacadas seu crescimento é paralisado (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995; FILGUEIRA,
2003).
A cultura deve ser mantida no limpo e ficar distante de outras espécies
susceptíveis ou hospedeiras do tripes, como alho, cebola, ervilha, amendoim e algumas ervas
daninhas. Plantas infectadas com o vírus devem ser eliminadas da lavoura e o controle
químico deve ser iniciado a partir da emergência das plantas até mais ou menos 80 dias
(MAKISHIMA; MIRANDA, 1995).
• Mosca-branca (Bemisia tabaci biótipo B)
Os insetos conhecidos vulgarmente como moscas-brancas (FIGURA 1) são
sugadores de seiva e têm como principal gênero Bemisia, o mais prejudicial e mais
amplamente distribuído e estudado em todo o mundo. Estima-se mais de 700 plantas
hospedeiras conhecidas dessa praga (FERREIRA; AVIDOS, 1998; HAJI, 2004).
Nas duas últimas décadas, a mosca-branca tem sido considerada, mundialmente,
uma das principais pragas dos sistemas agrícolas, encontrando-se, atualmente, presente em
todos os continentes. Esta praga vem ocasionando danos e prejuízos bastante expressivos em
inúmeras culturas, principalmente tomate, feijão, algodão, melão, melancia, abóbora,
olerícolas, algumas frutíferas e plantas ornamentais. As moscas-brancas pertencem à ordem
Hemíptera, subordem Sternorrhyncha e família Aleyrodidae. Dentre os gêneros de que
apresentam maiores problemas para a agricultura detaca-se Bemisia, com 37 espécies
conhecidas (HAJI et al., 2004).
São insetos pequenos com asas brancas e abdome amarelado, as fêmeas medem
aproximadamente 0,9mm e os machos 0,8mm, localizam-se na parte inferior das folhas, onde
depositam seus ovos. Possuem grande capacidade de reprodução e adaptação a condições
adversas, desenvolvem resistência aos inseticidas, tornando-se difícil o seu manejo (GALLO
et al., 2002; HAJI et al., 2004).
Além dos danos diretos que causam as plantas, a mosca-branca destaca-se como
eficiente vetor de vírus, que pode ser adquirido ao se alimentar em uma planta infectada por
19
um período de 15 minutos, denominado período acesso de aquisição, transmitindo o vírus na
modalidade persistente circulativa (SANTOS, et al. 2003a). Após 4 a 20 horas, período de
latência, a mosca-branca é capaz de transmitir o vírus por um período de dez a vinte dias,
entretanto, a eficiência de transmissão diminui ao longo desse tempo (METHA et al., 2004;
PICÓ et al., 2004). Períodos secos e quentes favorecem o desenvolvimento e a dispersão
dessa praga, sendo, por isto, observados surtos na estação seca. A chuva é um fator adverso,
causando mortalidade nas populações do inseto, principalmente, quando são fortes e
constantes (VILLAS-BÔAS et al., 1997). A duração do ciclo de vida varia de acordo com a
espécie, sendo a temperatura um dos fatores determinantes. Em temperaturas de 32 oC o ciclo
dura 19 dias, podendo chegar a 73 dias a 15 oC . Sob condições favoráveis, esta praga pode
apresentar de 11 a 15 gerações por ano, podendo cada fêmea ovipositar de 100 a 300 ovos
durante o seu ciclo de vida (BROWN; BIRD, 2004).
Na cultura do tomate os danos podem ser diretos e indiretos. Os danos diretos
produzidos pela mosca-branca ocorrem por meio de anomalias ou desordens fitotóxicas,
causadas pela injeção de toxinas durante a alimentação do inseto, como o amadurecimento
irregular dos frutos e frutos isoporizados (LOURENÇÃO; NAGAI, 1994). A desuniformidade
na maturação dos frutos dificulta o reconhecimento do ponto de colheita, reduz a produção e,
no caso do tomate industrial, a qualidade da pasta. Os danos indiretos podem ser observados
pelas excreções açucaradas produzidas pela praga que favorece o desenvolvimento de
fumagina sobre folhas e frutos, reduzindo o processo fotossintético das plantas, e pela
transmissão de vírus (HAJI et al., 1996).
FIGURA 1: Mosca-branca (Bemisia tabaci biótipo B). Foto: Carmem Santos, 2001.
20
2.2.2 Doenças do tomateiro
Doença de planta é qualquer anormalidade causada por fatores bióticos ou
abióticos que agem na planta, de maneira contínua, alterando o seu metabolismo. A doença
geralmente resulta em queda de produção e/ou perda de qualidade do produto. Pode ainda
manifestar-se no produto após a colheita, inviabilizando-o para o consumo (LOPES; ÁVILA,
2005).
No tomateiro as doenças são mais ou menos intensas em função de vários fatores:
clima, condução da lavoura, método de irrigação, tipo de solo, qualidade da semente,
população de patógenos presente na planta ou no solo. Os fungos, bactérias, micoplasmas,
vírus, viróides e nematóides, provocam doenças de importância cujos agentes causais podem
ser disseminados no campo por vetores ou práticas culturais (LOPES; SANTOS, 1994).
Na natureza, a disseminação dos vírus de plantas ocorre de forma muito
especializada. A maioria é transmitida por insetos vetores: pulgões, moscas-brancas,
cigarrinhas e tripes (LOPES; ÁVILA, 2005).
Das numerosas enfermidades que ocorrem no tomateiro, destacam-se as viroses
pelos danos causados, uma vez que podem ser inexpressivos ou até levar à perda total de
produção.
• Mosaico-Comum
Esta virose é ocasionada pelos vírus Tobacco mosaic virus (TMV) e Tomato
mosaic virus (ToMV), responsáveis pela doença no fumo e no tomateiro. Ocorre a
transmissão pelo contato com mãos contaminadas, ou com implementos agrícolas. A virose
também pode ser vinculada por sementes. Nos folíolos, observa-se o efeito “mosaico” o que
se caracteriza por áreas com tonalidades verdes clara e escura. Plantas afetadas jovens têm
crescimento retardado (FILGUEIRA, 2003).
Algumas estirpes de ToMV podem causar amarelecimento da planta e/ou mosaico
amarelo semelhante aos induzidos por geminivírus. Eventualmente, as folhas podem tomar
forma alongada e retorcida. Em ambientes de alta temperatura, a planta doente pode
permanecer assintomática. Os frutos podem apresentar mosqueamento, bronzeamento,
mosaico amarelo, manchas necróticas ou anéis e amadurecimento irregular (LOPES; ÁVILA,
2005). A cultivar Tropic e os híbridos Carmem e Luxor são resistentes a este vírus
(MAKISHIMA; MIRANDA, 1995).
21
• Vira Cabeça-do-tomateiro
Doença generalizada em quase todas as regiões produtoras do Brasil, causada por
várias espécies de vírus do gênero Tospovirus. Pelo menos quatro espécies do gênero ocorrem
em tomateiro no País: Tomato spotted wilt virus (TSWV), Tomato chlorotic spot virus
(TCSV), Groundnut ring spot virus (GRSV) e Chrysanthemun stem necrosis virus (CSNV)
(LOPES; ÁVILA, 2005).
O vírus TSWV infecta plantas cultivadas e plantas daninhas. É transmitido por
tripes, que o adquire no estado larval, mantendo a capacidade de transmiti-lo por toda a vida,
de modo persistente. Infecção em sementeira leva à perda total do campo e, após o
transplantio, quanto mais precoce a infecção, maiores são as perdas (MAKISHIMA;
MIRANDA, 1995).
Os sintomas do vira-cabeça variam em função da espécie de vírus, da idade em
que a planta foi infectada, da cultivar e das condições climáticas. O nome vira-cabeça do
tomateiro deriva do fato de o ponteiro da planta se curvar para baixo, sintoma típico da
doença (LOPES; ÁVILA, 2005). Em geral os sintomas são: folíolos do ápice arroxeados ou
bronzeados; podem ocorrer lesões necróticas nos folíolos; as folhas do topo curvam-se; há
nanismo em plantas jovens, em frutos verdes há lesões deprimidas; e em frutos maduros
ocorrem manchas aneladas amarelas (FILGUEIRA, 2003).
• Risca-do-tomateiro
O Potato virus Y (PVY), agente causal da risca do tomateiro, ocorre de forma
restrita em lavouras de tomate no Brasil. São poucas as plantas hospedeiras do vírus. É
encontrado também em lavouras de batata, pimentão e pimenta e em plantas daninhas da
família Solanaceae, que podem servir como fonte de inóculo do vírus ao tomateiro. A
transmissão é feita por pulgões, que adquirem o vírus em uma planta doente, a transmissão é
do tipo não persistente, ou seja, só são capazes de transmiti-lo por apenas alguns minutos a
poucas horas (FILGUEIRA, 2003; LOPES; ÁVILA, 2005).
O sintoma mais comum é um mosaico leve ou severo nas folhas mais nova, com
as nervuras apresentando coloração verde escura. Algumas estirpes podem apresentar
sintomas de mosaico associados com necrose do pecíolo e das nervuras da face inferior da
folha, que se volta para baixo dando à planta a aparência de pinheiro de Natal. Não se
observam sintomas nos frutos, mais infecções precoces podem causar perdas totais (LOPES;
ÁVILA, 2005).
22
• Mosaico-amarelo
O vírus do mosaico-amarelo, Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), está se
expandindo no Brasil e já ocorre nas principais regiões produtoras de tomate do País. Surtos
epidêmicos ocorrem frequentemente em lavouras de pimentão, pimenta e tomate. Quando a
infecção ocorre no início do ciclo da planta do tomate, os danos são consideráveis. O
PepYMV é transmitido por várias espécies de pulgões de maneira não-persistente. Os
sintomas variam conforme a cultivar de tomate. Nas cultivares muito susceptíveis, observa-se
mosaico severo e deformação foliar. Nas tolerantes, é mais comum mosaico leve e
amarelecimento das folhas novas. Os frutos normalmente não apresentam sintomas, mas
podem ter o seu tamanho reduzido. Podem ocorrer infecções mistas com geminivírus,
tospovirus e tobamovirus (LOPES; ÁVILA, 2005).
• Mosaico-do-pepino
Doença de larga distribuição, mas só ocasionalmente encontrada infectando
tomateiro no Brasil. É mais importante em cultivos de curcubitáceas e de pimentão. O
Cucumber mosaic virus (CMV) é transmitido por pulgões, embora estes não tenham grande
eficiência na transmissão de tomateiro para tomateiro. A infecção geralmente ocorre em
plantios próximos de plantas daninhas infectadas. O vírus não é transmitido por sementes de
tomate, embora sementes de outras espécies possam transmiti-lo. É grande o círculo de
hospedeiras do vírus, entre as quais estão: abóboras, alface, banana, cenoura, maracujá,
melancia, melão, pepino, pimentão, salsão e várias plantas ornamentais. Os sintomas são:
redução de crescimento em plantas jovens infectadas, mosqueado leve e enrolamento nas
folhas e o sintoma mais característico é o estreitamento foliar, conhecido como cordão de
sapato (LOPES; ÁVILA, 2005).
• Mosaico-dourado-do-tomateiro (Geminivirose)
O mosaico-dourado-do-tomateiro, causado por begomovírus Tomato golden
mosaic virus (TGMV), é a virose mais séria da cultura do tomate na atualidade. Contudo,
levantamentos recentes indicam a existência de mais de dez espécies de begomovírus no
Brasil (LOPES; ÁVILA, 2005).
A família Geminiviridae, apresenta vírus com partículas geminadas ou pareadas,
com genoma mono ou bipartido, composto por DNA circular de fita simples, com 2,6 Kb e
segundo a estrutura do genoma, inseto vetor e círculo de hospedeiros, está dividida em três
23
gêneros: Mastrevírus, Curtovírus e Begomovírus, (LAZAROWITZ, 2004; RYBICK et al.,
2004).
Os sintomas da infecção viral surgem nas folhas mais novas, em forma de
mosaico intenso, a partir da região do pecíolo. Também ocorre o enrolamento dos folíolos na
planta toda e a paralisação do crescimento da planta (LOPES; ÁVILA, 2005; FILGUEIRA,
2003).
Begomovírus
Para Polston e Anderson (1997 apud ZERBINI et al., 2002), os begomovírus são
considerados um grupo emergente de vírus de plantas, devido ao aumento da incidência e
severidade das doenças por eles causadas nas últimas décadas. Recentemente, a emergência
de novas espécies de begomovírus infectando tomateiros nas Américas veio ressaltar de forma
dramática o impacto causado por esses patógenos à agricultura. O controle das doenças
causadas por begomovírus é dificultado pela dificuldade de fontes naturais de resistência e
pela diversidade genética do inseto vetor, o que leva à rápida seleção de populações
resistentes a inseticidas.
Um dos principais problemas na cadeia de produção de tomate reside na alta
incidência de vírus da família Geminiviridae, gênero Begomovírus. A ocorrência da doença
tem sido generalizada desde o Nordeste ao Sudeste brasileiro, além de demais países sul-
americanos, onde perdas de 40% até 100% da produção têm sido relatadas. (FARIA et al.,
2000; COTRIM et al., 2004; SANTANA et al., 2007).
Segundo Haji et al., (2004), não existe disponibilidade no mercado nacional de
cultivares ou híbridos de tomate industrial com resistência ao geminivírus. O híbrido Gem
Pride (tomate industrial) de origem americanas, está sendo comercializado no mercado
brasileiro, porém seu alto valor o restringem a algumas áreas de produção e em quantidades
insuficientes para atender a demanda.
Segundo Costa (1976 apud ZERBINI et al. 2002) os begomovírus não são
transmitidos por semente ou por contato entre plantas infectadas e sadias. Sua dispersão ou
introdução no campo dá-se pela ação da mosca-branca a partir de fontes de vírus de áreas
próximas, podendo ser de cultivos antigos como também de fontes alternativas no campo.
Diversidade genética tem sido observada em espécies de begomovírus associadas ao
tomateiro no Nordeste, Sudeste e Centro-Oeste do Brasil (RIBEIRO et al., 2003), e o
relacionamento genético observado entre as espécies de tomate e de plantas daninhas sugere
que os vírus sejam provenientes de plantas nativas e que estão sendo transferidos para o
tomateiro pela mosca-branca (AMBROZEVICIUS et al., 2002). Segundo Villas-Bôas et al.
24
(1999) a B. tabaci tem se dispersado nos campos rapidamente, sendo considerada a espécie de
mosca-branca que comumente devasta os cultivos agrícolas nas várias regiões geográficas do
país.
Como a mosca-branca se alimenta da seiva das plantas, isso faz com que esses
insetos sejam eficientes em adquirir e transmitir vírus associados aos tecidos vasculares das
plantas, como é o caso de geminivírus. A relação begomovírus versus mosca-branca é do tipo
persistente-circulativo, ou seja, o inseto adquire o vírus durante o processo de alimentação em
planta infectada, este circula no seu corpo até atingir as glândulas salivares, tornando-o
infectivo, onde o vírus é inoculado no sistema vascular da planta quando a mosca-branca se
alimentar em uma planta sadia (HAJI et al., 2004).
No Ceará, os begomovírus tem sido constatado em, praticamente, toda a região
produtora da hortaliça. Levantamentos realizados por ARNAUD (2005) revelaram a
predominância de begomovírus nas lavouras comerciais da Chapada da Ibiapaba e a alta
disseminação de mosca-branca. Sintomas de mosaico clorótico, leve epinastia nas folhas além
do subdesenvolvimento, são comumente observados nas plantas de tomate infectadas
(FIGURA 2).
FIGURA 2: Tomate ‘Santa Clara’ infectado com begomovírus.
25
2.3 Plantas Daninhas
As plantas daninhas, também denominadas de invasoras ou infestantes, são
vegetais que crescem onde não são desejados. A presença dessas plantas em áreas de cultivo
compromete a produtividade e a sua interferência sobre as plantas cultivadas afeta também a
qualidade dos frutos. Algumas extraem grandes quantidades de nutrientes do solo e além da
competição direta, apresentam os seguintes mecanismos: alelopatia, hospedeiros
intermediários, desvalorização comercial dos produtos (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995;
LORENZI, 2000; DEUBER, 2003).
Quanto à classificação, a qual é baseada no ciclo vital, podem ser: plantas anuais,
bianuais e perenes. Entre as espécies anuais está à maioria das plantas infestantes das grandes
culturas e compreendem aquelas que germinam e completam o ciclo até a maturação das
sementes dentro da mesma estação de crescimento (60 a 140 dias). As espécies bianuais são
aquelas que germinam e crescem até a formação de folhas em roseta no primeiro ano,
completando o ciclo no ano seguinte. As espécies perenes são aquelas que vivem durante
muitos anos. Em regiões muito frias ou muito secas, sua parte aérea pode até desaparecer
durante o inverno ou durante o período seco, entretanto, sua parte subterrânea mantém-se
intacta para reiniciar o crescimento tão logo voltem às condições ideais de temperatura e
umidade (LORENZI, 2000).
As plantas infestantes podem ser hospedeiras de um grande número de insetos,
nematóides, ácaros e ser portadoras de diversas doenças. Impedir a entrada e a disseminação
de sementes e de outros órgãos de reprodução de novas espécies de plantas daninhas é a
primeira prática preventiva. A erradicação das plantas já existentes em uma área é uma das
maneiras de minimizar os danos que essas plantas podem ocasionar às culturas de importância
econômica. A adoção dessa prática é, especialmente, direcionada para espécies de ciclo
perene, mais agressivas, porém, dependendo do método adotado, outras espécies também são
eliminadas (DEUBER, 2003).
Plantas daninhas já foram relatadas como hospedeiras alternativas de vários
patógenos e insetos. A interferência indireta das culturas agrícolas por pragas que tem nas
plantas daninhas seus hospedeiros intermediários, é um fato muito comum (LORENZI, 2000).
Invasoras infectadas com a bactéria Xylella fastidiosa, agente causal da escaldadura das
folhas, foram encontradas em pomares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl) no
Paraná, representando ameaça para a fruteira uma vez que podem servir como reservatório de
26
patógenos onde insetos vetores podem se multiplicar, adquirir a bactéria e transmiti-la para as
plantas cultivadas (LEITE et al., 1997).
A associação de espécies nativas com vírus do gênero Tospovirus foi relatada em
lavouras comerciais de tomate em São Paulo. O tripes vetor (Frankliniella schultezei Trybom)
tinha nas plantas daninhas importantes hospedeiras e fonte do vírus para o tomateiro. A
dificuldade da erradicação das invasoras desfavoreceu o controle da virose na cultura
(GUIMARÃES et al., 1997). Plantas daninhas das famílias Amaranthaceae, Asteraceae,
Euphorbiaceae, Leguminosae, Malvaceae e Solanaceae, associadas a begomovírus têm sido
relatadas em diversas áreas produtoras do país e podem servir como fonte de inóculo para
plantas cultivadas, mediante a transmissão pelo inseto vetor (AMBROZEVICIUS et al.,.2002;
LIMA et al., 2002; ASSUNÇÃO et al., 2004; ASSUNÇÃO et al., 2006). Para Assunção et al.
(2006), a erradicação dessas plantas das áreas deve ser uma medida adotada visando à redução
da incidência dessas viroses. Ambrozevicius et al. (2002), relataram um alto grau de
diversidade genética de begomovírus em tomateiros e sugeriram que esses vírus foram
transferidos para tomateiro a partir de plantas daninhas. Assunção et al. (2006), também
encontraram diversidade genética de begomovírus nas invasoras, o que pode confirmar essas
plantas invasoras como fonte do inóculo.
No Ceará, begomovírus já foram relatados associados a plantas daninhas da
família Amaranthaceae: Amaranthus spinosus L., A. deflexus L., A. viridis L.; Asteraceae
Acantospermum. hispidium, Bidens pilosa; Rubiaceae: Borreria capitata Ruiz & Pav. e
Euphorbiaceae: Euphorbia heterophyla L. (SANTOS et al., 2003b; ARNAUD et al., 2006)
presentes em área de produção de tomate na Chapada da Ibiapaba.
27
Plantas daninhas comuns em lavouras de tomate
• Ageratum conyzoides L.
Conhecida popularmente como mentrasto, picão-branco, maria-preta, catinga de
bode, erva-de são-joão, é uma planta daninha muito disseminada em todas as regiões agrícolas
do país, infestando tanto lavouras anuais como perene, hortas e terrenos baldios. Pertence à
família Asteraceae e é uma planta anual, herbácea, nativa da América do Sul, muito
empregada na medicina caseira como tônica, estimulante e emenagoga (BRAGA, 1976;
LORENZI, 2000) (FIGURA 3).
• Amaranthus spinosus L.
Também conhecida como caruru-de-espinho, bredo-de-espinho e bredo-branco, é
uma planta anual, herbácea, espinhenta. Suas folhas e brotos são comestíveis em saladas e tem
propriedades diuréticas. Pertencente a família Amaranthaceae é originária da América
Tropical e disseminada em mais de 40 países, amplamente distribuído por todo território
brasileiro ocorrendo em lavouras perenes, terrenos baldios e eventualmente em culturas
anuais (BRAGA, 1976; LORENZI, 2000) (FIGURA 4).
• Amaranthus viridis L.
É conhecida como caruru-de-mancha, bredo e bredo-verdadeiro. Planta anual,
herbácea, muito ramificada, variavelmente pigmentada, pertence à família Amaranthaceae e
suas folhas são comestíveis em forma de salada. Suas folhas são diuréticas e
antiblenorrágicas. Originária do Caribe apresenta como característica diferencial uma mancha
violácea no centro das folhas (BRAGA, 1976; LORENZI, 2000) (FIGURA 5).
• Bidens pilosa L.
Conhecido como picão-preto, carrapicho de agulha, picão e fura-capa pertence à
família Asteraceae. É uma planta anual, herbácea nativa da América Tropical, propaga-se
apenas por semente, sendo capaz de produzir até três gerações por ano. É muito usada na
medicina caseira como diuréticos (BRAGA, 1976; LORENZI, 2000). (FIGURA 6).
28
FIGURA 4: bredo de espinho
(Amaranthus spinosus L).
FIGURA 3: mentrasto
(Ageratum conyzoides L).
FIGURA 6: picão preto
(Bidens pilosa L).
FIGURA 5: caruru de mancha
(Amaranthus viridis L).
29
2.4 Diagnose Viral
Em geral a diagnose de vírus é realizada pela avaliação dos sintomas, sorologia e
por meio de técnicas moleculares utilizando-se a reação em cadeia de polimerase (PCR) e a
hibridização com sonda radioativa (; ZERBINI et al., 2006).
Muitos métodos de diagnose de vírus foram estudados e desenvolvidos com base
nas propriedades inerentes à proteína capsidial, ao ácido nucléico viral e as atividades
biológicas do vírus (MACIEL-ZAMBOLIM, 1999). A detecção mais precisa de vírus vem
sendo realizada por meio de técnicas moleculares que permitem a diagnose das viroses,
inclusive em nível de espécie (HAJI et al., 2004).
São métodos de diagnose:
2.4.1) O método de diagnose através de plantas indicadoras
Consiste na inoculação do vírus em uma série de espécies e variedades de plantas,
ditas indicadora, e na observação e registro dos sintomas induzidos pelo vírus em cada uma
delas. O diagnostico é feito com base na comparação dos sintomas observados com aqueles
relatados na bibliografia (ZERBINI et al., 2006).
2.4.2) Métodos Sorológicos
a) Difusão dupla em gel
Fundamentada na precipitação antígeno-anticorpo, o teste de difusão dupla em gel
é realizado em meio semi-sólido, resultando na formação de bandas fáceis de serem
visualizadas onde se formam na presença de pequenas quantidades de antígeno, o que
aumenta significamente a sensibilidade do teste (ALMEIDA; LIMA, 2001; ZERBINI et al.,
2006).
b) Teste Elisa (Enzyme Linked Imunosorbent Assay)
O teste Elisa é considerado um método para identificação e quantificação de vírus
em plantas e outros antígenos apresentando maior sensibilidade, baseando-se no princípio
clássico onde o antígeno é reconhecido pelo anticorpo (Imunoglobulina) que lhe deu origem,
formando o complexo Ac-Ag (ALMEIDA; LIMA, 2001). A utilização de anti-soros contra a
capa protéica de geminivírus, permite a detecção deste vírus em amostras de plantas
30
infectadas a grande dificuldade em relação a este método é o pequeno número de anti-soros
disponível no mercado (GIVORD et al., 1994; CANCINO et al., 1995).
2.4.3) Métodos Moleculares
As técnicas moleculares como hibridação de ácidos nucléicos e reação em cadeia
de polimerase “Polymerase Chain reaction”-PCR, tem tido mais destaque devido a sua maior
sensibilidade.
a) Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction) PCR
A PCR é uma técnica bastante simples, versátil e de ampla aplicação, composta de
ciclos contendo três passos cada um (desnaturação, anelamento e extensão) que possibilita
produzir um grande número de cópias de uma seqüência especifica do DNA, limitada por dois
oligonucleotídeos (“primers”), facilitando o estudo na análise dos genes. Apresenta uma
sensibilidade superior a de qualquer outra técnica uma vez que na sorologia apenas a proteína
capsidal é responsável pela detecção e identificação podendo ser confundidas pelo anti-soro
utilizado para detecção, enquanto que as técnicas moleculares podem detectar outras porções
do genoma viral que não o gene da proteína capsidal (ALMEIDA; LIMA, 2001; ZERBINI et
al., 2006).
A principal vantagem da PCR é devido a sua estrema sensibilidade, onde é
possível detectar ácidos nucléicos em concentrações da ordem de fentogramas (10-18g). Tendo
como desvantagens seu elevado custo e também a ocorrência de falsos positivos devido a
enorme sensibilidade da técnica que pode levar à amplificação a partir de contaminantes da
amostra (ZERBINI et al., 2006).
b) Hibridização de Ácidos Nucléicos
É uma técnica extremamente sensível, baseada na imobilização do ácido nucléico
a ser detectado (na forma de fita simples) fixado em uma membrana de ‘nylon’ e na formação
de híbridos (fita dupla) com a sonda utilizada para detecção. Entre os métodos de hibridização
o dot-blot tem sido mais empregado no diagnóstico das fitoviroses (ALMEIDA; LIMA, 2001;
ZERBINI, 2006). A hibridização com sondas radioativas é um método altamente específico e
de amplo uso em detecção, porém esbarra na necessidade de uma infraestrutura adequada, de
treinamento de pessoal e no aumento de riscos para a saúde dos usuários (SANTANA et al.,
2007).
31
2.5 Controle de viroses
O controle de fitoviroses depende, principalmente, de medidas preventivas, que
devem ser tomadas por todos os produtores de uma região, estado ou país. Muitas medidas
são estabelecidas em legislação fitossanitárias nacionais e internacionais. A idéia generalizada
de controlar vírus com a aplicação de defensivos, visando à eliminação de vetores, quase
sempre leva ao insucesso, eleva o custo de produção, provoca sérios danos ao meio ambiente
e favorece o aparecimento de super pragas. Controlar uma doença não é simplesmente
exterminá-la após o seu aparecimento. O controle deve ser entendido como prática
permanente de medidas integradas, evitando que a doença apareça ou atinja proporções que
resultem em grandes danos e prejuízos (LOPES; ÁVILA, 2005).
Muitos métodos de controle são sugeridos para prevenir as doenças, como
controle cultural, controle biológico, químico e genético (HAJI et al., 2004).
O controle de begomovírus é difícil e todas as práticas que visem à redução de sua
incidência devem ser adotadas como parte de um manejo integrado. Apesar de dispendioso e
de provocar resistência nas populações de mosca-branca, o uso de controle químico do vetor,
deve fazer parte desse manejo (HAJI et al., 2004).
O emprego de práticas agrícolas rotineiras para criar um agroecossistema menos
favorável ao desenvolvimento e à sobrevivência dos insetos tais como: plantio de mudas
sadias, uso de barreiras para impedir ou retardar a entrada do vetor nas lavouras, uso de
armadilhas para atrair e reduzir a população de adultos de mosca-branca e manutenção da
lavoura no limpo, eliminando as plantas hospedeiras de viroses e os restos culturais
(EMBRAPA, 2007).
A resistência genética é a maneira mais efetiva para o controle de geminiviroses.
Alguns genótipos de tomate relatados como tolerantes e/ou resistentes ao geminivírus em
outros paises tem sido avaliados no Brasil, na tentativa de identificar fontes de resistência
(HAJI et al., 2004). No Ceará, o controle de begomovírus na região produtora de tomate da
Ibiapaba concentra-se na utilização de material genético tolerante e no controle sistemático do
inseto vetor (ARNAUD, 2005).
32
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os ensaios deste trabalho foram conduzidos em condições de casa-de-vegetação e
nos Laboratórios de Fitopatologia e Virologia Vegetal, na Universidade Federal do Ceará.
3.1 Material Vegetal
Amostras foliares de plantas de tomate com sintomas de infecção viral,
provenientes da Região de Ibiapaba-CE, foram submetidas à extração de DNA total e a PCR
com oligonucleotídeos específicos para begomovírus. Na eletroforese os fragmentos de DNA
amplificados, visualizados em gel de agarose sob luz ultravioleta, confirmaram a infecção.
Amostras de uma única planta foram empregadas como fonte do vírus para tomateiro ‘Santa
Clara’ utilizado nesse trabalho.
A relação das plantas daninhas utilizadas nos ensaios de transmissão viral com o
begomovírus do tomateiro empregando-se a mosca-branca, a enxertia e a inoculação
mecânica, encontra-se na TABELA 1.
TABELA 1. Relação das plantas daninhas investigadas com relação ao begomovírus. .
Família Espécie Nome Vulgar
Amaranthaceae Amaranthus spinosus Bredo de espinho
Caruru de espinho
Amaranthus viridis Bredo verdadeiro
Caruru de mancha
Asteraceae Ageratum conyzoides Mentrasto
Catinga de bode
Bidens pilosa Picão
Picão preto
33
3.2 PCR- Método empregado na detecção viral
3.2.1 Extração de DNA total
Em todas as etapas de detecção de vírus nas plantas inoculadas, foram coletadas
amostras foliares para extração de DNA total, empregando o protocolo de extração elaborado
por DELLAPORTA et al (1983), com modificações. Discos foliares de 1 cm foram triturados
em microtubos em presença de 500 µl de tampão de extração (Tris-HCl 1,0 M; EDTA 0,5M;
NaCl 5,0M; β-mercaptanol; água milli-Q estéril e autoclavada) adicionando-se,
posteriormente, 66 µl de SDS 10%, seguindo uma forte agitação e incubação a 65 0C em
banho-maria por 10 minutos. Em seguida, foi adicionado 160 µl de acetato de potássio 5M,
seguido de uma centrifugação a 10.000g por 10 min. Uma alíquota de 450 µl da parte aquosa
formada foi transferida cuidadosamente para outro microtubo, adicionando-se 225 µl de
isopropanol. Sucedeu-se uma nova centrifugação por 10 min. O sobrenadante foi descartado e
o “pellet” foi lavado com 500 µl de etanol a 70%. Depois se levou a centrifuga (Centrifuge
5415C-EPPENDORF) por 5 min e descartou-se o sobrenadante, o “pellet” foi levado à estufa
a 37 0C para secar. O DNA foi ressuspenso em 100 µl de água milli-Q (estéril e autoclavada)
e acondicionado a -20 0C.
3.2.2 Preparo das amostras para PCR
As reações para a PCR foram preparadas com 3 µl de DNA, 2,5 µl de tampão 10X
da enzima Taq polimerase, 0,75 µl de MgCl2 a 50 mM, 0,5 µl de dNTPs a 10mM, 0,7 µl do
primer PAc368 (CP1) (5’CCCGTCGACATGYCTAAGMGKGAKGCCCC-3’) e 0,7 µl do
primer PAv1320 (CP2) (5’CCCCTGCAGAACTTCCAAGTCTGGACG-3’), 0,2 µl de Taq
polimerase pht e 16,65 µl de água milli-Q estéril e autoclavada, completando o volume final
para 25 µl. Os oligonucleotídeos empregados na PCR amplificam fragmentos do genoma em
torno de 0,9kb do DNA A, referente da capa protéica do vírus.
O programa utilizado na amplificação do begomovírus no termociclador
(Mastercycler gradient-EPPENDORF) foi: aquecimento inicial de 94 ºC durante 3 minutos e
29 ciclos compostos de desnaturação (94 ºC/min) anelamento (53 ºC/1,0min) e extensão (72
ºC/2,0min). Concluídos os 30 ciclos seguiu-se uma extensão final de 72ºC por 7 minutos.
Após a eletroforese os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados em gel de
agarose 1% corado com brometo de etídio e observados sob luz ultravioleta em
fotodocumentador (mini-transiluminator Bio-Rad).
34
3.3 Teste de transmissão viral de tomateiro para plantas daninhas
3.3.1 Inoculação empregando a mosca-branca
Para os ensaios de transmissão de vírus, moscas-brancas avirulíferas eram
mantidas em gaiolas antiafídicas, onde plantas de gergelim (Sesamum indicum L.) e de tomate
foram colocadas para multiplicação do vetor. Na retirada das moscas-brancas da gaiola,
utilizou-se um aspirador adaptado para insetos, acoplado a um tubo Falcon.
Tomateiro infectado com begomovírus foi colocado em gaiola telada com
moscas-brancas avirulíferas. Grupos de 4-9 mudas sadias de bredo de espinho, caruru de
mancha, mentrasto e picão preto, foram, alternadamente, colocados naquela gaiola onde
permaneceram por sete dias em contato com as moscas-brancas virulíferas. Mudas de
tomateiro ‘Santa Clara’ sadias foram também levadas para a gaiola, como controle da
transmissão. Decorridos 15 dias da retirada de cada grupo de plantas da gaiola, procedeu-se a
coleta de amostras foliares de todas as plantas daninhas e das mudas de tomate para extração
de DNA.
Após a retirada das plantas da gaiola, realizou-se pulverização das mesmas com
inseticida recomendado para o vetor.
3.3.2 Inoculação por enxertia
Ramos novos de tomateiros infectados foram obtidos por meio de cortes
realizados com lâmina de barbear esterilizada. As secções foram enxertadas por garfagem nas
plantas daninhas sadias no estágio da 4ª folha verdadeira (FIGURA 7a), sendo estas seções
mantidas presas com auxílio de prendedores plásticos. Empregou-se de 08 a 10 plantas de
cada espécie daninha para os enxertos com tomate. Mudas sadias de tomate foram igualmente
inoculadas para controle da transmissão (FIGURA 7b). Após emissão de ramos novos,
amostras foliares eram coletadas para extração de DNA e PCR.
3.3.3 Inoculação mecânica
Na inoculação mecânica, foram utilizadas mudas de plantas daninhas com duas
folhas verdadeiras. Folhas novas de tomates infectados foram trituradas em almofariz de
porcelana, na presença de tampão de fosfato de potássio 0,05M, pH 7,5. O extrato foi
friccionado com pedaços de gazes umedecidas na parte adaxial das folhas previamente
polvilhada com abrasivo carborundum. Após a inoculação as mudas foram lavadas com água
corrente e mantidas em casa de vegetação para observação de surgimento dos sintomas.
35
3.4. Teste de transmissão viral de plantas daninhas para tomateiro
3.4.1 Inoculação empregando a mosca-branca
Após a extração e confirmação da presença do vírus nas quatro espécies de plantas
daninhas, procedeu-se aos ensaios de transmissão do vírus para o tomateiro. Mudas envasadas
de plantas daninhas infectadas foram colocadas em gaiolas individuais com moscas-brancas
avirulíferas (15-20) por um período acesso de aquisição de 24 horas. Depois desse tempo, os
insetos foram transferidos por meio de um aspirador manual para mudas jovens de tomate (6-
12 insetos) com duas folhas definitivas por igual período, ou seja, com período acesso de
inoculação de 24 horas (FIGURA 8). Passados 15 dias da inoculação, foram coletadas
amostras foliares dos tomateiros para extração de DNA e PCR.
FIGURA 7: Enxertia de ramo de tomateiro infectado em: a) muda de mentrasto (seta); b) muda de tomateiro ‘Santa Clara’.
b a
36
3.4.2 Inoculação por enxertia
Seções de ramos novos de plantas daninhas infectadas foram enxertadas por
garfagem em mudas sadias de tomateiro ‘Santa Clara’, no estágio da 4ª folha verdadeira. As
seções foram igualmente presas às plantas com os prendedores plásticos. Após emissão de
ramos novos de tomateiros, amostras foliares foram coletadas para procedimento de extração
de DNA e PCR, visando-se confirmar a transmissão.
FIGURA 8: Ensaio de transmissão de begomovírus com moscas-brancas virulíferas em muda de tomate provenientes de plantas daninhas.
37
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados da transmissão do begomovírus de plantas de tomate para plantas
daninhas são apresentados na TABELA 2. As quantidades de plantas daninhas submetidas à
inoculação com o vetor na gaiola, foram diferentes por não se ter quantidades suficientes para
serem igualadas, uma vez que semeadas no mesmo período havia diferença nas germinações
das sementes, e algumas como o mentrasto e bredo de espinho tinham uma reduzida
emergência. A germinação irregular de plantas daninhas se deve à dormência de suas
sementes, e a intensidade da dormência varia muito entre as espécies, sendo influenciada pela
temperatura e pela umidade do solo (TOMAZ et al, 2004).
Na transmissão do vírus do tomateiro para plantas daninhas tentou-se simular uma
condição natural, empregando-se a fonte viral, o vetor e espécies infestantes comuns em
lavouras de tomate e nas quais já se tinha relato de infecção natural de begomovírus, de
acordo com os levantamentos em campo realizados por Arnaud (2005). Conforme observado,
o begomovírus foi transmitido para as quatro espécies de plantas daninhas em percentual
variando de 22 a 37% (TABELA 2). Em condições naturais, begomovírus foi encontrado
nessas espécies em percentuais de 16% (mentrasto), 20% (caruru-de-mancha), 25% (picão
preto) e 65% (bredo de espinho) das amostras coletadas ao acaso em lavouras de tomate
na Chapada da Ibiapaba (ARNAUD, 2005). Os valores de campo foram similares aos do
ensaio, sendo superior somente para bredo de espinho. Segundo Arnaud (2005), essas
espécies foram encontradas com freqüência nas lavouras da Ibiapaba e nelas, comumente,
observou-se a presença da mosca-branca.. A presença do vírus foi detectada nas amostras
foliares pela visualização de bandas de 0,9kb em gel de agarose, fragmento amplificado de
tamanho esperado (FIGURA 9). Nesse gel, bandas inespecíficas observadas podem ter
resultado de alguma degeneração de oligonucleotídeos (BRIOSO et al. 1996), em razão de os
mesmos não terem sido desenhados para o begomovírus do tomateiro desse trabalho. As
plantas daninhas infectadas com begomovírus nestes ensaios não apresentaram sintomas
visíveis de infecção. Contudo, os tomateiros usados como controle positivo, exibiram os
sintomas de mosaico clorótico, epinastia e subdesenvolvimento da planta.
Na transmissão do vírus para plantas daninhas por meio da enxertia com secções de
tomateiros, apenas o picão preto foi infectado com o vírus (TABELA 2). O insucesso das
inoculações por enxertia, possa em parte, se dever à incompatibilidade dos tecidos envolvidos
ou à má junção e rápida morte dos enxertos. Repetição deste método deve ser realizada para
confirmação desses resultados.
38
Na inoculação mecânica não obtivemos resultados positivos, porém mudas de
tomates também foram inoculados no mesmo período, onde de 10 mudas, duas foram
infectadas com o begomovírus. Na inoculação mecânica o índice de transmissão de
begomovírus pode ser reduzido por fatores, como baixo percentual de replicação do vírus nas
células do mesófilo. Nas tentativas de transmissão de begomovírus isolados de tomateiros
infectados coletados na Ibiapaba para mudas de tomateiro ‘Santa Clara’, Arnaud (2005)
observou baixo percentual de transmissão, tanto nas inoculações mecânicas (5%) como nas
inoculações por enxertia (30%).
TABELA 2. Ensaio de transmissão de begomovírus do tomateiro para plantas daninhas.
Plantas daninhas/transmissão Plantas
infectadas/testadas
Inoculação por mosca-branca
Bredo de espinho 2/6 (33%)
Caruru de mancha 2/9 (22%)
Mentrasto 1/4 (25%)
Picão preto 3/8 (37%)
Inoculação por enxertia
Bredo de espinho 0/3 (0%)
Caruru de mancha 0/3 (0%)
Mentrasto 0/9 (0%)
Picão preto 2/10 (20%)
Inoculação mecânica
Bredo de espinho 0/4 (0%)
Caruru de mancha 0/6 (0%)
Mentrasto 0/10 (0%)
Picão preto 0/3 (0%)
1 2 3 4 5 6 7
39
Os resultados da transmissão do begomovírus das plantas daninhas retornando
para o tomateiro, realizado por meio da mosca-branca e por enxertia estão na TABELA 3.
Com base nesses dados, observou-se que houve uma variação de 12 a 70% na transmissão
viral empregando-se a mosca-branca. O menor percentual de transmissão constatado do
caruru de mancha para tomateiro (12%), pode ter sido em razão da repetida manipulação da
mosca-branca e da menor recuperação desses insetos nessa planta daninha (06/ planta) na
transferência para as mudas de tomate. Contudo, os valores da transmissão viral foram mais
elevados no retorno do begomovírus para o tomateiro do que deste para as quatro invasoras.
Isso pode ter sido em razão de o tomateiro ser a hospedeira natural do mesmo.
Ressalta-se ainda que o período acesso de inoculação do vírus nas mudas de
tomateiros foi de 24h, inferior aos sete dias da passagem do vírus do tomateiro para as plantas
daninhas. As plantas de tomateiro infectadas apresentaram, após 15 dias, os sintomas de
mosaico clorótico, ocasião da coleta das amostras para extração do DNA. Gel ilustrando o
resultado da transmissão viral para os tomateiros inoculados, pode ser observado na FIGURA
10. A infecção nos tomateiros foi constatada para todos os casos em que se empregou a
mosca-branca tendo por fonte de begomovírus as quatro plantas daninhas. Esses resultados
demonstraram que bredo de espinho, caruru de mancha, mentrasto e picão preto são
hospedeiras alternativas de begomovírus de tomate e que podem, no campo e na presença do
vetor, ser importantes fontes do vírus para o tomateiro.
FIGURA 9: Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomateiro e de plantas daninhas por mosca-branca infectadas com begomovírus. 1- marcador DNA Ladder 1 Kb; 2-tomate (controle positivo); 3-bredo-de-espinho; 4- mentrasto; 5-caruru de mancha; 6- picão-preto; 7- Tomate sadio.
0,9 Kb
40
TABELA 3: Ensaio de transmissão de begomovírus das plantas daninhas para tomateiros.
Transmissão Plantas de tomate
infectadas/inoculadas
Inoculação por mosca-branca
Tomate para Bredo de espinho 5/10 (50%)
Tomate para Caruru de mancha 1/8 (12%)
Tomate para Mentrasto 7/10 (70%)
Tomate para Picão preto 2/10 (20%)
Inoculação por enxertia
Tomate para Bredo de espinho 2/5 (40%)
Tomate para Caruru de mancha 0/3 (0%)
Tomate para Mentrasto 0/5 (0%)
Tomate para Picão preto 3/11 (27%)
Na transmissão por enxertia, onde seções de ramos de plantas daninhas infectadas
foram enxertados em tomateiro, houve resultados positivos somente para o picão (27%) e o
bredo de espinho (40%). Para caruru de mancha, cujo resultado foi negativo, o número de
tomateiros inoculado foi menor, em razão de haver pouco material vegetal para enxertia.
Além disso, dos tomateiros enxertados, somente dois emitiram ramos novos, os quais
apresentaram folhas pouco desenvolvidas, mesmo após os 15 dias da inoculação. O mesmo
ocorreu com a enxertia envolvendo o mentrasto. O pouco material vegetal coletado para teste
pode ter sido a razão do insucesso nesses casos. Na FIGURA 11, observa-se foto ilustrativa
do gel com tomateiros enxertados. Bandas bem visíveis e de tamanho esperado foram
observadas em tomateiros enxertados com picão preto e o bredo de espinho.
A erradicação das espécies daninhas hospedeiras de begomovírus como bredo-de-
espinho, caruru-de-mancha, mentrasto e picão preto, comumente encontrada em lavouras de
tomate na Chapada da Ibiapaba, pode ser recomendada no manejo da virose, visando à
redução da incidência de begomovírus da região produtora. Acrescenta-se ainda que moscas-
brancas são freqüentemente observadas sobre essas invasoras no campo.
A
41
A
B
FIGURA 10: Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomateiro inoculado empregando-se o vetor tendo por fonte plantas daninhas. A) 1-marcador DNA Ladder 1Kb; 2-tomateiro (controle positivo); 3-5 tomateiro (fonte mentrasto); 6-10 tomateiro (fonte bredo-de-espinho). B) 1-tomateiro (controle positivo); 2- tomate sadio; 3-4 tomateiro (fonte picão); 5- tomateiro (fonte caruru de mancha).
0,9 Kb
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A B
FIGURA 11: Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomateiros enxertados tendo por fonte seções de plantas daninhas. 1- marcador DNA Ladder 1 Kb; 2-tomate (controle positivo); 3-5 tomateiro (fonte picão preto); 6 e 7-tomateiros (fonte bredo-de-espinho).
1 2 3 4 5 6 7
0,9 Kb
42
5. CONCLUSÃO
• As plantas daninhas: bredo-de-espinho, caruru-de-mancha, mentrasto e picão
preto são hospedeiras alternativas do begomovírus do tomateiro;
• Mosca-branca transmitiu o begomovírus com maior eficiência para o
tomateiro;
• Bredo-de-espinho, caruru-de-mancha, mentrasto e picão preto, na presença do
vetor, podem ser importantes fontes de begomovírus para o tomateiro.
43
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